الميوسين الاغاروز جل الكهربائي: ويسترن التنشيف للبروتينات سكرية عالية الوزن الجزيئي

Abstract

Mucins، البروتينات بشكل كبير الغليكوزيلاتي بطانة الأسطح المخاطية، وقد تطورت باعتبارها عنصرا أساسيا للدفاع الفطرية عن طريق حماية البشرة ضد مسببات الأمراض الغازية. الدور الرئيسي لهذه الجزيئات هو تسهيل محاصرة الجسيمات والتخليص مع تعزيز تزييت من الغشاء المخاطي. خلال تخليق البروتين، mucins الخضوع الشديد O-بالغليكوزيل وmultimerization، مما يزيد بشكل كبير من كتلة وحجم هذه الجزيئات. هذه التعديلات بعد متعدية بالغة الأهمية بالنسبة لخصائص اللزجة من المخاط. ونتيجة لطبيعة الكيمياء الحيوية والبيولوجية الفيزيائية المعقدة لهذه الجزيئات، والعمل مع mucins يوفر العديد من التحديات التي لا يمكن التغلب عليها عن طريق أساليب تحليل البروتين التقليدية. على سبيل المثال، من ارتفاع الوزن الجزيئي يمنع الهجرة الكهربي عن طريق المواد الهلامية بولي أكريلاميد العادية وطبيعتها لزجة تسبب التصاق لأنابيب التجريبية. ومع ذلك، والتحقيق في دور mucins في الصحة(على سبيل المثال، الحفاظ على سلامة الغشاء المخاطي) ومرض (على سبيل المثال، hyperconcentration، mucostasis، السرطان) ويجري التحقيق اكتسبت في الآونة الأخيرة اهتماما وmucins كهدف علاجي. فهم أفضل للإنتاج ووظيفة الجزيئات الميوسين قد يؤدي إلى نهج الأدوية الجديدة، على سبيل المثال، مثبطات الميوسين إيماس الحبيبية و / أو وكلاء حال للبلغم. لذلك، بروتوكولات متسقة وموثوق بها للتحقيق في علم الأحياء الميوسين حاسمة للتقدم العلمي. هنا، نحن تصف الأساليب التقليدية لفصل الجزيئات الميوسين قبل الكهربائي باستخدام هلام الاغاروز، ونقل البروتين إلى غشاء النيتروسليلوز، وكشف عن إشارة مع الأجسام المضادة الميوسين محدد وكذلك الأشعة تحت الحمراء القارئ هلام الفلورسنت. هذه التقنيات قابلة للتطبيق على نطاق واسع لتحديد الميوسين الكميات، multimerization ولاختبار آثار المركبات الدوائية على mucins.

Introduction

ويتم إنتاج Mucins عادة الأسطح المخاطية التي تبطن التجاويف يتعرض للبيئة الخارجية (على سبيل المثال، الجهاز التنفسي، الجهاز الهضمي، ومساحات الإنجابية، سطح العين)، وكذلك الأعضاء الداخلية (على سبيل المثال، البنكرياس والمرارة والغدد الثديية). وجود هذه البروتينات السكرية يحافظ على ترطيب سطح ويشكل حاجز مادي ضد مسببات الأمراض. على الرغم من أن إنتاج الميوسين ضروري لالمخاطية الصحية، الميوسين hyperconcentration و / أو خصائص مخاط الشاذة يمكن أن يؤدي إلى انسداد القناة والاستعمار الجرثومي والتهاب مزمن، والذي يمكن أن يسبب تلف الأنسجة لا رجعة فيه. ويلاحظ وجود سلسلة مشابهة من الأحداث في العديد من الأمراض، على سبيل المثال.، والتليف الكيسي ^1، التهاب الأذن الوسطى المزمن ² وإصابة عنقي مهبلي ^3. وبالتالي، فمن المهم أن نفهم دور mucins في الصحة والمرض ووضع بروتوكولات روتينية لتحديد البروتين.

