Summary
Celler som växer i en tredimensionell (3-D) miljö representerar en markant förbättring jämfört med cellodling i 2-D-miljöer (t.ex. flaskor eller rätter). Här beskriver vi utvecklingen av en multicellulär 3-D organotypisk modell av det mänskliga tarmslemhinnan odlas under mikrogravitation som tillhandahålls av roterande-vägg-kärl (RWV) bioreaktorer.
Abstract
Eftersom celler som växer i en tredimensionell (3-D) miljö har potential att överbrygga många luckor i cellodling i 2-D miljöer (t.ex.., Flaskor eller tallrikar). I själva verket är det allmänt erkänt att celler odlade i flaskor eller rätter tenderar att de-differentiera och förlora specialiserade funktioner i vävnader från vilka de härstammar. För närvarande finns det i huvudsak två typer av 3-D systems kultur där cellerna sås i ställningar som härmar den nativa extracellulära matrisen (ECM): (a) statiska modeller och (b) modeller med hjälp bioreaktorer. Det första genombrottet var de statiska 3-D-modeller. 3D-modeller med hjälp av bioreaktorer såsom roterande vägg kärl (RWV) bioreaktorer är en senare utveckling. Det ursprungliga konceptet av RWV bioreaktorer utvecklades vid NASA: s Johnson Space Center i början av 1990-talet och tros att övervinna begränsningarna av statiska modeller såsom utveckling av hypoxiska, nekrotiska kärnor. De RWV bioreaktorer kan kringgå thär problem genom att tillhandahålla fluiddynamik som tillåter effektiv diffusion av näringsämnen och syre. Dessa bioreaktorer består av en rotator bas som tjänar till att uppbära och rotera två olika format av odlingskärl som skiljer sig genom sin typ luftning källa: (1) Långsam Svarvsido Vessels (STLVs) med en koaxiell oxygenator i centrum, eller (2 ) högt sidoförhållande Fartyg (HARVs) med syresättning via en platt, silikongummi gasöverföring membran. Dessa fartyg tillåter effektiv överföring gas samtidigt undvika bubbelbildning och åtföljande turbulens. Dessa villkor resulterar i laminärt flöde och minimal skjuvkraft som modeller reducerade vikt (mikrogravitation) i odlingskärlet. Här beskriver vi utvecklingen av en multicellulär 3-D organotypisk modell av det mänskliga tarmslemhinnan som består av en intestinal epitelcellinje och primära humana lymfocyter, endotelceller och fibroblaster som odlats under mikrogravitation som tillhandahålls av RWV bioreaktorn. </ P>
Introduction
Det första genombrottet i att bygga en 3-D-modellen rapporterades i början av 1980-talet då forskare började undersöka olika typer av byggnadsställningen (t.ex.., Laminin, kollagen typ I, kollagen IV och fibronektin) och cocktails av tillväxtfaktorer för att förbättra cell-till-cell och ECM-interaktioner av "statiska" 3-D-modeller 1-7. Sedan dess har det största problemet med dessa modeller varit begränsningar i överföringen av näringsämnen och syre i mediet och vävnadskonstruktioner 8. I motsats till celler i in vivo-miljö som mottar en jämn tillförsel av näringsämnen och syre från omgivande nätverk av blodkärl, den statiska karaktären hos dessa modeller hindrar effektiv fördelning av dem till cellerna. Till exempel, kommer cellaggregat som genereras i in vitro statiska modeller som överskrider några millimeter i storlek undantagslöst utvecklar hypoxiska, nekrotiska kärnor 9. De RWV bioreaktorer kan kringgå detta problemgenom att tillhandahålla fluiddynamik som tillåter effektiv diffusion av näringsämnen och syre 10-12. Men hittills arbete med RWV bioreaktorer har begränsats till införandet av en eller två celltyper 13-17. Dessutom, i stället för en rumslig orientering som liknar naturliga vävnader, dessa celler bildade cellaggregat. Den främsta orsaken till dessa begränsningar har varit bristen på en byggnadsställning kunna införliva celler på ett integrerat sätt. De ställningar som används i de RWV bioreaktorer hittills består, med få undantag 16-18, huvudsakligen av syntetiska mikropärlor, rörformiga cylindrar eller små ark 13-15,19-23. Dessa är styva material vars sammansättning och flexibilitet inte kan manipuleras, och till vilken cellerna är fästa till sin yta. Således, är det osannolikt att dessa modeller kommer att tillhandahålla ett system i vilket för att utvärdera, på ett integrerat sätt, de olika cellkomponenter såsom stromala celler (t ex., Fibroblaster, immun- och endoteliala celler) att should dispergeras inom byggnadsställning för att närmare efterlikna mänsklig vävnad.
