Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) leiten sich von spezialisierten (hemogenic) Endothelzellen während der Entwicklung, noch wenig über das Verfahren bekannt, von denen einige Endothelzellen angeben zu werden Blut bilden. Wir zeigen eine Durchflusszytometrie basierende Methode ermöglicht die gleichzeitige Isolierung von hemogenic Endothelzellen und HSPC aus murinen embryonalen Geweben.
Die Spezifikation von hemogenic Endothelzellen aus embryonalen vaskuläre Endothel tritt bei kurzen Entwicklungszeiten innerhalb verschiedene Gewebe und ist notwendig für die Entstehung der endgültigen HSPC aus dem murinen zusätzliche embryonale Dottersack, der Plazenta, Nabelschnur Gefäße und den embryonalen Aorta-Gonaden-Mesonephros ( AGM) Region. Die transiente Natur und die geringe Größe dieser Zellpopulation macht seine reproduzierbare Isolierung für eine sorgfältige Quantifizierung und experimentelle Anwendungen technisch schwierig. Wir haben eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) -basierte Protokoll für die simultane Isolierung von hemogenic Endothelzellen und HSPC etabliert während ihrer Spitzengenerationszeiten in den Dottersack und AGM. Wir zeigen, Methoden für die Präparation von Dottersack und AGM-Gewebe von Maus-Embryonen, und wir präsentieren optimierte Gewebe Verdauung und Antikörperkonjugation Bedingungen für maximale Überleben der Zelle vor der Identifizierung und den Abruf über FACS. Repräsentative FACS anaLyse Plots gezeigt, dass die hemogenic Endothelzellen und HSPC Phänotypen identifizieren und beschreiben eine Methyl basierender Test zur Bewertung ihrer Blutbildungspotential auf einer klonalen Ebene.
Ein Funktionskreislauf-System erfordert die parallele Entwicklung von Blutgefäßen und Blutzellen. Zu den frühesten Stadien der Blut Entwicklung (primitive Hämatopoese), der Ursprung von Erythroblasten bleibt 1 kräftig diskutiert. Im Gegensatz dazu in späteren Stadien der Blutzellentwicklung (definitive Hämatopoese) ist es immer deutlicher, dass HSPC Multi-Linie von spezialisierten vaskulären endothelialen Zellen entstehen, die den Blutbildungspotential (hemogenic Endothelzellen) im Dottersack, der Plazenta zu erwerben, und AGM 2-5, sowie in der Dotter und Nabelschnurgefäßen, die embryonale Endokard 6 und Kopf Gefäß 7. Die Spezifikation von hemogenic Endothelzellen innerhalb dieser unterschiedlichen Geweben tritt in bestimmten Phasen der Entwicklung; zum Beispiel im Dottersack bei ~ E8.25 und in der Hauptversammlung bei ~ E10 8-12. Doch selbst in diesen spezifischen Entwicklungs Fenster, die Bevölkerung von hemogenic endothelial Zellen stellt einen kleinen Bruchteil aller Endothelzellen (1 – 3% des Dottersackes und AGM Endothelzellen) 11,12. Der Prozess der hemogenic endothelial cell "Spezifikation" für murine kritisch, sowie menschliche, Hämatopoese. Hämatopoetische Zellen sind gezeigt worden , aus dem Endothel der Dottersack Gefäßen und der Aorta in menschlichen Embryonen 13 zu knospen, und mehrere Labors haben gezeigt , dass Blutzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen eine endotheliale Zellzwischen 14-16 erfordert. Somit definieren den Phänotyp murine hemogenic Endothelzellen und die molekularen Ereignisse zu verstehen , die in diesem Tiermodell für ihre Entwicklung führen sollte zur Erzeugung von hemogenic Endothelzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen Verfolgung in vitro Technologien erleichtern. Im Gegenzug HSPC die mögliche Entwicklung eines Ansatzes für eine groß angelegte Erzeugung von differenzierten Blutzelltypen aus Multi-Linie – selbst derived von menschlichen pluripotenten Stammzellen über einen physiologisch relevanten hemogenic Zwischen Endothelzellen – für hämatologische unglaubliche therapeutische Potenzial hätte, onkologischen und der regenerativen Medizin. Auf dem Weg zu diesem Ziel haben wir den Phänotyp hemogenic Endothelzellen