We present a protocol to identify protein moieties containing antigens for human and mouse IgM antibodies with specific kappa (Vκ) light chains. This protocol is not limited to IgM class antibodies but applies to all immunoglobulin isotypes that target their antigen with sufficiently high affinity during immunoprecipitations.
Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents in standard laboratory techniques. In contrast, several human IgMs demonstrated proof of efficacy in cancer models and models of CNS disorders including multiple sclerosis (MS) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Reasons for their lack of consideration include difficulties to express, purify and stabilize IgM antibodies, challenge to identify (non-protein) antigens, low affinity binding and fundamental knowledge gaps in carbohydrate and lipid research.
This manuscript uses HIgM12 as an example to provide a detailed protocol to detect antigens by Western blotting, immunoprecipitations and immunocytochemistry. HIgM12 targets polysialic acid (PSA) attached to the neural cell adhesion molecule (NCAM). Early postnatal mouse brain tissue from wild type (WT) and NCAM knockout (KO) mice lacking the three major central nervous system (CNS) splice variants NCAM180, 140 and 120 was used to evaluate the importance of NCAM for binding to HIgM12. Further enzymatic digestion of CNS tissue and cultured CNS cells using endoneuraminidases led us to identify PSA as the specific binding epitope for HIgM12.
Antikroppar av IgM-isotyp demonstrera stor terapeutisk potential för behandling av olika sjukdomar inklusive cancer och CNS-störningar 1-7. Den Vollmers 'gruppen som talrika antikroppar i cancerpatienter för potentiell användning som tumörspecifika biomarkörer eller aktiva terapeutiska medel som är i stånd att döda maligna celler genom att inducera apoptotiska reaktionsvägar 4,8,9. Intressant nog alla identifierade antikroppar med terapeutisk potential är av IgM-isotyp och tillhör gruppen "naturliga autoantikroppar" (NABS).
På liknande sätt identifierat Rodriguez gruppen mus och humana antikroppar som stimulerar remyelinisering hos kroniskt demyelinerade ryggmärgslesioner i modeller av multipel skleros (MS). Identisk med antikroppar med anti-cancereffekter, alla remyelinisering främjande antikroppar är alkoholfria drycker och IgM isotyp 1,6,7,10. De exakta antigener för de flesta identifierade IgM är fortfarande undetermined inklusive mänskliga remyelinisering främjande antikropp rHIgM22, för närvarande i fas I kliniska studier för MS-patienter 11. Trots upprepade försök av experter på området av lipid och kolhydrat forskning både i akademisk miljö och i samarbete med industrin 11, försöker identifiera rHIgM22 antigen har inte varit framgångsrika. Misslyckandet i standardtekniker som används för att identifiera antigener av IgG-antikroppar för att arbeta med IgM-antikroppar identifierar ett kritiskt behov av att förfina metoder som är specifika för dessa antikroppar som troligen mål kolhydrater eller lipid antigener.
Fokus i detta manuskript är den mänskliga regenerativ antikropp HIgM12 och de experimentella metoder som används för att identifiera dess antigen. Antikropp HIgM12 identifierades från patienter med Waldenströms makroglobulinemi, stimulerar neuritutväxt in vitro 12-14 och riktar polysialinsyra (PSA) som är fäst till det neurala cellvidhäftningsmolekyl (PSA-NCAM) 15,16. HIgM12 förlänger livslängden i en musmodell av ALS 17 och förbättrar funktionell utfall Theiler s mus encefalomyelit virus (TMEV) infekterade möss. Specifikt HIgM12 stimulerar spontan horisontell och vertikal motorisk aktivitet hos kroniskt demyelinerade möss och ökar antalet små och medelstora diameter ryggmärgs axoner åtta veckor efter en enda låg dos av intraperitoneal injicerad antikropp 18.
Den neurala celladhesionsmolekyl (NCAM) är ett glykoprotein av immunoglobulin (Ig) super uttrycks på cellytan av neuroner, glia, skelettmuskel, och naturliga mördarceller 19-25. De tre stora NCAM isoformer benämnda NCAM180, NCAM140 och NCAM120, finns alternativa splitsvarianter av en primärt transkript som varierar bara i deras cytoplasmadomän. I CNS, är NCAM huvud polysialylated molekyl (> 95%) med långa, negativt laddade sialinsyra-homopolymerer. polysialinsyra encid med n> 10 kallas PSA men kortare oligomera strukturer finns som också är biologiskt relevant. Andra polysialylated proteiner som uttrycks i CNS är SynCAM1 26, Neuropilin-2 (NRP-2) 27,28 och en natriumkanal subenhet 25 (för granskning se 29).
