Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Развитие многоклеточного трехмерной модели Органотипической слизистой оболочки пищеварительного тракта человека Выращенный в условиях микрогравитации

Published: July 25, 2016 doi: 10.3791/54148
Automatic Translation
1, 2, 1
1Center for Vaccine Development, Department of Pediatrics, University of Maryland School of Medicine, 2Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital for Children

Summary

Клетки , растущие в трехмерной (3-D) среды представляют собой значительное улучшение по сравнению с выращиванием клеток в 2-D средах (например, колбах или блюда). Здесь мы опишем развитие многоклеточного 3-D модели органотипического слизистой оболочки кишечника человека, культивируемых в условиях микрогравитации, представленной вращающейся стенки сосуда (RWV) биореакторах.

Abstract

Поскольку клетки растут в трехмерной (3-D) среде имеют потенциал для преодоления многих пробелов культивирования клеток в 2-D средах (например., Колбах или блюда). На самом деле, широко признается, что клетки, выращенные в колбах или блюда, как правило, де-дифференцироваться и теряют специализированные особенности тканей, из которых они были получены. В настоящее время существует в основном два типа систем культивирования 3-D, где клетки высевают в каркасах, имитирующие нативную внеклеточного матрикса (ECM): (а) статические модели и модели (б) с использованием биореакторов. Первый прорыв был статические модели 3-D. 3-D модели, использующие биореакторы, такие как вращающейся стенки-сосуда (RWV) биореакторы являются более недавнее развитие. Первоначальная концепция RWV биореакторов была разработана в Космическом центре имени Джонсона НАСА в начале 1990-х годов и, как полагают, чтобы преодолеть ограничения статических моделей, таких как развитие гипоксических, некротических ядер. В RWV биореакторов может обойти тысявляется проблемой, обеспечивая гидродинамику, которые позволяют эффективно диффузию питательных веществ и кислорода. Эти биореакторы состоят из вращающей базы , которая служит для поддержки и вращения двух различных форматов культуры судов , которые отличаются по типу источника аэрации: (1) Slow Turning Боковые Сосуды (STLVs) с коаксиальным оксигенаторе в центре, или (2 ) Коэффициент сосудов высокого Aspect (HARVs) с оксигенации при помощи плоского, силиконового каучука газообмена мембраны. Эти суда позволяют эффективную передачу газа, избегая образования пузырьков и последующее турбулентность. Эти условия приводят к ламинарного потока и минимальным усилием сдвига, что модели пониженной гравитации (микрогравитации) внутри сосуда для культивирования. Здесь мы описываем развитие многоклеточного 3-D модели органотипического слизистой оболочки кишечника человека, состоящей из кишечной эпителиальной клеточной линии и первичных человеческих лимфоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов, культивируемых в условиях микрогравитации, предоставленной RWV биореакторе. </ Р>

Introduction

Первый прорыв в построении модели 3-D сообщалось в начале 1980 - х , когда ученые начали исследовать различные типы эшафоте (например., Ламинин, коллаген типа I, коллаген IV, и фибронектин) и коктейли факторов роста для улучшения от клетки к клетке и ECM взаимодействий "статических" 3-D модели 1-7. С тех пор, основная проблема с этими моделями были ограничения в передаче питательных веществ и кислорода внутри среды и тканевых конструкций 8. В отличие от клеток в окружающую среду в естественных условиях , которая получает постоянный поток питательных веществ и кислорода из окружающих сетей кровеносных сосудов, статическая природа этих моделей препятствует эффективному распределению их к клеткам. Например, клеточные агрегаты , образующиеся в статических моделях в пробирке , которые превышают размером в несколько миллиметров неизбежно будет развиваться гипоксические, некротические ядра 9. В RWV биореакторов может обойти эту проблемуобеспечивая гидродинамику , которые позволяют эффективно диффузию питательных веществ и кислорода 10-12. Тем не менее, на сегодняшний день работы с использованием RWV биореакторов были ограничены включением одного или двух типов клеток 13-17. К тому же, вместо пространственной ориентации, подобной нативных тканей, эти клетки образуются клеточные агрегаты. Основной причиной этих ограничений является отсутствие лески, способного включать клетки комплексно. Леса , используемые в RWV биореакторах на сегодняшний день состоят, с некоторыми исключениями 16-18, в основном из синтетических микросфер, трубчатых цилиндров или небольших листов 13-15,19-23. Эти жесткие материалы, состав и гибкость не может манипулировать, и к которым клетки прикрепляются к их поверхности. Таким образом, маловероятно , что эти модели будут обеспечивать систему , в которой , чтобы оценить, в интегрированной форме, различные клеточные компоненты , такие как стромальные клетки (например., Фибробласты, иммунные и эндотелиальные клетки) , что should быть рассредоточены в эшафот, чтобы точно имитировать ткани человека.