ان يذهب في موعد، وقد تم تحديد 19 mucins الجينات وترميز لسلاسل ببتيد كبيرة تتراوح ما بين 1200 (على سبيل المثال، MUC1) إلى 22000 (على سبيل المثال، MUC16) الأحماض الأمينية. ويمكن تقسيم الأسرة الجينات الميوسين إلى نوعين: وmucins غشاء المرتبطة، والمشاركة في الخلايا مما يشير الى سطح التدريع، وmucins تشكيل هلام، المسؤولة عن الخصائص اللزجة من المواد الهلامية المخاط. mucins غشاء المرتبطة هي في معظمها أحادى ونعلق على سطوح الخلايا عبر النطاق الذي يمتد الغشاء مسعور. في المقابل، mucins تشكيل هلام تمتلك العديد من عامل فون ويلبراند (VWF) تشبه والسيستين الغنية المجالات التي لا غنى عنها لتشكيل شبكات البوليمرية ديناميكية. وتعلق glycans كبيرة لسيرين والمخلفات ثريونين توزع في جميع أنحاء apomucin. ويمكن لهذه يغوساكاريدس كثيفة المرتبطة يا تساهم بما يصل إلى 80٪ من الوزن الجزيئي ^(4). داخل وبين الجزيئية السندات ثاني كبريتيد ربط أحادية الميوسين ضمان سلامة الشبكه هلام الميوسينك. ونتيجة لبالغليكوزيل الثقيلة وmultimerization، mucins هي من بين أكبر الجزيئات في عالم الحيوان ولا يمكن تحليلها من قبل الكهربائي للهلام قياسي باستخدام هلام SDS-PAGE بولي أكريلاميد التقليدية وسلالم البروتين القياسية. هذه الأساليب حل / البروتينات منفصلة مع الأوزان الجزيئية أقل من 250 كيلو دالتون في حين أحادية الميوسين يمكن أن تصل إلى 2 نجمة داود الحمراء في حالة MUC16. ومع ذلك، وارتفاع الوزن الجزيئي بروتين سلالم يمكن استخدامها لدراسة أحادية الميوسين صغيرة (أي، MUC1).

مجموعة متنوعة من التقنيات يمكن تطبيقها على دراسة الميوسين الحجم والتشكل والتفاعل. تقليديا، يتم إنجاز توصيف البيوكيميائية mucins من الميوسين العزلة عبر الإيزوبيكنيكي الطرد المركزي الكثافة التدرج في المخزن تغيير طبيعة، تليها اللوني الحجم الإقصاء ومناعي (على سبيل المثال، فتحة النشاف) ^5. ديناميكية و / أو متعددة زاوية تشتت الضوء توفير معلومات عن حالة بلازميدة قليلة القسيمات العينات الميوسين غنية <سوب> 1. وبالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام الطرد المركزي النطاقي المعدل جانب مناعي ونقل المجهر الإلكتروني عادة لتحديد التشكل لجزيئات mucins ^6. يستخدم قياس الطيف الكتلي أيضا لتحديد mucins، كشف انشقاق بروتين وتحليل قليل السكاريد ^1،7،8 التكوين. هذه التقنيات مكلفة ومستهلكة للوقت وغالبا ما تتطلب كميات كبيرة و / أو تركيزات عالية من العينة. منهجية وصفت هنا، أي، الميوسين الفاصل الكهربائي، غير قابلة للتكرار، منخفضة التكلفة، ويمكن استخدامها في دراسات الإنتاجية العالية لتوفير النسبية الكميات الميوسين والتحقيق التجمع البوليمر. ومع ذلك، هذا الاختبار يتطلب عالية تقارب وعالية الدقة-الميوسين الأجسام المضادة التي قد لا تكون متاحة للmucins نادرة (على سبيل المثال، MUC19) أو أنواع معينة (على سبيل المثال، خنزير، النمس).

