Summary
As células que crescem num ambiente tridimensional (3-D) representam uma melhoria significativa sobre o cultivo de células em ambientes 2-D (por exemplo, frascos ou pratos). Aqui nós descrevemos o desenvolvimento de um modelo organot�ica 3-D multicelular da mucosa intestinal humana cultivadas sob microgravidade fornecida pela rotação da parede dos vasos biorreatores (RWV).
Abstract
Como as células que crescem em um ambiente tridimensional (3-D) têm o potencial para preencher muitas lacunas de cultivo celular em ambientes 2-D (ex., Frascos ou pratos). Na verdade, é amplamente reconhecido que as células crescidas em frascos ou pratos tendem a des-diferenciar-se e perder características especializadas dos tecidos a partir dos quais eles foram obtidos. Actualmente, existem essencialmente dois tipos de sistemas de cultura de 3-D, onde as células são semeadas em andaimes que imitam a matriz extracelular nativa (ECM): (a) modelos estáticos e modelos (b) utilizando biorreactores. O primeiro avanço foi a modelos estáticos em 3-D. modelos 3-D usando biorreatores como a parede do vaso rotativo (RWV) biorreatores são um desenvolvimento mais recente. O conceito original dos biorreatores RWV foi desenvolvido no Centro Espacial Johnson da NASA no início de 1990 e é acreditado para superar as limitações dos modelos estáticos, tais como o desenvolvimento de hipóxia, núcleos necróticos. Os biorreatores RWV pode contornar thé problema proporcionando dinâmica dos fluidos, que permitem a difusão eficiente de nutrientes e de oxigénio. Estes biorreatores consistem em uma base rotador que serve para apoiar e girar dois formatos diferentes de recipientes de cultura que diferem pelo seu tipo de fonte de aeração: (1) lenta ficar vasos laterais (STLVs) com um oxigenador de co-axial no centro, ou (2 ) Os navios de elevado coeficiente (HARVs) com oxigenação através de uma membrana de transferência de gás de borracha de silicone plana. Estes navios permitir a transferência de gás eficiente, evitando a formação de bolhas e consequente turbulência. Estas condições resultam em fluxo laminar e força de cisalhamento mínima que os modelos reduzida gravidade (microgravidade) no interior do recipiente de cultura. Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um modelo organotípico 3-D multicelular da mucosa intestinal humana composta por uma linha de célula epitelial intestinal e linfócitos humanos primários, células endoteliais e fibroblastos cultivados sob microgravidade fornecida por o bioreactor RWV. </ P>
Introduction
O primeiro avanço na construção de um modelo 3-D foi relatado no início de 1980, quando os cientistas começaram a investigar diferentes tipos de andaime (por exemplo., Laminina, colágeno tipo I, colágeno IV e fibronectina) e cocktails de fatores de crescimento para melhorar célula-célula e interacções ECM de modelos 3-D "estáticos" 1-7. Desde então, o problema principal com estes modelos tem sido limitações na transferência de nutrientes e de oxigénio dentro das construções de médio e de tecido 8. Em contraste com as células no ambiente in vivo que recebe um fluxo constante de nutrientes e de oxigénio a partir de redes em torno dos vasos sanguíneos, a natureza estática destes modelos dificulta a distribuição eficaz deles para as células. Por exemplo, os agregados celulares gerados em modelos in vitro estáticos que excedem alguns milímetros de tamanho irá invariavelmente desenvolver hipóxicas, centros necróticos 9. Os biorreatores RWV pode contornar este problemafornecendo a dinâmica dos fluidos, que permitem a difusão eficiente de nutrientes e oxigénio 10-12. No entanto, até à data, os trabalhos utilizando biorreactores RWV têm sido limitados à inclusão de um ou dois tipos de células 13-17. Além disso, em vez de uma orientação espacial semelhante a tecidos nativos, as células formaram agregados celulares. A principal razão para estas limitações tem sido a falta de uma estrutura de suporte capaz de incorporar células de uma forma integrada. Os andaimes utilizados nos biorreatores RWV até à data consistem, com poucas exceções 16-18, principalmente de microesferas sintéticas, cilindros tubulares ou pequenas folhas 13-15,19-23. Estes são materiais rígidos e cuja composição de flexibilidade não pode ser manipulado, e para a qual as células são ligadas à sua superfície. Assim, é improvável que estes modelos irá proporcionar um sistema no qual a avaliar, de uma forma integrada, os vários componentes celulares, tais como células do estroma (por ex., F ibroblastos, células do sistema imunológico e endoteliais) que should ser disperso dentro do andaime para imitar de perto o tecido humano.
Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um modelo organotípico 3-D multicelular da mucosa intestinal humana composta por uma linha de célula epitelial intestinal e linfócitos humanos primários, células endoteliais, fibroblastos e 24. Estas células foram cultivadas sob microgravidade fornecer pelo biorreator RWV 13,25-30. No nosso modelo 3-D, o ECM possui muitas propriedades distintas, tais como uma osmolalidade semelhante ao meio de cultura (por ex., Sistemas de retenção de difusão insignificante durante a cultura) e a capacidade de incorporar células e outras proteínas da matriz extracelular relevantes, bem como a rigidez adequada para ser utilizada em biorreactores de 24. Os sistemas biológicos são muito complexos, e ao longo dos últimos anos, tem havido uma mudança no foco da pesquisa da mucosa para o exame de interacções de células com o meio envolvente, em vez de estudá-los no isolation. Em particular, a importância das interacções célula-célula em influenciar a sobrevivência das células do intestino e a diferenciação está bem documentada 31-34. Especificamente, a comunicação entre as células epiteliais e os seus nicho tem uma profunda influência sobre a expansão de células epiteliais e diferenciação 35. Com efeito, é amplamente aceite que não só a célula-célula mas também as interacções célula-ECM são essenciais para a manutenção e diferenciação de células epiteliais em modelos de cultura de 3-D. Estudos anteriores demonstraram que as proteínas de ECM intestino, tais como colagénio I 24,36,37, laminina e fibronectina 38 39 são instrumentais em influenciar células epiteliais intestinais para adquirir orientação espacial semelhante à mucosa nativa. Assim, o desenvolvimento de novas tecnologias, como o nosso modelo 3-D 24, que pode imitar a diversidade é necessária fenotípica do intestino se pesquisadores pretendem recriar a arquitectura celular e estrutural complexoe função do microambiente intestinal. Esses modelos representam uma ferramenta importante no desenvolvimento e avaliação de novos medicamentos orais e vacinas candidatas.
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Protocol
Declaração de ética: Todas as amostras de sangue foram coletadas de voluntários que participaram no número de protocolo HP-00040025-1. A Universidade de Maryland Institutional Review Board aprovou este protocolo e autorizou a coleta de amostras de sangue de voluntários saudáveis para os estudos incluídos neste manuscrito. O objetivo deste estudo foi explicado aos voluntários, e todos os voluntários deram informados, assinaram termo de consentimento antes da coleta de sangue.
Nota: Veja a Tabela 1 para a preparação suplemento de meio. Ver Tabela 2 para a preparação de meios de cultura a 3-D.
1. Preparação de recipientes de cultura
- Desapertar a tampa da porta de enchimento do ml-embarcação 50 e preencha com 50 ml de meio de cultura estéril (por exemplo., RPMI). Efectuar todos os procedimentos sob condições estéreis em uma capa laminar.
- Coloque a tampa e limpe qualquer meio derramado em qualquer superfície com etanol 70%.
- Autorizará a embarcação a incubcomeu durante pelo menos 15 min a O / N à temperatura ambiente.
- Utilizar a porta de enchimento de se desfazer o meio de cultura e adicionar 30 ml de meio de cultura 3-D.
- Limpe qualquer meio derramado em qualquer superfície com etanol 70%.
2. Preparação das Células
- Linhagem humana de células epiteliais (HCT-8) 24,40.
- Células de cultura em meio RPMI suplementado com 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 50 ng / ml de gentamicina, 2 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, HEPES a 10 mM de tampão e soro fetal de bovino inactivado pelo calor a 10% (FBS ) (suplemento 1). A 70% de confluência, as células de divisão em uma proporção de 1: 5.
- Fibroblastos humanos (células do cólon CCD-18Co) 24,41.
- Células de cultura em meio de Basal de Eagle enriquecido com suplemento de 1 em confluência, as células de divisão em uma proporção de 1: 3..
- Veia Umbilical Humana Células endoteliais (HUVEC)
- Células de cultura em Meio Basal Endotelial (EBM) meio enriquecido com 100 ug / ml de heparina, 3 ug / ml de Suplemento de Crescimento de Células Endoteliais (ECGS), e Suplemento 1 a 70% de confluência, as células de divisão em uma proporção de 1:. 2.
- Isolar células mononucleares do sangue periférico (PBMC) a partir do sangue por centrifugação com gradiente de densidade usando técnicas padrão 43.
- Resumidamente, utilizando uma pipeta de 10 ml-, adicionar cuidadosamente 30 ml de sangue diluído (1: 1 sangue: Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS)) para um tubo de 50 mL cónico contendo 10 ml de meio de centrifugação de densidade. Após o passo de centrifugação, linfócitos e monócitos vai residir no "branco" camada entre os meios de centrifugação de densidade e camadas de plasma.
- Recolher a camada de branco, utilizando uma pipeta de transferência. Evitar contaminação de granulócitos através da limitação da recolha de meios de centrifugação de densidade. Depois de lavar 43, uSE PBMC como é ou criopreservadas em N2 líquido.
Nota: É importante destacar que consiste em grande parte de PBMC de linfócitos e monócitos, com uma pequena proporção de células dendríticas e outros tipos de células.
3. Preparação de células de colágeno-incorporados
- Determinar o número de inserções necessário, com base no número de condições experimentais para ser ajustado para cima. Coloque o número apropriado de inserções para os poços de uma placa de 6 poços.
