Summary
三次元（3-D）環境中で増殖する細胞は、2-D環境（ 例えば 、フラスコまたはディッシュ）で細胞培養上顕著な改善を示します。ここでは、回転-壁容器（RWV）バイオリアクターが提供する微小重力下で培養ヒト腸粘膜の多細胞3次元器官モデルの開発について説明します。
Abstract
三次元（3-D）環境中で増殖する細胞は、多数の2次元環境における細胞培養の隙間（ 例えば 、フラスコまたはディッシュ）をブリッジする可能性があるからです。実際には、広くフラスコまたはディッシュで増殖した細胞は、脱分化し、それらが由来する組織の特殊な機能を失う傾向があることが認識されます。 （a）は、静的モデルとバイオリアクターを用いて（b）のモデル：現在、天然の細胞外マトリックス（ECM）を模倣する細胞が足場に播種される3-D培養系の2種類が主に存在します。最初のブレークスルーは、静的な3次元モデルでした。このような回転-壁容器（RWV）バイオリアクターなどのバイオリアクターを用いた3次元モデルは、より最近開発されています。 RWVバイオリアクターのオリジナルのコンセプトは、1990年代初頭にNASAのジョンソン宇宙センターで開発された、そのような低酸素性、壊死性コアの開発のような静的なモデルの限界を克服すると考えられています。 RWVバイオリアクターは、番目のを回避する可能性があります栄養と酸素の効率的な拡散を可能にする流体力学を提供することによって、問題です。これらのバイオリアクターは、彼らの曝気源の種類によって異なる培養容器の二つの異なるフォーマットをサポートし、回転させるのに役立つローテータベースで構成されています。中心部に同軸人工肺で（1）スローターニング横船舶（STLVsを）、または（2フラット、シリコーンゴムガス転写膜を介して酸素との）高アスペクト比の船舶（HARVs）。バブル形成とその結果としての乱流を回避しながら、これらの血管は、効率的なガス移動を可能にします。これらの条件は、モデルは、培養容器内部の重力（重力）を低減し、層流と最小限のせん断力が生じます。ここでは、RWVバイオリアクターが提供する腸上皮細胞株および一次ヒトリンパ球、微小重力下で培養内皮細胞および線維芽細胞から成るヒト腸粘膜の多細胞3次元器官モデルの開発について説明します。</ P>
Introduction
改善するために、最初の3-Dモデルを構築する画期的な科学者は、足場の異なるタイプの調査を開始したときに、1980年代の初頭に報告された（ 例えば 、ラミニン、コラーゲンタイプI、コラーゲンIV、およびフィブロネクチン）および成長因子のカクテル「静的」3次元モデル1-7の細胞と細胞とECMの相互作用。それ以来、これらのモデルの主な問題点は、媒体および組織の構築8内の栄養と酸素の転送の制限となっています。血管のネットワークを周囲から栄養と酸素の定常流を受ける生体内環境での細胞とは対照的に、これらのモデルの静的な性質は、細胞へのそれらの効果的な分散を妨げます。例えば、 インビトロで生成された細胞凝集体のサイズは数ミリを超える静的モデルは常に低酸素性、壊死性コア9を開発します。 RWVバイオリアクターは、この問題を回避する可能性があります栄養素および酸素10〜12の効率的な拡散を可能にする流体力学を提供することによって。しかし、今日まで、RWVバイオリアクターを使用して作業は、1つまたは2つの細胞型13〜17を含むことに限定されています。また、代わりにネイティブの組織に似た空間的配向の、それらの細胞は、細胞凝集体を形成しました。これらの制限の主な理由は、一元的に細胞を組み込むことができる足場の欠如となっています。現在までにRWVバイオリアクターで使用される足場は、主に合成マイクロビーズ、チューブ状の円筒又は小シート13-15,19-23のいくつかの例外を除い16-18、で、構成されています。これらは、その組成や柔軟性に操作することができず、その細胞がその表面に結合して硬い材料です。したがって、一体的に、そのようなことだ間質細胞（ 例えば 、線維芽細胞、免疫細胞および内皮細胞）のような種々の細胞成分、これらのモデルを評価するには、システムを提供するとは考えにくいですhouldは密接にヒト組織を模倣するために、足場内に分散します。
ここでは、腸上皮細胞株および一次ヒトリンパ球、内皮細胞からなるヒト腸粘膜の多3次元器官型モデルの開発について説明し、線維芽細胞24。これらの細胞は、RWVバイオリアクター13,25-30によって提供微小重力下で培養しました。我々の3-Dモデルでは、ECM（ 例えば 、培養中に、無視できる拡散拘束）は、培地に類似オスモル濃度などの多くの異なる特性を有し、細胞および他の関連する細胞外マトリックスタンパク質を取り込む能力、ならびにバイオリアクター24において使用される適切な剛性。生物学的システムは非常に複雑であり、過去数年間、isolatioでそれらを勉強するのではなく、その周囲との細胞の相互作用の検討に向けて粘膜研究の焦点のずれがありましたn個。具体的には、腸細胞の生存および分化に影響を与えるで細胞-細胞相互作用の重要性はよく31-34に記載されています。具体的には、上皮細胞とそのニッチとの間の通信は、上皮細胞の増殖と分化35に多大な影響を与えています。実際、それは広く受け入れられていることだけでなく、細胞間だけでなく、細胞 - ECM相互作用が3次元培養モデルにおける上皮細胞の維持および分化に重要です。以前の研究は、コラーゲンI 24,36,37、ラミニン38およびフィブロネクチン39は、ネイティブの粘膜に似た空間的配向を獲得するために腸上皮細胞に影響を与えることに尽力しているとして、その腸のECMタンパク質を実証しました。したがって、腸の表現型の多様性を模倣することができ、当社の3次元モデル24、のような新しい技術の開発が必要とされている研究者は、複雑な細胞及び構造のアーキテクチャを再作成する場合および腸の微小環境の機能。これらのモデルは、新しい経口薬やワクチン候補の開発および評価における重要なツールを表します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