Здесь мы описываем развитие многоклеточного 3-D модели органотипического слизистой оболочки кишечника человека , состоящей из кишечной эпителиальной клеточной линии и первичных человеческих лимфоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов 24. Эти клетки культивировали в условиях микрогравитации, отданных RWV биореакторе 13,25-30. В нашем 3-D модели, ЕСМ обладает многими различными свойствами, такими как осмотическое давление , подобной культуральной среды (например., Незначительные диффузионные удерживающие устройства во время культивирования) и способностью включать клетки и другие соответствующие белки внеклеточного матрикса, а также как соответствующая жесткость для использования в биореакторах 24. Биологические системы очень сложны, и в течение последних нескольких лет наблюдается сдвиг в фокусе исследований через слизистую оболочку в направлении изучения клеточных взаимодействий с их окружением, а не изучать их в isolatioп. В частности, важность межклеточных взаимодействий в оказании влияния на выживание кишечника и дифференцировки клеток хорошо документирован 31-34. В частности, связь между эпителиальными клетками и их нишей оказывает глубокое влияние на расширение эпителиальных клеток и дифференцировки 35. В самом деле, широко признается, что не только от клетки к клетке, но и клетка-ECM взаимодействия имеют решающее значение для поддержания и дифференцировки эпителиальных клеток в моделях 3-D культуры. Предыдущие исследования показали , что кишка ECM белки , такие как коллаген I 24,36,37, ламинин 38 и фибронектин 39 играют важную роль в оказании влияния на эпителиальные клетки кишечника приобрести пространственную ориентацию , подобную нативной слизистую оболочку. Таким образом, разработка новых технологий, как наш 3-D модели 24, которая может имитировать требуется фенотипическое разнообразие кишечника , если исследователи намерены воссоздать сложную клеточную и структурную архитектуруи функции кишечника микросреды. Эти модели представляют собой важный инструмент в разработке и оценке новых препаратов и оральных вакцин-кандидатов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Заявление по этике: Все образцы крови были собраны у добровольцев , которые участвовали в номер протокола HP-00040025-1. Университет штата Мэриленд Совета по рассмотрению Institutional одобрил этот протокол и санкционировал сбор образцов крови от здоровых добровольцев для исследований, включенных в этой рукописи. Целью данного исследования было объяснено добровольцев, и все добровольцы дали информированное, подписанное согласие до взятия крови.

Примечание: смотри таблицу 1 для получения среднего дополнения. В таблице 2 при подготовке 3-D культуральной среды.

1. Подготовка судов культуры

  1. Отвинтить крышку заливной порта мл-сосуда 50 и залить 50 мл стерильной культуральной среды (например., RPMI). Выполните все процедуры в стерильных условиях в ламинарном шкафу.
  2. Замените крышку и вытрите пролитое среду на любой поверхности с 70% этанола.
  3. Дайте судну incubели в течение по крайней мере 15 мин до O / N при комнатной температуре.
  4. Используйте порт заливки, чтобы отбрасывать культуральной среды и добавляют 30 мл 3-D культуральной среды.
  5. Протрите пролитое среду на любой поверхности с 70% этанола.

2. Получение клеток

  1. Человеческой эпителиальной линии клеток (НСТ-8) 24,40.
    1. Культура клеток в среде RPMI с добавлением 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 50 мкг / мл гентамицина, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES-буфера и 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (ФБС ) (приложение 1). При 70% сплошности, расщепленные клетки в соотношении 1: 5.
  2. Ободочной кишки человека фибробласты (CCD-18Co клетки) 24,41.
    1. Культура клеток в среде базального Орла , обогащенной добавки 1 В сплошности, расщепленные клетки в соотношении 1: 3..
  3. Человек пупочной вены (HUVEC) клетки
  4. Культура клеток эндотелиальной базальной среды (EBM) среде , обогащенной 100 мкг / мл гепарина, 3 мкг / мл эндотелиальной Supplement клеточного роста (ECGS), и дополнения 1 при 70% сплошности, расщепленных клеток в соотношении 1: 2 . .
  • Лимфоциты / Моноциты
    1. Изолировать мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) из крови путем центрифугирования в градиенте плотности с использованием стандартных методик 43.
      1. Если коротко, то с помощью 10 мл пипетки, осторожно добавляют 30 мл разбавленной крови (1: 1 в крови: забуференный фосфатом физиологический раствор (ЗФР)) в 50 мл-коническую пробирку, содержащую 10 мл плотности центрифугирование сред. После стадии центрифугирования, лимфоциты и моноциты будет находиться в "белом" слое между плотностью центрифугирования сред и плазменных слоев.
      2. Возьмите белый слой с помощью пипетки передачи. Избегайте загрязнения гранулоцитов путем ограничения сбора плотности центрифугирования сред. После промывки 43, UРВМС себе как есть или криоконсервации в жидком N 2.
        Примечание: Важно подчеркнуть, что РВМС в основном состоит из лимфоцитов и моноцитов, с небольшой долей дендритных клеток и других типов клеток.
  • Растут все клетки в стандартных условиях культивирования при 37 ° С в атмосфере 5% CO 2.