- Prepara-se uma suspensão de fibroblastos e HUVEC:
- Lavam-se as frascos de duas vezes em PBS e separar as células usando tripsina, 0,25% (1x), com etilenodiaminotetra-acetato 0,05% de tripsina-tetrassódico (tripsina-EDTA). Adicionar uma solução de tripsina suficiente para cobrir a totalidade da área da superfície da cultura de células. Descolamento geralmente ocorre dentro de 5 a 15 min
- coletarcélulas isoladas em um tubo de 50 ml contendo 30 ml de meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) e 30% de FBS médio.
- Centrifuga-se o tubo a 500 xg durante 10 min.
- Ressuspender as células em 30 ml de DMEM-30% FBS forma.
- Contar o número total de células viáveis por diluição de 20 ul das células ressuspensas com 20 ul de tripano de corante azul. Carregar o hemocitómetro com a mistura de células. PBMC viáveis será branco claro; inviável PBMC irá adquirir o corante e tornar-se azul.
- Ressuspender cada tipo de células em DMEM-FBS a 30% meio a uma concentração de 5 - 8 x 10 7 células ml - 1.
- Preparar géis de colagénio contendo células
Nota: Cada vaso irá requerer a preparação de ~ 5 ml de gel de colagénio contendo as células.- Num tubo de 50 mL cónico-se preparar a mistura de colagénio por adição de 1 x meios DMEM suplementado com 50 ug / ml de gentamicina, 2 mM de L-glutamina e 10% de calor-inactivatEd FBS mais 3 mg / ml de colagénio bovino-I, 10 ug / laminina ml, 40 ug / mL de colagénio IV, 10 ug / mL de fibronectina, de 2 ug / ml de proteoglicano de sulfato de heparina e de NaOH a 15 mM (para atingir o pH fisiológico).
- Fechar o tubo e misturar por inversão do várias vezes até que a mistura está completamente homogeneizada. Evitar a formação de bolhas.
IMPORTANTE: Mantenha a mistura em gelo para evitar gelificação.- Passo crítico: Se a mistura desenvolve uma aparência ácida (cor amarelada), adição de algumas gotas de NaOH 1 N estéril para neutralizar a mistura.
- Adicionar HUVEC e concentrada fibroblastos a uma densidade de 1,0 - 1,2 e 1,5 - 2,0 x 10 6 células / ml, respectivamente para o colagénio-mistura enriquecida (descrito acima). Feche os tubos e misturar por inversão do várias vezes até que a mistura está completamente homogeneizada. Evitar a formação de bolhas. IMPORTANTE: Mantenha a mistura em gelo para evitar gelificação.
- Adicionar 4 - 5 ml de colagénio contendo célulasgel para cada inserção, previamente carregado dentro de um poço de placa 6, e deixou-se gelify na capa com pouco ou nenhum movimento, durante 1 h.
- Após 1 h, transferir a placa de 6 poços a uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2 durante 1 - 2 horas adicionais.
- Retorno da placa de 6 poços para a capa, e com a ajuda de um fórceps estéril assepticamente e bisturi de corte da membrana a partir da inserção de retirar o gel contendo as células a partir da membrana. Corte o gel destacada em pequenos quadrados (~ 5 x 5 mm).
- Adicionar os pequenos quadrados contendo as células em uma HARV 50-ml com a porta de enchimento.
- Prepara-se uma suspensão de 8 HCT-células epiteliais:
- Lavam-se as frascos de duas vezes em PBS e separar as células usando tripsina, 0,25% (1x), com tratamento com tripsina-EDTA. Adicionar uma solução de tripsina suficiente para cobrir a totalidade da área da superfície da cultura de células. Descolamento geralmente ocorre dentro de 10 a 15 min.
- Recolher as células isoladas em 30 mL de DMEM-30% FBS forma.
- CentrifUGE meio com FBS a 30% de DMEM-tubo contendo a 500 xg durante 10 min.
- Ressuspender as células em 30 ml de DMEM-30% FBS forma.
- Contar o número total de células viáveis como descrito em 3.2.5.
- Ressuspender as células epiteliais HCT-8 em DMEM-FBS a 30% no meio de uma concentração de 10 células 7 ml - 1.
- Adicionar 1 ml das células epiteliais HCT-8 concentrado em 50 ml HARV usando a porta de enchimento.
- Ao utilizar a porta de enchimento, adicionar meio de cultura adicional 3-D até que o recipiente está quase cheio (~ 20 ml).
- Coloque a tampa e limpe a borda do orifício de enchimento com 70% de etanol.
- Coloque uma seringa em cada porto de seringa da RWV: coloque uma seringa ml 5 contendo 3-4 ml de meio de cultura 3-D em um porto e uma seringa de 5 ml vazio na outra porta.
- Remover quaisquer bolhas visíveis puxando para a seringa vazia, enquanto aproximadamente o mesmo volume de meio é injectado através do outro orifício de seringa.
- Coloque os vessels no biorreator, ligue a alimentação e defina a velocidade para cerca de 13 a 14 rotações por minuto.
Nota: passo crítico: velocidade de rotação pode necessitar de ser ajustado várias vezes durante uma experiência para manter as células que orbitam no interior do vaso, evitando assim o contacto com as paredes dos vasos. - Células de cultura a 37 ° C, 5% de CO 2 sob microgravidade, fornecidos pelo biorreator RWV.