倫理の声明：すべての血液標本は、プロトコル番号HP-00040025から1に参加したボランティアから採取しました。メリーランド大学施設内倫理委員会は、このプロトコルを承認し、この原稿に含まれた研究のための健康なボランティアからの血液標本のコレクションを承認しました。本研究の目的は、ボランティアに説明した、そしてすべてのボランティアが知らさ与えた、採血前に同意書に署名しました。
注：培地補充の準備については、 表1を参照してください。 3-D培養培地の調製のための表2を参照されたいです。
培養容器の調製
- （ 例えば 、RPMI）50ミリリットル、容器の充填ポートのキャップを外し、無菌培養培地50mlで埋めます。層流フード内で無菌状態の下ですべての手順を実行します。
- キャップを交換し、70％エタノールで任意の表面上の任意のこぼれたメディアを拭きます。
- 容器はincubを許可します室温でO / Nに少なくとも15分間食べました。
- 培地を廃棄し、3次元培養液の30ミリリットルを追加するために充填ポートを使用します。
- 70％エタノールで任意の表面上の任意のこぼれた培地を拭いてください。
細胞の調製
- ヒト上皮細胞株（HCT-8）24,40。
- RPMIで培養細胞、100 U / mlのペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、50μg/ mlのゲンタマイシン、2mMのL-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、10mMのHEPES緩衝液及び10％熱不活性化ウシ胎児血清（FBS ）（ 補足1）。 5：70％の密集度、1の割合で分割する細胞で。
- ヒト結腸線維芽細胞（CCD-18Co細胞 ）24,41。
- サプリメント1で強化された基礎イーグル培地で培養細胞密集度で、1の割合で分割する細胞：。3。
- ヒト臍帯静脈内皮（HUVEC）細胞
- 100μg/ mlのヘパリン、3 / mlの内皮細胞成長サプリメント（ECGS）、およびサプリメント1で強化された内皮基礎培地で培養細胞（EBM）媒体1の比率で70％の密集度、分割細胞で：。2。
- 標準的な技術43を用いた密度勾配遠心分離により血液から末梢血単核細胞（PBMC）を単離します。
- 簡単に言えば、10ミリリットルピペットを使用して、慎重に希釈した血液の30ミリリットルを追加し（1：1の血液：リン酸緩衝食塩水（PBS））密度遠心分離培地の10ミリリットルを含む50ミリリットルコニカルチューブに。遠心分離工程の後、リンパ球および単球は、密度遠心分離媒体とプラズマ層との間の「白」層内に存在します。
- トランスファーピペットを用いて、白色層を収集します。密度遠心分離メディアのコレクションを制限することにより、顆粒球汚染を避けます。 43を洗浄した後、Uそれ自体PBMCであるか、または液体N 2中で凍結保存。
注：PBMCが大きく、樹状細胞および他の細胞型の小さな割合で、リンパ球および単球からなることを強調することが重要です。
コラーゲン埋め込まれた細胞の調製
- -セットアップする実験条件の数に基づいて、必要な挿入の数を決定します。 6ウェルプレートのウェルに挿入物の適切な数を配置します。
- HUVECおよび線維芽細胞の懸濁液を準備します。
- PBS中で2回フラスコを洗浄し、0.05％トリプシン四ナトリウムエチレンジアミン（トリプシンEDTA）でトリプシン、0.25％（1×）を使用して細胞を剥離。細胞培養表面領域の全体をカバーするのに十分なトリプシン溶液を加えます。剥離は、通常15分に5以内に起こります
- 収集しますダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）-30％FBS培地30mlを含む50ミリリットルチューブで剥離した細胞。
- 10分間、500×gでチューブを遠心。
- DMEM-30％FBS培地30mlに細胞を再懸濁。
- トリパンブルー色素20μlの再懸濁した細胞を20μlを希釈することにより生存細胞の総数をカウントします。細胞混合物で血球計数器をロードします。生存PBMCを明確に白になります。非生存PBMCは、色素を取得し、青になります。
- 8×10 7細胞ミリリットル- - 5の濃度でDMEM-30％FBS培地中で再懸濁し、各細胞型1。
- 細胞含有コラーゲンゲルを準備
注：各容器は、細胞含有コラーゲンゲルの〜5ミリリットルの準備が必要になります。- 50 mlのコニカルチューブに50μg/ mlのゲンタマイシン、2mMのL-グルタミンおよび10％熱inactivatを補った1×DMEM培地を添加することにより、コラーゲンの混合物を調製エドFBSプラスに3mg / mlのウシコラーゲンI、10 / mlのラミニン、40 / mlのコラーゲンIV、10 / mlのフィブロネクチン、2 / mlのヘパリン硫酸プロテオグリカンおよび15mMのNaOHで（生理的pHに到達します）。
- チューブを閉じて、混合物を完全に均質化されるまで、数回転倒混和します。気泡の形成を避けます。
重要：ゲル化を防止するために、氷上で混合物を保管してください。- 重要なステップ：混合物は酸性外観（黄色がかった色）を開発する場合は、混合物を中和するために、無菌の1N NaOH数滴を追加します。
- それぞれ濃縮されたコラーゲン混合物（上記）に、2.0×10 6細胞/ ml - 1.2および1.5から1.0の密度で濃縮されたHUVECおよび線維芽細胞を追加します。チューブを閉じて、混合物を完全に均質化されるまで、数回転倒混和します。気泡の形成を避けます。重要：ゲル化を防止するために、氷上で混合物を保管してください。
- 細胞含有コラーゲンの5ミリリットル - 4を追加します。各インサートのゲルは、以前に6ウェルプレートにロードされ、1時間、ほとんど、あるいはまったく動きとフードにgelifyすることができました。
