We present a protocol to identify protein moieties containing antigens for human and mouse IgM antibodies with specific kappa (Vκ) light chains. This protocol is not limited to IgM class antibodies but applies to all immunoglobulin isotypes that target their antigen with sufficiently high affinity during immunoprecipitations.
Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents in standard laboratory techniques. In contrast, several human IgMs demonstrated proof of efficacy in cancer models and models of CNS disorders including multiple sclerosis (MS) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Reasons for their lack of consideration include difficulties to express, purify and stabilize IgM antibodies, challenge to identify (non-protein) antigens, low affinity binding and fundamental knowledge gaps in carbohydrate and lipid research.
This manuscript uses HIgM12 as an example to provide a detailed protocol to detect antigens by Western blotting, immunoprecipitations and immunocytochemistry. HIgM12 targets polysialic acid (PSA) attached to the neural cell adhesion molecule (NCAM). Early postnatal mouse brain tissue from wild type (WT) and NCAM knockout (KO) mice lacking the three major central nervous system (CNS) splice variants NCAM180, 140 and 120 was used to evaluate the importance of NCAM for binding to HIgM12. Further enzymatic digestion of CNS tissue and cultured CNS cells using endoneuraminidases led us to identify PSA as the specific binding epitope for HIgM12.
Antistoffer av IgM-isotypen demonstrere stort terapeutisk potensiale for behandling av forskjellige sykdommer, inkludert kreft og CNS-lidelser 1-7. Den Vollmers 'gruppe identifisert en rekke antistoffer i kreftpasienter for potensiell bruk som tumor-spesifikke biomarkører eller aktive behandlingsformer som er i stand til å drepe ondartede celler ved å fremkalle apoptotiske trasé 4,8,9. Interessant, alle identifiserte antistoffer med terapeutiske potensialet er av IgM-isotype og hører til gruppen av "naturlige antistoffer" (Nabs).
Tilsvarende identifisert Rodriguez gruppe mus og humane antistoffer som stimulerer remyelinering i kronisk demyelinerte ryggmargslesjoner i modeller for multippel sklerose (MS). Identisk med antistoffer med anti-kreft effekt, alle remyelinering fremmende antistoffer er Nabs og av IgM-isotypen 1,6,7,10. De nøyaktige antigener for de identifiserte IGMS er fortsatt graved inkludert den menneskelige remyelinisering fremmende antistoff rHIgM22, for tiden i fase I kliniske studier for MS-pasienter 11. Til tross for gjentatte forsøk fra eksperter innen lipid og karbohydrat forskning både i den akademiske omgivelser og i samarbeid med industrien 11, forsøker å identifisere rHIgM22 s antigen har ikke vært vellykket. Svikt av standard teknikker som brukes til å identifisere antigener av IgG-antistoffer til å arbeide med IgM-antistoffer identifiserer et kritisk behov for å raffinere metoder som er spesifikke for disse antistoffene at mest sannsynlig mål karbohydrat eller lipid-antigener.
Fokus for dette manuskriptet er den menneskelige regenerativ antistoff HIgM12 og de eksperimentelle prosedyrer som brukes til å identifisere sitt antigen. Antistoff HIgM12 ble identifisert fra pasienter med Walden makroglobulinemi, stimulerer neurittutvekst in vitro 12-14 og mål polysialic syre (PSA) festet til nevrale celleadhesjonsmolekyl (PSA-NCAM) 15,16. HIgM12 forlenger levetiden i en musemodell for ALS 17 og forbedrer funksjonelle resultatet i Theiler sin muse encefalomyelitt virus (TMEV) -infected mus. Spesielt stimulerer HIgM12 spontan horisontal og vertikal motorisk aktivitet i kronisk demyelinerte mus og øker antall små og mellomstore diameter ryggmarg axoner åtte uker etter en enkelt, lav dose av intraperitoneal injisert antistoff 18.