- meio de cultura mudam a cada 3 - 4 dias, substituindo cerca de 30 ml com meio de cultura 3-D fresco.
- Após 4 dias (± 1 dia), remova os navios do biorreator e adicionar linfócitos / monócitos aos vasos (2 x 10 7 / vaso).
- Colocar os vasos de volta no bioreactor a 37 ° C, 5% de CO 2 durante um adicional de 5 dias (± 1 dia).
- Após os 5 dias adicionais (dia 9 da cultura), adicionar linfócitos / monócitos aos vasos (2 x 10 7 / vaso) e continuar as culturas para até 12 dias adicionais. meio de cultura mudam a cada 3 - 4 dias, substituindo cerca de 30 ml com meio de cultura 3-D fresco.
4. Colheita 3-D Culturas para Histologia
- Com o auxílio de uma pipeta de transferência de colheita de cada fragmento de gel pequeno, agora chamado "construção", numa placa de seis poços contendo 10 ml de tampão de formalina a 10%. Deixar durante 3 h à TA ou a 12 - 16 h a 4 ° C.
- Prepare o processamento de tecidos e cassetes de incorporação, rotulando e adicionando dois pedaços de almofadas de espuma biópsia em cada cassete.
- Mergulhar as cassetes em tampão de formalina a 10%.
- Com o auxílio de uma pinça colocar as construções-fixas entre as duas almofadas de espuma.
- Mergulhar as cassetes em tampão de formalina a 10%.
- Prosseguir com os procedimentos padrão para a incorporação, corte e coloração 44.
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Representative Results
Anteriormente temos manipulado um modelo organotípico 3-D multicelular da mucosa intestinal humana composta por uma linha de célula epitelial intestinal e linfócitos humanos primários, células endoteliais e fibroblastos cultivados sob condições de microgravidade 24 (Figura 1). Os fibroblastos e as células endoteliais foram embebidos numa matriz de colagénio I enriquecido com proteínas de membrana basal intestino adicional 45 (isto é., Laminina, colagénio IV, fibronectina e proteoglicano sulfato de heparina) e adicionou-se RWV biorreactores. Depois de 10 - 15 dias, a análise de coloração histológica demonstrou a presença de estruturas de vilo-como nas construções. Aproximadamente 60 - 80% destas células epiteliais foram organizados como uma monocamada de células polarizadas com os seus núcleos situados numa posição basal perto do ECM, que é uma característica importante das células bem diferenciadas (Figura 2).
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Figura 1: Diagrama da construção do modelo 3-D. Quatro passos são necessários para construir o sistema 3-D. Em primeiro lugar, para obter o número desejado de células para gerar o modelo 3-D, uma linha de células de enterócitos do intestino humano epitelial (HCT-8) e as células endoteliais humanas primárias e fibroblastos são crescidas como monocamadas confluentes em 2-D. Em segundo lugar, o ECM composto de colagénio-I enriquecido com matriz de proteínas de membrana basal intestino adicional (isto é., Laminina, colagénio IV, f ibronectina e proteoglicano de sulfato de heparina) é preparado. Em terceiro lugar, os fibroblastos e as células endoteliais são incorporados numa mistura de colagénio-I e adicionado a RWV biorreactores seguido pela HCT-8 células epiteliais adição. Em quarto lugar, linfócitos primários são adicionados à cultura nos dias 4 e 9 (± 1 dia)."> Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Comparação entre a normal Intestino humano e os modelos organot�icas. Hematoxilina e eosina de células cultivadas no modelo de microgravidade 3-D: tecidos foram coradas roxo e scaffold manchado rosa. As células do modelo 3-D foram cultivadas durante 14 ( "a" e "b") e 20 dias (C). Vinte dias após a semeadura, número total de células são mantidas, e as células foram características das vilosidades-como mostrar bem diferenciados. As imagens são exibidas em 100X ( "a" e "b") e 40X ( "c") ampliação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome do Produto | Pkg. Tamanho | Reconstituição | concentração de trabalho | Armazenamento |
| Fibroblastos Factor de Crescimento-básico (bFGF) | 25 mg | Para preparar as soluções de estoque / ml 25 mg; adicionar 25? g de FGF em 1 ml de meio estéril (RPMI mais FCS a 1%), agitar para dissolver, adiciona-se 100? l / aliquota | 5 ng / ml | -20 pó ° C, alíquotas de trabalho -20 ° C, evitar a repetição de congelamento / descongelamento |
| Factor de células estaminais (SCF) | 10 mg | Para preparar as soluções de estoque / ml 10 mg; adicionam-se 10 ug de SCF em 1 ml de meio estéril (RPMI mais FCS a 1%), agitar para dissolver, adicionar 250? l / aliquota | 5 ng / ml | -20 pó ° C, alíquotas de trabalho -20 ° C, evitar a repetição de congelamento / descongelamento |