definiert, auf einer klonalen Ebene im murinen Dottersack 11 und 12 AGM, zwei großen Standorten der endgültigen HSPC Produktion während der Embryonalentwicklung. Wie HSPC innerhalb erwachsenen Knochenmark 17, embryonale hemogenic Endothelzellen und HSPC zeigen Hoechst Farbstoff Ausströmen Eigenschaften und deshalb in den "Side Population" erscheinen (SP) von Zellen auf einem FACS Plot 5,11,12 (wie in Abbildung 3 dargestellt). Darüber hinaus haben wir auch gezeigt , dass hemogenic Endothelzellen Marker sowohl Endothelzellen exprimieren und Stammzellen (Flk1 und ckit, respectively), aber die hämatopoetischen Linienmarker nicht ausdrücken, CD45 5,11,12. Somit kann hemogenic Endothelzellen ident seinified und durch FACS wie Flk1 + / ckit + / CD45- SP – Zellen isoliert, und wir haben , dass diese Zellen in der Flk1- / ckit + / CD45 + SP Fraktion des Dottersackes und AGM Zellen 5,11,12 enthalten verursachen HSPC gezeigt. Hemogenic Endothelzellen und HSPC können identifiziert und von Dottersack oder AGM Gewebe entweder aus frisch getöteten Embryonen oder von Embryonen kultiviert für bis zu 48 Stunden in ex vivo Embryokultur geerntet , isoliert werden (wie in 1 dargestellt). Ex – vivo – Kultur erlaubt eine selektive Vorbehandlung von einzelnen Embryonen mit pharmakologischen Mitteln, und ermöglicht auch eine transiente Expression von gewünschten Transgene (dh durch lentivirale Transduktion). FACS Identifizierung hemogenic Endothelzellen und HSPC durch das hierin beschriebene Verfahren kann in genetisch manipulierten Mausmodellen als quantitatives Maß für definitive hämatopoetischen Entwicklung verwendet werden; die Zellen können auch für die nachfolgende experimentelle Anwendungen, einschließlich Blut-fo abgerufen werden,rming Assays, Expressionsanalyse und Transplantation.
Tierthemen: Verwendungen und ethische Überlegungen
Eine wachsende Zahl von Literatur hat den wichtigen Beitrag der hemogenic Endothelzellen HSPC Bildung während der endgültigen Hämatopoese Stadium der Embryonalentwicklung etabliert. Dennoch bleiben die physiologischen Bedingungen und Signale , die Spezifikation einer Subpopulation von Endothelzellen zu einem hemogenic Schicksal fördern schlecht verstanden, und daher noch nicht in einer in vitro Umgebung nachgeahmt werden. Tatsächlich sind die in diesem Dokument beschriebenen Techniken sind derzeit im Einsatz durch unser Labor und andere Gruppen das Feld des Verständnisses von hematovascular Entwicklung zu verbessern, so dass ein Konzept für die ex vivo hemogenic Endothelzellen Spezifikation und HSPC Produktion eines Tages entwickelt werden. Bis zu diesem Zeitpunkt bleibt jedoch das Feld abhängig von primären Gewebe von Wildtyp (und Gentisch modifiziert) Maus-Embryonen für die weitere Untersuchung angegeben hemogenic Endothelzellen und HSPC zu erhalten. (- 12 Somiten Paaren 10) yolk sac oder E10.5 (35-40 Somiten Paare) AGM 11,12 Hemogenic Endothelzellen und HSPC zuverlässig entweder aus E8.5 identifiziert und isoliert werden. Aufgrund der relativen Mangel an hemogenic Endothelzellen ( in der Regel repräsentieren 1-3% der gesamten Endothelzellen 11,12 in diesen Geweben) die gemeinsame Nutzung von Geweben aus mehreren (~ 8 – 10) littermates in einer einzigen Probe wird , um dringend empfohlen genügend Zellen für die nachfolgende Experimente erhalten. Die Überprüfung der hemogenic Endothelzellen und HSPC wurden erfolgreich identifiziert und isoliert von der Kultur der abgerufenen Zellen unter Bedingungen erreicht werden, die hämatopoetische Differenzierung induzieren. Unter diesen Bedingungen wird hemogenic Endothelzellen und HSPC zeigen hämatopoetische Differenzierung multi-lineage, wodurch das Auftreten von Kolonien enthaltenden erythroid Vorläufern (BFU-E), Granulozyten und Makrophagen-Vorläufern (CFU-GM) und Granulozyten, Erythrozyten, Makrophagen, Megakaryozyten-Vorläufer Kolonien (CFU-GEMM).