Det nevrale celleadhesjonsmolekyl (NCAM) er et glykoprotein av immunoglobulin (lg) superfamilien som uttrykkes på celleoverflaten av nerveceller, gliaceller, skjelettmuskel, og naturlig dreperceller 19-25. De tre store NCAM isoformene betegnes NCAM180, NCAM140, og NCAM120, er alternative spleise varianter av en primær transkripsjon som bare varierer i sin cytoplasmaområde. Innenfor CNS, er NCAM hoved polysialylated molekylet (> 95%) med lange, negativt ladede sialinsyre-homopolymerer. Polysialic encid med n> 10 er betegnet PSA men kortere oligomeric strukturer eksisterer som også er biologisk relevant. Andre polysialylated proteiner uttrykt i CNS er SynCAM1 26, Neuropilin-2 (NRP-2) 27,28 og en natriumkanal subenhet 25 (for oversikt se 29).
Metodene som beskrives her tillate antigen identifikasjon for mennesker og mus immunglobuliner som inneholder spesifikke kappa (Vκ) lette kjeder (VκI, VκIII eller VκIV lette kjeder for humane antistoffer og VκI lette kjeder for mus antistoffer) uavhengig av antistoffets isotype (f.eks IgG, IgM , IgA, IgD eller IgE). Denne begrensningen er basert på bruk av protein L agarose for immunoutfellinger med antistoffer av IgM-isotypen. Alternative strategier kan omfatte mannose-bindende lektiner og sekundære IgG anti-IgM-antistoffer covalent bundet til agarosekuler, noe som kan utvide anvendbarheten av denne metode til flere IgM antistoff økesLuding de med lambda (λ) lette kjeder (se diskusjon). Prosenter av serum IgM Vκ lette kjedene i forhold til IgM λ lette kjedene avledet fra friske individer er 1,5: 1 30.
Basert på den kromatografiske metoden som er benyttet her for å separere, berike, og immunologisk oppdage visse molekyler 31, er alle antigener som kreves for å inkludere i det minste en liten protein domene. Antistoffets spesifikke binding epitop kan være innenfor eller utenfor det protein domenet (for eksempel i glykoproteiner, lipoproteiner). Innledende biokjemiske trinnene som brukes for å identifisere spesifikt antigen for HIgM12, respektive å innskrenke listen over mulige kandidater, er de mest avgjørende skritt i denne metoden. Celletype spesifikke forberedelser og celle morfologi baserte karakteristikkene er beskrevet for gliacellene, men denne metoden kan ekstrapoleres til å betjene andre celletyper innenfor eller utenfor CNS.
Det er et presserendebehov for å utvikle nye eller endrede teknikker som kan anvendes for det økende antall av IgM-antistoffer med terapeutisk potensial for forskjellige menneskelige lidelser særlig i de tilfeller (de fleste IgM-antigener) hvor antistoff-mål er karbohydrat eller lipid-strukturer.
Humane naturlige IgM-autoantistoffer er tiltalende kandidater for immunterapi og har vist terapeutisk potensiale for behandling av forskjellige sykdommer, inkludert kreft og CNS-lidelser 1-7. Fortrinnsvis vil disse antistoffene ikke utløse en immunrespons i hvilken dannelsen av nøytraliserende antistoffer i vesentlig grad reduserer den effektive terapeutiske dose og effekt. Viktigere, har alle antistoffer med terapeutisk potensial vært av IgM isotype og hører til NAB repertoar 3-5,8,9,37,40,42-45. Et stort hinder for den potensielle kliniske anvendelsen av IgM-antistoffer er identifikasjonen av deres antigener, som er fastslått i mange tilfeller. Standard teknikker ansatt for IgG antistoffer er ofte ikke aktuelt å identifisere en IgM er antigen.