| Factor de crescimento de hepatócitos (HGF) | 5 mg | Para preparar as soluções de estoque / ml 5 mg; adicionam-se 5 ug de HGF em 1 ml de meio estéril (RPMI mais FCS a 1%), agitar para dissolver, adicionar 200? l / aliquota | 2 ng / mL | -20 pó ° C, alíquotas de trabalho -20 ° C, evitar a repetição de congelamento / descongelamento |
| endotelina 3 | 50 mg | Para preparar as soluções de estoque / ml 50 mg; adicionar 50? g de endotelina em 1 ml de meio estéril (RPMI mais FCS a 1%), agitar para dissolver, adiciona-se 100? l / aliquota | 10 ng / mL | -20 pó ° C, alíquotas de trabalho -20 ° C, evitar a repetição de congelamento / descongelamento |
| laminina | 1 mg | Descongelar lentamente a 2 - 8 ° C, redemoinho e adicionar 100 ul / aliquota | 10 mg / ml | líquido -20 o C, trabalhando alíquotas de -20 ° C, evitar a repetição freeze / descongelamento |
| Factor de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) | 10 mg | Para preparar as soluções de estoque / ml 5 mg; adicionam-se 10 ^ g de VEGF em 2 ml de água estéril, agitar para dissolver, adicionar 100? l / aliquota | 1 ng / mL | -20 pó ° C, alíquotas de trabalho -20 ° C, evitar a repetição de congelamento / descongelamento |
| Factor inibidor de leucemia (LIF) | 50 mg | Para preparar as soluções de estoque / ml 20 mg; adicionar 50? g de LIF em 2,5 ml de água estéril, agitar para dissolver, adicionar 100? l / aliquota | 4 ng / mL | -20 pó ° C, alíquotas de trabalho -20 ° C, evitar a repetição de congelamento / descongelamento |
| adenina | 25 g | Para preparar solução de 0,18 M; adicionar 121,5 mg og adedine em 50 ml de HCl 0,05 M (250 ul de HCl a 37,1% em 50 mL de água)), agitar para dissolver, filtrar e esterilizaradicionar 1 ml / aliquota | 1,8 x 10 -3 M | pó de 4 ° C, alíquotas de trabalho -20 ° C, evitar a repetição de congelamento / descongelamento |
| Insulina | 50 mg | Para preparar 5 mg solução estoque / ml; adicionar 50 mg de insulina em 10 mL de HCl 0,005 M (5 mL de HCl a 37,1% em 10 ml de água)), agitar para dissolver, filtro de esterilizar e adicionar 0,5 ml / aliquota | 5 mg / ml | -20 pó ° C, alíquotas de trabalho -20 ° C, evitar a repetição de congelamento / descongelamento |
| T3 | 100 mg | Para preparar 2 x 10 -8 solução stock M; adicionar 3,4 mg de T3 em 25 mL de NaOH 1 M, dilui-se 0,1 ml desta solução em 9,9 ml de PBS, dilui-se novamente 0,1 ml desta solução em 9,9 ml de PBS, agitar para dissolver, filtro de esterilizar e adicionar 0,5 ml / aliquota | 2 x 10 -11 M | pó de -20 o C, alíquotas de trabalho -20 <sup> o C, evitar a repetição de congelamento / descongelamento |
| toxina da cólera | 5 mg | Para preparar 10 -7 solução de M; adicionar 5 mg de toxina da cólera em 5 ml DDH estéril 2 O (loja em C -20 o); diluir 50 ul desta solução em 5 ml DDH 2 O, agite para homogeneizar, esterilizar filtro e adicione 0,5 ml / aliquota | 10 -10 M | pó 4-8 o C, alíquotas de trabalho -20 ° C, evitar a repetição de congelamento / descongelamento |
| fibronectina | 1 mg | Para preparar 1 mg solução estoque / ml; adicionar 1 mg de fibronectina em 1 ml de água destilada estéril. Permitir 30 min. para o material para entrar em solução. NÃO agitar ou um redemoinho. Adicione 100 ^ l / aliquota | 10 mg / ml | pó 4-8 o C, alíquotas de trabalho -20 ° C, evitar a repetição de congelamento / descongelamento |
| apo-transferrina | 100 mg Para preparar 5 mg solução estoque / ml (1.000 vezes); adiciona-se 100 mg de transferrina em 20 ml de PBS, agitar para dissolver, filtro de esterilizar e adicionar 0,5 ml / aliquota | 5 mg / ml | -20 pó ° C, alíquotas de trabalho -20 ° C, evitar a repetição de congelamento / descongelamento | |
| heparina | 50 KU | Para preparar 50 mg solução estoque / ml (1.000 vezes); adicionar 50 mg de heparina em 1 ml de água para dissolver redemoinho, filtro de esterilizar e adicionar 1 ml / aliquota | 0,1 mg / mL | -20 pó ° C, alíquotas de trabalho -20 ° C, evitar a repetição de congelamento / descongelamento |
| proteoglicano de sulfato de heparano | 1 mg | Para preparar a 0,1 mg / ml solução estoque; adicionar 1 mg de sulfato de heparano em 10 ml de água estéril redemoinho para dissolver, e adicionar 0,2 ml / aliquota | 2 mg / ml | pó de -20 o C, alíquotas de trabalho -20 ° C, eviterepetição de congelamento / descongelamento |
| colágeno IV | 5 mg | Para preparar a 2 mg / ml solutin estoque: adiciona-se 2 mg de colagénio V em 2,5 ml de ácido acético a 0,25% estéril. Permitir 1-2 horas para o material para ir para a solução do redemoinho por melhor dillution.. Adicione 400 ^ l / aliquota | 80 mg / ml | -20 pó ° C, alíquotas de trabalho -20 ° C, evitar a repetição de congelamento / descongelamento |
Tabela 1: Definido suplemento de meio Preparação.
