Summary
Celler, der vokser i en tredimensional (3-D) miljø repræsenterer en markant forbedring i forhold til celledyrkning i 2-D miljøer (f.eks kolber eller retter). Her beskriver vi udviklingen af en flercellet 3-D organotypiske model af den humane intestinale mucosa dyrket under vægtløshed billede ved at dreje-væg-beholder (RWV) bioreaktorer.
Abstract
Fordi celler, der voksede i en tredimensional (3-D) miljø har potentiale til at slå bro mange huller af celledyrkning i 2-D miljøer (f.eks., Kolber eller retter). Faktisk er det almindeligt anerkendt, at celler dyrket i kolber eller retter tendens til at de-differentiere og miste specialiserede funktioner i vævene, hvorfra de blev afledt. I øjeblikket er der hovedsagelig to typer af 3-D dyrkningssystemer hvor cellerne podes i stilladser efterligner den native ekstracellulære matrix (ECM): (a) statiske modeller og (b) modeller ved hjælp bioreaktorer. Det første gennembrud var de statiske 3-D-modeller. 3-D-modeller under anvendelse af bioreaktorer, såsom den roterende væg-fartøj (RWV) bioreaktorer er en nyere udvikling. Det oprindelige koncept af RWV bioreaktorer blev udviklet ved NASAs Johnson Space Center i begyndelsen af 1990'erne og menes at overvinde de begrænsninger af statiske modeller såsom udvikling af hypoxiske, nekrotiske kerner. De RWV bioreaktorer kan omgå ther problem ved at tilvejebringe fluid dynamik, der tillader effektiv diffusion af næringsstoffer og ilt. Disse bioreaktorer består af en rotator base, der tjener til at understøtte og rotere to forskellige formater af dyrkningsbeholdere, der adskiller sig ved deres beluftning kilde seværdighed: (1) Langsom Turning Laterale Fartøjer (STLVs) med en koaksial oxygenator i midten, eller (2 ) High Aspect Ratio Fartøjer (HARVs) med iltning via en flad, silikonegummi gas transfer-membran. Disse skibe tillader effektiv gas overførsel samtidig undgå bobledannelse og deraf følgende turbulens. Disse betingelser resulterer i laminar strømning og minimal forskydningskraft at modeller reduceret tyngdekraft (mikrogravitet) inden i dyrkningsbeholderen. Her beskriver vi udviklingen af en flercellet 3-D organotypiske model af den humane tarmslimhinde sammensat af en intestinal epitelcelle linje og primære humane lymfocytter, endotelceller og fibroblaster dyrket under vægtløshed tilvejebragt af RWV bioreaktoren. </ P>
Introduction
Det første gennembrud i opbygningen af en 3-D model blev rapporteret i de tidlige af 1980'erne, hvor forskere begyndt at undersøge forskellige typer af stilladset (eg., Laminin, collagen type I, collagen IV, og fibronectin) og cocktails af vækstfaktorer at forbedre celle-til-celle og ECM interaktioner af "statiske" 3-D-modeller 1-7. Siden da har det største problem med disse modeller været begrænsninger i overførslen af næringsstoffer og ilt inden for de mellemstore og væv konstruktioner 8. I modsætning til celler i in vivo miljø, der modtager en jævn strøm af næringsstoffer og oxygen fra omgivende netværk af blodkar, den statiske natur af disse modeller hindrer effektiv fordeling af dem til cellerne. For eksempel vil celleaggregater genereret ved in vitro statiske modeller, der overstiger nogle få millimeter i størrelse uvægerligt udvikle hypoxiske, nekrotiske kerner 9. De RWV bioreaktorer kan omgå dette problemved at tilvejebringe fluid dynamik, der tillader effektiv diffusion af næringsstoffer og ilt 10-12. Men til dato, arbejde ved hjælp RWV bioreaktorer er blevet begrænset til optagelse af en eller to celletyper 13-17. I stedet for en rumlig orientering ligner native væv, de celler dannet celleaggregater. Den væsentligste årsag til disse begrænsninger har været manglen på et stillads i stand til at indarbejde celler på en integreret måde. Stilladserne anvendes i RWV bioreaktorer til dato består, med få undtagelser 16-18, hovedsagelig af syntetiske mikroperler, rørformede cylindre eller små plader 13-15,19-23. Disse er stive materialer, hvis sammensætning og fleksibilitet ikke kan manipuleres, og hvortil cellerne er bundet til deres overflade. Således er det usandsynligt, at disse modeller vil tilvejebringe et system til at vurdere, på en integreret måde, de forskellige cellekomponenter såsom stromale celler (f.eks., Fibroblaster, immun- og endotheliale celler) at should blive dispergeret i stilladset til nøje efterligner humant væv.