Denne protokollen beskriver identifiseringen av PSA-NCAM som antigen for den regenerative humant IgM-antistoff HIgM12, effektive i dyremodellerav MS og ALS 15-18. Den metodikk som brukes er hovedsakelig anvendelig for alle humane antistoffer med spesifikk Vκ lette kjeder VκI, VκIII og VκIV og muse-antistoffer med VκI lette kjeder, uten hensyn til antistoffets isotype.
Den mest kritiske trinn i denne protokollen er bruken av IgM-antistoffer i affinitetskromatografiske anvendelser. Nærmere bestemt er fremgangsrike antistoff nødvendig for å virke som rullegardinstoffer i immunoutfellinger for å isolere eller til å anrike et antigen ut av komplekse vevs- eller cellekultur-lysater. Anrikede fraksjoner antigen kan sammenlignes med immunoutfellinger fra isotypekontrollantistoffer og deretter analysert for forskjeller ved massespektrometri. Ett viktig krav eller begrensning av dette trinnet er nærværet av den korrekte antistoff Vκ lettkjede og vert (human, mus) for å muliggjøre antistoffbinding til protein L agarose. Bruk av mannan-bindende protein bundet til agarose (også called mannose-bindende lektin) i stedet for L-proteinet agarose er et potensielt alternativ til å immunoutfelle IGMS uten særlige Vκ lette kjeder. Imidlertid, som det fremgår av Arnold et al. 35, antigen-bundet IgM-antistoffer binder ikke til mannan-bindende protein, som målet glykan synes å være utilgjengelige når IgM har bundet til dets antigen. Basert på disse funnene mannose-bindende protein kan ikke brukes som en bindende matrise for å immunoutfelle antigen belastede IgM molekyler med molekylvekt 35. Andre mulige alternativer kan være bruk av sekundære agarose-bundet anti-IgM IgG-antistoffer 46,47 eller bruk av overflateaktiverte magnetiske kuler 48. IgG antistoffer rettet mot IGMS kan være kjemisk tverrbundet til agarose A eller G-agarose for å redusere omfanget av eluerte antistoffet sammen med antigenet av interesse. En riktig sammenligning mellom ulike varianter av IgM immunopresipitering med hensyn til vellykket identifiserte antigener ier vanskelig fordi de fleste immunoutfellinger ble utført for å isolere eller utarme IGMS uten ytterligere interesse for sine antigener. I tillegg ble det ved hjelp av immunoutfellinger IGMS i hovedsak brukt for å bekrefte en allerede kjent eller forventet enkelt antigen med antistoff eksponering til rensede antigener 49. En ulempe ved agarose-koplet IgG rettet mot human IGMS er et meget lavt utbytte (10 – 15%) av immunopresipitert serum-IgM-molekyler sammenlignet med utgangsmaterialet 50. I motsetning til dette ble det overflateaktiverte magnetiske kuler med hell brukes til antistoffer av forskjellige isotyper, inkludert IgM for å immunoutfelle skrapesyke-assosiert fibriller 48. Denne metoden er ikke begrenset til spesifikke kappa (Vκ) eller lambda (λ) kjeder eller en spesiell vert, og kan i det vesentlige utvide spekteret av IgM-antistoffer som brukes i immunoutfellinger.
Et annet viktig skritt i protokollen er antistoffets evne til å fungere som en Detecting antistoff (primær antistoff) i Western blot eller andre screening plattformer. Vellykket antistoffer må målrette deres antigenet med tilstrekkelig høy affinitet til å tillate antigen binding i nærvær av ikke-ioniske eller muligens ioniske vaskemidler. Høy affinitet antistoffer er vanlig blant affinitets-maturated IgG-antistoffer, men mindre vanlig blant antistoffer av IgM-isotypen, som er en av årsakene til at det er relativt få kommersielt tilgjengelige IgM-antistoffer som detektering av midler i biokjemiske innstillinger. Høyaffinitets binding av antistoffer som er en forutsetning for immunoutfellinger av molekylære antigener og for Western blotting. Senking vaskemiddel konsentrasjoner eller fullstendig fravær av vaskemidler i IP buffere og oppløsnings buffere tillater antigen målretting av lav affinitet antistoffer via sin Fab-domene. I motsetning til dette er antistoffets evne til å målrette protein L-agarose via sin Fc-del ikke i vesentlig grad påvirkes blant isotype kontroll over en rekke forskjellige detergent konsenrasjoner. Imidlertid lav konsentrasjon vaskemiddel i lyseringsbuffer og IP-buffer hindrer cellemembranen avbrudd og isolering av spesifikke molekyler. Tilsvarende vil en lav konsentrasjon vaskemiddel i Western-blot vaske- buffere (for eksempel PBS-T) tillater antigen binding av lav-affinitets antistoffer, men på samme tid øker ikke-spesifikk binding, og er derfor ikke et alternativ.