| F-12 suplementado com | |||
| Reagente | Solução stock | Solução final | Quantidade |
| soro fetal de vitelo | 10% | 50 ml | |
| piruvato de sódio | 100 mM | 1 mM | 5 ml |
| L-Glutamina | 200 mM | 2 mM | 5 ml |
| Hepes | 1 H | 10 mM | 5 ml |
| gentamicina | 50 mg / ml | 50 ug / ml | 500 ul |
| Penicilina / estreptomicina | 10.000 U / ml / 10 mg / ml | 100 U / mL / 100 ug / ml | 5 ml |
| Insulina | 5 mg / ml | 5 ug / ml | 500 ul |
| T3 | 2 x 10-8 M | 2 x 10 -11 M | 500 ul |
| adenina | 1,8 x 10-1 M | 1,8 x 10-3 M | 5 ml |
| transferrina | 5 ug / ml | 500 ul | |
| heparina | 50 mg / ml | 0,1 mg / mL | 1 mL |
| ECGS | 3 mg / ml | 3 ug / ml | 5 ml |
| bFGF | 25 ug / ml | 5 ng / ml | 100 ul |
| SCF | 10 ug / ml | 5 ng / ml | 250 ul |
| HGF | 5 ug / ml | 2 ng / mL | 200 ul |
| endotelina 3 | 50 ug / ml | 10 ng / mL | 200 ul |
| LIF | 20 ug / ml | 4 ng / mL | 100 ul |
| VEGF | 5 ug / ml | 1 ng / mL | 100 ul |
| toxina Choleran | 10 -7 M | 10 -10 M | 500 ul </ Td> |
| Nota: A quantidade acima citada é para a preparação de 500 ml de 3-D do meio de cultura. A mídia deve ser armazenado a 4 ° C durante não mais de 2 semanas | |||
Tabela 2: Preparação de 3-D Meios de Cultura.
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Discussion
Neste artigo, descreve-se o desenvolvimento de um modelo de bioengenharia da mucosa intestinal humana composta de múltiplos tipos de células incluindo linfócitos primários humanos, fibroblastos e células endoteliais, bem como linhas de células epiteliais intestinais 24. Neste modelo 3-D, as células são cultivadas numa matriz extracelular rica em colagénio em condições de microgravidade 24.
Como descrito anteriormente, as principais características deste modelo são: (i) a capacidade de imitar a organização monocamada tecido epitelial, (ii) a indução de polaridade apropriada de células epiteliais, junções apertadas, desmossomas e microvilosidades, (iii) um longo cultura prazo (até 20 dias) com alta viabilidade das células primárias (por exemplo., células endoteliais e fibroblastos), (iv) a expressão dos marcadores de diferenciação dos tecidos do tipo incluindo vilina, citoqueratina, e-caderina e muCIN, (v) a capacidade de produzir quantidades consideráveis de citocinas (por exemplo., IL-8) e da fosfatase alcalina após estimulação antigénica, (vi) o transporte de nutrientes tais como glucose (isto é., a expressão de dissacaridases, e na presença de açúcar transportadores), e (vii) a diferenciação de várias linhagens de células epiteliais intestinais (ie., enterócito absorção, globet e células M 24).
É importante destacar que, para alcançar resultados reprodutíveis usando nosso modelo 3-D o investigador deve aderir a boas orientações de cultura celular 46-48. É crucial para as células de viabilidade, contaminação por micoplasma, mudanças no comportamento crescimento celular controlar sistematicamente. Se for identificado um problema, primeiro verifique se há alterações não autorizadas foram introduzidas para o protocolo. Se o problema persistir, mude para um novo lote de vários componentes médios (incluindo soro) e /ou células. Uma limitação do nosso modelo 3-D é o uso da linha celular epitelial HCT-8 tumorigénico. No entanto, é importante ter em conta que a presença de HCT-8 linha oferece a vantagem de estar disponível comercialmente. Além disso, essas células epiteliais não expressam antígeno leucocitário humano seja clássica ou não clássica (HLA) de classe I moléculas 49,50. Assim, eles permitem que a cultura de células epiteliais com PBMC de diferente HLA-classe I haplótipos na ausência de células epiteliais alloreactivity-PBMC. Além disso, ao comparar este sistema com sistemas como a célula-tronco intestino Organóides 51-53, este modelo oferece muitos benefícios. Embora Organóides células-tronco intestino fornecer informações valiosas sobre a biologia celular e diferenciação intestinal 51-53, este modelo permite a exposição apical direta com nutrientes, drogas e agentes patogênicos. Este modelo também proporciona fácil acesso ao conteúdo luminal peptídeos e citocinas anti-microbianos tais. Em contraste, Organóides são compactos unsua com uma superfície luminal virada para dentro. Por conseguinte, existe uma quantidade limitada de produto que pode ser introduzido no lúmen 54 organ�de.