Her beskriver vi udviklingen af en flercellet 3-D organotypiske model af den humane tarmslimhinde sammensat af en intestinal epitelcelle linje og primære humane lymfocytter, endotelceller, og fibroblaster 24. Disse celler blev dyrket under vægtløshed giver ved RWV bioreaktor 13,25-30. I vores 3-D model, ECM'en har mange forskellige egenskaber, såsom en osmolalitet svarende til dyrkningsmediet (f.eks., Ubetydelige diffusionssystemer begrænsninger under kultur) og evnen til at optage celler og andre relevante ekstracellulære matrixproteiner, samt passende stivhed til anvendelse i bioreaktorer 24. Biologiske systemer er meget komplekse, og i de seneste par år har der været et skift i fokus i slimhinde forskning mod undersøgelse af celle interaktioner med deres omgivelser i stedet for at studere dem i isolation. Især er betydningen af celle-celle-interaktioner i at påvirke intestinal celle overlevelse og differentiering veldokumenteret 31-34. Konkret kommunikationen mellem epitelceller og deres niche har en stor indflydelse på den epitelcelle ekspansion og differentiering 35. Faktisk er det almindeligt anerkendt, at ikke kun celle-til-celle, men også celle-til-ECM-interaktioner er afgørende for opretholdelsen og differentiering af epitelceller i 3-D kulturmodeller. Tidligere undersøgelser har vist, at tarmen ECM-proteiner, såsom kollagen I 24,36,37, laminin 38 og fibronectin 39 er medvirkende til at påvirke intestinale epitelceller til at erhverve rumlige orientering svarende til det native slimhinde. Således er udviklingen af nye teknologier, ligesom vores 3-D model 24, der kan efterligne den fænotypiske mangfoldighed tarmen er påkrævet, hvis forskere agter at genskabe den komplekse cellulære og strukturel arkitekturog funktion af tarmen mikromiljø. Disse modeller er et vigtigt redskab i udviklingen og evalueringen af nye orale lægemidler og vaccinekandidater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik erklæring: Alle blodprøver blev indsamlet fra frivillige, der deltog i protokol nummer HP-00.040.025-1. The University of Maryland Institutional Review Board godkendte denne protokol og autoriseret indsamling af blodprøver fra raske frivillige til de undersøgelser, der indgår i dette manuskript. Formålet med denne undersøgelse blev forklaret for frivillige, og alle frivillige gav informeret, underskrevet samtykke, før blodet lodtrækningen.
Bemærk: Se tabel 1 for medium supplement forberedelse. Se tabel 2 til fremstilling af 3-D dyrkningsmedier.
1. Fremstilling af kultur Fartøjer
- Skru hætten af fyld porten på 50 ml-beholder og fyldes med 50 ml sterilt dyrkningsmedium (fx., RPMI). Udfør alle procedurer under sterile forhold i en laminar hætte.
- Sæt hætten og tør eventuelt spildt medium på en hvilken som helst overflade med 70% ethanol.
- Lad fartøjet til incubspiste i mindst 15 min til O / N ved stuetemperatur.
- Brug fyldeporten at skille dyrkningsmediet og 30 ml af 3-D dyrkningsmedium.
- Tør spildt medium på en hvilken som helst overflade med 70% ethanol.
2. Forberedelse af cellerne
- Human epithelial cellelinie (HCT-8) 24,40.
- Dyrke celler i RPMI suppleret med 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 50 ug / ml gentamicin, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM HEPES puffer og 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS ) (tillæg 1). Ved 70% konfluens, opdele celler i forholdet 1: 5.
- Humane colon fibroblaster (CCD-18Co celler) 24,41.
- Dyrke celler i Basal Eagle-medium beriget med tillæg 1 Ved sammenflydning, opdele celler i forholdet 1:. 3.
- Human navlevene Endotheliale (HUVEC) celler
- Dyrke celler i endotel Basal Medium (EBM) medium beriget med 100 ug / ml heparin, 3 ug / ml endotelcellevækst-supplement (ECGS), og supplere 1 Ved 70% konfluens, opdele celler i forholdet 1:. 2.
- Isoler Perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra blod ved densitetsgradientcentrifugering ved anvendelse af standardteknikker 43.
- Kort beskrevet anvendelse af en 10 ml-pipette forsigtigt tilsættes 30 ml fortyndet blod (1: 1 Blod: phosphatbufret saltvand (PBS)) i en 50 ml konisk rør indeholdende 10 ml densitetscentrifugering medier. Efter centrifugering skridt vil lymfocytter og monocytter opholde sig i den "hvide" lag mellem densitetscentrifugering medier og plasma lag.
- Opsaml det hvide lag under anvendelse af en overførsel pipette. Undgå granulocyt kontaminering ved at begrænse indsamling af densitetscentrifugering medier. Efter vask 43, uSE PBMC som er eller kryopræserveret i flydende N2.
Bemærk: Det er vigtigt at understrege, at PBMC hovedsageligt består af lymfocytter og monocytter, med en lille andel af dendritiske celler og andre celletyper.
3. Forberedelse af kollagen-indlejrede celler
- Bestem antallet af indsatser nødvendig baseret på antallet af eksperimentelle betingelser, der skal set-up. Placer passende antal skær i brøndene på en plade med 6 brønde.