- さらに2時間- 1時間後、1 37℃、5％CO 2インキュベーターに6ウェルプレートに移します。
- フードに6ウェルプレートを返し、そして滅菌ピンセットの助けを借りてとメス無菌的にカットオフ膜を膜から細胞含有ゲルを取り外し、挿入から。小さな正方形に切り離さゲル（〜5×5 mm）をカットします。
- 充填ポートを使用して50-mlのHARVに小細胞含有正方形を追加します。
- HCT-8上皮細胞の懸濁液を準備します。
- PBS中で2回フラスコを洗浄し、トリプシンEDTA処理でトリプシン、0.25％（1×）を使用して細胞を剥離。細胞培養表面領域の全体をカバーするのに十分なトリプシン溶液を加えます。剥離は、通常10〜15分以内に起こります。
- DMEM-30％FBS培地30mlに剥離した細胞を収集します。
- Centrif10分間、500×gでチューブを含むUGE DMEM-30％FBS培地。
- DMEM-30％FBS培地30mlに細胞を再懸濁。
- 3.2.5で説明したように生存細胞の総数をカウントします。
- 10 7細胞mlの濃度でDMEM-30％FBS培地中のHCT-8上皮細胞を再懸濁する- 1。
- 充填ポートを使用して50-mlのHARVに濃縮されたHCT-8上皮細胞の1ミリリットルを追加します。
- 容器がほぼ一杯になるまで、充填ポートを使用して、（〜20ml）でさらに3-D培養培地を加えます。
- キャップを交換し、70％エタノールで充填ポートの唇を拭いてください。
- RWVの各シリンジポートに注射器を置き：場所3を含む5ミリリットルシリンジ - 4つのポートでの3次元培養培地1mlと他のポートで5ミリリットル、空のシリンジを。
- 媒体のほぼ同じボリュームが他のシリンジポートを介して注入されている間、空の注射器に引っ張ることによって、目に見える気泡を除去。
- VESを配置SELSバイオリアクターで、電源をオンにし、毎分約13〜14回転に速度を設定。
注：重要なステップ：回転速度は、それによって血管壁との接触を避け、容器内の旋回細胞を維持するために、実験中に数回に調整する必要があるかもしれません。 - RWVバイオリアクターが提供する37°C、微小重力下での5％のCO 2での培養細胞、。
- 新鮮な3-D培養培地で約30 mlで置き換えることにより、4日 - すべての3変化培地。
- 4日（±1日）の後、バイオリアクターから血管を除去し、（2×10 7 /容器）容器にリンパ球/単球を追加します。
- さらに5日（±1日）、37℃、5％CO 2で戻ってバイオリアクター内の血管を置きます。
- さらに5日（文化の日の9）の後、（2×10 7 /容器）容器にリンパ球/単球を追加して、最大12の追加日間培養を続けます。 新鮮な3-D培養培地で約30 mlで置き換えることにより、4日 - すべての3変化培地。
組織学のため4.収穫は、3次元培養
- トランスファーピペット採取の補助各小ゲル断片と、現在の10％ホルマリン緩衝液10mlを含有する6ウェルプレートに「構築物」と呼ばれます。 RTで3時間のままにするか、12 - 4℃で16時間。
- 標識し、各カセットに生検フォームパッドを2枚追加することで、組織処理および包埋カセットを準備します。
- 10％ホルマリン緩衝液中にカセットを浸します。
- 鉗子の助けを借りて2フォームパッドとの間に固定された構築物を配置します。
- 10％ホルマリン緩衝液中にカセットを浸します。
- 埋め込 み切片、および44を染色するための標準的な手順を進めます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
これまで我々は、腸上皮細胞株および一次ヒトリンパ球、微小重力条件24（ 図1）で培養内皮細胞および線維芽細胞からなるヒトの腸粘膜の多細胞3次元器官モデルを設計してきました。線維芽細胞および内皮細胞は、追加の腸基底膜タンパク質45（ すなわち 、ラミニン、コラーゲンIV、フィブロネクチン及びヘパリン硫酸プロテオグリカン）で富化Iは、マトリックスコラーゲン中に包埋し、バイオリアクターのRWVに添加しました。 10後 - 15日、組織染色分析は、構築物中の絨毛様構造の存在を実証しました。約60 -これらの上皮細胞の80％が、十分に分化した細胞（ 図2）の主要な機能であるECM、近い基礎位置にそれらの核と偏細胞の単層として組織されました。
1 ">："キープtogether.within-ページ= FO "ENT
図1：3 次元モデルの構築を示す図 。 4つのステップは、3-Dシステムを構築するために必要です。まず、3次元モデルを生成するために細胞に必要な数の、ヒト腸腸上皮細胞株（HCT-8）を得て、一次ヒト内皮細胞および線維芽細胞を、2-Dのコンフルエントな単層として増殖させます。第二に、付加的な腸基底膜タンパク質で富化コラーゲンIマトリックス（ すなわち 、ラミニン、コラーゲンIV、フィブロネクチン及びヘパリン硫酸プロテオグリカン）からなるECMを調製します。第三に、線維芽細胞および内皮細胞は、コラーゲンIの混合物中に埋め込まれ、付加HCT-8上皮細胞に続くバイオリアクターをRWVために添加されます。第四に、一次リンパ球日4,9（±1日）で培養物に添加されます。">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 正常ヒト腸および器官型モデルとの比較 。ヘマトキシリンおよび3次元微小重力モデルで培養した細胞のエオシン染色：組織はピンク、紫色染色し、足場を染色しました。 3-Dモデルからの細胞を、14（「A」および「B」）および20日（C）培養しました。二十日播種後、総細胞数が維持され、細胞が十分に分化示す絨毛のような機能でした。画像は100X（「a」および「b」）と40X（ "C"）の倍率で表示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 商品名 | PKG。サイズ | 再構成 | 作用濃度 | ストレージ |