Tilstedeværelsen av et antigen-protein kjerne er en forutsetning for denne metoden. Proteiner med posttranslational modifikasjoner (f.eks glykoproteiner, lipoproteiner) og umodifiserte proteiner, men ikke eneste lipider eller karbohydrater, kan påvises i Western blot. Det er ikke mulig å immunoutfelle lipider (f.eks sfingolipider) fra vevs- eller cellelysatene i nærvær eller fravær av detergenter. De fysiokjemiske egenskapene til vaskemidler og lipider er for like til å tillate selektiv lipid-antistoff-interaksjoner, mens på samme tid vaskemidler er vesentlig å forstyrremembraner for å tillate selektiv isolasjon av spesifikke molekyler. Til vår beste kjennskap, immunoutfellinger utelukkende består av karbohydrater, i fravær av et protein kjerne, har ikke tidligere blitt rapportert. Dette blir spesielt relevant fordi IgM-antistoffer ofte målrette karbohydrater og glykolipider, som ikke nødvendigvis er bundet til et protein enhet. Andre kromatografiske teknikker er nødvendig for separasjon og immunologiske identifisering av lipider og karbohydrater i fravær av et protein kjerne. For eksempel kan tynnsjiktskromatografi (TLC) av cellulære lipider med etterfølgende antistoffdeteksjon på TLC-platen (immuno-TLC) implementeres 51,52.
Andre anti-PSA-antistoffer er blitt beskrevet i tidligere studier og resultater, sammenlignet med HIgM12, så vel som den kommersielt tilgjengelige anti-PSA-IgM (klon 2-2B). Den mest brukte antistoff i feltet av PSA er et IgG-antistoff (klon 735) som er tilgjengelig som mus monoclonal eller kanin polyklonale antistoff 53. Denne anti-PSA IgG antistoff oppdager PSA på SynCAM og NCAM på ulike CNS celletyper, inkludert mikrogliaceller celler 41. I motsetning til den anti-PSA-IgG-antistoff, humane IgM-antistoffer HIgM12, HIgM42 og anti-PSA-muse-IgM (klon 2-2B) er ute av stand til å målrette PSA på SynCAM (men på NCAM) ved forskjellige embryonale og tidlige postnatale stadier i mus , mens ikke-polysialylated SynCAM er lett synlig 15. IgM antistoffer som brukes er heller ikke i stand til å oppdage Ptil på mikrogliaceller celler (figur 3 + 4). En mulig forklaring på forskjellene observert mellom antistoff-isotyper kan være lave PSA-SynCAM nivåer sammenlignet med nivåer av PSA-NCAM kombinert med potensielt lavere affinitet binding av IgM-antistoffer sammenlignet med anti-PSA-IgG. For å teste denne hypotesen, utførte vi immunoutfellinger i NCAM KO dyr på fosterstadiet E17 med store mengder SynCAM stede og brukes HIgM12 som en "pull-down agent" <sup> 15. I E17 WT kull styrer HIgM12 immunopresipitert PSA-NCAM i en grad som viste tilsvarende intensiteter av "trukket ned" PSA-NCAM forhold til IGMS tungkjede som detektert ved densitometri i påfølgende Western blot ved hjelp eluert antigener. Dette resultatet foreslått minst en tilstrekkelig affinitet HIgM12 til målet Ptil. I motsetning til WT kull styrer HIgM12 ikke oppdage PSA festet til SynCAM i NCAM KO dyr. Identiske resultater ble oppnådd i immunoutfellinger ved hjelp av humane anti-PSA IgM HIgM42. HIgM12 og HIgM42, samt mus anti-PSA IgM (klone 2-2B) var ikke i stand til å målrette Ptil på SynCAM i vestlige blotter fra WT og NCAM KO dyr på embryonale og postnatal utviklingsstadier. Gitt den lave mengden av HIgM12 kreves (0,1 ug / ml) for spesifikt å påvise PSA festet til NCAM i Western blot ved hjelp av små mengder av CNS vev (0,1 ug CNS vev per brønn) 15 synes det å være lite sannsynlig at lave affiniteter alene eransvarlig for fullstendig mangel på PSA-SynCAM deteksjon av HIgM12 i tre forskjellige metoder.