De metoder som beskrivs här tillåter antigen identifiering av humana och mus immunoglobuliner som innehåller specifika kappa (Vk) lätta kedjor (VκI, VκIII eller VκIV lätta kedjor för humana antikroppar och VκI lätta kedjor för musantikroppar) oberoende av antikroppens isotyp (t.ex. IgG, IgM , IgA, IgD eller IgE). Denna begränsning bygger på användning av protein L agaros för immunoutfällningar med antikroppar av IgM-isotyp. Alternativa strategier kan inkludera mannosbindande lektiner och sekundära IgG anti-IgM-antikroppar kovalent kopplade till agarospärlor, som kan bredda tillämpningen av denna metod för att fler IgM-antikroppar including de med lambda (λ) lätta kedjor (se diskussion). Förhållanden av serum IgM VK lätta kedjor jämfört med IgM λ lätta kedjor härledda från friska individer är 1,5: 1 30.
Baserat på det kromatografiska metod som används för att separera, berika och immunologiskt detektera vissa molekyler 31 alla antigener måste innehålla åtminstone en liten proteindomän. Antikroppens specifika bindnings epitop kan vara inom eller utanför den proteindomän (t.ex. i glykoproteiner, lipoproteiner). Inledande biokemiska steg som används för att identifiera det specifika antigenet för HIgM12, respektive att begränsa listan över potentiella kandidater, är de mest avgörande stegen i denna metod. Cell typspecifika preparat och cellmorfologin baserade karakterisering beskrivs för gliaceller men denna metod kan extrapoleras för att rymma andra celltyper inom eller utanför CNS.
Det finns ett trängandebehöver utveckla nya eller ändrade metoder som tillämpas för det ökande antalet IgM-antikroppar med terapeutisk potential för olika mänskliga sjukdomar särskilt i de fall (majoriteten av IgM antigen) där antikropps mål är kolhydrat- eller lipid strukturer.
Mänskliga naturliga IgM autoantikroppar är tilltalande kandidater för immunterapier och har visat terapeutisk potential för behandling av olika sjukdomar, inklusive cancer och sjukdomar i centrala nervsystemet 1-7. Med fördel kommer dessa antikroppar inte framkalla ett immunsvar, i vilken genereringen av neutraliserande antikroppar reducerar väsentligt den effektiva terapeutiska dosen och effekt. Viktigare är att alla antikroppar med terapeutisk potential varit av IgM-isotyp och tillhör NAB repertoaren 3-5,8,9,37,40,42-45. Ett stort hinder för den potentiella kliniska användningen av IgM-antikroppar är identifieringen av deras antigener, vilka inte är fastställd i många fall. Standardtekniker används för IgG-antikroppar är ofta inte är tillämpliga för att identifiera en IgM antigen.
Detta protokoll beskriver identifieringen av PSA-NCAM som antigen för den regenerativa human IgM-antikropp HIgM12, effektivt i djurmodellerMS och ALS 15-18. Den metod som användes är i huvudsak tillämpas på alla humana antikroppar med specifika Vk lätta kedjor VκI, VκIII och VκIV och musantikroppar med VκI lätta kedjor, oberoende av antikroppens isotyp.
Det mest kritiska steget i detta protokoll är användningen av IgM-antikroppar vid affinitetskromatografi-applikationer. Närmare bestämt är framgångsrika antikroppar som krävs för att fungera som rullgardinsmedel i immunoprecipitationer att isolera eller för att berika ett antigen av komplexa vävnads- eller cellkultur lysat. Anrikade antigenfraktioner kan jämföras med immunoutfällningar från isotyp kontrollantikroppar och analyserades därefter för skillnader genom masspektrometri. Ett väsentligt krav eller begränsning av detta steg är förekomsten av den korrekta antikroppen Vk lätt kedja och värd (människa, mus) för att möjliggöra antikroppsbindning till protein L-agaros. Användning av mannanbindande protein bundet till agaros (också called mannosbindande lektin) i stället för protein L-agaros är ett potentiellt alternativ till immunoprecipitera IgM utan specifika VK-lätta kedjor. Men enligt uppgift från Arnold et al. 35, antigenbundna IgM-antikroppar inte binder till mannanbindande protein, som mål glykan verkar bli otillgängliga när IgM har bundits till dess antigen. Baserat på dessa upptäckter mannanbindande protein kan inte användas som en bindande matris för att immunoprecipitera antigen-laddade IgM-molekyler 35. Andra potentiella alternativ skulle kunna vara användningen av sekundära agaros bundna anti-IgM IgG-antikroppar 46,47 eller användning av ytaktiverade magnetiska kulor 48. IgG-antikroppar riktade mot IgM kan vara kemiskt tvärbundet till agaros A eller agaros G för att minska omfattningen av eluerad antikropp tillsammans med antigenet av intresse. En korrekt jämförelse mellan olika varianter av IgM immunoutfällning med avseende på framgångsrikt identifierade antigener iär svårt eftersom de flesta immunoprecipitationer utfördes för att isolera eller utarma IgM utan vidare intresse för sina antigener. Dessutom har immunoutfällningar använder IgM främst används för att bekräfta en redan känd eller förväntad enda antigen med antikropp exponering för renade antigener 49. En nackdel med agaros-kopplade IgG riktad mot humant IgM är ett mycket lågt utbyte (10 – 15%) av immunoutfällt serum-IgM-molekyler i jämförelse med utgångsmaterialet 50. Däremot var ytaktiverade magnetiska pärlor med framgång tillämpas på antikroppar av olika isotyper, inklusive IgM att immunoutfälla skrapie-associerade fibriller 48. Denna metod är inte begränsad till särskilda kappa (Vk) eller lambda (λ) kedjor eller en viss värd och kan väsentligt bredda spektrumet av IgM-antikroppar som används i immunoprecipitationer.
