Summary
Celler som vokser i en tredimensjonal (3-D) miljø representerer en markert forbedring i forhold til celledyrking i 2-D-miljøer (f.eks flasker eller retter). Her beskriver vi utviklingen av en flercellet 3-D organotypiske modell av det menneskelige tarmslimhinnen dyrket under mikrogravitasjons tilgjengelig ved å dreie-vegg-fartøy (RWV) bioreaktorer.
Abstract
Fordi celler som vokser i en tredimensjonal (3-D) miljø har potensial til å bygge bro mange hull for celledyrking i 2-D-miljøer (f.eks., Kolber eller retter). Faktisk er det allment anerkjent at celler dyrket i kolber eller retter en tendens til å de-differensiere og mister spesialiserte funksjoner av vev fra der de ble hentet. For tiden er det i hovedsak to typer 3D-kultur systemer hvor cellene seeded inn stillaser etterligne de innfødte ekstracellulære matriks (ECM): (a) statiske modeller og (b) modeller som bruker bioreaktorer. Den første gjennombruddet var de statiske 3-D modeller. 3-D modeller som bruker bioreaktorer som roterende-vegg-fartøy (RWV) bioreaktorer er en nyere utvikling. Den opprinnelige konseptet av RWV bioreaktorer ble utviklet ved NASAs Johnson Space Center i begynnelsen av 1990 og antas å overvinne begrensninger av statiske modeller som for eksempel utvikling av hypoksiske, nekrotiske kjerner. De RWV bioreaktorer kan omgå ther problem ved å tilveiebringe fluiddynamikk som tillater effektiv diffusjon av næringsstoffer og oksygen. Disse bioreaktorer består av en rotator base som tjener til å støtte og rotere to forskjellige formater av kultur fartøy som avviker fra deres lufting kildetype: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) med en koaksial oksygenator i sentrum, eller (2 ) Høy sideforhold Vessels (Harvs) med oksygenering via en flat, silikongummi gass overføring membran. Disse fartøyene tillate effektiv gassoverføring samtidig unngå bobledannelse og påfølgende turbulens. Disse betingelsene resulterer i laminær strømning og minimale skjærkraft som modellerer redusert gravitasjon (mikrogravitasjon) på innsiden av kulturen fartøyet. Her beskriver vi utviklingen av en flercellet 3-D organotypiske modell av tarmslimhinnen hos mennesker bestående av en intestinal epitelcellelinje og primære humane lymfocytter, endotelceller og fibroblaster dyrket under mikrogravitasjon levert av RWV bioreaktoren. </ P>
Introduction
Den første gjennombrudd i byggingen av en 3-D-modell ble rapportert i begynnelsen av 1980-tallet da forskere begynt å undersøke forskjellige typer av stillaset (f.eks., Laminin, kollagen type I, kollagen IV, og fibronektin) og cocktail av vekstfaktorer for å forbedre celle-til-celle og ECM interaksjoner av "statisk" 3-D modeller 1-7. Siden den gang har det største problemet med disse modellene vært begrensninger i overføring av næringsstoffer og oksygen i løpet av de mellomstore og vev konstruerer 8. I motsetning til celler in in vivo miljø som mottar en jevn strøm av næringsstoffer og oksygen fra omgivende nettverk av blodårer, den statiske natur av disse modellene hindrer effektiv fordeling av dem til cellene. For eksempel vil celleaggregater som genereres i in vitro-modeller statiske som overstiger noen få millimeter i størrelse alltid utvikle hypoksiske, nekrotiske kjerner 9. De RWV bioreaktorer kan omgå dette problemetved å tilveiebringe fluiddynamikk som tillater effektiv diffusjon av næringsstoffer og oksygen 10-12. Men til dags dato, arbeid med RWV bioreaktorer har vært begrenset til inkludering av en eller to celletyper 13-17. Dessuten, i stedet for en romlig orientering som ligner naturlige vev, de celler som dannes celleaggregater. Hovedårsaken til disse begrensningene har vært mangelen på et stillas i stand til å innlemme celler i en integrert måte. Stillasene som brukes i RWV bioreaktorer til dags dato består, med få unntak 16-18, hovedsakelig av syntetisk mikroperler, rørformede sylindre eller små ark 13-15,19-23. Disse er stive materialer hvis sammensetning og fleksibilitet kan ikke manipuleres, og til hvilke celler som er festet til sin overflate. Således er det usannsynlig at disse modellene vil tilveiebringe et system for å evaluere, på en integrert måte, de forskjellige cellekomponenter slik som stromale celler (f.eks. Fibroblaster,, immun og endoteliale celler) at should bli spredt innenfor stillas til tett etterligne menneskelig vev.