Vi konkluderer med at det er betydelige forskjeller mellom anti-PSA IgM antistoffer og ofte publisert anti-PSA IgG antistoff (klon 735). Det er ikke klart hvorfor kommersielt tilgjengelige anti-PSA IgM-antistoffer ikke ble brukt oftere i det siste for å bekrefte resultatene oppnådd med antiPSA IgG antistoff 735. Dette er spesielt interessant fordi HIgM12 allerede har dokumentert effekt i forskjellige sykdomsmodeller. Mens andre anti-PSA IgM-antistoffer kan ha lignende terapeutiske effekter er det fortsatt uklart om anti-PSA IgG antistoff (klon 735) har en lignende terapeutisk utfall i modeller av MS og ALS.
I korte trekk, ble metodene som er beskrevet her brukes primært for å identifisere antigenet av de regenerative humant antistoff HIgM12 å støtte potensielle kliniske forsøk for MS og eventuelt andre nevrodegenerative sykdommer. Identifiseringen av maurigens for antistoffer med biologisk aktivitet er like viktig skritt for å forstå deres virkningsmekanisme. Dette blir særlig relevant i sammenheng med en rekke monoklonale antistoffer tiden blir testet for sikkerhet og effekt i menneskelige forsøk. Mens antall klinisk testet IgM antistoffer til dags dato er liten, nylige fremskritt i hybridoma teknologi sammen med et økende antall studier fremhever det terapeutiske potensialet i dette antistoffet klassen 1-10,37,40,42-45 oppfordrer til utvikling av nye eller modifiserte metoder anvendelig for å identifisere ikke-protein-IgM-antigener.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (R01 GM092993, R01 NS048357 og R21 NS073684), National Science Foundation (KARRIERE Award), Minnesota Partnership Award for bioteknologi og medisinsk Genomics, National Multiple Sclerosis Society (CA1060A) og Mayo Clinic Senter for klinisk og translasjonell Science (CCaTS). Forfatterne erkjenner støtte fra Applebaum, Hilton, Peterson og Sanford Foundations, månen og Marilyn Park Styreverv Fondet og McNeilus familien.