| 線維芽細胞増殖因子ベーシック（bFGFを） | 25 mgの | 25μg/ mlのストック溶液を調製しました。無菌培地の1ミリリットル（RPMI + 1％FCS）、スワールは、溶解を100μl/アリコートを追加するためにFGF25μgのを追加します。 | 5 ngの/ mlの | 粉末-20℃、作業アリコートO -20℃O、繰り返し凍結/融解を避けます |
| 幹細胞因子（SCF） | 10 mgの | 10μg/ mlのストック溶液を調製しました。無菌培地の1ミリリットル（RPMI + 1％FCS）、スワールは、溶解を250μl/アリコートを追加するためにSCFを10μgを追加 | 5 ngの/ mlの | 粉末-20℃、作業アリコートO -20℃O、繰り返し凍結/融解を避けます |
| 肝細胞増殖因子（HGF） | 5 mgの | 5μg/ mlのストック溶液を調製しました。無菌培地の1ミリリットル（RPMI + 1％FCS）、スワールは、溶解を200μl/アリコートを追加するためにHGF5μgのを追加します。 | 2 ngの/ mlの | 粉末-20℃、作業アリコートO -20℃O、繰り返し凍結/融解を避けます |
| エンドセリン3 | 50 mgの | 50μg/ mlのストック溶液を調製しました。無菌培地の1ミリリットル（RPMI + 1％FCS）、スワールは、溶解を100μl/アリコートを追加するためにエンドセリン50μgのを追加します。 | 10 ng / mlで | 粉末-20℃、作業アリコートO -20℃O、繰り返し凍結/融解を避けます |
| ラミニン | 1 mgの | 2でゆっくりと解凍- 8°Cの 、旋回し、100μl/アリコートを追加 | 10 mg / mlで | 液体-20 oをCは、アリコートを-20 O Cを作業、繰り返しFREを回避しますエズ/解凍 |
| 血管内皮増殖因子（VEGF） | 10 mgの | 5μg/ mlのストック溶液を調製しました。滅菌水2mlへのVEGFの10μgのを追加し、スワールは、溶解を100μl/アリコートを追加します | 1 ngの/ mlの | 粉末-20℃、作業アリコートO -20℃O、繰り返し凍結/融解を避けます |
| 白血病抑制因子（LIF） | 50 mgの | 20μg/ mlのストック溶液を調製しました。滅菌水2.5ミリリットルにLIFを50μgを追加し、スワールは、溶解を100μl/アリコートを追加します | 4 ngの/ mlの | 粉末-20℃、作業アリコートO -20℃O、繰り返し凍結/融解を避けます |
| アデニン | 25グラム | 0.18 Mのストック溶液を調製しました。フィルタは殺菌、0.05 MのHCl（37.1パーセントHClを250μlの水の50ミリリットルへ））の50ミリリットル、溶解するスワールに121.5ミリグラムOGのadedineを追加し、1ミリリットルを追加/アリコート | 1.8×10 -3 M | 粉末4°Cの 、作業アリコート-20 C O、繰り返し凍結/融解を避けます |
| インスリン | 50 mgの | 5mg / mlのストック溶液を調製しました。 0.005 10mlの1MのHCl（10mlの水に37.1パーセントのHClを5μl）を）にインスリン50mgを追加し、溶解するスワール、フィルターは0.5ミリリットル/アリコートを殺菌し、追加します | 5 mg / mlで | 粉末-20℃、作業アリコートO -20℃O、繰り返し凍結/融解を避けます |
| T3 | 100 mgの | 2×10 -8 Mのストック溶液を調製しました。 、1MのNaOHの25ミリリットルにT3の3.4 mgの追加のPBS 9.9ミリリットルに、この溶液0.1mlを希釈し、殺菌、スワールを溶解するために、PBSの9.9ミリリットル中に再びこの溶液0.1mlを希釈フィルターと0.5ミリリットルを追加/アリコート | 2×10 -11 M | 粉末-20℃、作業アリコートO -20 <SUP> O C、繰り返し凍結/融解を避けます |
| コレラ毒素 | 5 mgの | 10 -7 Mのストック溶液を調製しました。 5ミリリットルにコレラ毒素5mgを追加し、無菌のddH 2 O（ストア-20°Cの時）。 0.5ミリリットル/アリコートを殺菌し、追加5ミリリットルのddH 2 Oに、この溶液50μlを希釈、均一化するスワール、フィルタ | 10 -10 M | 粉末4から8°Cの 、作業アリコート-20 C O、繰り返し凍結/融解を避けます |
| フィブロネクチン | 1 mgの | 1mg / mlのストック溶液を調製しました。滅菌distiled水1mlにフィブロネクチン1mgを追加します。 30分を許可します。材料のために溶液中に行く。 攪拌OR旋回しないでください 。 100μl/アリコートを追加 | 10 mg / mlで | 粉末4から8°Cの 、作業アリコート-20 C O、繰り返し凍結/融解を避けます |
| アポトランスフェリン | 100 mgの 5mg / mlのストック溶液（1,000倍）を調製しました 。フィルターは0.5ミリリットル/アリコートを殺菌し、追加、溶解させるためにPBSスワールの20ミリリットルにトランスフェリン100mgを追加 | 5 mg / mlで | 粉末-20℃、作業アリコートO -20℃O、繰り返し凍結/融解を避けます | |
| ヘパリン | 50 KU | （1,000倍）を 50 mg / mlでストック溶液を調製しました。フィルタは、1ミリリットル/アリコートを殺菌し、追加、溶解するために水の旋回の1ミリリットル中にヘパリン50mgを追加 | 0.1mg / mlの | 粉末-20℃、作業アリコートO -20℃O、繰り返し凍結/融解を避けます |