النشاف الغربي الاغاروز مناسبة لحل مجموعة واسعة من عينات الميوسين غني مع concentraستعقد بدءا من 50 ميكروغرام / مل (على سبيل المثال، يغسل الخلية) إلى 5 ملغ / مل (على سبيل المثال، البلغم). وقدم هذا الاختبار في 1990s، وأجري إلا في عدد قليل من المختبرات المتخصصة ^9،10. في البداية، وقد ساعدت هذه التقنية تحديد جزء من السكان أحادية الميوسين في إفرازات الجهاز التنفسي الإنسان ^11،12 وأكدت عملية oligomerization في الخلايا الكأسية، والذي يتألف من تشكيل ديمر في الشبكة الإندوبلازمية تليها multimerization ديمر في جهاز جولجي ^13. وفي الآونة الأخيرة، وتوليد الأجسام المضادة ضد mucins الفئران تسهيل دراسات على نماذج حيوانية صغيرة (على سبيل المثال، الميوسين ناقصة، نماذج الماوس βENaC، OVA تحدى) وفتح مجال جديد للبحث عن الدراسات قبل السريرية مركبات اختبار الدوائية تهدف إلى إزالة المخاط من الرئتين ^14-17. ونتيجة لاهتمام متزايد في الميوسين البيولوجيا وتوليد رواية، والأجسام المضادة الميوسين أكثر تحديدا، وصفنا hereiن منهجية لفصل mucins بواسطة الكهربائي للهلام الاغاروز، ونقل فراغ لالنيتروسليلوز وهما لونا كشف الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء.

Protocol

1. إعداد المخازن لالميوسين جل الغربية التنشيف

1. إعداد 1 لتر من 50X تاي عازلة (تريس، خلات-EDTA).
   1. في 700 مل من الماء المقطر (DH ₂ O) إضافة 242 غرام من قاعدة تريس (0.4 م)، 57.1 غرام من حامض الخليك الجليدي (وزن السائل) (0.2 م) و14.61 غرام من ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) (50 ملم).
   2. ضبط درجة الحموضة إلى 8.0 وجعل حجم ما يصل الى 1 لتر مع DH ₂ O.
2. إعداد 10 مل من 10X العازلة تحميل.
   1. إعداد 5 مل من العازلة 1X تاي. للقيام بذلك، قم بإضافة 5 مل من الجلسرين (50٪)، و 25 ملغ من اللون الأزرق برموفينول (0.25٪)، و 100 ملغ من كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) (1٪).
3. إعداد 2 لتر من العازلة 20x والصوديوم المالحة سترات (SSC).
   1. في 1.5 لتر من O ₂ درهم، إضافة 350.6 غرام من كلوريد الصوديوم (3 م) و176.4 غرام من سترات الصوديوم (نا ₃ C ₆ H ₅ O ₇₎ (0.3 م). ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 وجعل وحدة التخزين إلى 2 ليتر مع DH ₂ O.
4. إعداد 1 لتر من العازلة 1X تاي 0.1٪ SDS.
   1. إضافة 20 مل من 50X تاي إلى 980 مل من درهم ₂ O. إضافة 1 غرام من SDS لجعل 0.1٪ SDS-تاي حل.

2. تاي-SDS إعداد جل الاغاروز

1. (. أي 150 مل) صب كمية كافية من 1X تاي 0.1٪ عازلة SDS في دورق مخروطي ميكرووافابل لجعل 5-7 هلام مم. إضافة 0.8٪ (1.2 غرام) مسحوق الاغاروز.
2. قارورة الميكروويف في 30 ثانية فترات متقطعة مع دوامات حتى الاغاروز يذوب تماما (عادة 1-3 دقائق). استخدام منصات يد الساخنة خلال هذه العملية. كن حذرا من الغليان البركانية في حين يحوم.
3. يسمح الحل الاغاروز ليبرد ل5-10 دقيقة. ملاحظة: الحل الاغاروز جاهزة للسكب عند أسفل القارورة يمكن أن يترك على راحة لمدة 5 ثوان.
4. تحضير صينية الصب الكهربائي (10 × 15 سم) عن طريق ختم حواف مع الشريط ووضع جيد تمشيط في الموقف.
5. صب الحل الاغاروز ببطء في تيانه صب علبة لتجنب تشكيل فقاعات. إزالة الفقاعات باستخدام طرف ماصة. انتظر هلام لتبرد وترسيخ تماما. مرة واحدة عزز، إزالة المشط ببطء لتجنب انهيار الآبار عن طريق الشفط وإزالة الشريط من حواف الدرج.
6. وضع الجل الاغاروز في مربع هلام وملء وحدة الكهربائي مع٪ عازلة 1X 0.1 تاي SDS حتى يتم تغطية جل تماما.