Här beskriver vi utvecklingen av en multicellulär 3-D organotypisk modell av det mänskliga tarmslemhinnan som består av en intestinal epitelcellinje och primära humana lymfocyter, endotelceller och fibroblaster 24. Dessa celler odlades enligt mikrogravitation tillhandahålla av RWV bioreaktorn 13,25-30. I vårt 3-D-modellen, ECM besitter många distinkta egenskaper, såsom en osmolalitet som liknar till odlingsmediet (t ex., Försumbara diffusionssystem begränsningar under odling) och möjligheten att införliva celler och andra relevanta extracellulära matrisproteiner, såväl som den lämplig styvhet för att användas i bioreaktorer 24. Biologiska system är mycket komplexa, och under de senaste åren har det skett en förskjutning i fokus för mucosal forskning mot undersökning av cellinteraktioner med sin omgivning snarare än att studera dem i isolation. I synnerhet, är betydelsen av cell-cell interaktioner påverka tarmcellöverlevnad och differentiering väl dokumenterad 31-34. Specifikt kommunikationen mellan epitelceller och deras nisch har en djup påverkan på epitelceller expansionen och differentieringen 35. I själva verket är det allmänt accepterat att inte bara cell till cell utan även cell-till-ECM interaktioner är avgörande för underhåll och differentieringen av epitelceller i 3-D kulturmodeller. Tidigare studier har visat att gut ECM-proteiner, såsom kollagen I 24,36,37, laminin 38 och fibronektin 39 bidrar till att påverka tarmepitelceller att förvärva rymdorientering som liknar den nativa slemhinnan. Således, utveckling av ny teknik, som vår 3-D-modellen 24, som kan efterlikna den fenotypiska mångfald tarmen krävs om forskare har för avsikt att återskapa den komplexa cellulära och strukturella arkitekturoch funktion i tarmmikromiljö. Dessa modeller utgör ett viktigt verktyg i utvecklingen och utvärderingen av nya orala läkemedel och vaccinkandidater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Alla blodprover samlades in från frivilliga som deltog i protokoll nummer HP-00.040.025-1. University of Maryland Institutional Review Board godkänt detta protokoll och godkänt insamling av blodprover från friska frivilliga försökspersoner för de studier som ingår i detta manuskript. Syftet med denna studie var förklarat för volontärer, och alla volontärer gav informerat undertecknade samtycke innan bloddragningen.
Obs: Se tabell 1 för beredning medel tillägg. Se tabell 2 för framställningen av den 3-D odlingsmedier.
1. Beredning av odlingskärl
- Skruva av locket till påfyllningsöppningen av 50 ml-kärl och fyll med 50 ml sterilt odlingsmedium (t ex., RPMI). Utför alla förfaranden under sterila betingelser i ett laminärt dragskåp.
- Sätt på locket och torka utspilld medium på alla ytor med 70% etanol.
- Låt kärlet att incubåt i minst 15 min till O / N vid RT.
- Använda påfyllningsporten för att kassera odlingsmedium och tillsätts 30 ml 3-D-odlingsmedium.
- Torka utspilld medium på alla ytor med 70% etanol.
2. Framställning av celler
- Human epitelial cellinje (HCT-8) 24,40.
- Kulturceller i RPMI kompletterat med 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin, 50 | ig / ml gentamicin, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM HEPES-buffert och 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS ) (supplement 1). Vid 70% konfluens, dela celler vid ett förhållande av 1: 5.
- Humana kolon fibroblaster (CCD-18Co-celler) 24,41.
- Kulturceller i Basal Eagle-medium berikat med supplement 1 At confluency, dela celler vid ett förhållande av 1:. 3.
- Human Umbilical Vein Endothelial (HUVEC) -celler
- Kulturceller i Endothelial Basal Medium (EBM) medium berikat med 100 | j, g / ml heparin, 3 | ig / ml Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS), och komplettera en Vid 70% konfluens, dela celler vid ett förhållande av 1:. 2.
- Isolera Perifera mononukleära blodceller (PBMC) från blod genom densitetsgradientcentrifugering med användning av standardtekniker 43.
- I korthet, under användning av en 10 ml-pipett, tillsätt försiktigt 30 ml utspätt blod (1: 1 blod: Fosfatbuffrad saltlösning (PBS)) i en 50 ml konisk tub innehållande 10 ml av densitetscentrifugering media. Efter centrifugeringssteget, kommer lymfocyter och monocyter uppehålla sig i den "vita" skikt mellan densitetscentrifugering media och plasmaskikt.
- Uppsamla det vita lagret med hjälp av en pipett. Undvik förorening granulocyter genom att begränsa insamling av densitetscentrifugering media. Efter tvättning 43, use PBMC som är eller frysförvarade i flytande N2.
Obs: Det är viktigt att betona att PBMC består till stor del av lymfocyter och monocyter, med en liten andel av dendritiska celler och andra celltyper.
3. Framställning av kollagen-inbäddade celler
- Bestäm antalet insatser behövs baserat på antalet experimentella betingelser sättas upp. Placera ett lämpligt antal av skär in i brunnarna i en 6-brunnsplatta.