- Forbered en suspension af HUVEC og fibroblaster:
- Vask kolberne to gange i PBS og løsne cellerne ved hjælp af trypsin, 0,25% (1x) med 0,05% trypsin-tetranatriumethylendiamintetraacetat (trypsin-EDTA). Tilsæt så trypsinopløsning til at dække hele det cellekulturen overfladeareal. Detachment sker normalt inden for 5 til 15 min
- Indsamleløsnede celler i en 50 ml-rør indeholdende 30 ml Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) -30% FBS medium.
- Centrifugeres røret ved 500 xg i 10 min.
- Resuspender cellerne i 30 ml DMEM-30% FBS-medium.
- Tæl det samlede antal levedygtige celler ved at fortynde 20 pi af de resuspenderede celler med 20 pi trypanblåt. Indlæse hæmocytometer med celleblandingen. Levedygtige PBMC'er vil være hvid klar; ikke-levedygtigt PBMC vil erhverve farvestoffet og blive blå.
- Resuspender hver celletype i DMEM-30% FBS-medium ved en koncentration på 5 - 8 x 10 7 celler ml - 1.
- Forbered celle-holdige kollagengeler
Bemærk: Hvert fartøj vil kræve fremstilling af ~ 5 ml celleholdige kollagengel.- I en 50 ml-konisk rør forberede kollagen blandingen ved tilsætning af 1 x DMEM-medium, suppleret med 50 ug / ml gentamicin, 2 mM L-glutamin og 10% varmeinaktiveret inactivated FBS plus 3 mg / ml bovint collagen-I, 10 ug / ml laminin, 40 ug / ml collagen IV, 10 ug / ml fibronectin, 2 ug / ml heparinsulfatproteoglycan og 15 mM NaOH (for at nå den fysiologiske pH).
- Glasset lukkes og blandes ved at vende flere gange, indtil blandingen er helt homogeniseres. Undgå bobledannelse.
VIGTIGT: Hold blandingen på is for at forhindre geldannelse.- Kritiske trin: Hvis blandingen udvikler en sur udseende (gullig farve), der tilsættes nogle få dråber steril 1 N NaOH for at neutralisere blandingen.
- Tilføj koncentreret HUVEC og fibroblaster ved en densitet på 1,0 - 1,2 og 1,5 - 2,0 x 10 6 celler / ml, henholdsvis til den berigede-collagen blanding (beskrevet ovenfor). Luk rørene og bland ved at vende flere gange, indtil blandingen er helt homogeniseres. Undgå bobledannelse. VIGTIGT: Hold blandingen på is for at forhindre geldannelse.
- Tilsæt 4 - 5 ml af den celleholdige collagengel til hver indsats, der tidligere er indlæst i en 6 brønd-plade og fik lov at gelify i hætten med ringe eller ingen bevægelse i 1 time.
- Efter 1 time overføre 6-brønds plade til en 37 ° C, 5% CO2 inkubator i 1 - 2 yderligere timer.
- Returnere 6-brønds plade til hætten, og med hjælp af en steril pincet og skalpel aseptisk cut-off membran fra indsatsen afmontere celleholdige gel fra membranen. Skær fritliggende gel i små firkanter (~ 5 x 5 mm).
- Tilsæt små celleholdige firkanter i en 50 ml HARV hjælp fyldeporten.
- Forbered en suspension af HCT-8 epitelceller:
- Vask kolberne to gange i PBS og frigøre cellerne ved anvendelse af trypsin, 0,25% (1x) med trypsin-EDTA-behandling. Tilsæt så trypsinopløsning til at dække hele det cellekulturen overfladeareal. Detachment sker normalt inden for 10 til 15 min.
- Indsamle løsnede celler i 30 ml DMEM-30% FBS-medium.
- centrifugaluge DMEM-30% FBS-medium indeholdende rør ved 500 xg i 10 min.
- Resuspender cellerne i 30 ml DMEM-30% FBS-medium.
- Tæl det samlede antal levedygtige celler, som beskrevet i 3.2.5.
- Resuspendere HCT-8 epitelceller i DMEM-30% FBS-medium ved en koncentration på 10 7 celler ml - 1.
- Tilsæt 1 ml af de koncentrerede HCT-8 epitelceller i 50-ml HARV hjælp fyldeporten.
- Ved at bruge fyldeporten, tilsættes yderligere 3-D dyrkningsmedium indtil fartøjet er næsten fuld (~ 20 ml).
- Sæt hætten og tør læben af fyld port med 70% ethanol.
- Placer en sprøjte i hver sprøjte-porten på RWV: sted en 5 ml-sprøjte indeholdende 3 - 4 ml 3-D dyrkningsmedium i en port og en 5 ml-tomme sprøjte i den anden havn.
- Fjern eventuelle synlige bobler ved at trække ind i det tomme sprøjte under omtrent samme volumen af medium indsprøjtes gennem den anden sprøjte port.
- Placer vessels i bioreaktoren, tænde for strømmen og indstille hastigheden til omkring 13 til 14 omdrejninger i minuttet.
Bemærk: Kritisk trin: rotationshastighed kan være nødvendigt at justere et par gange under et eksperiment for at opretholde cellerne i kredsløb inden i karret, hvorved der undgås kontakt med karvæggene. - Dyrke celler ved 37 ° C, 5% CO2 under vægtløshed, leveret af den RWV bioreaktoren.