3. تحميل عينة والكهربائي الفصل

ملاحظة: في المختبر لدينا، ونحن عادة استخدام عينات من كل من الفأر والإنسان، بما في ذلك السائل قصبي سنخي غسيل (BALF، وكلاهما الأنواع)، الغسيل خلية من الخلايا البشرية القصبية الظهارية (HBE)، واللعاب والبلغم العينات البشرية. عينات يمكن التشويه والتحريف في 6 M اليوريا على جمع أو تخزينها لفترات قصيرة من الزمن (6 ساعات) وذلك بإضافة بروتين كوكتيل المانع.

1. إعداد نماذج للتحميل من خلال إضافة 10٪ من صبغ تحميل على كل عينة (أي 30 ميكرولتر من العينة و3ميكرولتر من صبغ). التجانس عينات من قبل pipetting صعودا وهبوطا. تدور لفترة وجيزة أسفل الأنابيب عند 5000 دورة في الدقيقة لجمع قطرات.
2. تحميل بعناية حجم مساو من عينات في الآبار.
   1. نصائح ما قبل الرطب و / أو استخدام ماصات الإزاحة الموجبة لتسهيل تحميل عينات لزجة جدا. ببطء نضح 80-90٪ من محلول العينة صبغ (أي 27 - 30 ميكرولتر) لتجنب الفقاعات pipetting ل.
   2. تحميل ببطء في الجزء السفلي من الآبار والانتقال تدريجيا إلى طرف الماصة التصاعدي. للعينات التي لا تزال تعلق على طرف ماصة، الاستغناء في زاوية 45 درجة واستطال مباشرة فوق البئر أو بلطف استخدام الجانب من البئر لكسر مخاط لزج. لا تفرط في الآبار.
3. قم بتوصيل أقطاب كهربائية من مربع هلام لمولد الطاقة الكهربائي. ضمان توصيل الأقطاب الكهربائية بشكل صحيح (أي والرصاص الأحمر توصيله إلى الناتج الإيجابي للمولد) للسماح سلبا اتهم mucins لتشغيل نحو إيجابي القطب.
4. تشغيل هلام في 80 فولت لمدة 90 دقيقة لجل مشط واحد، أو 60-75 دقيقة لجل مشط مزدوج لمنع التداخل بين صفين.
5. تحويل مولد OFF السلطة وقطع الأقطاب من مصدر الطاقة.
6. إزالة بعناية الجل من مربع هلام مع يد واحدة على كل جانب من جانبي الدرج الصب لضمان يبقى جل في المكان.

4. تقليل الاغاروز جل لكفاءة نقل الميوسين

1. وضع بعناية شقة هلام في وعاء زجاجي. شطف الجل مع DH ₂ O لإزالة آثار عازلة تاي-SDS.
2. إعداد 1 لتر من العازلة 4X SSC بإضافة 200 مل من 20x وSSC إلى 800 مل من درهم ₂ O. جعل 200 مل من 10 ملي dithiothreitol (DTT) 4X SSC الحل بإضافة 309 ملغ من DTT جديدة في 200 مل من العازلة 4X SSC.
3. نقع هلام مع العازلة DTT-4X SSC والغطاء. صخرة بلطف لمدة 20 دقيقة (10 التناوب في الدقيقة الواحدة). شطف هلام مع العازلة 4X SSC DTT خالية.