- Bered en suspension av HUVEC och fibroblaster:
- Tvätta kolvar två gånger i PBS och lossa cellerna med hjälp av trypsin, 0,25% (1x) med 0,05% trypsin-tetranatriumetylendiamintetraacetat (trypsin-EDTA). Tillsätt tillräckligt trypsinlösning för att täcka hela den cellodlings ytarea. Detachment inträffar vanligen inom 5 till 15 min
- Samlalösgjorda celler i ett 50 ml-rör innehållande 30 ml av Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) -30% FBS medium.
- Centrifugera röret vid 500 xg under 10 min.
- Resuspendera cellerna i 30 ml DMEM-30% FBS-medium.
- Räkna det totala antalet viabla celler genom att späda 20 | il av de återsuspenderade cellerna med 20 ^ il trypanblått färgämne. Ladda hemocytometer med cellblandningen. Livskraftiga PBMC blir vit klar; nonviable PBMC förvärvar färgen och blir blå.
- Resuspendera varje celltyp i DMEM-30% FBS-medium vid en koncentration av 5 - 8 x 10 7 celler ml - 1.
- Förbereda cellinnehållande kollagengeler
Obs: Varje fartyg kommer att kräva upprättandet av ~ 5 ml cellinnehållande kollagengel.- I en 50 ml konisk tub bereda kollagenblandningen genom att tillsätta 1 x DMEM-medium, kompletterat med 50 | ig / ml gentamicin, 2 mM L-glutamin och 10% värme inactivated FBS plus 3 mg / ml bovint kollagen-I, 10 | ig / ml laminin, 40 | ig / ml kollagen IV, 10 | ig / ml fibronektin, 2 | ig / ml heparinsulfat-proteoglykan och 15 mM NaOH (för att nå det fysiologiska pH).
- Tillslut röret och blanda genom att vända flera gånger tills blandningen är helt homogeniseras. Undvik bubbelbildning.
VIKTIGT: Låt blandningen på is för att förhindra gelning.- Kritiskt steg: Om blandningen utvecklar en sur utseende (gulaktig färg), tillsätt några droppar steril 1 N NaOH för att neutralisera blandningen.
- Lägg koncentrerad HUVEC och fibroblaster med en täthet av 1,0 - 1,2 och 1,5 - 2,0 x 10 6 celler / ml, respektive till den anrikade-kollagenblandningen (beskriven ovan). Stäng rören och blanda genom att vända flera gånger tills blandningen är helt homogeniseras. Undvik bubbelbildning. VIKTIGT: Låt blandningen på is för att förhindra gelning.
- Tillsätt 4 - 5 ml av den cellinnehållande kollagengel till varje insats, som har laddats in i en 6-brunnars-plattan, och tilläts gelify i huven med liten eller ingen rörelse under 1 timme.
- Efter 1 h, överföra 6-brunnar till en 37 ° C, 5% CO2 inkubator under 1 - 2 ytterligare timmar.
- Returnera 6-brunnar till huven, och med hjälp av en steril pincett och skalpell aseptiskt cut-off membranet från insatsen loss cellinnehållande gel från membranet. Skär fristående gelén i små fyrkanter (~ 5 x 5 mm).
- Lägg till de små cellinnehållande rutor i en 50-ml HARV hjälp av påfyllningsporten.
- Bered en suspension av HCT-8 epitelceller:
- Tvätta flaskorna två gånger i PBS och lossa cellerna med användning av trypsin, 0,25% (1x) med Trypsin-EDTA-behandling. Tillsätt tillräckligt trypsinlösning för att täcka hela den cellodlings ytarea. Detachment inträffar vanligtvis inom 10 till 15 min.
- Samla lösgjorda celler i 30 ml DMEM-30% FBS-medium.
- centrifugeUge DMEM-30% FBS medium innehållande röret vid 500 xg under 10 minuter.
- Resuspendera cellerna i 30 ml DMEM-30% FBS-medium.
- Räkna det totala antalet livskraftiga celler som beskrivs i 3.2.5.
- Resuspendera HCT-8 epitelceller i DMEM-30% FBS-medium vid en koncentration av 10 7 celler ml - 1.
- Tillsätt 1 ml av de koncentrerade HCT-8 epitelceller in i 50-ml HARV hjälp av påfyllningsporten.
- Med hjälp av påfyllningsöppningen, lägga till ytterligare 3-D-odlingsmedium till dess att kärlet är nästan full (~ 20 ml).
- Sätt tillbaka locket och torka läppen av påfyllningsporten med 70% etanol.
- Placera en spruta i varje spruta sporten hos RWV: placera en 5 ml-spruta innehållande 3-4 ml av 3-D-odlingsmedium i en port och en 5 ml-tomma sprutan i den andra porten.
- Ta bort alla synliga bubblor genom att dra i den tomma sprutan medan ungefär samma volym medium injiceras genom den andra sprutan porten.
- Placera vestygen i bioreaktorn, slå på strömmen och ställa in hastigheten till cirka 13 till 14 varv per minut.
Notera: Kritiskt steg: Rotationshastighets kan behöva justeras några gånger under ett experiment för att bibehålla cellerna som kretsar inuti kärlet och därigenom undvika kontakt med kärlväggarna. - Odlingsceller vid 37 ° C, 5% CO 2 i mikrogravitation, som tillhandahålls av RWV bioreaktorn.