- Skift dyrkningsmediet hver 3 - 4 dage ved at erstatte ca. 30 ml med frisk 3-D dyrkningsmedium.
- Efter 4 dage (± 1 dag), fjerne skibe fra bioreaktoren og tilføje lymfocytter / monocytter til skibene (2 x 10 7 / kar).
- Placer fartøjer tilbage i bioreaktoren ved 37 ° C, 5% CO2 i yderligere 5 dage (± 1 dag).
- Efter yderligere 5 dage (dag 9 for kulturen), der tilsættes lymfocytter / monocytter på beholderne (2 x 10 7 / kar) og fortsætte kulturerne i op til 12 yderligere dage. Skift dyrkningsmediet hver 3 - 4 dage ved at erstatte ca. 30 ml med frisk 3-D dyrkningsmedium.
4. Høst 3-D kulturer til histologi
- Ved hjælp af en overførsel pipette høst hver lille gel fragment, nu kaldet "konstruere", i en seks-brønds plade indeholdende 10 ml 10% formalin buffer. Efterlad i 3 timer ved stuetemperatur eller i 12 - 16 timer ved 4 ° C.
- Forbered vævsbehandling og indlejring kassetter ved mærkning og tilføje to stykker biopsi skumpuder i hver kassette.
- Fordybe kassetterne i 10% formalin buffer.
- Ved hjælp af pincet placere den faste konstruktioner mellem de to puder.
- Fordybe kassetterne i 10% formalin buffer.
- Fortsæt med standardprocedurer for indlejring, sektionering og farvning 44.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidligere udviklet en multicellulær 3-D organotypiske model af den humane intestinale mucosa består af en intestinal epitelcelle linje og primære humane lymfocytter, endotelceller og fibroblaster dyrket under vægtløshed betingelser 24 (figur 1). Fibroblaster og endotelceller blev indlejret i et kollagen I matrix beriget med yderligere gut basalmembranproteiner 45 (dvs.., Laminin, collagen IV, fibronektin og heparinsulfatproteoglycan) og tilsat til RWV bioreaktorer. Efter 10 - 15 dage histologisk farvning analyse viste tilstedeværelsen af villus-lignende strukturer i konstruktionerne. Ca. 60 - 80% af disse epitelceller blev organiseret som et monolag af polariserede celler med deres kerner placeret i en basal position nær ECM, som er et væsentligt træk ved godt differentierede celler (figur 2).
ent "fo: holde-together.within-side =" 1 ">
Figur 1: Diagram over Opførelse af 3-D model. Fire trin er nødvendige for at bygge 3-D systemet. Først, for at opnå det krævede antal celler til at generere 3-D-model, en human intestinal enterocytterne epitelcellelinie (HCT-8) og primære humane endotelceller og fibroblaster dyrkes som 2-D konfluerende monolag. For det andet, ECM består af kollagen-I matrix beriget med yderligere gut basalmembranproteiner (dvs.., Laminin, collagen IV, fibronektin og heparinsulfatproteoglycan) fremstilles. Tredje er fibroblaster og endotelceller indlejret i en collagen-I-blanding og tilsat til RWV bioreaktorer efterfulgt af tilsætning HCT-8 epitelceller. For det fjerde er de primære lymfocytter tilsættes til kulturen på dag 4 og 9 (± 1 dag)."> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Sammenligning mellem den normale menneskelige tarm og de Organotypiske Models. Hematoxylin og eosin-farvning af celler dyrket i 3-D vægtløshed model: væv blev farvet lilla og stillads farves pink. Celler fra 3-D model blev dyrket i 14 ( "a" og "b") og 20 dage (c). Tyve dage efter podning, er det samlede celleantal opretholdt, og cellerne var godt differentierede Viser villus-lignende funktioner. Billeder vises på 100X ( "a" og "b") og 40X ( "c") forstørrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
| produktnavn | Pkg. Størrelse | rekonstituering | Arbejde Koncentration | Opbevaring |
| Fibroblast vækstfaktor-Basic (bFGF) | 25 mg | Til fremstilling 25 ug / ml stamopløsning; tilsættes 25 ug FGF i 1 ml sterilt medium (RPMI plus 1% FCS), hvirvel at opløses, tilsættes 100 pi / portion | 5 ng / ml | pulver -20 o C, der arbejder portioner -20 ° C, undgå at gentage fryse / tø |
| Stem Cell Factor (SCF) | 10 mg | Til fremstilling 10 ug / ml stamopløsning; tilføje 10 ug SCF i 1 ml sterilt medium (RPMI plus 1% FCS), hvirvel at opløses, tilføje 250 ul / portion | 5 ng / ml | pulver -20 o C, der arbejder portioner -20 ° C, undgå at gentage fryse / tø |