"> 5. فراغ الجمعية النشافة ونقل العينة إلى النيتروسليلوز غشاء

1. إعداد فراغ نشافة للنقل.
   1. قطع بعناية غشاء النيتروسليلوز في أبعاد أوسع قليلا من الجل (أي 10 × 15 سم).
   2. حصيرة مسامية الرطب مع DH ₂ O ووضعه على نحو سلس جنبا حتى في ورق نشاف.
   3. الرطب النيتروسليلوز غشاء العازلة مع SSC 4X DTT خالية ووضعه في وسط حصيرة التي يسهل اختراقها.
   4. تغطية حصيرة التي يسهل اختراقها مع طوقا المطاط، وترك افتتاح طوقا الانحياز على وجه التحديد مع غشاء النيتروسليلوز. إذا حصيرة مسامية لا تزال واضحة، وضبط بعناية الغشاء لضمان تزال توجد فجوة بين طوقا والغشاء.
2. وضع بعناية agarose هلام على رأس الغشاء. ضمان أشكال هلام يتم وضع ختم ضيق مع طوقا والآبار من هلام على الغشاء لنقل.
   1. تجنب تشكيل فقاعات بين الغشاء وهلام. للحد منتشكيل فقاعات، بخ بضع قطرات من 4X SSC العازلة على الغشاء، وحرك جل من أعلى إلى أسفل لطرد أي فقاعات تشكيلها. تجنب تحريك الجل على الغشاء كما ستبدأ البروتينات إلى وصمة عار على الفور.
3. تغطية بعناية هلام مع العازلة 4X SSC.
4. بدء نقل الميوسين عن طريق الشفط.
   1. تحويل نشافة فراغ على والضغط وضعت في 40 - 50 ميللي بار. إضافة بضع قطرات من العازلة 4X SSC على هلام كل 5-10 دقيقة لمنع جل من الجفاف. نقل تشغيل لمدة 90 دقيقة. اختياري: عند الانتهاء، بمناسبة الآبار مع قلم رصاص للتوجيه.
5. التخلص من هلام واسترجاع غشاء النيتروسليلوز باستخدام الملقط البلاستيك على حافة الغشاء.

6. حجب غشاء وكشف

1. شطف الغشاء فورا مع المياه المالحة الفوسفات-1X (PBS). لا تدع غشاء تجف.
2. تزج الغشاء في 50 مل من 3٪ الحليب PBS عازلة تمنع ومكان على ريال عمانيCKER في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. بعد الحضانة، وتجاهل المخزن المؤقت الحجب.
3. تزج الغشاء في 1٪ الحليب PBS حل الأجسام المضادة الأولية. احتضان الغشاء في حل الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها على الكرسي الهزاز في 4 درجات مئوية. بعد الحضانة، وتجاهل حل الأجسام المضادة الأولية. تمييع الأجسام المضادة الأولية لنسبة 1: 2000 من حل الأجسام المضادة لعرقلة العازلة. ملاحظة: للحصول على عينات القادمين من الفئران، ونحن نستخدم UNC 222 أرنب مكافحة Muc5b والماعز البروتين مكافحة الفلوري الأخضر (GFP). للعينات التي تنشأ من البشر، ونحن نستخدم مكافحة MUC5B و45M1 مكافحة MUC5AC الأجسام المضادة الأولية H300.
4. غسل غشاء 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة على الكرسي الهزاز.
5. تزج الغشاء في 1٪ الحليب PBS حل الضد الثانوية. تمييع الأجسام المضادة الثانوية إلى نسبة 1: 7500 من حل الأجسام المضادة لعرقلة العازلة ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الكرسي الهزاز (على سبيل المثال، 700 المضادة للأرنب و 680 المضادة للماعز). يحفظ بعيدا عن الضوء التي يحتضنها في التعاون غير شفافةNTAINER. تجاهل الحل الضد الثانوية بعد 1 ساعة.
6. غسل غشاء 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. شطف الغشاء مع DH ₂ O لإزالة الملح.
7. قراءة غشاء على نظام مضان الأشعة تحت الحمراء وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

Representative Results

وتبين لنا نتائج ممثل من الميوسين التعبير التالي الكهربائي للهلام الاغاروز في BALF من رئات الفئران (الشكل 1). في هذا المثال، استخدمنا هلام الاغاروز لإظهار upregulation من الميوسين إنتاج التالية IL-13 معاملة نموذج الفأر TG-Muc5ac. وتبين لطخة غربية تمثيل مرئي من الميوسين التعبير، والتي يمكن استخدامها لتحليل كمي متعدد القسيمات أو الفرقة مونومر شدة إشارة (الشكل 2). ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لإظهار تعبير عن mucins في الظهارية الشعب الهوائية (HBE) غسل الخلايا البشرية وعينات البلغم الإنسان. وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم لإظهار الحد من mucins بعد العلاج مع الحد من وكلاء. وتبين لنا نتائج ممثل من غسل HBE تعامل مع زيادة تركيزات DTT (الشكل 3). نحن كميا فقدان كثافة إشارة متعدد القسيمات بعد تقليل الميوسين مع العلاج مع سن الحد الإقليم الشمالي (الشكل 4).