Her beskriver vi utviklingen av en flercellet 3-D organotypiske modell av tarmslimhinnen hos mennesker bestående av en intestinal epitelcellelinje og primære humane lymfocytter, endotelceller og fibroblaster 24. Disse cellene ble dyrket i henhold til mikrogravitasjon gir av RWV bioreaktor 13,25-30. I vår 3-D-modell, besitter ECM mange forskjellige egenskaper, for eksempel en osmolalitet lignende til kulturmediet (f.eks., Neglisjerbare diffusjonelle begrensninger i løpet av kultur), og evnen til å innlemme celler og andre relevante ekstracellulære matriksproteiner, samt passende stivhet til å brukes i bioreaktorer 24. Biologiske systemer er svært komplekse, og i løpet av de siste årene har det vært et skifte i fokus for slimhinne forskning mot undersøkelse av celle interaksjoner med omgivelsene heller enn å studere dem i isolation. Spesielt er betydningen av celle-celle interaksjoner i å påvirke tarmcelleoverlevelse og differensiering godt dokumentert 31-34. Nærmere bestemt har kommunikasjonen mellom epitelceller og deres nisje en stor innflytelse på den epiteliale celle ekspansjon og differensiering 35. Faktisk er det allment akseptert at ikke bare celle-til-celle, men også celle-til-ECM interaksjoner er kritisk for vedlikehold og differensiering av epitelceller i 3-D kultur modeller. Tidligere studier har vist at tarmen ECM-proteiner som kollagen I 24,36,37, laminin og fibronektin 38 39 er medvirkende til å påvirke intestinale epitelceller for å erverve romlig orientering som ligner den native mucosa. Således har utviklingen av nye teknologier, som vår 3-D-modell 24, som kan etterligne den fenotypiske mangfoldet av tarmen er nødvendig hvis forskere har til hensikt å gjenskape den komplekse cellulære og strukturell arkitekturog funksjon i tarmen mikromiljøet. Disse modellene representerer et viktig verktøy i utvikling og evaluering av nye orale legemidler og vaksinekandidater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk uttalelse: Alle blodprøver ble samlet inn fra frivillige som deltok i protokollnummer HP-00040025-1. The University of Maryland Institutional Review Board godkjent denne protokollen og autorisert innsamling av blodprøver fra friske frivillige for studiene som inngår i dette manuskriptet. Hensikten med denne studien ble forklart til frivillige, og alle frivillige ga informert, undertegnet samtykke før blodprøvetaking.
Merk: Se tabell 1 for medium supplement forberedelse. Se tabell 2 for fremstilling av 3-D kulturmedier.
1. Utarbeidelse av kultur Vessels
- Skru av lokket på påfyllings porten på 50 ml-fartøy og fyll opp med 50 ml sterilt dyrkingsmedium (f.eks., RPMI). Utfør alle prosedyrer under sterile forhold i en laminær hette.
- Sett på lokket og tørk bort sølt medium på alle underlag med 70% etanol.
- Tillate fartøyet å incubspiste i minst 15 min til O / N på RT.
- Bruk fylleåpning for å forkaste kulturmediet og tilsett 30 ml av 3-D kulturmediet.
- Tørk eventuelt sølt medium på alle underlag med 70% etanol.
2. Utarbeidelse av celler
- Menneskelig epitel cellelinje (HCT-8) 24,40.
- Kultur celler i RPMI supplert med 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 50 ug / ml gentamicin, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM HEPES-buffer og 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS ) (supplement 1). Ved 70% konfluens, splittede celler ved et forhold på 1: 5.
- Menneske colonic fibroblaster (CCD-18Co celler) 24,41.
- Kultur celler i Basal Eagles medium anriket med supplement 1 ved sammenflyting, splittede celler ved et forhold på 1: 3..
- Menneskelig navleveneendotel (HUVEC) celler
- Kultur celler i endotel Basal Medium (EBM) medium anriket med 100 ug / ml heparin, 3 ug / ml endotelcelle-vekstsupplement (ECGS), og supplere 1 Ved 70% konfluens, splittede celler ved et forhold på 1: 2..
- Isolere Perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra blod ved tetthetssentrifugering ved anvendelse av standardteknikker 43.
- I korthet, ved anvendelse av en 10 ml-pipette, tilsett forsiktig 30 ml fortynnet blod (1: 1 blodet: Fosfatbufret saltløsning (PBS)) i et 50 ml konisk rør inneholdende 10 ml av densitetssentrifugering media. Etter sentrifugeringstrinn, vil lymfocytter og monocytter bor i den "hvite" lag mellom tetthet sentrifuge media og plasma-lag.
- Samle det hvite sjiktet ved hjelp av en overføring pipette. Unngå granulocytt forurensning ved å begrense samlingen av tetthetssentrifugering media. Etter vask 43, use PBMC som er eller oppbevart i flytende N2.
Merk: Det er viktig å understreke at PBMC består hovedsakelig av lymfocytter og monocytter, med en liten andel av dendrittiske celler og andre celletyper.
3. Utarbeidelse av kollagen-innebygde celler
- Bestem antall innsatser behov basert på antall eksperimentelle forhold til å bli satt opp. Plassere et passende antall innsatser inn i brønnene i en 6-brønns plate.