Acreditamos que o nosso modelo organot�ica 3-D multicelular da mucosa intestinal humano tem um potencial de grande alcance como uma ferramenta para a descoberta na saúde e na doença, incluindo interação com patógenos, o tráfico de antigénio, e inflamatória e dos processos metabólicos 24. Por fim, devido à natureza multicelular do nosso modelo 3-D, o nosso modelo poderia permitir gain- e perda de estudos usando tipos de células do sistema imunológico que são susceptíveis de influenciar o comportamento das células epiteliais in vivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor | Synthecon | RCCs-4DQ | For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available. |
| Disposable 50 ml-vessel | Synthecon | D-405 | Box with 4 vessels |
| HCT-8 epithelial cells | ATCC | CCL-244 | |
| CCD-18Co Fibroblasts | ATCC | CRL-1459 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | ATCC | CRL-1730 | HUVEC |
| Fibroblast Growth Factor-Basic | Sigma | F0291 | bFGF |
| Stem Cell Factor | Sigma | S7901 | SCF |
| Hepatocyte Growth Factor | Sigma | H1404 | HGF |
| Endothelin 3 | Sigma | E9137 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
| Vascular Endothelial Growth Factor | Sigma | V7259 | VEGF |
| Leukemia Inhibitory Factor | Santa Cruz | sc-4377 | (LIF |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Insulin | Sigma | I-6634 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma | T-6397 | T3 |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
| Fibronectin | BD | 354008 | Isolated from human plasma |
| apo-Transferrin | Sigma | T-1147 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Heparan sulfate proteoglycan | Sigma | H4777 | Isolated from basement membrane of mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | Isolated from human placenta |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| D-MEM, powder | Invitrogen | 12800-017 | |
| 10% formalin–PBS | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Bovine type I collagen | Invitrogen | A1064401 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | MT25-052-CI | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750-060 | |
| Penicillin/streptomincin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
| Ham's F-12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| Basal Medium Eagle | Invitrogen | 21010-046 | BME |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | EBM-2 |
| Endothelial cell growth supplement | Millipore | 02-102 | ECGS |
References
- Aumailley, M., Timpl, R. Attachment of cells to basement membrane collagen type IV. J Cell Biol. 103, 1569-1575 (1986).
- Buset, M., Winawer, S., Friedman, E. Defining conditions to promote the attachment of adult human colonic epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 23, 403-412 (1987).
- Fitzgerald, T. J., Repesh, L. A., Blanco, D. R., Miller, J. N. Attachment of Treponema pallidum to fibronectin, laminin, collagen IV, and collagen I, and blockage of attachment by immune rabbit IgG. Br J Vener Dis. 60, 357-363 (1984).
- Goetschy, J. F., Ulrich, G., Aunis, D., Ciesielski-Treska, J. Fibronectin and collagens modulate the proliferation and morphology of astroglial cells in culture. Int J Dev Neurosci. 5, 63-70 (1987).
- Paye, M., Lapiere, C. M. The lack of attachment of transformed embryonic lung epithelial cells to collagen I is corrected by fibronectin and FXIII. J Cell Sci. 86, 95-107 (1986).
- Pourreau-Schneider, N., et al. Estrogen response of MCF-7 cells grown on diverse substrates and in suspension culture: promotion of morphological heterogeneity, modulation of progestin receptor induction; cell-substrate interactions on collagen gels. J Steroid Biochem. 21, 763-771 (1984).
- Pratt, B. M., Harris, A. S., Morrow, J. S., Madri, J. A. Mechanisms of cytoskeletal regulation. Modulation of aortic endothelial cell spectrin by the extracellular matrix. Am J Pathol. 117, 349-354 (1984).
- Jessup, J. M., et al. Microgravity culture reduces apoptosis and increases the differentiation of a human colorectal carcinoma cell line. In vitro cellular & developmental biology - Animal. 36, 367-373 (2000).
- Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Res. 46, 5320-5329 (1986).
- Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat Med. 4, 901-907 (1998).
- Zwezdaryk, K. J., Warner, J. A., Machado, H. L., Morris, C. A., Honerzu Bentrup, K. Rotating cell culture systems for human cell culture: human trophoblast cells as a model. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M. M. Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Barrila, J., et al. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat Rev Microbiol. 8, 791-801 (2010).
- Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes and infection / Institut Pasteur. 8, 1813-1825 (2006).
- Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect Immun. 69, 7106-7120 (2001).
- Alcantara Warren, C., et al. Detection of epithelial-cell injury, and quantification of infection, in the HCT-8 organoid model of cryptosporidiosis. J Infect Dis. 198, 143-149 (2008).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
- Lin, H. J., O'Shaughnessy, T. J., Kelly, J., Ma, W. Neural stem cell differentiation in a cell-collagen-bioreactor culture system. Brain Res. Dev Brain Res. 153, 163-173 (2004).