الشكل 1. Upregulation من الميوسين الإنتاج بعد IL-13 معاملة من TG-Muc5ac / البروتين الفلوري الأخضر (GFP) نموذج الفأر وتغرس الفئران overexpressing Muc5ac الموسومة ب GFP مع برنامج تلفزيوني. (-) أو IL-13 (+) للحث على الكأس حؤول الخلايا وإنتاج الميوسين الزيادة في الرئتين (ن = 3 لكل مجموعة). تم حصادها BALF وفصلها عن طريق الميوسين الغرب النشاف الاغاروز. تم بحثها الغشاء مع الأرنب بولكلونل مكافحة Muc5b (الأحمر) وبولكلونل الماعز المضادة للGFP (الخضراء). نظام الأشعة تحت الحمراء يمكن أن تستخدم لإظهار النتائج على النحو تراكب أو قناة واحدة مع وجود خيار لتغيير الصور إلى الأبيض والأسود. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

her.within الصفحات = "1">
الشكل 2.. وتم قياس التحليل الكمي من الميوسين الاغاروز جل عرض Upregulation من الميوسين إفراز في الفئران التي عولجت-13-IL Muc5b إشارة كثافة لكل حارة من هلام الميوسين هو مبين في الشكل 1. وتشير النتائج إلى أن الميوسين إفراز تم زيادة 5.1 أضعاف خلال الفئران التي عولجت في برنامج تلفزيوني في الحيوانات المعالجة IL-13 (ن = 3، ص <0.005). البيانات كما هو موضح يعني ± SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وعولج الشكل 3. الحد من MUC5AC وMUC5B Mucins في يغسل HBE المعالجة مع يغسل DTT. HBE مع 0، 0.005، 0.01، 0.05، 0.1، 0.5، 1، 5، 10، 50 و 100 ملي DTT عند 37 درجة مئوية لمدة 30 مينوتوفاق. تم بحثها الغشاء مع بولكلونل الأرنب مكافحة MUC5B (الأخضر) وبولكلونل الماوس مكافحة MUC5AC (الحمراء). اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4. تم قياس التحليل الكمي من الميوسين الاغاروز جل عرض اختفاء فرقة Multimeric في يغسل HBE المعالجة مع التلفزيون الرقمي الأرضي. MUC5AC وMUC5B كثافة إشارة عن كل حارة من هلام الميوسين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

بروتوكول الميوسين النشاف الغربي هو موضح في هذا الفيديو يجمع بين التقنيات التقليدية المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية لفصل ونقل الجزيئات الكبيرة، مثل الحمض النووي، مع التقنيات العادية للكشف عن البروتين، أي، immunoblotting. ويمكن تطبيق نفس التقنية لدراسة بيولوجيا الجليكوسامينوجليكان المعقدة، مثل انهيار عالية الوزن الجزيئي حمض الهيالورونيك ^18. على الرغم من أن هذه التقنية يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من فحوصات، يعتمد نجاح الغرب النشاف الاغاروز على عدد وافر من الخطوات التي تتطلب إجراءات دقيقة وتعتمد على الوقت. من أجل تحقيق أقصى قدر من النجاح، ينبغي إعادة النظر في بعض الخطوات الحاسمة.

إعداد العينات وهلام تحميل خطوات حاسمة لنتائج دقيقة. عينات الميوسين الغنية، أي، sputa، هي، بطبيعتها، ملتصقة إلى أنابيب التجريبي، أي، نصائح الماصة، أنابيب الطرد المركزي، والمرشحات. استخدام pipets الإزاحة الإيجابية وقبليمكن -wetting نصائح الماصة تسهيل تحميل المواد اللزجة في الآبار. تتطلب هذه العينات اهتماما خاصا نظرا لالطفو المتزايد والحساسية من هذه المواد. عينات المركزة (فوق 5 ملغ / مل) ستنقل بشكل سيئ من خلال حجم المسام من هلام الاغاروز 0.8٪ و قد يتطلب مزيدا من التخفيف و / أو تمسخ في ما يصل إلى 6 M اليوريا. ومع ذلك، تجنب تشغيل عينات التشويه والتحريف في guanidinium كلوريد (GuHCl) كما guanidinium سوف يعجل مع SDS. وبالتالي، والعينات المخزنة في GuHCl تتطلب خطوة غسيل إضافية. لدراسات الحالة غير البوليمرية، وتخفيض جزئي (0.5 ملي DTT لمدة 5 دقائق) تحسن كثيرا من الهجرة من عينات المركزة (انظر الشكل 3).