- Utarbeide en suspensjon av HUVEC og fibroblaster:
- Vask kolbene to ganger i PBS og løsne cellene ved hjelp av trypsin, 0,25% (1x) med 0,05% trypsin-tetranatrium-etylendiamintetraacetat (Trypsin-EDTA). Tilsett nok trypsinoppløsning til å dekke helheten av cellekulturen flateareal. Detachment oppstår vanligvis innen 5 til 15 min
- Samlefrittliggende celler i en 50 ml-rør inneholdende 30 ml av Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) -30% FBS medium.
- Sentrifuger røret ved 500 x g i 10 min.
- Resuspender cellene i 30 ml DMEM-30% FBS-medium.
- Telle det totale antall levedyktige celler ved å fortynne 20 pl av de resuspenderte cellene med 20 ul av Trypan blått fargestoff. Laste hemocytometer med celleblandingen. Levedyktige PBMC vil være hvit klart; nonviable PBMC skal tilegne seg fargestoff og bli blå.
- Resuspender hver celletype i DMEM-30% FBS-medium ved en konsentrasjon på 5 - 8 x 10 7 celler ml - 1.
- Forbered celleholdige kollagen gels
Merk: Hvert fartøy vil kreve fremstilling av ~ 5 ml celle-inneholdende kollagen-gel.- I et 50 ml konisk rør fremstille kollagenet blandingen ved tilsetning av 1 x DMEM media supplert med 50 ug / ml gentamicin, 2 mM L-glutamin og 10% varme-inactivated FBS pluss 3 mg / ml bovint kollagen-I, 10 pg / ml laminin, 40 ug / ml kollagen IV, 10 pg / ml fibronektin, 2 ug / ml heparin-sulfat proteoglykaner og 15 mM NaOH (for å nå den fysiologiske pH).
- Lukke røret og bland ved å snu flere ganger inntil blandingen er fullstendig homogenisert. Unngå bobledannelse.
VIKTIG: Hold blandingen på is for å hindre geldannelse.- Kritiske trinn: Hvis blandingen utvikler et surt utseende (gulaktig farge), tilsett noen dråper av sterilt 1 N NaOH for å nøytralisere blandingen.
- Legg konsentrert HUVEC og fibroblaster ved en tetthet på 1,0 - 1,2 og 1,5 - 2,0 x 10 6 celler / ml, henholdsvis til den anrikede-kollagenblanding (beskrevet ovenfor). Lukk rørene og bland ved å snu flere ganger inntil blandingen er fullstendig homogenisert. Unngå bobledannelse. VIKTIG: Hold blandingen på is for å hindre geldannelse.
- Tilsett 4 - 5 ml av celle-inneholdende kollagengel til hver pakning som på forhånd er lagt inn i en seks godt plate, og tillatt å gelify i hetten med liten eller ingen bevegelse i 1 time.
- Etter 1 time, overføre seks-brønns plate i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator i 1 - 2 ytterligere timer.
- Returnere 6-brønns plate til hetten, og ved hjelp av en steril pinsett og skalpell aseptisk cut-off av membranen fra innsatsen løsner det celleholdige gel fra membranen. Skjær frittliggende gel i små firkanter (~ 5 x 5 mm).
- Legge til den lille celle-inneholdende kvadrater i et 50-ml HARV ved hjelp av fylleåpning.
- Utarbeide en suspensjon av HCT-8 epitelceller:
- Vask kolbene to ganger i PBS og løsne cellene ved hjelp av trypsin, 0,25% (1x) med Trypsin-EDTA-behandling. Tilsett nok trypsinoppløsning til å dekke helheten av cellekulturen flateareal. Detachment oppstår vanligvis innen 10 til 15 min.
- Samle frigjorte celler i 30 ml DMEM-30% FBS-medium.
- sentrifugeuge DMEM-30% FBS medium inneholdende rør ved 500 x g i 10 min.
- Resuspender cellene i 30 ml DMEM-30% FBS-medium.
- Telle det totale antall levedyktige celler som beskrevet i 3.2.5.
- Resuspender HCT-8 epiteliale celler i DMEM-30% FBS-medium ved en konsentrasjon på 10 celler 7 ml - 1.
- Tilsett 1 ml av de konsentrerte HCT-8-epitelceller i den 50 ml HARV ved hjelp av fylleåpning.
- Ved hjelp av fylleåpningen, tilsett ytterligere 3-D kulturmedium inntil beholderen er nesten fullstendig (~ 20 ml).
- Sett på lokket og tørk leppe av fylleåpning med 70% etanol.
- Plasser en sprøyte i hver sprøyte porten på RWV: sted en 5 ml-sprøyte inneholdende 3-4 ml av 3-D dyrkingsmedium i en port og en 5 ml-tomme sprøyten i den andre porten.
- Fjern eventuelle synlige bobler ved å trekke inn den tomme sprøyte og under tilnærmet samme volum av medium injiseres gjennom den andre sprøyte porten.
- Plasser vesSels i bioreaktor, slå på strømmen og angi hastigheten til ca 13 til 14 omdreininger i minuttet.
Merk: Kritisk trinn: Rotasjonshastigheten kan være nødvendig å justere noen få ganger i løpet av et eksperiment for å opprettholde cellene i bane inne i beholderen, for derved å unngå kontakt med beholderveggene. - Kultur celler ved 37 ° C, 5% CO2 i henhold vektløshet, levert av RWV bioreaktoren.