    • 3. Получение коллагеном внедренных клеток

    1. Определить количество вставок необходимости, исходя из числа экспериментальных условий, которые необходимо установить вверх-. Поместите необходимое количество вставок в лунки 6-луночного планшета.
    2. Приготовьте суспензию HUVEC и фибробластов:
      1. Промыть колб дважды в PBS и открепления клеток с помощью трипсина, 0,25% (1x) с 0,05% трипсин-тетранатриевый этилендиаминтетраацетат (трипсин-ЭДТА). Добавьте достаточное количество раствора трипсина, чтобы покрыть полноту площади поверхности клеточной культуры. Отрыв обычно происходит в течение 5 до 15 мин
      2. собиратьотдельные клетки в 50 мл-пробирку, содержащую 30 мл среды Игла в модификации Игла (DMEM) -30% ЭТС среды.
      3. Центрифуга трубки при 500g в течение 10 мин.
      4. Ресуспендируют клеток в 30 мл DMEM-30% FBS среды.
      5. Подсчитать общее количество жизнеспособных клеток путем разбавления 20 мкл ресуспендировали клеток с 20 мкл трипанового синего красителя. Загрузите гемоцитометра со смесью клеток. Приемлемые МНПК будет белым ясно; нежизнеспособными РВМС приобретет краситель и станет синим.
        1. Ресуспендируют каждый тип клеток в среде DMEM-30% FBS среде при концентрации 5 - 8 х 10 7 кл мл - 1.
    3. Подготовка клеток, содержащих коллаген гели
      Примечание: Каждое судно потребует подготовки ~ 5 мл клеточной содержащих коллагеновый гель.
      1. В 50 мл-коническую трубку готовят смесь коллагена путем добавления 1 х DMEM средств массовой информации, дополненной 50 мкг / мл гентамицина, 2 мМ L-глутамина и 10% термически inactivatEd ФБС плюс 3 мг / мл бычьего коллагена I, 10 мкг / мл ламинин, 40 мкг / мл коллагена IV, 10 мкг мл фибронектина, 2 мкг / мл гепарин протеогликанов / сульфат и 15 мМ NaOH (для достижения физиологического рН).
      2. Закройте пробирку и взболтайте несколько раз до тех пор, пока смесь не будет полностью гомогенизируют. Избегайте образования пузырьков.
        ВАЖНО: Держите смесь на лед, чтобы предотвратить гелеобразования.
        1. Критический шаг: Если смесь развивается кислый вид (желтоватый цвет), добавьте несколько капель стерильного 1 N NaOH для нейтрализации смеси.
      3. Добавить концентрированный HUVEC и фибробластами при плотности 1,0 - 1,2 и 1,5 - 2,0 × 10 6 клеток / мл, соответственно , к обогащенной смеси коллагена (описанного выше). Закройте пробирки и взболтайте несколько раз, пока смесь не будет полностью гомогенизируют. Избегайте образования пузырьков. ВАЖНО: Держите смесь на лед, чтобы предотвратить гелеобразования.
      4. Добавить 4 - 5 мл клеточной содержащих коллагенгель для каждой вставки, предварительно загружаются в 6 луночного планшета, и позволили gelify в капот практически без движения в течение 1 часа.
      5. Через 1 ч передать 6-луночный планшет с 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе в течение 1 - 2 дополнительных часов.
      6. Вернуть 6-луночного планшета к капоту, и с помощью стерильного пинцета и скальпель асептических отсечение мембрану из вставки отсоединение клеток, содержащих гель из мембраны. Обрежьте отдельностоящий гель на небольшие квадраты (~ 5 х 5 мм).
      7. Добавьте небольшие клетки, содержащие квадраты в 50-мл HARV с использованием порта заполнения.
    4. Приготовьте суспензию HCT 8-эпителиальных клеток:
      1. Вымойте колбы дважды в PBS и открепления клеток с помощью трипсина, 0,25% (1x) с обработкой трипсин-ЭДТА. Добавьте достаточное количество раствора трипсина, чтобы покрыть полноту площади поверхности клеточной культуры. Отрыв обычно происходит в течение от 10 до 15 мин.
      2. Собирают обособленные клетки в 30 мл DMEM-30% FBS среды.
      3. ЦентробежнаяУГЭ DMEM-30% FBS среду, содержащую трубку при 500g в течение 10 мин.
      4. Ресуспендируют клеток в 30 мл DMEM-30% FBS среды.
      5. Подсчитать общее количество жизнеспособных клеток, как описано в 3.2.5.
      6. Ресуспендируют НСТ-8 эпителиальных клеток в среде DMEM-30% FBS среде при концентрации 10 7 клеток мл - 1.
      7. Добавить 1 мл концентрированного НСТ-8 эпителиальных клеток в 50-мл HARV с использованием порта заливки.
    5. Используя порт заливки, добавить дополнительную питательную среду 3-D до тех пор, пока судно почти полностью заполнен (~ 20 мл).
    6. Замените крышку и протрите губы заполняющего порта с 70% -ным этанолом.
    7. Поместите шприц в каждом шприцевой порту RWV: место в 5 мл-шприц, содержащий 3 - 4 мл 3-D культуральной среды в одном порту и 5 мл шприц пустой в другом порту.
    8. Удалите все видимые пузырьки, потянув в пустой шприц в то время как примерно такой же объем среды вводят через другой порт шприца.
    9. Поместите весиSELS в биореакторе, включите питание и установите скорость приблизительно от 13 до 14 оборотов в минуту.
      Примечание: критический шаг: Частота вращения может потребоваться скорректировать несколько раз во время эксперимента , чтобы поддерживать клетки орбитальные внутри сосуда, тем самым избегая контакта со стенками сосуда.
    10. Культуры клеток при 37 ° С, 5% СО 2 в условиях микрогравитации, предоставляемые RWV биореактора.
    11. Изменение культуральной среды через каждые 3 - 4 дня, заменяя примерно 30 мл свежего 3-D культуральной среды.
    12. После 4 -х дней (± 1 день), удалить сосуды из биореактора и добавить лимфоциты / моноциты к судам (2 х 10 7 / сосуд).
    13. Поместите сосуды обратно в биореакторе при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение еще ​​5 дней (± 1 день).
    14. После дополнительных 5 дней (9 -й день культуры), добавляют лимфоциты / моноциты к судам (2 х 10 7 / сосуд) и по- прежнему культур до 12 дополнительных дней. Изменение культуральной среды через каждые 3 - 4 дня, заменяя примерно 30 мл свежего 3-D культуральной среды.