| パラン硫酸プロテオグリカン | 1 mgの | 0.1mg / mlのストック溶液を調製しました。溶解するために滅菌水の旋回の10ミリリットルにヘパラン硫酸1mgを追加し、0.2ミリリットル/アリコートを追加 | 2 mg / mlで | 粉末-20 C O、一定分量-20 C Oの作業、避けます繰り返し凍結/解凍 |
| コラーゲンIV | 5 mgの | 2mg / mlのストックsolutinを準備するには：無菌0.25％の酢酸2.5ミリリットルにコラーゲンVの2ミリグラムを追加します。溶液中に行くべき材料のための2時間よりよいdillutionための渦巻 - 1を許可します。 400μL/アリコートを追加 | 80 mg / mlで | 粉末-20℃、作業アリコートO -20℃O、繰り返し凍結/融解を避けます |
表1： 定義され た 培地補充準備。
| を補充したF-12培地 | |||
| 試薬 | 貯蔵液 | 最終的な解決 | 量 |
| ウシ胎仔血清 | 10％ | 50ミリリットル | |
| ピルビン酸ナトリウム | 100 mMの | 1 mMの | 5ミリリットル |
| L-グルタミン | 200 mMの | 2 mMの | 5ミリリットル |
| ヘペス | 1 M | 10 mMの | 5ミリリットル |
| ゲンタマイシン | 50 mg / mlで | 50μg/ mlの | 500μlの |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | 万U /ミリリットル/ 10 mg / mlで | 100 U / mlの/100μg/ mlの | 5ミリリットル |
| インスリン | 5 mg / mlで | 5μg/ mlの | 500μlの |
| T3 | 2×10から8 M | 2×10 -11 M | 500μlの |
| アデニン | 1.8×10から1 M | 1.8×10から3 M | 5ミリリットル |
| トランスフェリン | 5μg/ mlの | 500μlの | |
| ヘパリン | 50 mg / mlで | 0.1mg / mlの | 1ミリリットル |
| ECGS | 3 mg / mlで | 3 / mlの | 5ミリリットル |
| bFGFを | 25 / mlの | 5 ngの/ mlの | 100μlの |
| SCF | 10μg/ mlの | 5 ngの/ mlの | 250μlの |
| HGF | 5μg/ mlの | 2 ngの/ mlの | 200μlの |
| エンドセリン3 | 50μg/ mlの | 10 ng / mlで | 200μlの |
| LIF | 20 / mlの | 4 ngの/ mlの | 100μlの |
| VEGF | 5μg/ mlの | 1 ngの/ mlの | 100μlの |
| Choleran毒素 | 10 -7 M | 10 -10 M | 500μlの</ TD> |
| 注：上記で引用量は、3-D培養液500mlを調製するためのものです。媒体は、せいぜい2週間4℃で保存されなければなりません | |||
表2：3-D培養培地の調製。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本稿では、一次ヒトリンパ球、線維芽細胞、および内皮細胞、ならびに腸上皮細胞株24を含む倍数細胞型から成る、ヒト腸粘膜の生物工学モデルの開発を記載します。この3次元モデルでは、細胞は、微小重力条件下24の下で、コラーゲンが豊富な細胞外マトリックス内で培養されます。
前述したように、このモデルの主な特徴は次の通りである：（i）上皮組織の単層組織を模倣する能力、（ii）の上皮細胞、タイトジャンクション、デスモソームと微絨毛の適切な極性の誘導を、（iii）の長期用語の初代細胞（ すなわち 、線維芽細胞および内皮細胞）の高い生存率を用いた培養（20日まで）、（iv）の発現ビリン、サイトケラチン、E-カドヘリンおよびμを含む組織様分化マーカー抗原刺激の際にかなりのサイトカインの量（ 例えば 、IL-8）およびアルカリホスファターゼを生産するCIN、（V）機能、（VI）、グルコース（ すなわち 、ジサッカリダーゼの発現、及び砂糖の存在のような栄養素の輸送をトランスポーター）、および（VII）腸管上皮細胞（ すなわち 、吸収性の腸細胞、globetとM細胞）24の多系列分化。
研究者は、良好な細胞培養のガイドライン46-48に準拠している必要があり、当社の3次元モデルを用いて再現性のある結果を達成するためにそれを強調することが重要です。系統的に生存性、マイコプラズマ汚染及び細胞成長挙動の変化について細胞を制御することが重要です。問題が識別された場合、最初に何も不正な変更がプロトコルに導入されていないことを確認してください。問題が解決しない場合は、/（血清を含む）様々な培地成分の新しいバッチに切り替えて、または細胞。我々の3-Dモデルの制限は、腫瘍形成性HCT-8上皮細胞株の使用です。しかし、HCT-8ラインの存在は、市販であるという利点を提供することを考慮することが重要です。また、これらの上皮細胞は、古典的または非古典的ヒト白血球抗原（HLA）のいずれかを発現しない級Iは49,50を分子。従って、それらは上皮細胞PBMCの同種反応性の非存在下での異なるHLAクラスIハプロタイプのPBMCと上皮細胞の培養を可能にします。このような腸の幹細胞オルガノイド51-53のようなシステムで、このシステムを比較した場合また、このモデルは、多くの利点を提供しています。腸管幹細胞オルガノイドは、細胞生物学および腸分化51-53についての貴重な情報を提供していますが、このモデルは、栄養素、薬物や病原体への直接の頂端の露出が可能になります。また、このモデルでは、管腔の内容物などの抗菌ペプチドおよびサイトカインへの容易なアクセスを提供します。これとは対照的に、オルガノイドは、未コンパクトでありますその内側に面した腔面と。その結果、オルガノイドルーメン54内に導入することができる製品の制限された量があります。