Es bleiben viele offene Fragen auf dem Gebiet der hematovascular Entwicklung – ein Feld, das aufgrund der technischen Schwierigkeiten noch in den Anfängen ist inhärent Studium vorübergehend und kleinen Zellpopulationen, die nur während bestimmter Entwicklungs Fenster entstehen. Die Techniken, die oben skizzierten verbessern viele dieser Schwierigkeiten, indem sie für die Isolierung von sogar einzelne Zellen aus der hemogenic Endothelzellen und HSPC Populationen in embryonalen Geweben bei kritischen Entwicklungszeitpunkten Reagenzien und Geräte verwenden, die in den meisten Labors der Regel zur Verfügung stehen. Unser Protokoll ermöglicht auch die parallele Isolierung von nicht-hemogenic endothelialen Zellfraktionen aus der YS und AGM, die für unabhängige Analysen verwendet werden kann oder als Kontrollen für die hemogenic endothelialen Zellfraktion in nachfolgenden Analysen.
Ein wichtiger Punkt in der Isolierung der hemogenic Endothelzellen dieses mehrfarbige FACS-basierte Methode ist geeignet spektralen compensation und genaue Zeichnung von einfarbige Tore. Als solches ist es dringend empfohlen, dass ungefärbte und einfarbige Kontrollen in allen Versuchsreihen aufgenommen werden, und dass sie – zusammen mit Proben mit Isotyp-Kontroll-Antikörper behandelt – verwendet werden, um zunächst geeignete spektrale Kompensation und Zeichnung von Toren etablieren. Jedoch unspezifische Anfärbung ist dieses Protokoll minimal, so ungefärbten und einfarbige Kontrollen für die Routineprüfung von Gattern ausreichend sind einmal FACS Sorter Einstellungen optimiert wurden.
Ungenau gezogen SP Tore sind ein besonderes Anliegen, mit dem Ansatz, die in diesem Bericht beschrieben. Frühere Studien haben gezeigt , dass die multipotenten Stammzellen Vorzugs Efflux von Hoechst zeigen rot 17, die physiologische Grundlage für ihr Aussehen in der SP durch FACS bilden. Wir haben gezeigt, dass hemogenic Endothelzellen und HSPC werden in ähnlicher Weise innerhalb der SP Zellfraktion 5,11 gefunden. Medikamente wie der Calciumkanal inInhibitor Verapamil blockiert dieses Hoechst Farbstoff Ausströmen Verhalten in SP-Zellen über Blockierung einer Vielzahl von Widerstands Transporter multidrug Trans. In hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen, in diesem Fall in erster Linie über den ABCG2 / BCRP1 transporter 24. Verapamil induziert typischerweise> 50% Blockierung der SP, aber der Gesamtgrad der Hoechst Efflux und seine anschließende Blockierung durch Verapamil gesehen wurde von Entwicklungszeitpunkt beeinflußt zu werden gezeigt, vermutlich aufgrund sich ändernder Expression mehrerer mehrfach arzneimittelresistenten transporter Typen mit Differential Hoechst Effluxleistung und Empfindlichkeit gegenüber Verapamil 5. Somit ist es dringend empfohlen, Verapamil behandelten Hoechst gebeiztes Negativkontrolle standardmässig enthalten sein richtige SP Gating zu gewährleisten: Wenn ein SP-Gatter richtig gezogen wird, sollte eine bemerkenswerte Reduktion in der Anzahl der SP-Zellen in Proben mit Hoechst gefärbt detektiert werden in das Vorhandensein von Verapamil.