- Ändra odlingsmedium var 3 - 4 dagar genom att ersätta cirka 30 ml med färsk 3-D odlingsmedium.
- Efter 4 dagar (± 1 dag), ta bort fartyg från bioreaktorn och lägga lymfocyter / monocyter till kärlen (2 x 10 7 / kärl).
- Placera kärlen tillbaka i bioreaktorn vid 37 ° C, 5% CO2 under ytterligare 5 dagar (± 1 dag).
- Efter ytterligare 5 dagar (dag 9 av odlingen), lägga till lymfocyter / monocyter till kärlen (2 x 10 7 / kärl) och fortsätt kulturerna för upp till 12 extra dagar. Ändra odlingsmedium var 3 - 4 dagar genom att ersätta cirka 30 ml med färsk 3-D odlingsmedium.
4. Skörd 3-D kulturer för histologi
- Med hjälp av en överföringspipett skörd varje liten gel fragment, som nu kallas "konstruera" i en sex-brunnar innehållande 10 ml 10% formalin buffert. Låt stå i 3 h vid RT eller för 12-16 timmar vid 4 ° C.
- Förbered vävnadsbehandling och bädda kassetter genom att märka och lägga till två bitar av biopsi kuddar i varje kassett.
- Doppa kassetterna i 10% formalin buffert.
- Med hjälp av pincett placera fasta-konstruktioner mellan de två kuddar.
- Doppa kassetterna i 10% formalin buffert.
- Fortsätt med standardprocedurer för inbäddning, sektionering och färgning 44.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidigare har vi konstruerat en multicellulär 3-D organotypisk modell av det mänskliga tarmslemhinnan som består av en intestinal epitelcellinje och primära humana lymfocyter, endotelceller och fibroblaster som odlats under mikrogravitation betingelser 24 (Figur 1). Fibroblaster och endotelceller var inbäddade i en kollagen I matris berikad med ytterligare gut basalmembranproteiner 45 (ie., Laminin, kollagen IV, fibronektin och heparinsulfat proteoglykan) och sattes till RWV bioreaktorer. Efter 10 - 15 dagar, visade histologisk färgning analys närvaron av villus-liknande strukturer i konstruktionerna. Cirka 60 - 80% av dessa epitelceller var organiserade som ett monoskikt av polariserade celler med deras kärnor är belägna i en basal position nära ECM, vilket är ett viktigt inslag i väl-differentierade celler (Figur 2).
ent "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1: Diagram av Byggandet av 3-D-modellen. Fyra steg är nödvändiga för att bygga 3D-systemet. Först, för att erhålla den erforderliga antalet celler för att generera 3-D-modellen, en human intestinal enterocyter epitelcellinje (HCT-8) och primära humana endotelceller och fibroblaster odlas som 2-D sammanflytande monoskikt. För det andra, ECM består av kollagen-I Matrix berikad med extra gut källaren membranproteiner (dvs., Laminin, kollagen IV, fibronektin och heparinsulfat proteoglykan) framställs. För det tredje är fibroblaster och endotelceller inbäddad i en kollagen-I blandningen och sattes till RWV bioreaktorer, följt av tillsats HCT-8 epitelceller. För det fjärde är primära lymfocyter till odlingen vid dagarna 4 och 9 (± 1 dag)."> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Jämförelse mellan normal Human tarmen och Organotypic modeller. Hematoxylin och eosin-färgning av celler odlade i 3-D mikrogravitation modell: vävnader färgades lila och byggnadsställning färgas rosa. Celler från 3-D-modellen odlades under 14 ( "a" och "b") och 20 dagar (c). Tjugo dagar efter sådd, är totala cellantalet underhållas, och celler var väl differentierade som visar villus-liknande funktioner. Bilderna visas på 100X ( "a" och "b") och 40X ( "c") förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| produktnamn | Pkg. Storlek | rekonstitution | arbets Koncentration | Lagring |
| Fibroblasttillväxtfaktor-Basic (bFGF) | 25 mg | För att framställa 25 ^ g / ml stamlösning; Tillsätt 25 mikrogram av FGF i 1 ml sterilt medium (RPMI plus 1% FCS), snurra att upplösa, tillsätt 100 l / portion | 5 ng / ml | pulver -20 ° C, arbets portioner -20 ° C, undvika upprepning frysning / tining |
| Stem Cell Factor (SCF) | 10 mg | För att framställa 10 ^ g / ml stamlösning; tillsätt 10 mikrogram av SCF i 1 ml sterilt medium (RPMI plus 1% FCS), snurra att upplösa, tillsätt 250 pl / portion | 5 ng / ml | pulver -20 ° C, arbets portioner -20 ° C, undvika upprepning frysning / tining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | 5 mg | För att framställa 5 ^ g / ml stamlösning; Tillsätt 5 mikrogram av HGF i 1 ml sterilt medium (RPMI plus 1% FCS), snurra att upplösa, tillsätt 200 l / portion | 2 ng / ml | pulver -20 ° C, arbets portioner -20 ° C, undvika upprepning frysning / tining |