| Hepatocytvækstfaktor (HGF) | 5 mg | Til fremstilling 5 ug / ml stamopløsning; tilsættes 5 ug HGF i 1 ml sterilt medium (RPMI plus 1% FCS), hvirvel at opløses, tilføje 200 pi / portion | 2 ng / ml | pulver -20 o C, der arbejder portioner -20 ° C, undgå at gentage fryse / tø |
| endothelin 3 | 50 mg | Til fremstilling 50 ug / ml stamopløsning; tilføje 50 ug Endotelin i 1 ml sterilt medium (RPMI plus 1% FCS), hvirvel at opløses, tilsættes 100 pi / portion | 10 ng / ml | pulver -20 o C, der arbejder portioner -20 ° C, undgå at gentage fryse / tø |
| Laminin | 1 mg | Optø langsomt 2 - 8 ° C, hvirvel og tilsæt 100 ul / portion | 10 mg / ml | flydende -20 o C, arbejder portioner -20 ° C, undgå at gentage freEze / tø |
| Vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) | 10 mg | Til fremstilling 5 ug / ml stamopløsning; der tilsættes 10 ug VEGF i 2 ml sterilt vand, til at hvirvle opløse, tilsættes 100 pl / alikvot | 1 ng / ml | pulver -20 o C, der arbejder portioner -20 ° C, undgå at gentage fryse / tø |
| Leukæmi inhibitorisk faktor (LIF) | 50 mg | Til fremstilling 20 ug / ml stamopløsning; tilsæt 50 ug af LIF i 2,5 ml sterilt vand, til at hvirvle opløse, tilsættes 100 pl / alikvot | 4 ng / ml | pulver -20 o C, der arbejder portioner -20 ° C, undgå at gentage fryse / tø |
| adenin | 25 g | Til fremstilling 0,18 M stamopløsning; tilføje 121,5 mg og adedine i 50 ml 0,05 M HCI (250 pi 37,1% HCI i 50 ml vand)), til at hvirvle opløse, filter sterilisere ogtilsættes 1 ml / portion | 1,8 x 10 -3 M | pulver 4 ° C, der arbejder portioner -20 ° C, undgå at gentage fryse / tø |
| Insulin | 50 mg | Til fremstilling 5 mg / ml stamopløsning; tilsæt 50 mg insulin i 10 ml 0,005 M HCI (5 pi 37,1% HCI i 10 ml vand)), hvirvel at opløse, filter sterilisere og tilsæt 0,5 ml / portion | 5 mg / ml | pulver -20 o C, der arbejder portioner -20 ° C, undgå at gentage fryse / tø |
| T3 | 100 mg | Til fremstilling 2 x 10 -8 M stamopløsning; tilføj 3.4 mg T3 i 25 ml 1 M NaOH, fortyndet 0,1 ml af denne opløsning i 9,9 ml PBS, fortyndes igen 0,1 ml af denne opløsning i 9,9 ml PBS, hvirvel at opløse, filter sterilisere og tilsæt 0,5 ml / portion | 2 x 10 -11 M | pulver -20 o C, der arbejder portioner -20 <sup> o C, undgå at gentage fryse / tø |
| koleratoksin | 5 mg | Til fremstilling 10 -7 M stamopløsning; tilsættes 5 mg Kolera toksin i 5 ml sterilt Hedeselskabet 2 O (opbevares ved -20 ° C); fortyndes 50 pi af denne opløsning i 5 ml Hedeselskabet 2 O, at swirl blandes og filtreres sterilisere og tilsæt 0,5 ml / portion | 10 -10 M | pulver 4-8 o C, der arbejder portioner -20 o C, undgå at gentage fryse / tø |
| Fibronectin | 1 mg | At forberede 1 mg / ml stamopløsning; tilsættes 1 mg fibronectin i 1 ml sterilt distiled vand. Tillad 30 min. for materiale til at gå i opløsning. IKKE agitere ELLER SWIRL. Tilsæt 100 pi / alikvot | 10 mg / ml | pulver 4-8 o C, der arbejder portioner -20 o C, undgå at gentage fryse / tø |
| apo-transferrin | 100 mg Til fremstilling 5 mg / ml stamopløsning (1.000 x); tilsæt 100 mg transferrin i 20 ml PBS hvirvel at opløse, filter sterilisere og tilsæt 0,5 ml / portion | 5 mg / ml | pulver -20 o C, der arbejder portioner -20 ° C, undgå at gentage fryse / tø | |
| Heparin | 50 KU | Til fremstilling 50 mg / ml stamopløsning (1.000 x); tilsæt 50 mg heparin i 1 ml vand hvirvel at opløse, filter sterilisere og der tilsættes 1 ml / portion | 0,1 mg / ml | pulver -20 o C, der arbejder portioner -20 ° C, undgå at gentage fryse / tø |
| Heparansulfatproteoglycan | 1 mg | Til fremstilling 0,1 mg / ml stamopløsning; tilsættes 1 mg heparansulfat i 10 ml sterilt vand hvirvel for at opløse, og der tilsættes 0,2 ml / portion | 2 mg / ml | pulver -20 o C, der arbejder portioner -20 ° C, undgåGentag fryse / tø |
| Collagen IV | 5 mg | Til fremstilling 2 mg / ml stamopløsning solutin: der tilsættes 2 mg af kollagen V i 2,5 ml sterilt 0,25% eddikesyre. Tillad 1 - 2 ud hr til materiale til at gå i opløsning Swirl bedre dillution.. Tilsæt 400 pi / alikvot | 80 mg / ml | pulver -20 o C, der arbejder portioner -20 ° C, undgå at gentage fryse / tø |
Tabel 1: Defineret Medium Supplement Forberedelse.