Wir haben zuvor gezeigt, die sortiertSP – Zellen aus den E9.5 murine Dottersack haben eine ~ 80-90 – fach größere Fähigkeit HSPC in Methylcellulose-basierte hämatopoetischen Kultur , wenn auf eine abgestimmte Anzahl von E9.5 unfraktioniertem, nicht Hoechst gefärbt ganze YS Gewebezellen 5 im Vergleich zu erzeugen. Weitere Charakterisierung der SP hat, dass in dem murine Dottersack während der frühen hämatopoetischen und Gefäßentwicklung bei E8.0 gezeigt, gibt es merkliche Expression von VE-Cadherin und Flk-1, jedoch geringe Expression des Stiels (c-Kit) und hämatopoetischen Marker (CD45). Somit wird bei diesem Entwicklungs Zeitpunkt, Ur (non-hemogenic) EG, definiert als Flk-1 + / CD31 + / CD45- nicht SP-Zellen vorherrschen. Dieser Expressionsprofil verschiebt als endothelialen Marker – Expression abnimmt und CD45 und c-Kit – Expression erhöht, gleichzeitig mit einer zunehmenden Fähigkeit HSPC in vitro zwischen E9.5 und E11.5 5 zu erzeugen. Dies legt nahe, hämatopoetische Aktivität von YS Gewebe innerhalb des SP enthalten ist, immer am deutlichsten zwischen E9.5 und E11.5 und occurring durch einen zeitlich abgestimmten Verlust der endothelialen Eigenschaften und allmählichen Erwerb von hämatopoetischen Kapazität. Als solche Expression der multidrug resistance – Transporter, der zu dem SP – Phänotyp verleihen sind eine wichtige phänotypische Marker hemogenic Endothel 5; in der Tat, zeigen nicht-SP – Zellen von der Hauptversammlung nicht Blut bildende Potential 12. Somit erfolgreiche Isolierung des SP über Hoechst-Färbung sowohl in der YS und AGM wird sichergestellt, dass Zellen aus der hämatopoetischen Stammzellabteil eines bestimmten Gewebes geordnet werden, und die anschließende Antikörperfärbung von Zellen innerhalb dieser Fraktion Unterscheidung des hemogenic ermöglichen (Flk -1 + / c-Kit + / CD45-) im Vergleich zu HSPC (Flk1- / c-kit + / CD45 +) Populationen 5,11,12. Weiterhin wurde festgestellt worden , dass die zuvor CD41 + Zellen innerhalb der SP des Dottersackes und AGM Geweben der Bildung multi lineage Kolonie in der Lage sind , auf Basis Methylcellulose Kultur 11,12. Wir definieren hemogenic Endothelzellen als Flk1 + c-Kit + CD45- SP Zelles von CD45 als Designated Marker hämatopoetischer Abstammung mit eher als CD41 angesichts unserer dass die Expression von Flk1 und CD45 zu finden , ist praktisch gegenseitig ausschließende 5,11. Dies ermöglicht eine reine Isolierung von Zellen innerhalb der SP, die sowohl Endothel haben (Flk-1) und Stamm Merkmale (c-Kit), die für Endothelzellen zu hämatopoetischen Übergang aber, die noch nicht diese Veränderung erfahren, wie durch das Fehlen von CD45 in diesen bestimmt Zellen. Es wäre nützlich, Unter Fraktionierung der HSPC Bevölkerung zu berücksichtigen, definiert als Flk-1- / c-Kit + / CD45 + / SP-Zellen, in CSF1R + (Gewebe-Makrophagen) und Csf1r- (HSC) Fraktion wie kürzlich von Gomez und Kollegen berichteten 25, da dieser eine höhere Auflösung des wahren HSPC gegenüber Gewebe – Makrophagen – Vorläuferpopulationen bereitstellen würde, aber dies sollte nicht die Integrität der hemogenic endothelialen Zellfraktion beeinflussen deren Isolierung wir seit CSF1R umrissen ist eine Markierung der Makrophagen – Vorläufern 26.