| endotelin 3 | 50 mg | För att framställa 50 ^ g / ml stamlösning; tillsätt 50 mikrogram av Endotelin i 1 ml sterilt medium (RPMI plus 1% FCS), snurra att upplösa, tillsätt 100 l / portion | 10 ng / ml | pulver -20 ° C, arbets portioner -20 ° C, undvika upprepning frysning / tining |
| laminin | 1 mg | Tina långsamt vid 2-8 ° C, snurra och tillsätt 100 l / portion | 10 mg / ml | flytande -20 ° C, som arbetar portioner -20 ° C, undvika upprepning freeze / tö |
| Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) | 10 mg | För att framställa 5 ^ g / ml stamlösning; tillsätt 10 ^ g av VEGF i 2 ml sterilt vatten, för att virvla runt lösa upp, tillsätt 100 | il / alikvot | 1 ng / ml | pulver -20 ° C, arbets portioner -20 ° C, undvika upprepning frysning / tining |
| Leukemihämmande faktor (LIF) | 50 mg | För att framställa 20 ^ g / ml stamlösning; tillsätt 50 | j, g av LIF i 2,5 ml sterilt vatten, för att virvla runt lösa upp, tillsätt 100 | il / alikvot | 4 ng / ml | pulver -20 ° C, arbets portioner -20 ° C, undvika upprepning frysning / tining |
| adenin | 25 g | För att framställa 0,18 M stamlösning; lägga 121,5 mg og adedine i 50 ml 0,05 M HCl (250 | il av 37,1% HCl i 50 ml vatten)), för att virvla runt lösas upp, filtersterilisera ochtillsätt 1 ml / portion | 1,8 x 10 -3 M | pulver 4 ° C, arbets portioner -20 ° C, undvika upprepning frysning / tining |
| Insulin | 50 mg | För att framställa 5 mg / ml stamlösning; tillsätt 50 mg insulin i 10 ml av 0,005 M HCl (5 | j, l av 37,1% HCl i 10 ml vatten)), virvla runt för att lösa upp, filtersterilisera och tillsätt 0,5 ml / alikvot | 5 mg / ml | pulver -20 ° C, arbets portioner -20 ° C, undvika upprepning frysning / tining |
| T3 | 100 mg | För att framställa 2 x 10 -8 M stamlösning; lägg 3,4 mg T3 i 25 ml av 1 M NaOH, späd 0,1 ml av denna lösning i 9,9 ml PBS, utspädd igen 0,1 ml av denna lösning i 9,9 ml PBS, virvla runt för att lösa upp, filtersterilisera och tillsätt 0,5 ml / alikvot | 2 x 10 -11 M | pulver -20 ° C, arbets portioner -20 <sup> o C, undvika upprepning frysning / tining |
| koleratoxin | 5 mg | För att framställa 10 -7 M stamlösning; lägg till 5 mg av koleratoxin i 5 ml steril DDH 2 O (förvaras vid -20 ° C); späd 50 | il av denna lösning i 5 ml DDH 2 O, för att virvla runt homogenisera, filtrera sterilisera och tillsätt 0,5 ml / alikvot | 10 -10 M | pulver 4-8 ° C, arbets portioner -20 ° C, undvika upprepning frysning / tining |
| fibronektin | 1 mg | För att bereda 1 mg / ml stamlösning; tillsätt 1 mg fibronektin i 1 ml sterilt distiled vatten. Tillåt 30 min. för materialet att gå i lösning. INTE agitera eller virvel. Tillsätt 100 l / portion | 10 mg / ml | pulver 4-8 ° C, arbets portioner -20 ° C, undvika upprepning frysning / tining |
| apo-Transferrin | 100 mg För att framställa 5 mg / ml stamlösning (1,000x); tillsätt 100 mg transferrin i 20 ml PBS swirl att lösa upp, filtersterilisera och tillsätt 0,5 ml / alikvot | 5 mg / ml | pulver -20 ° C, arbets portioner -20 ° C, undvika upprepning frysning / tining | |
| Heparin | 50 KU | För att framställa 50 mg / ml stamlösning (1,000x); tillsätt 50 mg heparin in i 1 ml vatten swirl att lösa upp, filtersterilisera och tillsätt 1 ml / alikvot | 0,1 mg / ml | pulver -20 ° C, arbets portioner -20 ° C, undvika upprepning frysning / tining |
| Heparansulfatproteoglykan | 1 mg | För att framställa 0,1 mg / ml stamlösning; lägg 1 mg heparansulfat i 10 ml sterilt vatten virvel för att lösa upp och tillsätt 0,2 ml / alikvot | 2 mg / ml | pulver -20 ° C, arbets portioner -20 ° C, undvikaupprepa frys / tö |
| Kollagen IV | 5 mg | För att framställa 2 mg / ml förråds solutin: tillsätt 2 mg kollagen V i 2,5 ml steril 0,25% ättiksyra. Tillåt 1-2 h för material att gå i lösning Snurra bättre förtunning.. Tillsätt 400 | il / alikvot | 80 mg / ml | pulver -20 ° C, arbets portioner -20 ° C, undvika upprepning frysning / tining |
Tabell 1: Defined Medium Supplement Preparation.