Ett annat viktigt steg i protokollet är antikroppens förmåga att fungera som en Detecting antikropp (primär antikropp) i Western blotting eller andra screening plattformar. Framgångsrika antikroppar måste rikta sina antigen med tillräckligt hög affinitet för att medge antigen bindning i närvaro av icke-joniska eller möjligen joniska rengöringsmedel. Antikroppar med hög affinitet är vanliga bland affinitets maturated IgG-antikroppar, men mindre vanligt bland antikroppar av IgM-isotyp, som är ett av skälen till att det finns relativt få kommersiellt tillgängliga IgM-antikroppar som detekterande medel i biokemiska inställningar. Högaffinitetsbindning av antikroppar är ett krav för immunoutfällningar av molekylära antigener och för Western blotting. Sänkning tvättmedelskoncentrationer eller total avsaknad av rengöringsmedel i IP buffertar och lys buffertar kan antigen inriktning på låg affinitet antikroppar via dess Fab-domänen. Däremot är antikroppens förmåga att målprotein L agaros via sin Fc-delen inte väsentligt påverkas bland isotypkontrollerna över en rad olika tvättmedels kontrationer. Men låg koncentration tvättmedel i lysbuffert och IP buffert förhindrar cellmembranet avbrott och isolering av specifika molekyler. På liknande sätt, en låg koncentration detergent i Western blot-tvättbuffertar (t.ex. PBS-T) medger antigenbindning av låg affinitet antikroppar men samtidigt ökar icke-specifik bindning och är därför inte ett alternativ.
Närvaron av ett antigen-protein kärnan är ett annat krav för den här metoden. Proteiner med posttranslationella modifieringar (t.ex., glykoproteiner, lipoproteiner) och omodifierade proteiner, men inte enda lipider eller kolhydrater, är detekterbara i Western blöts. Det är inte möjligt att immunoprecipitera lipider (t.ex. sfingolipider) från vävnad eller cellysat i närvaro eller frånvaro av detergenter. De fysikalisk-kemiska egenskaperna hos tvättmedel och lipider är alltför liknar tillåta selektiva lipid-antikropp interaktioner, medan samtidigt tvättmedel är avgörande för att störamembran i syfte att möjliggöra selektiv isolering av specifika molekyler. Såvitt vi vet, immunoutfällningar enbart består av kolhydrater, i avsaknad av en proteinkärna, inte tidigare har rapporterats. Detta blir särskilt relevant, eftersom IgM-antikroppar rikta ofta kolhydrater och glykolipider, som inte nödvändigtvis är kopplade till ett protein enhet. Andra kromatografiska tekniker behövs för separation och immunologisk identifiering av lipider och kolhydrater i frånvaro av en proteinkärna. Till exempel kan tunnskiktskromatografi (TLC) av cellulära lipider med efterföljande detektionsantikropp på TLC-platta (immun TLC) genomförs 51,52.