    4. Заготовка 3-D Культуры для гистологии

    1. С помощью пипетки урожая каждый маленький фрагмент гель, который теперь называется "строить" в шесть-луночного планшета, содержащую 10 мл 10% -ного буфера формалина. Оставьте в течение 3 ч при комнатной температуре или в течение 12 - 16 ч при температуре 4 ° С.
    2. Приготовьте обработки тканей и встраивание кассеты путем маркировки и добавление двух кусков пены биопсии прокладок в каждой кассете.
    3. Погружают кассеты в 10% формалине буфера.
    4. С помощью пинцета поместите с фиксированной конструкции между двумя подушках из пеноматериала.
    5. Погружают кассеты в 10% формалине буфера.
    6. Продолжить со стандартными процедурами для встраивания, секционирования и окрашивания 44.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Ранее мы разработали многоклеточного 3-D модели органотипической слизистой оболочки кишечника человека состоит из кишечной эпителиальной клеточной линии и первичных человеческих лимфоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов , культивируемых в условиях микрогравитации 24 (рисунок 1). Фибробласты и эндотелиальные клетки были встроены в коллагена I матрице , обогащенной дополнительным кишка базальной мембраной белков 45 (то есть., Ламинин, коллаген IV, фибронектина и гепаринсульфат протеогликановых) и добавляют к RWV биореакторы. Через 10 - 15 дней, гистологический анализ окрашивания показал наличие ворсинок-подобных структур в конструкциях. Примерно 60 - 80% этих эпителиальных клеток были организованы в виде монослоя поляризованных клеток с их ядер , расположенных в базисной позиции вблизи ECM, который является одной из главных особенностей хорошо дифференцированных клеток (рисунок 2).