| F-12-medium kompletterat med | |||
| Reagens | Förrådslösning lösning~~POS=HEADCOMP | Den slutliga lösningen | Belopp |
| Fetalt kalvserum | 10% | 50 ml | |
| natriumpyruvat | 100 mM | 1 mM | 5 ml |
| L-glutamin | 200 mM | 2 mM | 5 ml |
| Hepes | 1 M | 10 mM | 5 ml |
| gentamicin | 50 mg / ml | 50 | j, g / ml | 500 ^ |
| Penicillin / streptomycin | 10000 E / ml / 10 mg / ml | 100 U / ml / 100 ^ g / ml | 5 ml |
| Insulin | 5 mg / ml | 5 | j, g / ml | 500 ^ |
| T3 | 2 x 10-8 M | 2 x 10 -11 M | 500 ^ |
| adenin | 1,8 x 10-1 M | 1,8 x 10-3 M | 5 ml |
| transferrin | 5 | j, g / ml | 500 ^ | |
| heparin | 50 mg / ml | 0,1 mg / ml | 1 ml |
| ECGS | 3 mg / ml | 3 | j, g / ml | 5 ml |
| bFGF | 25 | j, g / ml | 5 ng / ml | 100 ^ |
| SCF | 10 | j, g / ml | 5 ng / ml | 250 | il |
| HGF | 5 | j, g / ml | 2 ng / ml | 200 ^ |
| endotelin 3 | 50 | j, g / ml | 10 ng / ml | 200 ^ |
| LIF | 20 | j, g / ml | 4 ng / ml | 100 ^ |
| VEGF | 5 | j, g / ml | 1 ng / ml | 100 ^ |
| Choleran toxin | 10 -7 M | 10 -10 M | 500 pl </ Td> |
| Obs: Mängden ovan citerade är för framställning av 500 ml av 3-D odlingsmedier. Media måste lagras vid 4 ° C i högst 2 veckor | |||
Tabell 2: Framställning av 3-D Culture Media.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta manuskript beskriver vi utvecklingen av en genmanipulerad modell av det mänskliga tarmslemhinna består av multiplar celltyper inklusive primära humana lymfocyter, fibroblaster, och endotelceller, såväl som intestinala epiteliala cellinjer 24. I denna 3-D-modellen, celler odlas i en kollagen-rika extracellulära matrix i mikrogravitation villkor 24.
Såsom tidigare beskrivits, de viktigaste egenskaperna hos denna modell är: (i) förmåga att härma epitelvävnad mono organisation, (ii) induktionen av lämplig polaritet av epitelceller, tight junctions, desmosomer och mikrovilli, (iii) en lång uttrycket kultur (upp till 20 dagar) med hög lönsamhet för de primära cellerna (dvs., fibroblaster och endotelceller), (iv) uttrycket vävnadsliknande differentieringsmarkörer inklusive villin, cytokeratin, E-cadherin och mucin, (v) förmågan att producera stora mängder av cytokiner (t ex., IL-8) och alkalisk fosfatas på antigen stimulering, (vi) transport av näringsämnen såsom glukos (dvs., uttryck av disackaridaser, och närvaro av socker transportörer), och (vii) flera härstamning differentiering av intestinala epitelceller (dvs., absorberande enterocyter, globet och M-celler) 24.
Det är viktigt att understryka att för att uppnå reproducerbara resultat med hjälp av vår 3-D-modellen utredaren måste följa riktlinjer för god cellodlings 46-48. Det är mycket viktigt att systematiskt styra celler för livskraft, mykoplasmkontaminering och förändringar i celltillväxtbeteende. Om ett problem identifieras först säkerställa att inga obehöriga ändringar har gjorts till protokollet. Om problemet kvarstår, byta till en ny sats av olika mediumkomponenter (inklusive serum) och /eller celler. En begränsning av vår 3-D-modellen är användningen av tumorigena HCT-8 epitelial cellinje. Det är dock viktigt att tänka på att förekomsten av HCT-8 Line erbjuder fördelen av att vara kommersiellt tillgängliga. Dessutom dessa epitelceller inte uttrycka antingen klassisk eller icke-klassisk HLA-antigen (HLA) -klass I-molekyler 49,50. Således, de tillåter den kultur av epitelceller med PBMC från olika HLA-klass I haplotyper i frånvaro av epitelcell-PBMC alloreaktivitet. Dessutom, när man jämför detta system med system som tarmen stamceller organoids 51-53, har den här modellen många fördelar. Även gut stamcells organoids ge ovärderlig information om cellbiologi och tarm differentiering 51-53, medger denna modell direkt apikala exponering för näringsämnen, droger och patogener. Denna modell ger också enkel tillgång till luminala innehållet sådana antimikrobiella peptider och cytokiner. I kontrast, organoids är kompakta undess med en luminal yta vänd inåt. Följaktligen finns det en begränsad mängd av produkt som kan införas i organoid lumen 54.