- Endring kulturmedium etter 3 - 4 dager ved å erstatte omtrent 30 ml med frisk 3-D kulturmediet.
- Etter 4 dager (± 1 dag), fjerne fartøyer fra bioreaktor og legge lymfocytter / monocytter til fartøyene (2 x 10 7 / fartøy).
- Plasser skipene tilbake i bioreaktoren ved 37 ° C, 5% CO2 i ytterligere 5 dager (± 1 dag).
- Etter ytterligere 5 dager (dag 9 av kulturen), legge lymfocytter / monocytter til fartøyene (2 x 10 7 / fartøy) og fortsette kulturer for inntil 12 ekstra dager. Endring kulturmedium etter 3 - 4 dager ved å erstatte omtrent 30 ml med frisk 3-D kulturmediet.
4. Høsting 3-D kulturer for histologi
- Ved hjelp av en overførings pipette avling hver liten gel-fragmentet, nå kalt "bygge", inn i en seks-brønns plate inneholdende 10 ml 10% formalin buffer. La i 3 timer ved RT eller av 12 - 16 timer ved 4 ° C.
- Forbered vevet behandling og innebygging kassetter ved merking og legge til to stykker av biopsi puter i hver kassett.
- Fordyp kassettene i 10% formalin buffer.
- Ved hjelp av pinsett plassere de faste-konstruksjoner mellom de to puter.
- Fordyp kassettene i 10% formalin buffer.
- Fortsett med standardprosedyrer for innebygging, seksjonering, og farging 44.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidligere utviklet en flercellet 3-D organotypiske modell av tarmslimhinnen hos mennesker bestående av en intestinal epitelcellelinje og primære humane lymfocytter, endotelceller og fibroblaster dyrket under betingelser mikrogravitasjon 24 (figur 1). Fibroblaster og endotelceller ble innleiret i en kollagen I matrix beriket med ytterligere gut basalmembran-proteiner 45 (f.eks., Laminin, kollagen IV, fibronektin og heparinsulfat proteoglykan) og tilsatt til RWV bioreaktorer. Etter 10 - 15 dager, histologisk farging analyse viste nærvær av Haug-lignende strukturer i konstruksjonene. Omtrent 60 - 80% av disse epitelceller ble organisert som et monolag av polariserte celler med sine kjerner som befinner seg i en basal posisjon nær ECM, som er en viktig funksjon av godt differensierte celler (figur 2).
ent "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1: Skisse av Byggingen av 3-D modell. Fire trinn er nødvendige for å bygge opp den 3-D system. Først, for å oppnå det nødvendige antall celler for å generere den 3-D-modell, en human intestinal enterocyte epitelial cellelinje (HCT-8) og primære humane endotelceller og fibroblaster blir dyrket som 2-D konfluent monolag. For det andre ECM består av kollagen-I matrix beriket med ekstra gut kjeller membran proteiner (f.eks., Laminin, kollagen IV, fibronektin og heparin sulfat proteoglykan) er forberedt. For det tredje blir fibroblaster og endotelceller innleiret i en kollagen-I blandingen og tilsatt til RWV bioreaktorer, etterfulgt av tilsetning HCT-8 epitelceller. For det fjerde er primære lymfocytter tilsatt til kulturen på dager 4 og 9 (± 1 dag)."> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Sammenligning mellom normal menneskelig tarmen og organotypiske Models. Hematoxylin og eosin farging av celler dyrket i 3-D mikrogravitasjon modell: vev ble farget lilla og stillas farget rosa. Celler fra den 3-D-modell ble dyrket i 14 ( "a" og "b") og 20 dager (c). Tjue dager etter såing, er totalt celle tall vedlikeholdt, og cellene var godt differensiert Viser Haug-lignende funksjoner. Bildene vises på 100X ( "a" og "b") og 40X ( "c") forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Produktnavn | Pkg. Størrelse | tilberedning | Arbeide Konsentrasjon | Lagring |
| Fibroblast vekstfaktor-Basic (bFGF) | 25 mg | For å fremstille 25 mikrogram / ml stamløsning; legge til 25 ug av FGF i 1 ml sterilt medium (RPMI pluss 1% FCS), virvel for å oppløse tilsettes 100 ul / alikvot | 5 ng / ml | pulver -20 o C, arbeids porsjoner -20 o C, unngå gjentakelse fryse / tine |
| Stamcellefaktor (SCF) | 10 mg | For å fremstille 10 mikrogram / ml stamløsning; legge til 10 ug av SCF i 1 ml sterilt medium (RPMI pluss 1% FCS), virvel å løse opp, legge til 250 ul / alikvot | 5 ng / ml | pulver -20 o C, arbeids porsjoner -20 o C, unngå gjentakelse fryse / tine |