    лор "ВОК: Keep-together.within-странице =" 1 "> Рисунок 1
    Рисунок 1: Схема конструкции 3-D модели. Четыре шага необходимо построить систему 3-D. Во-первых, чтобы получить требуемое количество ячеек для создания модели 3-D, человеческий кишечный линию эпителиальных клеток энтероцитов (HCT-8) и первичные эндотелиальные клетки человека и фибробласты выращивали в 2-D сливающихся монослоев. Во- вторых, блок управления двигателем состоит из коллагена-я матрица , обогащенная дополнительным кишка базальной мембраны белков (то есть., Ламинин, коллаген IV, фибронектин и гепарин сульфат протеогликанов) получают. В-третьих, фибробласты и эндотелиальные клетки встраиваются в смеси коллаген-I и добавляют к RWV биореакторы с последующим добавлением НСТ-8 эпителиальных клеток. В-четвертых, первичные лимфоциты к культуре добавляют в дни 4 и 9 (± 1 день)."> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    фигура 2
    Рисунок 2: Сравнение между нормальными человеческими кишечником и Органотипической моделей. Гематоксилином и эозином клеток, культивируемых в модели микрогравитации 3-D: ткани окрашивали фиолетовый и подмости пятнами розового цвета. Клетки из модели 3-D культивировали в течение 14 ( "A" и "B") и 20 дней (с). Через двадцать дней после посева, общее число клеток сохраняются, и клетки были хорошо дифференцированные, демонстрирующая ворсин подобные функции. Изображения отображаются на 100х ( "A" и "B") и 40X ( "с") увеличения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    наименование товара Уп. Размер Восстановление Рабочая концентрация Место хранения
    Фактор роста фибробластов-Basic (bFGF) 25 мг Для подготовки 25 мкг / мл маточного раствора; добавить 25 мкг FGF в 1 мл стерильной среды (RPMI плюс 1% FCS), вихрем растворяться, добавляют 100 мкл / аликвоты 5 нг / мл порошок -20 ° С, рабочие аликвоты -20 ° C, во избежание повторного замораживания / оттаивания
    Фактор стволовых клеток (SCF) 10 мг Для приготовления 10 мкг / мл маточного раствора; добавить 10 мкг SCF в 1 мл стерильной среды (RPMI плюс 1% FCS), вихрем растворяться, добавляют 250 мкл / аликвоты 5 нг / мл порошок -20 ° С, рабочие аликвоты -20 ° C, во избежание повторного замораживания / оттаивания
    Фактор роста гепатоцитов (HGF) 5 мг Для приготовления 5 мкг / мл маточного раствора; добавьте 5 мкг HGF в 1 мл стерильной среды (RPMI плюс 1% FCS), вихрем растворяться, добавляют 200 мкл / аликвоты 2 нг / мл порошок -20 ° С, рабочие аликвоты -20 ° C, во избежание повторного замораживания / оттаивания
    эндотелина 3 50 мг Для приготовления 50 мкг / мл маточного раствора; добавьте 50 мкг эндотелина в 1 мл стерильной среды (RPMI плюс 1% FCS), вихрем растворяться, добавляют 100 мкл / аликвоты 10 нг / мл порошок -20 ° С, рабочие аликвоты -20 ° C, во избежание повторного замораживания / оттаивания
    Laminin 1 мг Разморозить медленно при 2 - 8 ° С, вихрем и добавить 100 мкл / аликвоты 10 мг / мл жидкости -20 ° С, работая аликвоты -20 ° С, во избежание повторения FreЭз / оттаивание
    Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) 10 мг Для приготовления 5 мкг / мл маточного раствора; добавить 10 мкг VEGF в 2 мл стерильной воды, вихрем, чтобы растворить, добавить 100 мкл / аликвоты 1 нг / мл порошок -20 ° С, рабочие аликвоты -20 ° C, во избежание повторного замораживания / оттаивания
    Ингибирующий лейкоз фактор (LIF) 50 мг Для подготовки 20 мкг / мл маточного раствора; добавьте 50 мкг LIF в 2,5 мл стерильной воды, вихрем, чтобы растворить, добавить 100 мкл / аликвоты 4 нг / мл порошок -20 ° С, рабочие аликвоты -20 ° C, во избежание повторного замораживания / оттаивания
    аденин 25 г Для приготовления 0,18 М маточного раствора; добавить 121,5 мг ог adedine в 50 мл 0,05 М HCl (250 мкл 37,1% HCl в 50 мл воды)), чтобы растворить вихрь, фильтр стерилизуют идобавляют 1 мл / аликвоту 1,8 х 10 -3 М порошок 4 ° С, рабочие аликвоты -20 ° С, во избежание повторного замораживания / оттаивания
    инсулином 50 мг Для приготовления 5 мг / мл маточного раствора; добавляют 50 мг инсулина в 10 мл 0,005 М HCl (5 мкл 37,1% HCl в 10 мл воды)), вихрем растворяться, фильтра стерилизовать и добавляют 0,5 мл / аликвоты 5 мг / мл порошок -20 ° С, рабочие аликвоты -20 ° C, во избежание повторного замораживания / оттаивания
    T3 100 мг Для приготовления 2 х 10 -8 М маточного раствора; добавьте 3,4 мг Т3 в 25 мл 1 М NaOH, разбавленных 0,1 мл этого раствора в 9,9 мл PBS, разбавленные снова 0,1 мл этого раствора в 9,9 мл PBS, вихря для растворения, фильтр стерилизуют и добавляют 0,5 мл / аликвоты 2 х 10 -11 М порошок -20 ° С, рабочие аликвоты -20 <SUP> о С, во избежание повторного замораживания / оттаивания
    холерный энтеротоксин 5 мг Для приготовления 10 -7 М маточного раствора; добавляют 5 мг холерного токсина в 5 мл стерильной DDH 2 O (хранить при температуре -20 ° С); развести 50 мкл этого раствора в 5 мл DDH 2 O, вихрем гомогенизировать, фильтр стерилизуют и добавляют 0,5 мл / аликвоты 10 -10 М порошок 4 - 8 ° С, рабочие аликвоты -20 ° С, во избежание повторного замораживания / оттаивания
    фибронектина 1 мг Для приготовления 1 мг / мл маточного раствора; добавляют 1 мг фибронектина в 1 мл стерильной воды distiled. Разрешить 30 мин. для материала , чтобы перейти в раствор. не агитирую или закружить. Добавьте 100 мкл / аликвоты 10 мг / мл порошок 4 - 8 ° С, рабочие аликвоты -20 ° С, во избежание повторного замораживания / оттаивания
    апо-трансферрина 100 мг Для приготовления 5 мг / мл маточного раствора (1,000x); добавляют 100 мг трансферрина в 20 мл PBS Хорошо перемешать, фильтр стерилизуют и добавляют 0,5 мл / аликвоты 5 мг / мл порошок -20 ° С, рабочие аликвоты -20 ° C, во избежание повторного замораживания / оттаивания
    гепарин 50 KU Для приготовления 50 мг / мл маточного раствора (1,000x); добавляют 50 мг гепарина в 1 мл воды водоворот растворяться, фильтр стерилизуют и добавляют 1 мл / аликвоты 0,1 мг / мл порошок -20 ° С, рабочие аликвоты -20 ° C, во избежание повторного замораживания / оттаивания
    Гепаран- протеогликана сульфата 1 мг Для приготовления 0,1 мг / мл маточного раствора; добавляют 1 мг гепарансульфата в 10 мл стерильной воды для растворения вихрем, и добавить 0,2 мл / аликвоты 2 мг / мл порошок -20 ° С, рабочие аликвоты -20 ° C, избегатьповторное замораживание / оттаивание
    Коллаген IV 5 мг Для приготовления 2 мг / мл маточного solutin: добавить 2 мг коллагена V в 2,5 мл стерильного 0,25% -ной уксусной кислоты. Разрешить 1 - 2 ч для материала в раствор Вихревой для лучшего dillution.. Добавить 400 мкл / аликвоты 80 мг / мл порошок -20 ° С, рабочие аликвоты -20 ° C, во избежание повторного замораживания / оттаивания

    Таблица 1: Определяется средний Дополнение Подготовка.