私たちは、人間の腸粘膜の私たちの多細胞3次元器官型モデルは、病原体との相互作用、抗原の人身売買、および炎症性および代謝24を処理するなど、健康と病気の両方で発見のためのツールとして、幅広い可能性を秘めていると信じています。最後に、原因で私たちの3-Dモデルの多細胞性のために、我々のモデルは、in vivoでの上皮細胞の挙動に影響を与える可能性がある免疫細胞の種類を使用してgain-と損失の研究を可能にすることができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor | Synthecon | RCCs-4DQ | For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available. |
| Disposable 50 ml-vessel | Synthecon | D-405 | Box with 4 vessels |
| HCT-8 epithelial cells | ATCC | CCL-244 | |
| CCD-18Co Fibroblasts | ATCC | CRL-1459 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | ATCC | CRL-1730 | HUVEC |
| Fibroblast Growth Factor-Basic | Sigma | F0291 | bFGF |
| Stem Cell Factor | Sigma | S7901 | SCF |
| Hepatocyte Growth Factor | Sigma | H1404 | HGF |
| Endothelin 3 | Sigma | E9137 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
| Vascular Endothelial Growth Factor | Sigma | V7259 | VEGF |
| Leukemia Inhibitory Factor | Santa Cruz | sc-4377 | (LIF |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Insulin | Sigma | I-6634 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma | T-6397 | T3 |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
| Fibronectin | BD | 354008 | Isolated from human plasma |
| apo-Transferrin | Sigma | T-1147 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Heparan sulfate proteoglycan | Sigma | H4777 | Isolated from basement membrane of mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | Isolated from human placenta |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| D-MEM, powder | Invitrogen | 12800-017 | |
| 10% formalin–PBS | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Bovine type I collagen | Invitrogen | A1064401 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | MT25-052-CI | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750-060 | |
| Penicillin/streptomincin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
| Ham's F-12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| Basal Medium Eagle | Invitrogen | 21010-046 | BME |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | EBM-2 |
| Endothelial cell growth supplement | Millipore | 02-102 | ECGS |
References
- Aumailley, M., Timpl, R. Attachment of cells to basement membrane collagen type IV. J Cell Biol. 103, 1569-1575 (1986).
- Buset, M., Winawer, S., Friedman, E. Defining conditions to promote the attachment of adult human colonic epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 23, 403-412 (1987).