Vi tror att vår flercelliga 3-D organotypic modell av det mänskliga tarmslemhinnan har bred potential som ett verktyg för upptäckt i både hälsa och sjukdom, inklusive interaktion med patogener, antigen trafficking, och inflammatoriska och metaboliska processer 24. Slutligen, på grund av den flercelliga naturen av vårt 3-D-modellen, kan vår modell möjliggör GAIN- och förluststudier med immuncelltyper som sannolikt kommer att påverka epitelceller beteende in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor | Synthecon | RCCs-4DQ | For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available. |
| Disposable 50 ml-vessel | Synthecon | D-405 | Box with 4 vessels |
| HCT-8 epithelial cells | ATCC | CCL-244 | |
| CCD-18Co Fibroblasts | ATCC | CRL-1459 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | ATCC | CRL-1730 | HUVEC |
| Fibroblast Growth Factor-Basic | Sigma | F0291 | bFGF |
| Stem Cell Factor | Sigma | S7901 | SCF |
| Hepatocyte Growth Factor | Sigma | H1404 | HGF |
| Endothelin 3 | Sigma | E9137 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
| Vascular Endothelial Growth Factor | Sigma | V7259 | VEGF |
| Leukemia Inhibitory Factor | Santa Cruz | sc-4377 | (LIF |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Insulin | Sigma | I-6634 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma | T-6397 | T3 |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
| Fibronectin | BD | 354008 | Isolated from human plasma |
| apo-Transferrin | Sigma | T-1147 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Heparan sulfate proteoglycan | Sigma | H4777 | Isolated from basement membrane of mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | Isolated from human placenta |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| D-MEM, powder | Invitrogen | 12800-017 | |
| 10% formalin–PBS | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Bovine type I collagen | Invitrogen | A1064401 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | MT25-052-CI | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750-060 | |
| Penicillin/streptomincin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
| Ham's F-12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| Basal Medium Eagle | Invitrogen | 21010-046 | BME |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | EBM-2 |
| Endothelial cell growth supplement | Millipore | 02-102 | ECGS |
References
- Aumailley, M., Timpl, R. Attachment of cells to basement membrane collagen type IV. J Cell Biol. 103, 1569-1575 (1986).
- Buset, M., Winawer, S., Friedman, E. Defining conditions to promote the attachment of adult human colonic epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 23, 403-412 (1987).
- Fitzgerald, T. J., Repesh, L. A., Blanco, D. R., Miller, J. N. Attachment of Treponema pallidum to fibronectin, laminin, collagen IV, and collagen I, and blockage of attachment by immune rabbit IgG. Br J Vener Dis. 60, 357-363 (1984).
- Goetschy, J. F., Ulrich, G., Aunis, D., Ciesielski-Treska, J. Fibronectin and collagens modulate the proliferation and morphology of astroglial cells in culture. Int J Dev Neurosci. 5, 63-70 (1987).
- Paye, M., Lapiere, C. M. The lack of attachment of transformed embryonic lung epithelial cells to collagen I is corrected by fibronectin and FXIII. J Cell Sci. 86, 95-107 (1986).
- Pourreau-Schneider, N., et al. Estrogen response of MCF-7 cells grown on diverse substrates and in suspension culture: promotion of morphological heterogeneity, modulation of progestin receptor induction; cell-substrate interactions on collagen gels. J Steroid Biochem. 21, 763-771 (1984).
- Pratt, B. M., Harris, A. S., Morrow, J. S., Madri, J. A. Mechanisms of cytoskeletal regulation. Modulation of aortic endothelial cell spectrin by the extracellular matrix. Am J Pathol. 117, 349-354 (1984).
- Jessup, J. M., et al. Microgravity culture reduces apoptosis and increases the differentiation of a human colorectal carcinoma cell line. In vitro cellular & developmental biology - Animal. 36, 367-373 (2000).
- Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Res. 46, 5320-5329 (1986).
- Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat Med. 4, 901-907 (1998).
- Zwezdaryk, K. J., Warner, J. A., Machado, H. L., Morris, C. A., Honerzu Bentrup, K. Rotating cell culture systems for human cell culture: human trophoblast cells as a model. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M. M. Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Barrila, J., et al. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat Rev Microbiol. 8, 791-801 (2010).
- Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes and infection / Institut Pasteur. 8, 1813-1825 (2006).
- Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect Immun. 69, 7106-7120 (2001).
- Alcantara Warren, C., et al. Detection of epithelial-cell injury, and quantification of infection, in the HCT-8 organoid model of cryptosporidiosis. J Infect Dis. 198, 143-149 (2008).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
- Lin, H. J., O'Shaughnessy, T. J., Kelly, J., Ma, W. Neural stem cell differentiation in a cell-collagen-bioreactor culture system. Brain Res. Dev Brain Res. 153, 163-173 (2004).