| Hepatocytt vekstfaktor (HGF) | 5 mg | For å fremstille 5 ug / ml stamløsning; tilsett 5 ug av HGF i 1 ml sterilt medium (RPMI pluss 1% FCS), virvel å løse opp, legge til 200 ul / alikvot | 2 ng / ml | pulver -20 o C, arbeids porsjoner -20 o C, unngå gjentakelse fryse / tine |
| endotelin 3 | 50 mg | For å fremstille 50 mikrogram / ml stamløsning; legge til 50 ug av Endotelin inn i 1 ml sterilt medium (RPMI pluss 1% FCS), virvel for å oppløse tilsettes 100 ul / alikvot | 10 ng / ml | pulver -20 o C, arbeids porsjoner -20 o C, unngå gjentakelse fryse / tine |
| laminin | 1 mg | Tine sakte ved 2 - 8 o C, virvel og tilsett 100 ul / delmengde | 10 mg / ml | flytende -20 o C, arbeider porsjoner -20 o C, unngå gjentakelse freeze / tine |
| Vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) | 10 mg | For å fremstille 5 ug / ml stamløsning; legge til 10 ug av VEGF til 2 ml sterilt vann, virvel for å løse opp, tilsett 100 ul / alikvot | 1 ng / ml | pulver -20 o C, arbeids porsjoner -20 o C, unngå gjentakelse fryse / tine |
| Leukemi hemmende faktor (LIF) | 50 mg | For å fremstille 20 mikrogram / ml stamløsning; legge til 50 ug av LIF i 2,5 ml sterilt vann, virvel for å løse opp, tilsett 100 ul / alikvot | 4 ng / ml | pulver -20 o C, arbeids porsjoner -20 o C, unngå gjentakelse fryse / tine |
| adenin | 25 g | For å forberede 0,18 M stamløsning; legge til 121,5 mg og adedine inn i 50 ml av 0,05 M HCl (250 ul av 37,1% HCl i 50 ml vann)), virvel for å oppløse, filter og steriliseretilsett 1 ml / aliquot | 1,8 x 10 -3 M | pulver 4 o C, som arbeider porsjoner -20 o C, unngå gjentakelse fryse / tine |
| Insulin | 50 mg | For å fremstille 5 mg / ml stamløsning; tilsett 50 mg av insulin i 10 ml 0,005 M HCI (5 ul av 37,1% HCl i 10 ml vann)), virvel for å oppløse, filter sterilisere og tilsett 0,5 ml / aliquot | 5 mg / ml | pulver -20 o C, arbeids porsjoner -20 o C, unngå gjentakelse fryse / tine |
| T3 | 100 mg | For å forberede 2 x 10 -8 M stamløsning; legge til 3,4 mg T3 inn i 25 ml 1 M NaOH, fortynnet 0,1 ml av denne løsningen i 9,9 ml PBS, fortynnes igjen 0,1 ml av denne løsningen i 9,9 ml PBS, virvel for å oppløse, filter sterilisere og tilsett 0,5 ml / aliquot | 2 x 10 -11 M | pulver -20 o C, som arbeider porsjoner -20 <sup> o C, unngå gjentakelse fryse / tine |
| koleratoksin | 5 mg | For å forberede 10 -7 M stamløsning; legge til 5 mg koleratoksin inn i 5 ml sterilt DDH 2 O (butikk ved -20 o C); fortynne 50 mL av denne løsningen i 5 ml DDH 2 O, til virvel homogenisere, filter sterilisere og tilsett 0,5 ml / delmengde | 10 -10 M | pulver 4-8 o C, som arbeider porsjoner -20 o C, unngå gjentakelse fryse / tine |
| fibronektin | 1 mg | For å fremstille 1 mg / ml stamløsning; tilsett 1 mg fibronektin i 1 ml sterilt vann destilleres. Tillat 30 min. for materiale til å gå i oppløsning. IKKE agitere ELLER SWIRL. Tilsett 100 ul / alikvot | 10 mg / ml | pulver 4-8 o C, som arbeider porsjoner -20 o C, unngå gjentakelse fryse / tine |
| apo-Transferrin | 100 mg For å fremstille 5 mg / ml stamløsning (1,000x); legge til 100 mg av transferrin i 20 ml PBS virvel å løse opp, filter sterilisere og tilsett 0,5 ml / delmengde | 5 mg / ml | pulver -20 o C, arbeids porsjoner -20 o C, unngå gjentakelse fryse / tine | |
| heparin | 50 KU | For å fremstille 50 mg / ml stamløsning (1,000x); tilsett 50 mg heparin i 1 ml vann virvel for å løse opp, filter sterilisere og tilsett 1 ml / aliquot | 0,1 mg / ml | pulver -20 o C, arbeids porsjoner -20 o C, unngå gjentakelse fryse / tine |
| Heparansulfat proteoglykan | 1 mg | For å fremstille 0,1 mg / ml stamløsning; legge til 1 mg av heparan-sulfat i 10 ml sterilt vann virvel for å løse opp, og tilsett 0,2 ml / aliquot | 2 mg / ml | pulver -20 o C, som arbeider porsjoner -20 o C, unngågjenta fryse / tine |
| kollagen IV | 5 mg | For å fremstille 2 mg / ml stam solutin: Tilsett 2 mg av kollagen V i 2,5 ml steril 0,25% eddiksyre. Tillat 1-2 timer for materiale til å gå inn i løsningen Swirl for bedre tynning.. Tilsett 400 ul / delmengde | 80 mg / ml | pulver -20 o C, arbeids porsjoner -20 o C, unngå gjentakelse fryse / tine |
Tabell 1: Definert Medium Supplement forberedelse.