نقل البروتين إلى غشاء النيتروسليلوز هو خطوة رئيسية لهذا البروتوكول، وإذا لم تنفذ بدقة، يمكن أن يؤدي إلى الغشاء الملون، وإشارة ضعيفة والنتائج الكمية كاذبة. الأغشية النيتروسليلوز هي حساسة وتلوث بسهولة ووينبغي دائما أن التعامل مع قفازات والحرص على تفادي غير محددة ملزمة والضرر. وضع الجل على الغشاء يتطلب محاذاة دقيقة لتوليد ختم مشددة ومنع تسرب عازلة نقل، التي من شأنها أن تؤدي إلى البقع وتقليل كفاءة النقل. سوف تكون فقاعات بين جل وغشاء منع نقل البروتين وينبغي تجنب بعناية.

يعتمد مناعي الأمثل على ارتفاع تقارب، الأجسام المضادة عالية التحديد ضد العمود الفقري البروتين من الميوسين الهدف. في الآونة الأخيرة، والتكنولوجيات استراتيجية التحصين رواية، تصميم مستضد والفرز العائد إلى زيادة نجاح مع توليد الأجسام المضادة الميوسين وفرت أدوات جديدة لدراسة البيولوجيا الميوسين. من أجل الكشف عن اثنين mucins مختلفة على لطخة واحدة، أي، MUC5AC وMUC5B، يجب ان تستمد اثنين من الأجسام المضادة الأولية من الأنواع المضيفة مختلفة، أي والأرانب والماعز. أيضا، تحتاج إلى الأجسام المضادة الثانوية ليكون المسمى مع fluorophore مختلفةالصورة ليتم الكشف في كل نانومتر قناة 700 nm- و 800.

النسبية وفرة الميوسين وحجم الميوسين يمكن quantitated مباشرة مع برامج التصوير. إشارة الفلورسنت يتناسب طرديا مع كمية الميوسين الهدف، مما يسمح الكمي لمجموعة واسعة من العينات، من أدنى (على سبيل المثال، يغسل الخلية) إلى الأعلى (على سبيل المثال، البلغم) الميوسين التركيز. ومع ذلك، تركيز الميوسين المطلق يتطلب تنقية معايير الميوسين الذي لا الموصوفة في هذا البروتوكول كما هو عملية طويلة وصعبة التي تم وصفها في عبد الله وآخرون. ^19. وبالإضافة إلى ذلك، يوفر الاغاروز الغرب النشاف إمكانية لإجراء فحوصات تحول الميوسين لدراسة عملية البلمرة أو التحلل. التنقل الكهربي من mucins يعتمد على دولتهم البوليمرية، أي، يتم تأخير الهجرة من البوليمرات كبيرة، ويمكن أن يكون كميا باستخدام برامج التصوير. على سبيل المثال، والحد من وكلاء وإحداث ش التنقلIFT للإشارة إلى أن يرتبط مع التغيرات في الخصائص الفيزيائية الحيوية من المخاط. هذا الفحص يمكن استخدامها لدراسة عملية multimerization الميوسين ¹³ ولكن أيضا لاختبار وكلاء الدوائية التي تهدف إلى التأثير على شبكة الميوسين ^11. وفي الختام، الميوسين النشاف الاغاروز الغربي إلى جانب وضع العلامات مضان تغيرت بشكل كبير نهجنا لدراسة mucins من خلال إنتاج البيانات الكمية والنوعية العالية.