- Fitzgerald, T. J., Repesh, L. A., Blanco, D. R., Miller, J. N. Attachment of Treponema pallidum to fibronectin, laminin, collagen IV, and collagen I, and blockage of attachment by immune rabbit IgG. Br J Vener Dis. 60, 357-363 (1984).
- Goetschy, J. F., Ulrich, G., Aunis, D., Ciesielski-Treska, J. Fibronectin and collagens modulate the proliferation and morphology of astroglial cells in culture. Int J Dev Neurosci. 5, 63-70 (1987).
- Paye, M., Lapiere, C. M. The lack of attachment of transformed embryonic lung epithelial cells to collagen I is corrected by fibronectin and FXIII. J Cell Sci. 86, 95-107 (1986).
- Pourreau-Schneider, N., et al. Estrogen response of MCF-7 cells grown on diverse substrates and in suspension culture: promotion of morphological heterogeneity, modulation of progestin receptor induction; cell-substrate interactions on collagen gels. J Steroid Biochem. 21, 763-771 (1984).
- Pratt, B. M., Harris, A. S., Morrow, J. S., Madri, J. A. Mechanisms of cytoskeletal regulation. Modulation of aortic endothelial cell spectrin by the extracellular matrix. Am J Pathol. 117, 349-354 (1984).
- Jessup, J. M., et al. Microgravity culture reduces apoptosis and increases the differentiation of a human colorectal carcinoma cell line. In vitro cellular & developmental biology - Animal. 36, 367-373 (2000).
- Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Res. 46, 5320-5329 (1986).
- Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat Med. 4, 901-907 (1998).
- Zwezdaryk, K. J., Warner, J. A., Machado, H. L., Morris, C. A., Honerzu Bentrup, K. Rotating cell culture systems for human cell culture: human trophoblast cells as a model. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M. M. Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Barrila, J., et al. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat Rev Microbiol. 8, 791-801 (2010).
- Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes and infection / Institut Pasteur. 8, 1813-1825 (2006).
- Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect Immun. 69, 7106-7120 (2001).
- Alcantara Warren, C., et al. Detection of epithelial-cell injury, and quantification of infection, in the HCT-8 organoid model of cryptosporidiosis. J Infect Dis. 198, 143-149 (2008).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
- Lin, H. J., O'Shaughnessy, T. J., Kelly, J., Ma, W. Neural stem cell differentiation in a cell-collagen-bioreactor culture system. Brain Res. Dev Brain Res. 153, 163-173 (2004).
- He, L., et al. Increased proliferation and adhesion properties of human dental pulp stem cells in PLGA scaffolds via simulated microgravity. Intl Endo J. , (2015).