| F-12 medium supplert med | |||
| reagens | Stock Solution | Den endelige løsningen | Beløp |
| Føtalt kalveserum | 10% | 50 ml | |
| natriumpyruvat | 100 mm | 1 mm | 5 ml |
| L-glutamin | 200 mm | 2 mm | 5 ml |
| Hepes | 1 M | 10 mm | 5 ml |
| gentamicin | 50 mg / ml | 50 ug / ml | 500 mL |
| Penicillin / streptomycin | 10 000 U / ml / 10 mg / ml | 100 U / ml / 100 pg / ml | 5 ml |
| Insulin | 5 mg / ml | 5 ug / ml | 500 mL |
| T3 | 2 x 10-8 M | 2 x 10 -11 M | 500 mL |
| adenin | 1,8 x 10-1 M | 1,8 x 10-3 M | 5 ml |
| transferrin | 5 ug / ml | 500 mL | |
| heparin | 50 mg / ml | 0,1 mg / ml | 1 ml |
| ECGS | 3 mg / ml | 3 ug / ml | 5 ml |
| bFGF | 25 ug / ml | 5 ng / ml | 100 pl |
| SCF | 10 ug / ml | 5 ng / ml | 250 fil |
| HGF | 5 ug / ml | 2 ng / ml | 200 ul |
| endotelin 3 | 50 ug / ml | 10 ng / ml | 200 ul |
| LIF | 20 pg / ml | 4 ng / ml | 100 pl |
| VEGF | 5 ug / ml | 1 ng / ml | 100 pl |
| Choleran toksin | 10 -7 M | 10 -10 M | 500 fil </ Td> |
| Merk: Mengden sitert ovenfor er for fremstilling av 500 ml 3-D kulturmedier. Media må oppbevares ved 4 ° C i mer enn 2 uker | |||
Tabell 2: Fremstilling av 3-D Culture Media.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskriptet, beskriver vi utviklingen av en bioengineered modell av det menneskelige tarmslimhinnen består av multiple celletyper, inkludert primære, humane lymfocytter, fibroblaster og endotelceller, samt intestinale epitel-cellelinjer 24. I denne 3-D-modell, blir cellene dyrket i et kollagenrikt ekstracellulær matriks i henhold til mikrogravitasjon betingelser 24.
Som beskrevet tidligere, de viktigste trekk ved denne modellen er: (i) evnen til å etterligne den epitelvev monolaget organisasjon, (ii) induksjon av passende polaritet av epitelceller, tett veikryss, desmosomer og mikrovilli, (iii) en lang- uttrykket kultur (opp til 20 dager) med høy levedyktighet av de primære celler (f.eks., fibroblaster og endotelceller), (iv) uttrykket vev-lignende differensieringsmarkører, inkludert villin, cytokeratin, E-cadherin og mucin, (v) en evne til å produsere betydelige mengder av cytokiner (f.eks., IL-8) og alkalisk fosfatase ved antigenstimulering, (vi) til transport av næringsstoffer, slik som glukose (f.eks., ekspresjon av disakkarider, og nærværet av sukker transportører), og (vii) multi-avstamning differensiering av intestinale epitelceller (ie., absorberende enterocyte, Globet og M-celler) 24.
Det er viktig å understreke at for å oppnå reproduserbare resultater ved hjelp av vår 3-D modell etterforskeren må forholde seg til gode cellekultur retningslinjer 46-48. Det er avgjørende å systematisk kontrollere celler for levedyktighet, mycoplasma forurensning og endringer i cellevekst oppførsel. Hvis et problem er identifisert, sikre først at ingen uautoriserte endringer har blitt introdusert til protokollen. Hvis problemet vedvarer, bytt til en ny gruppe med de ulike mellom komponenter (inkludert serum) og /eller celler. En begrensning av vår 3-D-modellen er bruken av tumorigent HCT-8 epitelcellelinje. Imidlertid er det viktig å vurdere at tilstedeværelsen av HCT-8 linje har den fordelen av å være kommersielt tilgjengelig. Dessuten, disse epitelceller ikke uttrykke enten klassisk eller ikke-klassisk human leukocytt antigen (HLA) -klassen jeg molekyler 49,50. Således, de tillater kultur av epitelceller med PBMC fra forskjellige HLA-klasse I haplotyper i fravær av epitelcelle-PBMC alloreactivity. Videre, når man sammenligner dette systemet med systemer som gut stamcelle organoids 51-53, denne modellen byr på mange fordeler. Selv gut stamcelle organoids gi uvurderlig informasjon om cellebiologi og tarm differensiering 51-53, tillater denne modellen direkte apikale eksponering for næringsstoffer, narkotika og patogener. Denne modellen gir også enkel tilgang til luminal innholdet slike antimikrobielle peptider og cytokiner. I motsetning til dette, organoids er kompakte unsin med en luminal vender innover. Følgelig er det en begrenset mengde av produkt som kan innføres i organoid lumen 54.