- He, L., et al. Increased proliferation and adhesion properties of human dental pulp stem cells in PLGA scaffolds via simulated microgravity. Intl Endo J. , (2015).
- Straub, T. M., et al. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg Infect Dis. 13, 396-403 (2007).
- Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Lack of norovirus replication and histo-blood group antigen expression in 3-dimensional intestinal epithelial cells. Emerg Infect Dis. 19, 431-438 (2013).
- Goodwin, T. J., Schroeder, W. F., Wolf, D. A., Moyer, M. P. Rotating-wall vessel coculture of small intestine as a prelude to tissue modeling: aspects of simulated microgravity. Proc Soc Exp Biol Med. 202, 181-192 (1993).
- Goodwin, T. J., Jessup, J. M., Wolf, D. A. Morphologic differentiation of colon carcinoma cell lines HT-29 and HT-29KM in rotating-wall vessels. In Vitro Cell Dev Biol. 28, 47-60 (1992).
- Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Engineering of a multicellular organotypic model of the human intestinal mucosa. Gastroenterology. 141, 18-20 (2011).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am J Physiol Renal Physiol. 281, 12-25 (2001).
- Cherry, R. S., Papoutsakis, E. T. Physical mechanisms of cell damage in microcarrier cell culture bioreactors. Biotech and Bioeng. 32, 1001-1014 (1988).
- Bergmann, S., Steinert, M. From Single Cells to Engineered and Explanted Tissues: New Perspectives in Bacterial Infection Biology. Int Rev Cell Mol Biol. 319, 1-44 (2015).
- Xu, B., et al. Simulated microgravity affects ciprofloxacin susceptibility and expression of acrAB-tolC genes in E. coli ATCC25922. Int J Clin Exp Pathol. 8, 7945-7952 (2015).
- Han, C., Jiang, C., Yu, C., Shen, H. Differentiation of transforming growth factor beta1-induced mesenchymal stem cells into nucleus pulposus-like cells under simulated microgravity conditions. Cell Mol Biol (Noisy-le-Grand, France). 61, 50-55 (2015).
- Wang, C., et al. Microgravity activates p38 MAPK-C/EBPbeta pathway to regulate the expression of arginase and inflammatory cytokines in macrophages. Inflamm Res. 64, 303-311 (2015).
- Iliev, I. D., et al. Human intestinal epithelial cells promote the differentiation of tolerogenic dendritic cells. Gut. 58, 1481-1489 (2009).
- Kerneis, S., Bogdanova, A., Kraehenbuhl, J. P., Pringault, E. Conversion by Peyer's patch lymphocytes of human enterocytes into M cells that transport bacteria. Science. 277, 949-952 (1997).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. , (2010).
- Lei, N. Y., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support the growth of intestinal epithelial stem cells. PLoS One. 9, e84651 (2014).
- Voog, J., Jones, D. L. Stem cells and the niche: a dynamic duo. Cell Stem Cell. 6, 103-115 (2010).
- Jabaji, Z., et al. Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium. Tissue Eng Part C Methods. 19, 961-969 (2013).
- Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9, e107814 (2014).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9, 2354-2368 (2014).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med. 239, Maywood, N.J. 1124-1134 (2014).
- Tompkins, W. A., Watrach, A. M., Schmale, J. D., Schultz, R. M., Harris, J. A. Cultural and antigenic properties of newly established cell strains derived from adenocarcinomas of the human colon and rectum. J Natl Cancer Inst. 52, 1101-1110 (1974).
- Hinterleitner, T. A., Saada, J. I., Berschneider, H. M., Powell, D. W., Valentich, J. D. IL-1 stimulates intestinal myofibroblast COX gene expression and augments activation of Cl- secretion in T84 cells. Am J Physiol. 271, 1262-1268 (1996).
- Hoshi, H., McKeehan, W. L. Brain- and liver cell-derived factors are required for growth of human endothelial cells in serum-free culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 6413-6417 (1984).
- Salerno-Goncalves, R., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Characterization of CD8(+) Effector T Cell Responses in Volunteers Immunized with Salmonella enterica. Serovar Typhi Strain Ty21a Typhoid Vaccine. J Immunol. 169, 2196-2203 (2002).
- Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. , e51064 (2014).
- Eastburn, D. J., Mostov, K. E. Laying the foundation for epithelia: insights into polarized basement membrane deposition. EMBO Rep. 11, 329-330 (2010).
- Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. a report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Altern Lab Anim. 33, 261-287 (2005).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111, 1021-1046 (2014).
- Hartung, T., et al. Good Cell Culture Practice. ECVAM Good Cell Culture Practice Task Force Report 1. Altern Lab Anim. 30, 407-414 (2002).
- Blanchet, O., et al. Altered binding of regulatory factors to HLA class I enhancer sequence in human tumor cell lines lacking class I antigen expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 3488-3492 (1992).
- Palmisano, G. L., et al. HLA-E surface expression is independent of the availability of HLA class I signal sequence-derived peptides in human tumor cell lines. Hum Immunol. 66, 1-12 (2005).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. , (2014).