| F-12 medium suppleret med | |||
| Reagens | stamopløsning | endelige løsning | Beløb |
| Føtalt kalveserum | 10% | 50 ml | |
| natriumpyruvat | 100 mM | 1 mM | 5 ml |
| L-Glutamin | 200 mM | 2 mM | 5 ml |
| Hepes | 1 M | 10 mM | 5 ml |
| gentamicin | 50 mg / ml | 50 ug / ml | 500 pi |
| Penicillin / streptomycin | 10.000 U / ml / 10 mg / ml | 100 U / ml / 100 ug / ml | 5 ml |
| Insulin | 5 mg / ml | 5 ug / ml | 500 pi |
| T3 | 2 x 10 - 8 M | 2 x 10 -11 M | 500 pi |
| adenin | 1,8 x 10 - 1 m | 1,8 x 10 - 3 m | 5 ml |
| transferrin | 5 ug / ml | 500 pi | |
| heparin | 50 mg / ml | 0,1 mg / ml | 1 ml |
| ECGS | 3 mg / ml | 3 ug / ml | 5 ml |
| bFGF | 25 ug / ml | 5 ng / ml | 100 pi |
| SCF | 10 ug / ml | 5 ng / ml | 250 pi |
| HGF | 5 ug / ml | 2 ng / ml | 200 pi |
| endothelin 3 | 50 ug / ml | 10 ng / ml | 200 pi |
| LIF | 20 ug / ml | 4 ng / ml | 100 pi |
| VEGF | 5 ug / ml | 1 ng / ml | 100 pi |
| Choleran toksin | 10 -7 M | 10 -10 M | 500 pi </ Td> |
| Bemærk: Mængden ovennævnte er til fremstilling af 500 ml 3-D kulturmedier. Medier skal opbevares ved 4 ° C i ikke mere end 2 uger | |||
Tabel 2: Fremstilling af 3-D dyrkningsmediet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskript, beskriver vi udviklingen af af en biologisk model for den humane intestinale mucosa består af multipla celletyper, herunder primære humane lymfocytter, fibroblaster, og endotelceller samt intestinale epiteliale cellelinier 24. I denne 3-D-model, er cellerne dyrket i et collagen-rige ekstracellulære matrix under vægtløshed betingelser 24.
Som tidligere beskrevet, de væsentligste træk ved denne model er: (i) evnen til at efterligne epitelvævet monolag organisation, (ii) induktionen af passende polaritet af epitelceller, tight junctions, desmosomer og mikrovilli, (iii) en lang udtrykket kultur (op til 20 dage) med høj levedygtighed af de primære celler (dvs.., fibroblaster og endotelceller), (iv) udtrykket væv-lignende differentieringsmarkører herunder villin, cytokeratin, E-cadherin og mucin, (v) evnen til at producere betydelige mængder af cytokiner (f.eks., IL-8) og alkalisk phosphatase ved antigenstimulering, (vi) transporten af næringsstoffer, såsom glucose (dvs.., ekspression af disaccharidaser, og tilstedeværelse af sukker transportører) og (vii) den multi-slægt differentiering af intestinale epitelceller (dvs.., absorberende enterocytterne, globet og M-celler) 24.
Det er vigtigt at understrege, at for at opnå reproducerbare resultater ved hjælp af vores 3-D model investigator skal overholde god cellekultur retningslinjer 46-48. Det er afgørende systematisk kontrollere celler til levedygtighed, forurening med mycoplasma og ændringer i cellevækst adfærd. Hvis der identificeres et problem, først sikre, at ingen uautoriserede ændringer er blevet indført til protokollen. Hvis problemet fortsætter, skal du skifte til et nyt parti af de forskellige mellemstore komponenter (herunder serum) og /eller celler. En begrænsning af vores 3-D model er anvendelsen af tumorigen HCT-8 epitelcellelinie. Imidlertid er det vigtigt at overveje, at tilstedeværelsen af HCT-8 linie giver den fordel at være kommercielt tilgængelige. Hertil kommer, at disse epitelceller ikke udtrykke enten klassisk eller ikke-klassisk human leukocyt antigen (HLA) class I molekyler 49,50. Således giver mulighed for dyrkning af epitelceller med PBMC fra forskellige HLA-klasse I-haplotyper i fravær af epitelcelle-PBMC alloreactivity. Endvidere, når man sammenligner dette system med systemer som tarmen stamcelle organoids 51-53, denne model giver mange fordele. Selvom gut stamceller organoids give uvurderlige oplysninger om cellebiologi og tarm differentiering 51-53, denne model tillader direkte apikale udsættelse for næringsstoffer, medicin og patogener. Denne model giver også nem adgang til luminale indhold sådanne antimikrobielle peptider og cytokiner. I modsætning hertil organoids er kompakte undens med en luminal overflade, der vender indad. Der er derfor en begrænset mængde af produkt, der kan indføres i organoide lumen 54.