Vi mener at vår flercellet 3-D organotypic modell av den menneskelige tarmslimhinnen har bred potensial som et verktøy for funn i både helse og sykdom, inkludert samspill med patogener, antigen menneskehandel, og inflammatorisk og metabolske prosesser 24. Til slutt, på grunn av flercellede naturen av vår 3-D-modell, kan vår modell gjør det mulig gevinst-og tap-studier med immuncelletyper som er egnet til å påvirke epitelceller oppførsel in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor | Synthecon | RCCs-4DQ | For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available. |
| Disposable 50 ml-vessel | Synthecon | D-405 | Box with 4 vessels |
| HCT-8 epithelial cells | ATCC | CCL-244 | |
| CCD-18Co Fibroblasts | ATCC | CRL-1459 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | ATCC | CRL-1730 | HUVEC |
| Fibroblast Growth Factor-Basic | Sigma | F0291 | bFGF |
| Stem Cell Factor | Sigma | S7901 | SCF |
| Hepatocyte Growth Factor | Sigma | H1404 | HGF |
| Endothelin 3 | Sigma | E9137 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
| Vascular Endothelial Growth Factor | Sigma | V7259 | VEGF |
| Leukemia Inhibitory Factor | Santa Cruz | sc-4377 | (LIF |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Insulin | Sigma | I-6634 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma | T-6397 | T3 |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
| Fibronectin | BD | 354008 | Isolated from human plasma |
| apo-Transferrin | Sigma | T-1147 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Heparan sulfate proteoglycan | Sigma | H4777 | Isolated from basement membrane of mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | Isolated from human placenta |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| D-MEM, powder | Invitrogen | 12800-017 | |
| 10% formalin–PBS | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Bovine type I collagen | Invitrogen | A1064401 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | MT25-052-CI | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750-060 | |
| Penicillin/streptomincin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
| Ham's F-12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| Basal Medium Eagle | Invitrogen | 21010-046 | BME |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | EBM-2 |
| Endothelial cell growth supplement | Millipore | 02-102 | ECGS |
References
- Aumailley, M., Timpl, R. Attachment of cells to basement membrane collagen type IV. J Cell Biol. 103, 1569-1575 (1986).
- Buset, M., Winawer, S., Friedman, E. Defining conditions to promote the attachment of adult human colonic epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 23, 403-412 (1987).
- Fitzgerald, T. J., Repesh, L. A., Blanco, D. R., Miller, J. N. Attachment of Treponema pallidum to fibronectin, laminin, collagen IV, and collagen I, and blockage of attachment by immune rabbit IgG. Br J Vener Dis. 60, 357-363 (1984).
- Goetschy, J. F., Ulrich, G., Aunis, D., Ciesielski-Treska, J. Fibronectin and collagens modulate the proliferation and morphology of astroglial cells in culture. Int J Dev Neurosci. 5, 63-70 (1987).
- Paye, M., Lapiere, C. M. The lack of attachment of transformed embryonic lung epithelial cells to collagen I is corrected by fibronectin and FXIII. J Cell Sci. 86, 95-107 (1986).
- Pourreau-Schneider, N., et al. Estrogen response of MCF-7 cells grown on diverse substrates and in suspension culture: promotion of morphological heterogeneity, modulation of progestin receptor induction; cell-substrate interactions on collagen gels. J Steroid Biochem. 21, 763-771 (1984).
- Pratt, B. M., Harris, A. S., Morrow, J. S., Madri, J. A. Mechanisms of cytoskeletal regulation. Modulation of aortic endothelial cell spectrin by the extracellular matrix. Am J Pathol. 117, 349-354 (1984).
- Jessup, J. M., et al. Microgravity culture reduces apoptosis and increases the differentiation of a human colorectal carcinoma cell line. In vitro cellular & developmental biology - Animal. 36, 367-373 (2000).
- Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Res. 46, 5320-5329 (1986).
- Unsworth, B. R., Lelkes, P. I.
- Zwezdaryk, K. J., Warner, J. A., Machado, H. L., Morris, C. A., Honerzu Bentrup, K. Rotating cell culture systems for human cell culture: human trophoblast cells as a model. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M. M. Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Barrila, J., et al. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat Rev Microbiol. 8, 791-801 (2010).
- Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes and infection / Institut Pasteur. 8, 1813-1825 (2006).
- Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect Immun. 69, 7106-7120 (2001).
- Alcantara Warren, C., et al. Detection of epithelial-cell injury, and quantification of infection, in the HCT-8 organoid model of cryptosporidiosis. J Infect Dis. 198, 143-149 (2008).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
- Lin, H. J., O'Shaughnessy, T. J., Kelly, J., Ma, W. Neural stem cell differentiation in a cell-collagen-bioreactor culture system. Brain Res. Dev Brain Res. 153, 163-173 (2004).