- He, L., et al. Increased proliferation and adhesion properties of human dental pulp stem cells in PLGA scaffolds via simulated microgravity. Intl Endo J. , (2015).
- Straub, T. M., et al. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg Infect Dis. 13, 396-403 (2007).
- Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Lack of norovirus replication and histo-blood group antigen expression in 3-dimensional intestinal epithelial cells. Emerg Infect Dis. 19, 431-438 (2013).
- Goodwin, T. J., Schroeder, W. F., Wolf, D. A., Moyer, M. P. Rotating-wall vessel coculture of small intestine as a prelude to tissue modeling: aspects of simulated microgravity. Proc Soc Exp Biol Med. 202, 181-192 (1993).
- Goodwin, T. J., Jessup, J. M., Wolf, D. A. Morphologic differentiation of colon carcinoma cell lines HT-29 and HT-29KM in rotating-wall vessels. In Vitro Cell Dev Biol. 28, 47-60 (1992).
- Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Engineering of a multicellular organotypic model of the human intestinal mucosa. Gastroenterology. 141, 18-20 (2011).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am J Physiol Renal Physiol. 281, 12-25 (2001).
- Cherry, R. S., Papoutsakis, E. T. Physical mechanisms of cell damage in microcarrier cell culture bioreactors. Biotech and Bioeng. 32, 1001-1014 (1988).
- Bergmann, S., Steinert, M. From Single Cells to Engineered and Explanted Tissues: New Perspectives in Bacterial Infection Biology. Int Rev Cell Mol Biol. 319, 1-44 (2015).
- Xu, B., et al. Simulated microgravity affects ciprofloxacin susceptibility and expression of acrAB-tolC genes in E. coli ATCC25922. Int J Clin Exp Pathol. 8, 7945-7952 (2015).
- Han, C., Jiang, C., Yu, C., Shen, H. Differentiation of transforming growth factor beta1-induced mesenchymal stem cells into nucleus pulposus-like cells under simulated microgravity conditions. Cell Mol Biol (Noisy-le-Grand, France). 61, 50-55 (2015).
- Wang, C., et al. Microgravity activates p38 MAPK-C/EBPbeta pathway to regulate the expression of arginase and inflammatory cytokines in macrophages. Inflamm Res. 64, 303-311 (2015).
- Iliev, I. D., et al. Human intestinal epithelial cells promote the differentiation of tolerogenic dendritic cells. Gut. 58, 1481-1489 (2009).
- Kerneis, S., Bogdanova, A., Kraehenbuhl, J. P., Pringault, E. Conversion by Peyer's patch lymphocytes of human enterocytes into M cells that transport bacteria. Science. 277, 949-952 (1997).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. , (2010).
- Lei, N. Y., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support the growth of intestinal epithelial stem cells. PLoS One. 9, e84651 (2014).
- Voog, J., Jones, D. L. Stem cells and the niche: a dynamic duo. Cell Stem Cell. 6, 103-115 (2010).
- Jabaji, Z., et al. Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium. Tissue Eng Part C Methods. 19, 961-969 (2013).
- Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9, e107814 (2014).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9, 2354-2368 (2014).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med. 239, Maywood, N.J. 1124-1134 (2014).
- Tompkins, W. A., Watrach, A. M., Schmale, J. D., Schultz, R. M., Harris, J. A. Cultural and antigenic properties of newly established cell strains derived from adenocarcinomas of the human colon and rectum. J Natl Cancer Inst. 52, 1101-1110 (1974).
- Hinterleitner, T. A., Saada, J. I., Berschneider, H. M., Powell, D. W., Valentich, J. D. IL-1 stimulates intestinal myofibroblast COX gene expression and augments activation of Cl- secretion in T84 cells. Am J Physiol. 271, 1262-1268 (1996).
- Hoshi, H., McKeehan, W. L. Brain- and liver cell-derived factors are required for growth of human endothelial cells in serum-free culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 6413-6417 (1984).
- Salerno-Goncalves, R., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Characterization of CD8(+) Effector T Cell Responses in Volunteers Immunized with Salmonella enterica. Serovar Typhi Strain Ty21a Typhoid Vaccine. J Immunol. 169, 2196-2203 (2002).
- Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. , e51064 (2014).
- Eastburn, D. J., Mostov, K. E. Laying the foundation for epithelia: insights into polarized basement membrane deposition. EMBO Rep. 11, 329-330 (2010).
- Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. a report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Altern Lab Anim. 33, 261-287 (2005).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111, 1021-1046 (2014).
- Hartung, T., et al. Good Cell Culture Practice. ECVAM Good Cell Culture Practice Task Force Report 1. Altern Lab Anim. 30, 407-414 (2002).
- Blanchet, O., et al. Altered binding of regulatory factors to HLA class I enhancer sequence in human tumor cell lines lacking class I antigen expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 3488-3492 (1992).
- Palmisano, G. L., et al. HLA-E surface expression is independent of the availability of HLA class I signal sequence-derived peptides in human tumor cell lines. Hum Immunol. 66, 1-12 (2005).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. , (2014).