- Straub, T. M., et al. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg Infect Dis. 13, 396-403 (2007).
- Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Lack of norovirus replication and histo-blood group antigen expression in 3-dimensional intestinal epithelial cells. Emerg Infect Dis. 19, 431-438 (2013).
- Goodwin, T. J., Schroeder, W. F., Wolf, D. A., Moyer, M. P. Rotating-wall vessel coculture of small intestine as a prelude to tissue modeling: aspects of simulated microgravity. Proc Soc Exp Biol Med. 202, 181-192 (1993).
- Goodwin, T. J., Jessup, J. M., Wolf, D. A. Morphologic differentiation of colon carcinoma cell lines HT-29 and HT-29KM in rotating-wall vessels. In Vitro Cell Dev Biol. 28, 47-60 (1992).
- Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Engineering of a multicellular organotypic model of the human intestinal mucosa. Gastroenterology. 141, 18-20 (2011).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am J Physiol Renal Physiol. 281, 12-25 (2001).
- Cherry, R. S., Papoutsakis, E. T. Physical mechanisms of cell damage in microcarrier cell culture bioreactors. Biotech and Bioeng. 32, 1001-1014 (1988).
- Bergmann, S., Steinert, M. From Single Cells to Engineered and Explanted Tissues: New Perspectives in Bacterial Infection Biology. Int Rev Cell Mol Biol. 319, 1-44 (2015).
- Xu, B., et al. Simulated microgravity affects ciprofloxacin susceptibility and expression of acrAB-tolC genes in E. coli ATCC25922. Int J Clin Exp Pathol. 8, 7945-7952 (2015).
- Han, C., Jiang, C., Yu, C., Shen, H. Differentiation of transforming growth factor beta1-induced mesenchymal stem cells into nucleus pulposus-like cells under simulated microgravity conditions. Cell Mol Biol (Noisy-le-Grand, France). 61, 50-55 (2015).
- Wang, C., et al. Microgravity activates p38 MAPK-C/EBPbeta pathway to regulate the expression of arginase and inflammatory cytokines in macrophages. Inflamm Res. 64, 303-311 (2015).
- Iliev, I. D., et al. Human intestinal epithelial cells promote the differentiation of tolerogenic dendritic cells. Gut. 58, 1481-1489 (2009).
- Kerneis, S., Bogdanova, A., Kraehenbuhl, J. P., Pringault, E. Conversion by Peyer's patch lymphocytes of human enterocytes into M cells that transport bacteria. Science. 277, 949-952 (1997).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. , (2010).
- Lei, N. Y., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support the growth of intestinal epithelial stem cells. PLoS One. 9, e84651 (2014).
- Voog, J., Jones, D. L. Stem cells and the niche: a dynamic duo. Cell Stem Cell. 6, 103-115 (2010).
- Jabaji, Z., et al. Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium. Tissue Eng Part C Methods. 19, 961-969 (2013).
- Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9, e107814 (2014).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9, 2354-2368 (2014).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med. 239, Maywood, N.J. 1124-1134 (2014).
- Tompkins, W. A., Watrach, A. M., Schmale, J. D., Schultz, R. M., Harris, J. A. Cultural and antigenic properties of newly established cell strains derived from adenocarcinomas of the human colon and rectum. J Natl Cancer Inst. 52, 1101-1110 (1974).
- Hinterleitner, T. A., Saada, J. I., Berschneider, H. M., Powell, D. W., Valentich, J. D. IL-1 stimulates intestinal myofibroblast COX gene expression and augments activation of Cl- secretion in T84 cells. Am J Physiol. 271, 1262-1268 (1996).
- Hoshi, H., McKeehan, W. L. Brain- and liver cell-derived factors are required for growth of human endothelial cells in serum-free culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 6413-6417 (1984).
- Salerno-Goncalves, R., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Characterization of CD8(+) Effector T Cell Responses in Volunteers Immunized with Salmonella enterica. Serovar Typhi Strain Ty21a Typhoid Vaccine. J Immunol. 169, 2196-2203 (2002).
- Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. , e51064 (2014).
- Eastburn, D. J., Mostov, K. E. Laying the foundation for epithelia: insights into polarized basement membrane deposition. EMBO Rep. 11, 329-330 (2010).
- Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. a report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Altern Lab Anim. 33, 261-287 (2005).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111, 1021-1046 (2014).
- Hartung, T., et al. Good Cell Culture Practice. ECVAM Good Cell Culture Practice Task Force Report 1. Altern Lab Anim. 30, 407-414 (2002).
- Blanchet, O., et al. Altered binding of regulatory factors to HLA class I enhancer sequence in human tumor cell lines lacking class I antigen expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 3488-3492 (1992).
- Palmisano, G. L., et al. HLA-E surface expression is independent of the availability of HLA class I signal sequence-derived peptides in human tumor cell lines. Hum Immunol. 66, 1-12 (2005).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. , (2014).