- He, L., et al. Increased proliferation and adhesion properties of human dental pulp stem cells in PLGA scaffolds via simulated microgravity. Intl Endo J. , (2015).
- Straub, T. M., et al. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg Infect Dis. 13, 396-403 (2007).
- Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Lack of norovirus replication and histo-blood group antigen expression in 3-dimensional intestinal epithelial cells. Emerg Infect Dis. 19, 431-438 (2013).
- Goodwin, T. J., Schroeder, W. F., Wolf, D. A., Moyer, M. P. Rotating-wall vessel coculture of small intestine as a prelude to tissue modeling: aspects of simulated microgravity. Proc Soc Exp Biol Med. 202, 181-192 (1993).
- Goodwin, T. J., Jessup, J. M., Wolf, D. A. Morphologic differentiation of colon carcinoma cell lines HT-29 and HT-29KM in rotating-wall vessels. In Vitro Cell Dev Biol. 28, 47-60 (1992).
- Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Engineering of a multicellular organotypic model of the human intestinal mucosa. Gastroenterology. 141, 18-20 (2011).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am J Physiol Renal Physiol. 281, 12-25 (2001).
- Cherry, R. S., Papoutsakis, E. T. Physical mechanisms of cell damage in microcarrier cell culture bioreactors. Biotech and Bioeng. 32, 1001-1014 (1988).
- Bergmann, S., Steinert, M. From Single Cells to Engineered and Explanted Tissues: New Perspectives in Bacterial Infection Biology. Int Rev Cell Mol Biol. 319, 1-44 (2015).
- Xu, B., et al. Simulated microgravity affects ciprofloxacin susceptibility and expression of acrAB-tolC genes in E. coli ATCC25922. Int J Clin Exp Pathol. 8, 7945-7952 (2015).
- Han, C., Jiang, C., Yu, C., Shen, H. Differentiation of transforming growth factor beta1-induced mesenchymal stem cells into nucleus pulposus-like cells under simulated microgravity conditions. Cell Mol Biol (Noisy-le-Grand, France). 61, 50-55 (2015).
- Wang, C., et al. Microgravity activates p38 MAPK-C/EBPbeta pathway to regulate the expression of arginase and inflammatory cytokines in macrophages. Inflamm Res. 64, 303-311 (2015).
- Iliev, I. D., et al. Human intestinal epithelial cells promote the differentiation of tolerogenic dendritic cells. Gut. 58, 1481-1489 (2009).
- Kerneis, S., Bogdanova, A., Kraehenbuhl, J. P., Pringault, E. Conversion by Peyer's patch lymphocytes of human enterocytes into M cells that transport bacteria. Science. 277, 949-952 (1997).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. , (2010).
- Lei, N. Y., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support the growth of intestinal epithelial stem cells. PLoS One. 9, e84651 (2014).
- Voog, J., Jones, D. L. Stem cells and the niche: a dynamic duo. Cell Stem Cell. 6, 103-115 (2010).
- Jabaji, Z., et al. Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium. Tissue Eng Part C Methods. 19, 961-969 (2013).
- Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9, e107814 (2014).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9, 2354-2368 (2014).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med. 239, Maywood, N.J. 1124-1134 (2014).
- Tompkins, W. A., Watrach, A. M., Schmale, J. D., Schultz, R. M., Harris, J. A. Cultural and antigenic properties of newly established cell strains derived from adenocarcinomas of the human colon and rectum. J Natl Cancer Inst. 52, 1101-1110 (1974).
- Hinterleitner, T. A., Saada, J. I., Berschneider, H. M., Powell, D. W., Valentich, J. D. IL-1 stimulates intestinal myofibroblast COX gene expression and augments activation of Cl- secretion in T84 cells. Am J Physiol. 271, 1262-1268 (1996).
- Hoshi, H., McKeehan, W. L. Brain- and liver cell-derived factors are required for growth of human endothelial cells in serum-free culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 6413-6417 (1984).
- Salerno-Goncalves, R., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Characterization of CD8(+) Effector T Cell Responses in Volunteers Immunized with Salmonella enterica. Serovar Typhi Strain Ty21a Typhoid Vaccine. J Immunol. 169, 2196-2203 (2002).
- Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. , e51064 (2014).
- Eastburn, D. J., Mostov, K. E. Laying the foundation for epithelia: insights into polarized basement membrane deposition. EMBO Rep. 11, 329-330 (2010).
- Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. a report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Altern Lab Anim. 33, 261-287 (2005).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111, 1021-1046 (2014).
- Hartung, T., et al. Good Cell Culture Practice. ECVAM Good Cell Culture Practice Task Force Report 1. Altern Lab Anim. 30, 407-414 (2002).
- Blanchet, O., et al. Altered binding of regulatory factors to HLA class I enhancer sequence in human tumor cell lines lacking class I antigen expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 3488-3492 (1992).
- Palmisano, G. L., et al. HLA-E surface expression is independent of the availability of HLA class I signal sequence-derived peptides in human tumor cell lines. Hum Immunol. 66, 1-12 (2005).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. , (2014).