    F-12 среду , дополненную
    реактив Основной раствор Окончательное решение Количество
    Фетальной телячьей сыворотки 10% 50 мл
    пируват натрия 100 мМ 1 мМ 5 мл
    L-Глютамин 200 мМ 2 мМ 5 мл
    Hepes 1 М 10 мМ 5 мл
    Гентамицин 50 мг / мл 50 мкг / мл 500 мкл
    Пенициллин / стрептомицин 10000 ед / мл / 10 мг / мл 100 ед / мл / 100 мкг / мл 5 мл
    инсулином 5 мг / мл 5 мкг / мл 500 мкл
    T3 2 х 10 - 8 М 2 х 10 -11 М 500 мкл
    аденин 1,8 х 10 - 1 M 1,8 х 10 - 3 М 5 мл
    Transferrin 5 мкг / мл 500 мкл
    гепарин 50 мг / мл 0,1 мг / мл 1 мл
    ECGS 3 мг / мл 3 мкг / мл 5 мл
    bFGF 25 мкг / мл 5 нг / мл 100 мкл
    SCF 10 мкг / мл 5 нг / мл 250 мкл
    HGF 5 мкг / мл 2 нг / мл 200 мкл
    эндотелина 3 50 мкг / мл 10 нг / мл 200 мкл
    LIF 20 мкг / мл 4 нг / мл 100 мкл
    VEGF 5 мкг / мл 1 нг / мл 100 мкл
    Choleran токсин 10 -7 М 10 -10 М 500 мкл </ TD>
    Примечание: Количество цитированной выше для приготовления 500 мл 3-D культуральной среды. Медиа должны храниться при температуре 4 ° С в течение не более 2-х недель

    Таблица 2: Получение 3-D медиакультуре.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    В этой рукописи мы опишем развитие биоинженерного модели слизистой оболочки кишечника человека , состоящего из типов клеток , включая кратные первичных человеческих лимфоцитов, фибробластов и эндотелиальных клеток, а также эпителиальным клеткам кишечника линии 24. В этом 3-D модели, клетки культивируют в коллагеновой богатых внеклеточного матрикса в условиях микрогравитации 24.

    Как было описано выше, основные особенности этой модели являются: (I) способность имитировать эпителиальной тканевой организации монослоя (II) индукция соответствующей полярности эпителиальных клеток, плотных соединений, десмосом и микроворсинок, (III) на длительный термин культура (до 20 дней) с высокой жизнеспособности первичных клеток (то есть., фибробластов и эндотелиальных клеток), (IV) выражение в подобные ткани маркеры дифференцировки , включая виллин, цитокератином, E-кадгерина и мюCIN, (v) возможность производить значительные количества цитокинов (например, IL-8) и щелочной фосфатазы при антигенной стимуляции, (VI) перенос питательных веществ , таких как глюкоза (то есть., экспрессия дисахаридов, и присутствие сахара транспортеров) и (VII) мульти-родословная дифференцировки эпителиальных клеток кишечника (то есть., абсорбирующим энтероците, Globet и M клеток) 24.

    Важно подчеркнуть , что для достижения воспроизводимых результатов , используя нашу 3-D модель исследователь должен придерживаться хороших принципов клеточной культуры 46-48. Крайне важно, чтобы систематически контролировать клетки для жизнеспособности, загрязнения микоплазмы и изменения в поведении роста клеток. Если проблема определена, сначала убедитесь, что никакие несанкционированные изменения не были внесены в протокол. Если проблема не решена, перейти к новой партии различных компонентов среды (в том числе в сыворотке крови) и /или клетки. Ограничением нашего 3-D модели является использование онкогенного НСТ-8 эпителиальной клеточной линии. Тем не менее, важно учитывать, что присутствие НСТ-8 линии предлагает преимущество быть коммерчески доступным. Кроме того, эти эпителиальные клетки не выражают ни классической или неклассической человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) -класс I молекулы 49,50. Таким образом, они позволяют культуру эпителиальных клеток с РВМС различной HLA класса I гаплотипа в отсутствие эпителиального клеточного РВМС аллореактивность. Кроме того, при сравнении этой системы с системами , такими как кишка стволовой клетки органоиды 51-53, эта модель предлагает множество преимуществ. Хотя кишка стволовых клеток органоиды содержат ценную информацию о клеточной биологии и кишечной дифференцировки 51-53, эта модель позволяет прямое верхушечный воздействие питательных веществ, наркотиков и патогенных микроорганизмов. Эта модель также обеспечивает легкий доступ к содержимому просветными такие антимикробные пептиды и цитокины. В противоположность этому, органоиды компактны ООНего с полостной поверхности, обращенной внутрь. Следовательно, существует ограниченное количество продукта , которое может быть введено в Органоид Просвет 54.