Vi mener, at vores flercellede 3-D organotypiske model af den menneskelige tarmslimhinden har vidtrækkende potentiale som et værktøj til opdagelse i både sundhed og sygdom, herunder samspillet med patogener, antigen menneskehandel og inflammatoriske og metaboliske processer 24. Endelig skyldes den flercellede karakter af vores 3-D model, kunne vores model muliggøre GAIN- og tabsgivende undersøgelser under anvendelse immune celletyper, der sandsynligvis vil påvirke epitelcelle adfærd in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor | Synthecon | RCCs-4DQ | For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available. |
| Disposable 50 ml-vessel | Synthecon | D-405 | Box with 4 vessels |
| HCT-8 epithelial cells | ATCC | CCL-244 | |
| CCD-18Co Fibroblasts | ATCC | CRL-1459 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | ATCC | CRL-1730 | HUVEC |
| Fibroblast Growth Factor-Basic | Sigma | F0291 | bFGF |
| Stem Cell Factor | Sigma | S7901 | SCF |
| Hepatocyte Growth Factor | Sigma | H1404 | HGF |
| Endothelin 3 | Sigma | E9137 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
| Vascular Endothelial Growth Factor | Sigma | V7259 | VEGF |
| Leukemia Inhibitory Factor | Santa Cruz | sc-4377 | (LIF |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Insulin | Sigma | I-6634 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma | T-6397 | T3 |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
| Fibronectin | BD | 354008 | Isolated from human plasma |
| apo-Transferrin | Sigma | T-1147 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Heparan sulfate proteoglycan | Sigma | H4777 | Isolated from basement membrane of mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | Isolated from human placenta |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| D-MEM, powder | Invitrogen | 12800-017 | |
| 10% formalin–PBS | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Bovine type I collagen | Invitrogen | A1064401 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | MT25-052-CI | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750-060 | |
| Penicillin/streptomincin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
| Ham's F-12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| Basal Medium Eagle | Invitrogen | 21010-046 | BME |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | EBM-2 |
| Endothelial cell growth supplement | Millipore | 02-102 | ECGS |
References
- Aumailley, M., Timpl, R. Attachment of cells to basement membrane collagen type IV. J Cell Biol. 103, 1569-1575 (1986).
- Buset, M., Winawer, S., Friedman, E. Defining conditions to promote the attachment of adult human colonic epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 23, 403-412 (1987).
- Fitzgerald, T. J., Repesh, L. A., Blanco, D. R., Miller, J. N. Attachment of Treponema pallidum to fibronectin, laminin, collagen IV, and collagen I, and blockage of attachment by immune rabbit IgG. Br J Vener Dis. 60, 357-363 (1984).
- Goetschy, J. F., Ulrich, G., Aunis, D., Ciesielski-Treska, J. Fibronectin and collagens modulate the proliferation and morphology of astroglial cells in culture. Int J Dev Neurosci. 5, 63-70 (1987).
- Paye, M., Lapiere, C. M. The lack of attachment of transformed embryonic lung epithelial cells to collagen I is corrected by fibronectin and FXIII. J Cell Sci. 86, 95-107 (1986).
- Pourreau-Schneider, N., et al. Estrogen response of MCF-7 cells grown on diverse substrates and in suspension culture: promotion of morphological heterogeneity, modulation of progestin receptor induction; cell-substrate interactions on collagen gels. J Steroid Biochem. 21, 763-771 (1984).
- Pratt, B. M., Harris, A. S., Morrow, J. S., Madri, J. A. Mechanisms of cytoskeletal regulation. Modulation of aortic endothelial cell spectrin by the extracellular matrix. Am J Pathol. 117, 349-354 (1984).
- Jessup, J. M., et al. Microgravity culture reduces apoptosis and increases the differentiation of a human colorectal carcinoma cell line. In vitro cellular & developmental biology - Animal. 36, 367-373 (2000).
- Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Res. 46, 5320-5329 (1986).
- Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat Med. 4, 901-907 (1998).
- Zwezdaryk, K. J., Warner, J. A., Machado, H. L., Morris, C. A., Honerzu Bentrup, K. Rotating cell culture systems for human cell culture: human trophoblast cells as a model. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M. M. Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Barrila, J., et al. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat Rev Microbiol. 8, 791-801 (2010).
- Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes and infection / Institut Pasteur. 8, 1813-1825 (2006).
- Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect Immun. 69, 7106-7120 (2001).
- Alcantara Warren, C., et al. Detection of epithelial-cell injury, and quantification of infection, in the HCT-8 organoid model of cryptosporidiosis. J Infect Dis. 198, 143-149 (2008).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
- Lin, H. J., O'Shaughnessy, T. J., Kelly, J., Ma, W. Neural stem cell differentiation in a cell-collagen-bioreactor culture system. Brain Res. Dev Brain Res. 153, 163-173 (2004).