المشاكل المشتركة مع الاغاروز الميوسين الغرب النشاف يمكن أن يؤدي إلى النتائج التالية: انخفاض كثافة إشارة، خلفية عالية و / أو ظهور punctates على الغشاء. عدة استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها يمكن استخدامها لتحسين الصور هلام الميوسين. ويمكن زيادة كثافة إشارة عن طريق تحميل كميات أكبر عينة و / أو زيادة تركيزات الأجسام المضادة الأولية والثانوية. عادة، وارتفاع إشارة الخلفية تعزى إلى حجب و / أو غسل غير كاف، والتي يمكن حلها عن طريق أداء كتلة أطول/ غسل حضانات، فضلا عن استخدام الأمثل حجب المخازن المتوفرة تجاريا. ظهور punctates يمكن أن يكون نتيجة للحضانات غشاء بمد في درجة حرارة الغرفة، مما يسهل نمو البكتيريا. ويمكن أيضا أن يكون سبب Punctates عن تلف غشاء النيتروسليلوز من حل DTT تمرغ (الخطوة 4.1)، ويمكن تجنب ذلك بدهن الجل الاغاروز جيدا قبل نقل و / أو تقليل تركيز DTT إلى 5 ملم.

القيد الرئيسي من الاغاروز الميوسين النشاف الغربية هو عدم وجود سلم البروتين للبروتينات عالية الوزن الجزيئي والمعايير الميوسين، مما يعيق المطلق الكمي الميوسين. معظم النتائج المنشورة من المواد الهلامية الاغاروز الميوسين على دراسات مقارنة لحجم وتركيز. استبعاد حجم اللوني مع تشتت الضوء إلى جانب معامل الانكسار هو أسلوب آخر يستخدم لمعرفة ما الوزن الجزيئي الدقيق وتركيز الجزيئات. ومع ذلك، هذا الأسلوب هو مكلفالثانية يفتقر خصوصية لmucins، وبالتالي، الجزيئات الكبيرة التدابير الأخرى المدرجة في العينات، على سبيل المثال، الحمض النووي. وبالإضافة إلى ذلك، حجم الإقصاء اللوني غير قادر على التفريق بين أنواع الميوسين، أي، MUC5AC مقابل MUC5B، والتدابير ومتوسط ​​تركيز وحجم من خليط من mucins المدرجة في عينة معينة.

تقنيات أخرى يمكن استخدامها لدراسة mucins بما في ذلك الضوء حيوية ومتعددة زاوية نثر ^1، الإيزوبيكنيكي ومعدل منطقتين centrifugations ^6، المجهر الإلكتروني، قياس الطيف الكتلي ^1،7،8. ومع ذلك، مع لجنة التحقيق من وكلاء الدوائية رواية استهداف جزيئات الميوسين، لا بد من تطوير تقنيات مختبر موثوق بها لدراسة علم الأحياء الميوسين. الاغاروز الميوسين الغرب النشاف هي تقنية سهلة وغير مكلفة نسبيا والتي يمكن استخدامها للرد على أسئلة هامة بشأن العمليات الميوسين، أي، تغيير في الميوسين عبء وحجم ونسبة. وسيتم استخدام هذا الاختبارفي التطبيقات المستقبلية لاختبار نجاعة الأدوية وسمية لجزيئات جديدة تهدف إلى إزالة المخاط ملتصقة في في التجارب المختبرية والنماذج الحية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris Base	Sigma	T6060-1kg	1 kg
Glacial Acetic Acid	Sigma	ARK2183-1L	1 L
EDTA	Sigma	EDS-100g	100 g
Glycerol	Fisher	BP229-1	1 L
Bromophenol Blue	Sigma	114391-5g	5 g
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	Sigma	L6026-50g	50 g
20x SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer	Promega	V4261	1 L
NaCl	Fisher	S271-1	1 kg
Trisodium Citrate (Na3C6H5O7)	Sigma	W302600-1kg	1 kg
10 mM DTT (dithiothreitol)	Sigma	D0632	25 g
Milk Powder	Saco		Instant non-fat dry milk
Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Gibco lifetechnologies	14200-025	500 ml
Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples)	Rockland antibodies and assays	600-101-215	1 mg
UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples)	UNC
H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples)	Santa Cruz	sc-20119	200 μg
45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples)	Abcam	ab3649	100 μg
Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye	LI-COR Biosciences	926-32213	0.5 mg
Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye	LI-COR Biosciences	926-68022	0.5 mg
Electrophoresis Gel Box and Casting Tray	Owl Seperation Systems
Power Supply Box	Biorad	Model 200/20
Membrane Blotting Paper	Amersham	10600016
Whatman Paper and Nitrocellulose membrane	GE	10 439 196
Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230 v	Expotech USA	230600-2
Odyssey Infrared Fluorescence System	LI-COR Biosciences