Hemogenic Endothelzellen sind eine seltene Subpopulation sowohl YS und AGM (bestehend aus 1-3% der Endothelzellen) und daher eine große Herausforderung in ihrer Studie nicht ausreichend Zellausbeute für nachfolgende Anwendungen. Dieses Protokoll führt in der Regel 70-80% der Zellen durch die Zeit des Sortierens tragfähige verbleibenden und einem typischen hemogenic Endothelzelle Art, die aus gepoolten Geweben aus verschiedenen Embryonen erhalten werden, können nur einige hundert Zellen selbst unter optimalen Bedingungen, mit nur 10-20% Ausbeute von eingebetteten Zellen in Methyl produzierenden Kolonien abgerufen. Um sortierten Zellzahl zu maximieren, ist es dringend empfohlen, dass die Ermittler Schritte unternehmen, um Gewebe und die Lebensfähigkeit der Zellen bei jedem Schritt des Verfahrens zu gewährleisten: Gewebe sollte schnell seziert und gepoolt und Proben sollten, wann immer möglich auf Eis gehalten werden. Die Proben sollten frisch unmittelbar vor der FACS-Sortierung und sortiert in Sammelröhrchen mit einem hohen Serumgehalt oder direkt in Methyl Kultur hergestellt werden, wie beschrieben,d über. Wenn Lebensfähigkeit Probleme weiterhin bestehen, Sammelröhrchen auch sein kann mit Serum vorbeschichtet weiter sortierte das Überleben der Zelle zu verbessern. Wenn hemogenic endothelialen Zellausbeute gering bleibt, adulten Knochenmark oder im Handel erhältlichen fluorophorkonjugierten Kügelchen können für die spektrale Kompensation anstelle der embryonalen Gewebe stamm einzelne Farbe Kontrollen hierin beschriebenen verwendet werden. Wenn sortierten Zellen für die Kultur bestimmt sind, hemogenic Endothelzellen und HSPC sollten direkt in Gewebekulturvertiefungen sortiert werden. Wenn sortierten Zellen für DNA oder RNA-bezogenen Genexpressionsanalyse bestimmt sind, hemogenic und nicht-hemogenic Endothelzellen und HSPC können direkt in den Sammelröhrchen, die Probe Lysepuffer Verlust zu minimieren Zelle sortiert werden.
Die skizzierten Technik erlaubt erfolgreich (und simultan) Isolierung von hemogenic und nicht-hemogenic Endothelzellen sowie HSPC und reifen Blutzellfraktionen aus den gleichen embryonalen Geweben. Dieser Ansatz ermöglicht es weiteren Zapfeny der molekularen Grundlagen der kritischen Übergänge, die auftreten, wie Endothelzellen Blut erzeugen. Erkenntnisse aus diesen Entwicklungsstudien gewonnenen Erkenntnisse können dann die Erzeugung von menschlichen hemogenic Endothelzellen und HSPC Nachkommen von pluripotenten zur Optimierung verwendet werden und möglicherweise autologe Stammzellen für die Behandlung von vorherrschenden hämatopoetischen Erkrankungen.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester) | Sigma | D5942 | TOXIC irritant: Wear eye protection, mask, and gloves when handling. |
Absorbent bench underpad | Covidien | 7134 | |
#5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
8.5cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | TOXIC inhalant: Use in fume hood. |
100x Penicillin Streptomycin Glutamine (10,000u/mL Penicillin, 10,000mg/mL Streptomycin, 29.2mg/mL L-glutamine) | Invitrogen | 10378016 | |
Type II Collagenase | Worthington | LS004174 | |
Falcon 70uM nylon cell strainer | Corning | CLS431751 | |
Anti-Mouse CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | |
Anti-Mouse CD31 – PE | eBioscience | 12-0311-81 | |
Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 561259 | |
Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma | 14533 | TOXIC: irritant. Wear eye protection and gloves when handling. Prepare stock solution of 25mg/mL in distilled H2O, store aliquots at -20C until ready for use |
Verapamil Hydrochloride | Sigma | 1711202 | TOXIC: irritant. Wear eye protection, mask, and gloves when handling. Prepare stock solution of 5mM (100X) in 95% ethanol. Store at -20C until ready for use |
Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
MethoCult GF M3434 | Stem Cell Technologies | 3434 | Thaw and aliquot per manufacturer's instructions |
Modified Giemsa Stain | Sigma | GS500 | TOXIC: Contains Methanol – use in fume hood and wear gloves with handling. Dilute in distilled water to 0.02% solution. |
Cytospin Centrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
Clipped Funnel Starter Kit | Thermo Scientific | 3120110 | Includes cytofunnels, filter paper, cytoslides, and cytoclips for use with Cytospin centrifuge |
Anti-Mouse B-220 – FITC | BD Pharmingen | 553088 | |
Anti-Mouse Gr-1-FITC | eBioscience | 11-5931-85 | |
Anti-Mouse Ter-119-FITC | eBioscience | 11-5921-85 | |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 10437-077 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (4.5g/L) | Life Technologies | 11965-092 | |
Hank's Buffered Salt Solution | Life Technologies | 14175-095 | |
Fibronectin-coated 24-well tissue culture plate | EMD Millipore | PIFB24P05 | |
IgG2A-PE | BD Pharmingen | 553930 | |
IgG2B-FITC | BD Pharmingen | 556923 |