- He, L., et al. Increased proliferation and adhesion properties of human dental pulp stem cells in PLGA scaffolds via simulated microgravity. Intl Endo J. , (2015).
- Straub, T. M., et al. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg Infect Dis. 13, 396-403 (2007).
- Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Lack of norovirus replication and histo-blood group antigen expression in 3-dimensional intestinal epithelial cells. Emerg Infect Dis. 19, 431-438 (2013).
- Goodwin, T. J., Schroeder, W. F., Wolf, D. A., Moyer, M. P. Rotating-wall vessel coculture of small intestine as a prelude to tissue modeling: aspects of simulated microgravity. Proc Soc Exp Biol Med. 202, 181-192 (1993).
- Goodwin, T. J., Jessup, J. M., Wolf, D. A. Morphologic differentiation of colon carcinoma cell lines HT-29 and HT-29KM in rotating-wall vessels. In Vitro Cell Dev Biol. 28, 47-60 (1992).
- Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Engineering of a multicellular organotypic model of the human intestinal mucosa. Gastroenterology. 141, 18-20 (2011).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am J Physiol Renal Physiol. 281, 12-25 (2001).
- Cherry, R. S., Papoutsakis, E. T. Physical mechanisms of cell damage in microcarrier cell culture bioreactors. Biotech and Bioeng. 32, 1001-1014 (1988).
- Bergmann, S., Steinert, M. From Single Cells to Engineered and Explanted Tissues: New Perspectives in Bacterial Infection Biology. Int Rev Cell Mol Biol. 319, 1-44 (2015).
- Xu, B., et al. Simulated microgravity affects ciprofloxacin susceptibility and expression of acrAB-tolC genes in E. coli ATCC25922. Int J Clin Exp Pathol. 8, 7945-7952 (2015).
- Han, C., Jiang, C., Yu, C., Shen, H. Differentiation of transforming growth factor beta1-induced mesenchymal stem cells into nucleus pulposus-like cells under simulated microgravity conditions. Cell Mol Biol (Noisy-le-Grand, France). 61, 50-55 (2015).
- Wang, C., et al. Microgravity activates p38 MAPK-C/EBPbeta pathway to regulate the expression of arginase and inflammatory cytokines in macrophages. Inflamm Res. 64, 303-311 (2015).
- Iliev, I. D., et al. Human intestinal epithelial cells promote the differentiation of tolerogenic dendritic cells. Gut. 58, 1481-1489 (2009).
- Kerneis, S., Bogdanova, A., Kraehenbuhl, J. P., Pringault, E. Conversion by Peyer's patch lymphocytes of human enterocytes into M cells that transport bacteria. Science. 277, 949-952 (1997).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. , (2010).
- Lei, N. Y., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support the growth of intestinal epithelial stem cells. PLoS One. 9, e84651 (2014).
- Voog, J., Jones, D. L. Stem cells and the niche: a dynamic duo. Cell Stem Cell. 6, 103-115 (2010).
- Jabaji, Z., et al. Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium. Tissue Eng Part C Methods. 19, 961-969 (2013).
- Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9, e107814 (2014).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9, 2354-2368 (2014).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med. 239, Maywood, N.J. 1124-1134 (2014).
- Tompkins, W. A., Watrach, A. M., Schmale, J. D., Schultz, R. M., Harris, J. A. Cultural and antigenic properties of newly established cell strains derived from adenocarcinomas of the human colon and rectum. J Natl Cancer Inst. 52, 1101-1110 (1974).
- Hinterleitner, T. A., Saada, J. I., Berschneider, H. M., Powell, D. W., Valentich, J. D. IL-1 stimulates intestinal myofibroblast COX gene expression and augments activation of Cl- secretion in T84 cells. Am J Physiol. 271, 1262-1268 (1996).
- Hoshi, H., McKeehan, W. L. Brain- and liver cell-derived factors are required for growth of human endothelial cells in serum-free culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 6413-6417 (1984).
- Salerno-Goncalves, R., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Characterization of CD8(+) Effector T Cell Responses in Volunteers Immunized with Salmonella enterica. Serovar Typhi Strain Ty21a Typhoid Vaccine. J Immunol. 169, 2196-2203 (2002).
- Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. , e51064 (2014).
- Eastburn, D. J., Mostov, K. E. Laying the foundation for epithelia: insights into polarized basement membrane deposition. EMBO Rep. 11, 329-330 (2010).
- Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. a report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Altern Lab Anim. 33, 261-287 (2005).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111, 1021-1046 (2014).
- Hartung, T., et al. Good Cell Culture Practice. ECVAM Good Cell Culture Practice Task Force Report 1. Altern Lab Anim. 30, 407-414 (2002).
- Blanchet, O., et al. Altered binding of regulatory factors to HLA class I enhancer sequence in human tumor cell lines lacking class I antigen expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 3488-3492 (1992).
- Palmisano, G. L., et al. HLA-E surface expression is independent of the availability of HLA class I signal sequence-derived peptides in human tumor cell lines. Hum Immunol. 66, 1-12 (2005).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. , (2014).