    Мы полагаем , что многоклеточные 3-D модель Органотипической слизистой оболочки кишечника человека имеет широкие возможности в качестве инструмента для обнаружения как в здоровье и болезни, в том числе взаимодействие с патогенными микроорганизмами, незаконный оборот антигена и воспалительных и метаболических процессов 24. Наконец, из - за многоклеточного природы нашего 3-D модели, наша модель могла бы позволить амплитудно и потери исследований с использованием типов иммунных клеток, которые могут влиять на поведение клеток эпителиального в естественных условиях.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor  Synthecon RCCs-4DQ For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available.
    Disposable 50 ml-vessel Synthecon D-405 Box with 4 vessels
    HCT-8 epithelial cells  ATCC CCL-244
    CCD-18Co Fibroblasts  ATCC CRL-1459
    Human Umbilical Vein Endothelial Cells ATCC CRL-1730 HUVEC
    Fibroblast Growth Factor-Basic  Sigma F0291 bFGF
    Stem Cell Factor  Sigma S7901 SCF
    Hepatocyte Growth Factor  Sigma H1404 HGF
    Endothelin 3 Sigma E9137
    Laminin Sigma L2020 Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor
    Vascular Endothelial Growth Factor  Sigma V7259 VEGF
    Leukemia Inhibitory Factor  Santa Cruz sc-4377 (LIF
    Adenine Sigma A2786
    Insulin Sigma I-6634
    3,3',5-triiodo-L-thyronine  Sigma T-6397 T3
    Cholera Toxin Sigma C-8052
    Fibronectin BD 354008 Isolated from human plasma
    apo-Transferrin Sigma T-1147
    Heparin Sigma H3149
    Heparan sulfate  proteoglycan Sigma H4777 Isolated from basement membrane of mouse  Engelbreth-Holm-Swarm tumor
    Collagen IV Sigma C5533 Isolated from human placenta
    Heat-inactivated fetal bovine serum  Invitrogen 10437-028
    D-MEM, powder Invitrogen 12800-017
    10% formalin–PBS  Fisher Scientific SF100-4
    Bovine type I collagen  Invitrogen A1064401
    Trypsin-EDTA  Fisher Scientific MT25-052-CI
    Sodium pyruvate Invitrogen 11360-070
    Gentamicin  Invitrogen 15750-060
    Penicillin/streptomincin  Invitrogen 15140-122
    L-Glutamine Invitrogen 25030-081
    Hepes Invitrogen 15630-080
    Ham's F-12 Invitrogen 11765-054
    Basal Medium Eagle Invitrogen 21010-046 BME
    RPMI-1640 Invitrogen 11875-093
    Endothelial Basal Medium Lonza CC-3156 EBM-2
    Endothelial cell growth supplement Millipore 02-102 ECGS