DMEM | Fisher Scientific | MT-10-013-CVRF | HIGH GLUCOSE, with glutamine, with sodium pyruvate, 500 ml |
DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml, L-glutamine, sodium pyruvate, high glucose |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/mL, 100 ml |
N-2 Supplement (100X) | Life Technologies | 17502-048 | 5 ml |
B-27 Supplement (50X) | Life Technologies | 17504-044 | serum free, 10 ml |
Fetal Bovine Serum – Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | 500 ml |
STERILE WATER FOR IRRIGATION | Baxter Healthcare | #2F7114 | USP-1000 ml, 12/CA |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7886-50MG | D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys · xHBr, Molecular Weight 30,000-70,000 g/mol, 50 mg |
bovine serum albumin fraction V | Sigma | A-3294-100G | heat shock fraction, protease free, pH 7, purity 98%, 100 g |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767-500G | C6H12O6, Molecular Weight: 180.16 g/mol, ACS reagent, 500 g |
Trypsin from bovine pancreas | Sigma | T9935-100mg | essentially salt-free, lyophilized powder, =9,000 BAEE units/mg protein, |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025-150KU | Type IV, lyophilized powder, =2,000 Kunitz units/mg protein |
Recombinant Rat FGF basic Protein | R&D systems | 3339-FB-025 | BSA as a carrier protein, 25 ug, lyophilized, >95%, 16.2 kDa |
Recombinant Rat PDGF-AA Protein | R&D systems | 1055-AA-50 | carrier free, 50 ug, lypphilized, >97%, E.coli-derived, 12.5 kDa |
Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | 500 ml, No Glutamine, No Aspartic Acid, No Glutamic Acid |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | crystalline, 1 kg, reagent grade, Molecular Weight 30.03 g/mol (as monomer) |
Tris[hydroxymethyl]aminomethane (Tris bas | Biorad | #1610719 | 1 kg, 99.8% pure, powder |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Biorad | #1610302 | 1 kg, powder |
Glycine | Fisher Scientific | BP-381-5 | C2H5NO2, Molecular weight: 75.07 g/mol, White crystalline Powder, 5 kg |
Sodium chloride | Sigma | S7653-5KG | NaCl, Molecular Weight: 58.44 g/mol, 5 kg |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751-500G | NaH2PO4, Molecular Weight: 119.98 g/mol, 500 g |
Phosphate-buffered Solution 1X (PBS) | Cellgro | MT-21-040-CV | Without Calcium and Magnesium, 6 x 500 ml |
Falcon 60mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning Life Sciences | #353002 | 60 mm Cell Culture Dish, TC-treated polystyrene, 20/pack, sterile |
Falcon 60 mm x 15 mm Petri dish | Corning Life Sciences | #351007 | Not TC-Treated Bacteriological Petri Dish, 20/Pack |
6 well cell culture plates | Corning Costar | CLS3516 | 6 well, flat bottom (Individually wrapped), gamma-irradiated, growth area 9.5 c |
75cm² tissue culture flask | Corning Life Sciences | 430720U | 75cm² U-Shaped Canted Neck Cell Culture Flask with Plug Seal Cap |
Pierce™ Protein L Plus Agarose | ThermoFisher Scientific | #20520 | 2 ml, crosslinked 6% beaded agarose (CL-6B), binding capacity: 10 to 20 mg IgG |
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Biorad | 456-1094 | 10-well, 50 µl, for use with Mini-PROTEAN electrophoresis cells |
Immobilon-P Membrane | Millipore | IPVH00010 | PVDF, 0.45 µm, 26.5 cm x 3.75 m roll |
Anti-Polysialic Acid-NCAM Antibody, clone | Millipore | MAB5324 | 50 microliters, Host: mouse, monoclonal IgM |
XT sample buffer (Western blot) | Biorad | #1610791 | 10 ml, 4 x premixed protein sample buffer |
2-mercaptoethanol | Biorad | #1610710 | 25 ml, 98 % pure, 14.2 M |
Endoneuraminidase-N (Endo-N) | ABC Scientific | ABC0020 | 50 microliters, 200 µg/ml, 3500 U/mg |
25 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circles No. 1; Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 25mm |
HEPES buffer solution | ThermoFisher Scientific | 15630-080 | 100 ml, 1M |
Hanks' Balanced Salt Solution 1X (HBSS) | Cellgro | MT-21-022-CV | 500 ml, without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
Papain | Worthington Biochemical Cooperation | LS003119 | lyophilized powder, 100 mg |
Magnesiumsulfate | Sigma | M-2643-500G | powder, 500 g |
L-Glutamine | Gibco | #25030-081 | 100 ml, 200 mM |