Andra anti-PSA-antikroppar har beskrivits i tidigare studier och resultat jämfört med HIgM12 samt den kommersiellt tillgängliga anti-PSA IgM (klon 2-2B). Det mest använda antikroppen inom området för PSA är en IgG-antikropp (klon 735) tillgängligt som mus monoclonal eller kanin polyklonal antikropp 53. Denna anti-PSA-IgG-antikropp upptäcker PSA på SynCAM och NCAM på olika CNS celltyper inklusive mikrogliaceller 41. I motsats till den anti-PSA-IgG-antikropp, humana IgM-antikroppar HIgM12, HIgM42 och anti-PSA-mus-IgM (klon 2-2B) är oförmögna att rikta PSA på SynCAM (men på NCAM) vid olika embryonala och första tiden efter födseln hos möss , medan icke-polysialylated SynCAM är lätt att upptäcka 15. IgM-antikroppar som används är inte heller kunna upptäcka PSA på mikrogliaceller (figurer 3 + 4). En möjlig förklaring till skillnaderna mellan antikroppsisotyper kan vara låga PSA-SynCAM nivåer jämfört med nivåer av PSA-NCAM i kombination med potentiellt lägre affinitet bindningen av IgM-antikroppar jämfört med anti-PSA-IgG. För att testa denna hypotes, genomförde vi immunoutfällningar i NCAM KO djur på fosterstadiet E17 med stora mängder SynCAM närvarande och används HIgM12 som en "pull-down agent" <sup> 15. I E17 WT kull kontroller HIgM12 immunutfälldes PSA-NCAM i en omfattning som visade liknande intensiteter av "dras ner" PSA-NCAM jämfört med IgM tung kedja såsom detekteras genom densitometri i efterföljande Western blöt med användning eluerade antigenerna. Detta resultat antydde åtminstone en tillräcklig affinitet HIgM12 till sitt mål PSA. Till skillnad från WT kull styr HIgM12 inte upptäcka PSA bifogas SynCAM i NCAM KO djur. Identiska resultat erhölls i immunoutfällningar med användning av den humana anti-PSA IgM HIgM42. HIgM12 och HIgM42, samt mus-anti-PSA IgM (klon 2-2B) kunde inte rikta PSA på SynCAM i Western blöts från WT och NCAM KO djur på embryonala och postnatal utvecklingsstadier. Med tanke på den låga mängden HIgM12 krävs (0,1 | j, g / ml) för att specifikt detektera PSA fäst NCAM i Western blöt med användning av små mängder av CNS-vävnad (0,1 | j, g CNS-vävnad per brunn) 15 den verkar vara osannolikt att låga affiniteter ensamma äransvarig för total avsaknad av PSA-SynCAM upptäckt av HIgM12 i tre olika metoder.
Vi drar slutsatsen att det finns betydande skillnader mellan anti-PSA-IgM-antikroppar och ofta publicerade anti-PSA-IgG-antikropp (klon 735). Det är inte klart varför kommersiellt tillgängliga anti-PSA IgM-antikroppar inte användas oftare i det förflutna för att bekräfta resultat som erhållits med antiPSA IgG-antikropp 735. Detta är särskilt intressant eftersom HIgM12 redan har bevisad effekt i olika sjukdomsmodeller. Medan andra anti-PSA IgM-antikroppar kan ha liknande terapeutiska effekter är det fortfarande oklart om den anti-PSA-IgG-antikropp (klon 735) har en liknande terapeutisk resultatet i modeller av MS och ALS.
I korthet var metoder som beskrivs här i första hand användas för att identifiera antigenet av de regenerativa HIgM12 humana antikropp för att stödja potentiella kliniska prövningar för MS och eventuellt andra neurodegenerativa sjukdomar. Identifieringen av antigens för antikroppar med biologisk aktivitet är lika viktigt steg för att förstå deras verkningsmekanism. Detta blir särskilt relevant i samband med ett stort antal monoklonala antikroppar för närvarande testas för säkerhet och effekt i mänskliga prov. Medan antalet av kliniskt testade IgM-antikroppar som hittills är liten, senaste framstegen inom hybridomteknologi tillsammans med ett ökande antal studier som belyser den terapeutiska potentialen av denna antikroppsklass 1-10,37,40,42-45 uppmanar utvecklingen av nya eller modifierade metoder som tillämpas för att identifiera icke-protein IgM antigen.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health (R01 GM092993, R01 NS048357 och R21 NS073684), National Science Foundation (KARRIÄR Award), Minnesota Partnership Award för bioteknik och medicinteknik Genomics, National Multiple Sclerosis Society (CA1060A) , och Mayo Clinic centrum för klinisk och Translationell Science (CCaTS). Författarna erkänner stöd från Applebaum, Hilton, Peterson och Sanford stiftelser, månen och Marilyn Park Styrelseuppdrag fonden och McNeilus familjen.
DMEM | Fisher Scientific | MT-10-013-CVRF | HIGH GLUCOSE, with glutamine, with sodium pyruvate, 500 ml |
DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml, L-glutamine, sodium pyruvate, high glucose |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/mL, 100 ml |
N-2 Supplement (100X) | Life Technologies | 17502-048 | 5 ml |
B-27 Supplement (50X) | Life Technologies | 17504-044 | serum free, 10 ml |
Fetal Bovine Serum – Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | 500 ml |
STERILE WATER FOR IRRIGATION | Baxter Healthcare | #2F7114 | USP-1000 ml, 12/CA |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7886-50MG | D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys · xHBr, Molecular Weight 30,000-70,000 g/mol, 50 mg |
bovine serum albumin fraction V | Sigma | A-3294-100G | heat shock fraction, protease free, pH 7, purity 98%, 100 g |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767-500G | C6H12O6, Molecular Weight: 180.16 g/mol, ACS reagent, 500 g |
Trypsin from bovine pancreas | Sigma | T9935-100mg | essentially salt-free, lyophilized powder, =9,000 BAEE units/mg protein, |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025-150KU | Type IV, lyophilized powder, =2,000 Kunitz units/mg protein |
Recombinant Rat FGF basic Protein | R&D systems | 3339-FB-025 | BSA as a carrier protein, 25 ug, lyophilized, >95%, 16.2 kDa |
Recombinant Rat PDGF-AA Protein | R&D systems | 1055-AA-50 | carrier free, 50 ug, lypphilized, >97%, E.coli-derived, 12.5 kDa |
Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | 500 ml, No Glutamine, No Aspartic Acid, No Glutamic Acid |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | crystalline, 1 kg, reagent grade, Molecular Weight 30.03 g/mol (as monomer) |
Tris[hydroxymethyl]aminomethane (Tris bas | Biorad | #1610719 | 1 kg, 99.8% pure, powder |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Biorad | #1610302 | 1 kg, powder |
Glycine | Fisher Scientific | BP-381-5 | C2H5NO2, Molecular weight: 75.07 g/mol, White crystalline Powder, 5 kg |
Sodium chloride | Sigma | S7653-5KG | NaCl, Molecular Weight: 58.44 g/mol, 5 kg |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751-500G | NaH2PO4, Molecular Weight: 119.98 g/mol, 500 g |
Phosphate-buffered Solution 1X (PBS) | Cellgro | MT-21-040-CV | Without Calcium and Magnesium, 6 x 500 ml |
Falcon 60mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning Life Sciences | #353002 | 60 mm Cell Culture Dish, TC-treated polystyrene, 20/pack, sterile |
Falcon 60 mm x 15 mm Petri dish | Corning Life Sciences | #351007 | Not TC-Treated Bacteriological Petri Dish, 20/Pack |
6 well cell culture plates | Corning Costar | CLS3516 | 6 well, flat bottom (Individually wrapped), gamma-irradiated, growth area 9.5 c |
75cm² tissue culture flask | Corning Life Sciences | 430720U | 75cm² U-Shaped Canted Neck Cell Culture Flask with Plug Seal Cap |
Pierce™ Protein L Plus Agarose | ThermoFisher Scientific | #20520 | 2 ml, crosslinked 6% beaded agarose (CL-6B), binding capacity: 10 to 20 mg IgG |
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Biorad | 456-1094 | 10-well, 50 µl, for use with Mini-PROTEAN electrophoresis cells |
Immobilon-P Membrane | Millipore | IPVH00010 | PVDF, 0.45 µm, 26.5 cm x 3.75 m roll |
Anti-Polysialic Acid-NCAM Antibody, clone | Millipore | MAB5324 | 50 microliters, Host: mouse, monoclonal IgM |
XT sample buffer (Western blot) | Biorad | #1610791 | 10 ml, 4 x premixed protein sample buffer |
2-mercaptoethanol | Biorad | #1610710 | 25 ml, 98 % pure, 14.2 M |
Endoneuraminidase-N (Endo-N) | ABC Scientific | ABC0020 | 50 microliters, 200 µg/ml, 3500 U/mg |
25 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circles No. 1; Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 25mm |
HEPES buffer solution | ThermoFisher Scientific | 15630-080 | 100 ml, 1M |
Hanks' Balanced Salt Solution 1X (HBSS) | Cellgro | MT-21-022-CV | 500 ml, without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
Papain | Worthington Biochemical Cooperation | LS003119 | lyophilized powder, 100 mg |
Magnesiumsulfate | Sigma | M-2643-500G | powder, 500 g |
L-Glutamine | Gibco | #25030-081 | 100 ml, 200 mM |