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Aumailley, M., Timpl, R. Attachment of cells to basement membrane collagen type IV. J Cell Biol. 103, 1569-1575 (1986).
    2. Buset, M., Winawer, S., Friedman, E. Defining conditions to promote the attachment of adult human colonic epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 23, 403-412 (1987).
    3. Fitzgerald, T. J., Repesh, L. A., Blanco, D. R., Miller, J. N. Attachment of Treponema pallidum to fibronectin, laminin, collagen IV, and collagen I, and blockage of attachment by immune rabbit IgG. Br J Vener Dis. 60, 357-363 (1984).
    4. Goetschy, J. F., Ulrich, G., Aunis, D., Ciesielski-Treska, J. Fibronectin and collagens modulate the proliferation and morphology of astroglial cells in culture. Int J Dev Neurosci. 5, 63-70 (1987).
    5. Paye, M., Lapiere, C. M. The lack of attachment of transformed embryonic lung epithelial cells to collagen I is corrected by fibronectin and FXIII. J Cell Sci. 86, 95-107 (1986).
    6. Pourreau-Schneider, N., et al. Estrogen response of MCF-7 cells grown on diverse substrates and in suspension culture: promotion of morphological heterogeneity, modulation of progestin receptor induction; cell-substrate interactions on collagen gels. J Steroid Biochem. 21, 763-771 (1984).
    7. Pratt, B. M., Harris, A. S., Morrow, J. S., Madri, J. A. Mechanisms of cytoskeletal regulation. Modulation of aortic endothelial cell spectrin by the extracellular matrix. Am J Pathol. 117, 349-354 (1984).
    8. Jessup, J. M., et al. Microgravity culture reduces apoptosis and increases the differentiation of a human colorectal carcinoma cell line. In vitro cellular & developmental biology - Animal. 36, 367-373 (2000).
    9. Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Res. 46, 5320-5329 (1986).
    10. Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat Med. 4, 901-907 (1998).
    11. Zwezdaryk, K. J., Warner, J. A., Machado, H. L., Morris, C. A., Honerzu Bentrup, K. Rotating cell culture systems for human cell culture: human trophoblast cells as a model. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
    12. Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M. M. Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
    13. Barrila, J., et al. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat Rev Microbiol. 8, 791-801 (2010).
    14. Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes and infection / Institut Pasteur. 8, 1813-1825 (2006).
    15. Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect Immun. 69, 7106-7120 (2001).
    16. Alcantara Warren, C., et al. Detection of epithelial-cell injury, and quantification of infection, in the HCT-8 organoid model of cryptosporidiosis. J Infect Dis. 198, 143-149 (2008).
    17. Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
    18. Lin, H. J., O'Shaughnessy, T. J., Kelly, J., Ma, W. Neural stem cell differentiation in a cell-collagen-bioreactor culture system. Brain Res. Dev Brain Res. 153, 163-173 (2004).
    19. He, L., et al. Increased proliferation and adhesion properties of human dental pulp stem cells in PLGA scaffolds via simulated microgravity. Intl Endo J. , (2015).
    20. Straub, T. M., et al. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg Infect Dis. 13, 396-403 (2007).
    21. Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Lack of norovirus replication and histo-blood group antigen expression in 3-dimensional intestinal epithelial cells. Emerg Infect Dis. 19, 431-438 (2013).
    22. Goodwin, T. J., Schroeder, W. F., Wolf, D. A., Moyer, M. P. Rotating-wall vessel coculture of small intestine as a prelude to tissue modeling: aspects of simulated microgravity. Proc Soc Exp Biol Med. 202, 181-192 (1993).
    23. Goodwin, T. J., Jessup, J. M., Wolf, D. A. Morphologic differentiation of colon carcinoma cell lines HT-29 and HT-29KM in rotating-wall vessels. In Vitro Cell Dev Biol. 28, 47-60 (1992).
    24. Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Engineering of a multicellular organotypic model of the human intestinal mucosa. Gastroenterology. 141, 18-20 (2011).
    25. Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am J Physiol Renal Physiol. 281, 12-25 (2001).
    26. Cherry, R. S., Papoutsakis, E. T. Physical mechanisms of cell damage in microcarrier cell culture bioreactors. Biotech and Bioeng. 32, 1001-1014 (1988).
    27. Bergmann, S., Steinert, M. From Single Cells to Engineered and Explanted Tissues: New Perspectives in Bacterial Infection Biology. Int Rev Cell Mol Biol. 319, 1-44 (2015).
    28. Xu, B., et al. Simulated microgravity affects ciprofloxacin susceptibility and expression of acrAB-tolC genes in E. coli ATCC25922. Int J Clin Exp Pathol. 8, 7945-7952 (2015).
    29. Han, C., Jiang, C., Yu, C., Shen, H. Differentiation of transforming growth factor beta1-induced mesenchymal stem cells into nucleus pulposus-like cells under simulated microgravity conditions. Cell Mol Biol (Noisy-le-Grand, France). 61, 50-55 (2015).
    30. Wang, C., et al. Microgravity activates p38 MAPK-C/EBPbeta pathway to regulate the expression of arginase and inflammatory cytokines in macrophages. Inflamm Res. 64, 303-311 (2015).
    31. Iliev, I. D., et al. Human intestinal epithelial cells promote the differentiation of tolerogenic dendritic cells. Gut. 58, 1481-1489 (2009).
    32. Kerneis, S., Bogdanova, A., Kraehenbuhl, J. P., Pringault, E. Conversion by Peyer's patch lymphocytes of human enterocytes into M cells that transport bacteria. Science. 277, 949-952 (1997).
    33. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. , (2010).
    34. Lei, N. Y., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support the growth of intestinal epithelial stem cells. PLoS One. 9, e84651 (2014).
    35. Voog, J., Jones, D. L. Stem cells and the niche: a dynamic duo. Cell Stem Cell. 6, 103-115 (2010).
    36. Jabaji, Z., et al. Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium. Tissue Eng Part C Methods. 19, 961-969 (2013).
    37. Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9, e107814 (2014).
    38. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9, 2354-2368 (2014).
    39. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med. 239, Maywood, N.J. 1124-1134 (2014).
    40. Tompkins, W. A., Watrach, A. M., Schmale, J. D., Schultz, R. M., Harris, J. A. Cultural and antigenic properties of newly established cell strains derived from adenocarcinomas of the human colon and rectum. J Natl Cancer Inst. 52, 1101-1110 (1974).
    41. Hinterleitner, T. A., Saada, J. I., Berschneider, H. M., Powell, D. W., Valentich, J. D. IL-1 stimulates intestinal myofibroblast COX gene expression and augments activation of Cl- secretion in T84 cells. Am J Physiol. 271, 1262-1268 (1996).
    42. Hoshi, H., McKeehan, W. L. Brain- and liver cell-derived factors are required for growth of human endothelial cells in serum-free culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 6413-6417 (1984).
    43. Salerno-Goncalves, R., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Characterization of CD8(+) Effector T Cell Responses in Volunteers Immunized with Salmonella enterica. Serovar Typhi Strain Ty21a Typhoid Vaccine. J Immunol. 169, 2196-2203 (2002).
    44. Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. , e51064 (2014).
    45. Eastburn, D. J., Mostov, K. E. Laying the foundation for epithelia: insights into polarized basement membrane deposition. EMBO Rep. 11, 329-330 (2010).
    46. Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. a report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Altern Lab Anim. 33, 261-287 (2005).
    47. Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111, 1021-1046 (2014).
    48. Hartung, T., et al. Good Cell Culture Practice. ECVAM Good Cell Culture Practice Task Force Report 1. Altern Lab Anim. 30, 407-414 (2002).
    49. Blanchet, O., et al. Altered binding of regulatory factors to HLA class I enhancer sequence in human tumor cell lines lacking class I antigen expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 3488-3492 (1992).
    50. Palmisano, G. L., et al. HLA-E surface expression is independent of the availability of HLA class I signal sequence-derived peptides in human tumor cell lines. Hum Immunol. 66, 1-12 (2005).
    51. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
    52. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
    53. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
    54. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. , (2014).

    Tags

    Биоинженерия выпуск 113 Человек трехмерные (3-D) микрогравитации вращающейся стенки сосуда (RWV) кишечник эпителиальные клетки
    Развитие многоклеточного трехмерной модели Органотипической слизистой оболочки пищеварительного тракта человека Выращенный в условиях микрогравитации
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Salerno-Goncalves, R., Fasano, A.,… More

    Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity. J. Vis. Exp. (113), e54148, doi:10.3791/54148 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter