造血干细胞和祖细胞(HSPC)的发展过程中从专门(hemogenic)内皮细胞衍生,还知之甚少由一些内皮细胞指定成为血液形成的过程。我们展示了一个流式细胞仪为基础的方法,允许从鼠胚胎组织hemogenic内皮细胞和HSPC的同时分离。
从胚胎血管内皮hemogenic内皮细胞的规格在不同组织中短暂的发展时期发生,并且是必要的权威性HSPC从鼠额外的胚胎卵黄囊,胎盘,脐带血管和胚胎主动脉 – 性腺 – 中肾的出现( AGM)地区。该细胞群的瞬时性质和小尺寸使得其小心量化和实验应用再现的隔离技术上困难。我们已经在在卵黄囊和AGM的峰值生成时间建立了荧光激活细胞分选(FACS)的协议为hemogenic内皮细胞和HSPC的同时分离。我们演示了卵黄囊和从小鼠胚胎AGM组织解剖方法,以及我们提出之前通过流式细胞仪识别和检索最大细胞存活优化组织消化和抗体偶联条件。代表FACS ANA裂解图所示标识的hemogenic内皮细胞和表型HSPC,并描述基于甲基纤维素法对克隆水平评估其造血的潜力。
一个功能循环系统需要血管和血细胞的并行开发。在血液开发(原始造血)的最初阶段,红细胞的起源仍然热烈讨论1。相反,在血细胞发育(永久造血)的后期阶段,它已成为越来越清楚,多系HSPC从卵黄囊,胎盘内获得造血潜力(hemogenic内皮细胞)专门血管内皮细胞和AGM出现2-5,以及在卵黄和脐带血管,胚胎心内膜6和头部脉管7。 hemogenic内皮细胞的这些不同组织中的规范发生在发育的特定阶段;例如,在〜E8.25卵黄囊内,并在〜E10 8-12的AGM内。然而,即使在这些特定发育窗,hemogenic远藤人口thelial细胞代表所有的内皮细胞的一小部分- 11,12(1卵黄囊和AGM内皮细胞的3%)。 hemogenic内皮细胞“规范”的过程是鼠关键的,以及人类,造血功能。造血细胞已经显示从卵黄囊血管的内皮细胞,并在人类胚胎13主动脉芽,和几个实验室已经证明,从人多能干细胞的血细胞的生产需要中间体14-16内皮细胞。因此,限定鼠hemogenic内皮细胞的表型和理解,导致其在该动物模型的开发应有助于追求用于产生自人多能干细胞hemogenic内皮细胞的体外技术的分子事件。反过来,用于大规模产生从多谱系HSPC分化血细胞类型的方法的最终发展 – 本身DERI经由生理相关hemogenic内皮细胞中间VED从人多能干细胞 – 将对血液,肿瘤学和再生医学难以置信的治疗潜力。为了实现这一目标,我们已经定义hemogenic内皮细胞的表型,在克隆水平,鼠卵黄囊11和AGM 12,二胚胎发生过程中确定的HSPC生产主要场所内。像成人骨髓17,胚胎hemogenic内皮细胞和HSPC展览Hoechst的染料流出属性内HSPC,因此出现了“侧群”中在FACS曲线图5,11,12( 如图3所示)的细胞(SP)。此外,我们还表明,hemogenic内皮细胞表达两种内皮标志物和干细胞(分别的Flk1和CKIT,),但是不表达造血谱系标记,CD45 5,11,12。因此,hemogenic内皮细胞可以是IDENT指明分数,并通过FACS分离的Flk1 + / CKIT + / CD45 – SP细胞,我们已经表明,这些细胞给予包含卵黄囊和AGM细胞5,11,12的Flk1- / CKIT + / CD45 + SP级分中产生HSPC。 Hemogenic内皮细胞和HSPC可以识别和从卵黄囊或从任一新鲜安乐死胚胎收获的AGM组织中分离出,或者从在体外胚胎培养长达48小时(如在图1中描绘)中培养胚胎。 体外培养允许选择性个别胚与药理学试剂的前处理,并且还允许所希望的转基因( 即,通过慢病毒转导)的瞬时表达。 hemogenic内皮细胞和HSPC通过本文描述的方法的FACS鉴定可以用作在遗传操作的小鼠模型确定的造血发育的定量量度;也可以用于随后的实验应用,包括血液佛检索到的细胞中最差测定,表达分析,和移植。
动物主题:用途和伦理问题
越来越多的文献机构已建立hemogenic内皮细胞形成HSPC期间胚胎发育的决定性阶段造血的重要贡献。然而,在生理条件和信号促进内皮细胞的一个亚群的规格朝向hemogenic命运仍然知之甚少,因此还不能在体外设置来模拟。事实上,在本文中描述的技术是目前在由我们实验室和其它基团,可改善其hematovascular发展,使得用于离体 hemogenic内皮细胞说明书和HSPC生产办法可能有一天会开发领域的理解。直到这样的时间,但是,该领域仍然依赖于从野生型初级组织(与基因角度讲修改)小鼠胚胎来获得指定hemogenic内皮细胞和HSPC进一步研究。 Hemogenic内皮细胞和HSPC可以可靠地识别和从任一E8.5分离(10 – 12体节对)卵黄囊或E10.5(35 – 40体节对)的AGM 11,12。由于hemogenic内皮细胞的相对稀缺(通常占1 -总内皮细胞11,12-这些组织内的3%),从多个组织的池(〜8 – 10)同窝成一个单一的样品强烈,以便建议获得足够的细胞用于后续实验。核实hemogenic内皮细胞和HSPC已成功鉴定和分离可以通过检索细胞培养诱导造血细胞分化的条件下完成的。在这些条件下,hemogenic内皮细胞和HSPC将表现出多谱系造血细胞分化,导致在含有红霉素菌落的外观- 甲状腺祖细胞(BFU-E),粒细胞和巨噬细胞祖细胞(CFU-GM),和粒细胞,红细胞,巨噬细胞,巨核细胞祖集落(CFU-GEMM)。
有留在hematovascular发展领域的许多悬而未决的问题 – 这是尚处于起步阶段现场,由于在研究过程中具体的发展窗户,只有出现短暂的小细胞群所固有的技术难题。上面列出的技术通过允许从hemogenic内皮细胞甚至单个细胞和HSPC种群在使用试剂和设备通常是在大多数实验室可用的关键发育时间点胚胎组织的隔离改善许多的这些困难。我们的协议还允许从YS和AGM非hemogenic内皮细胞级分,其可以被用于独立的分析,或作为对照用于随后的分析的hemogenic内皮细胞级分的平行隔离。
在使用这种多色基于FACS的方法hemogenic内皮细胞的分离的一个关键点是适当的光谱合作mpensation和单色门精确的绘制。因此,强烈建议在未染色和单色彩控制包括在所有的实验运行,他们 – 与同型匹配的对照抗体治疗的样品一起 – 可以用来初步建立适当的光谱补偿和门的图。然而,非特异性染色由这个协议中,因而未染色和单色控制是足够的栅极的例行核查一次的FACS分拣设定已优化是最小的。
绘制不准确门SP与本报告中所描述的方法特别的关注。以前的研究已经表明,多潜能干细胞表现出的Hoechst红17的优惠流出,形成用于通过FACS其在SP外观的生理基础。我们已经表明,hemogenic内皮细胞和HSPC被SP的细胞级分5,11内类似地找到。药物如在钙通道维拉帕米抑制因子通过各种跨膜多药耐药转运堵塞阻断SP细胞此赫斯特染料外排的行为。在造血干细胞和祖细胞,这主要发生经由ABCG2 / BCRP1转运24。通常维拉帕米诱导> 50%的SP堵塞,但是,Hoechst的流出看到的整体程度及其随后堵塞由维拉帕米已经显示由发育时间受到影响,这可能是由于改变多种多药耐药转运体类型的表达与差Hoechst的流出的能力,和敏感性维拉帕米5。因此,强烈建议维拉帕米处理赫斯特染色阴性对照被标准地纳入以确保正确的SP门:如果SP门正确绘制,在SP细胞的数量显着减少应该在用Hoechst染色的样品被检测存在维拉帕米。
之前我们已经表明,分类从小鼠E9.5卵黄囊SP细胞有80〜 -相比于普通E9.5的匹配数量时,基于甲基纤维素造血文化产生HSPC 90倍的更大的能力,非赫斯特染色全YS组织细胞5。 SP的进一步表征表明,在早期造血,在E8.0血管发育过程中的鼠卵黄囊,存在VE-钙粘蛋白和的Flk-1的明显的表达,但干(的c-Kit)和造血标记物的低表达(CD45)。因此,在这个时间点的发育,原始(非hemogenic)乳油,定义为的Flk-1 + / CD31 + / CD45-非SP细胞占主导地位。这种表达谱移内皮标志物表达降低和CD45和c-Kit表达的增加,伴随着在 E9.5和E11.5 5之间体外生成HSPC增加的能力。这表明YS组织的造血活性包含在SP中,成为E9.5和E11.5,和occurr之间最明显ING通过内皮细胞的特点和逐步收购造血能力定时损失。这样,多药耐药转运该给SP的表型产生的表达是hemogenic内皮5的重要表型标记;事实上,从AGM非SP细胞不表现出造血潜能12。因此,通过在两个YS和AGM Hoechst染色的SP成功分离确保了细胞将来自该馏分内的给定组织的造血干细胞区室,和细胞的后续抗体染色进行排序将允许hemogenic歧视(的Flk -1 + /的c-Kit + / CD45-)与HSPC(Flk1- / C-KIT + / CD45 +)的人口5,11,12。此外,先前已指出,卵黄囊和AGM组织的SP内的CD41 +细胞是能够多谱系集落形成的基于甲基纤维素培养11,12。我们定义hemogenic内皮细胞的Flk1 +的c-Kit + CD45-细胞SPS按使用CD45作为造血系统的指定标志,而不是CD41给了我们寻找的Flk1和CD45的表达几乎是相互排斥的5,11。这允许同时具有内皮在SP内信元的纯隔离(的Flk-1)和茎必要内皮特性(的c-Kit)造血过渡但尚未经过了这种变化,因为在这些情况下的CD45确定细胞。考虑HSPC人口的分分离,定义为的Flk-1 / C-套装+ / CD45 + / SP细胞,成CSF1R +(组织巨噬细胞)和Csf1r-(HSC)分数,将是有益最近由戈麦斯和他的同事报告25,因为这将提供与组织的巨噬细胞祖细胞种群的真实HSPC的更大的分辨率,但这不应影响hemogenic内皮细胞级分,其隔离自从CSF1R我们提出是巨噬细胞祖细胞26的标记物的完整性。
HemogENIC内皮细胞在两种YS和AGM(包括1 – 内皮细胞的3%)一个罕见亚群,因此在他们的研究中的一个主要挑战是用于随后应用不足细胞产量。该协议通常导致通过排序的时间,和典型hemogenic内皮细胞从汇集组织从多个胚胎获得排序剩余的活细胞的70-80%可以产生仅几百细胞,即使在最佳条件下,只有10%-20%检索到嵌入甲基产生的菌落细胞。为了最大限度地提高分选的细胞数量,所以强烈建议研究者采取措施,以确保整个过程的每一个步骤组织及细胞活力:组织应迅速解剖汇集,以及样品应保持在冰上,只要有可能。样品应立即FACS分选前准备新鲜,并分成含药血清含量高,或直接进入甲基纤维素文化描述收集管d以上。如果生存问题仍然存在,收集管也可以预涂血清,以进一步提高分选细胞的存活。如果hemogenic内皮细胞产量仍然很低,可用于代替本文所述的胚胎组织衍生的单色控制的频谱补偿成人骨髓或市售的荧光团共轭珠。如果分选的细胞被用于培养,hemogenic内皮细胞和HSPC应直接分类到组织培养孔中。如果分选的细胞被用于DNA或RNA相关的基因表达分析,hemogenic和非hemogenic内皮细胞和HSPC可以直接排序到含有样品的裂解缓冲液以最小化细胞损失收集管。
概述的技术允许从相同胚胎组织hemogenic和非hemogenic内皮细胞的成功(和同时)隔离,以及HSPC和成熟的血细胞级分。这种方法可以进一步螺柱发生的内皮细胞生成血液的临界转变的分子基础的年。从这些发育研究中获得的分析可以被用于从多能干优化人力hemogenic内皮细胞和HSPC后代的产生,和潜在的自体,茎为流行造血功能障碍的治疗中的细胞。
The authors have nothing to disclose.
作者宣称,他们没有竞争的经济利益。
DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester) | Sigma | D5942 | TOXIC irritant: Wear eye protection, mask, and gloves when handling. |
Absorbent bench underpad | Covidien | 7134 | |
#5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
8.5cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | TOXIC inhalant: Use in fume hood. |
100x Penicillin Streptomycin Glutamine (10,000u/mL Penicillin, 10,000mg/mL Streptomycin, 29.2mg/mL L-glutamine) | Invitrogen | 10378016 | |
Type II Collagenase | Worthington | LS004174 | |
Falcon 70uM nylon cell strainer | Corning | CLS431751 | |
Anti-Mouse CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | |
Anti-Mouse CD31 – PE | eBioscience | 12-0311-81 | |
Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 561259 | |
Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma | 14533 | TOXIC: irritant. Wear eye protection and gloves when handling. Prepare stock solution of 25mg/mL in distilled H2O, store aliquots at -20C until ready for use |
Verapamil Hydrochloride | Sigma | 1711202 | TOXIC: irritant. Wear eye protection, mask, and gloves when handling. Prepare stock solution of 5mM (100X) in 95% ethanol. Store at -20C until ready for use |
Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
MethoCult GF M3434 | Stem Cell Technologies | 3434 | Thaw and aliquot per manufacturer's instructions |
Modified Giemsa Stain | Sigma | GS500 | TOXIC: Contains Methanol – use in fume hood and wear gloves with handling. Dilute in distilled water to 0.02% solution. |
Cytospin Centrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
Clipped Funnel Starter Kit | Thermo Scientific | 3120110 | Includes cytofunnels, filter paper, cytoslides, and cytoclips for use with Cytospin centrifuge |
Anti-Mouse B-220 – FITC | BD Pharmingen | 553088 | |
Anti-Mouse Gr-1-FITC | eBioscience | 11-5931-85 | |
Anti-Mouse Ter-119-FITC | eBioscience | 11-5921-85 | |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 10437-077 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (4.5g/L) | Life Technologies | 11965-092 | |
Hank's Buffered Salt Solution | Life Technologies | 14175-095 | |
Fibronectin-coated 24-well tissue culture plate | EMD Millipore | PIFB24P05 | |
IgG2A-PE | BD Pharmingen | 553930 | |
IgG2B-FITC | BD Pharmingen | 556923 |