Abstract
Mucine, die stark glykosylierte Proteine Schleimhautoberflächen auskleiden, sind als wichtiger Bestandteil der angeborenen Abwehr entwickelte sich durch das Epithel gegen eindringende Krankheitserreger zu schützen. Die Hauptrolle dieser Makromoleküle ist Einfangen der Teilchen und Abstand zu erleichtern, während die Schmierung der Schleimhaut zu fördern. Während der Proteinsynthese zu unterziehen Mucine intensive O-Glykosylierung und Multimerisierung, die dramatisch die Masse und Größe dieser Moleküle erhöhen. Diese post-translationalen Modifikationen sind entscheidend für die viskoelastischen Eigenschaften des Schleims. Als Folge der komplexen biochemischen und biophysikalischen Natur dieser Moleküle stellt die Arbeit mit Mucinen vielen Herausforderungen, die nicht durch herkömmliche Proteinanalyseverfahren überwunden werden können. Zum Beispiel ihre hohem Molekulargewicht verhindert elektrophoretische Wanderung durch regelmäßige Polyacrylamidgelen und ihre klebrigen Natur verursacht Adhäsion an Versuchsrohr. Doch die Untersuchung der Rolle von Mucinen in den Bereichen Gesundheit(Z. B. die Aufrechterhaltung der Schleimhaut Integrität) und Krankheiten (z. B. Hyperkonzentration, mucostasis, Krebs) hat vor kurzem gewonnen Interesse und Mucine werden als therapeutisches Ziel untersucht. Ein besseres Verständnis der Produktion und Funktion von Makromolekülen Mucin können neue pharmazeutische Ansätze, beispielsweise Inhibitoren der Muzin - Granulat Exozytose und / oder schleimlösende Mittel führen. Daher konsistente und zuverlässige Protokolle kritisch Mucin Biologie sind für wissenschaftlichen Fortschritt zu untersuchen. Hier beschreiben wir herkömmlichen Verfahren Mucin Makromolekülen durch Elektrophorese unter Verwendung eines Agarosegels getrennt, übertragen Protein in Nitrocellulosemembran und Erkennungssignal mit Mucin-spezifische Antikörper sowie Infrarot-Fluoreszenz Gel reader. Diese Techniken sind allgemein anwendbar Mucin Quantifizierung Multimerisierung zu bestimmen und die Wirkungen von pharmakologischen Verbindungen auf Mucinen zu testen.
Introduction
Mucine werden normalerweise durch Schleimhautoberflächen erzeugt , die Hohlräume freigelegt mit der äußeren Umgebung Leitung (z. B., Atmungs-, Verdauungs-, Fortpflanzungstrakt, Augenoberfläche) sowie der inneren Organe (zB Pankreas, Gallenblase, Brustdrüsen). Das Vorhandensein dieser Glykoproteine hält Oberflächenhydratation und bildet eine physikalische Barriere gegen Krankheitserreger. Obwohl Mucin Produktion ist wichtig, Gesundheit, Mucin Hyperkonzentration und / oder anomale Schleim Eigenschaften der Schleimhaut zu Obstruktion, bakterielle Besiedlung und chronische Entzündungen führen kann, die irreversible Gewebeschäden verursachen können. Eine ähnliche Kaskade von Ereignissen werden in mehreren Krankheiten beobachtet, z. B. zystische Fibrose 1, chronische Otitis media 2 und zervikovaginalen Infektion 3. Daher ist es wichtig, die Rolle von Mucinen in Gesundheit und Krankheit zu verstehen und Routineprotokollen zur Proteinidentifizierung zu etablieren.
Miteinander ausgehenHaben, 19 Mucine Gene für große Polypeptidketten kodieren identifiziert und von 1,200 bis hin (z. B. MUC1) bis 22.000 (zB MUC16) Aminosäuren. Die Mucin-Genfamilie kann in zwei Untertypen unterteilt werden: die Membran-assoziierten Mucine, beteiligt an Zellsignalisierung und Oberflächen Abschirmung und die gelbildenden Mucine, verantwortlich für die viskoelastischen Eigenschaften von Schleim Gelen. Membran-assoziierte Mucine sind meist monomeren und heften sich an den Zelloberflächen über eine hydrophobe Transmembrandomäne. Im Gegensatz dazu gelbildenden Mucine besitzen mehrere von-Willebrand-Faktor (vWF) -ähnliche und Cystein-reichen Domänen, die für die Bildung von dynamischen polymeren Netzwerke wesentlich sind. Große Glykane sind an Serin und Threonin-Resten im gesamten apomucin verteilt. Diese dichten O-verknüpften Oligosaccharide kann bis zu 80% des Molekulargewichts 4 beitragen. Intra- und intermolekulare Disulfidbrücken verbindet Mucin Monomere gewährleisten die Integrität des Mucin Gel network. Als Folge der schweren Glykosylierung und Multimerisierung sind Muzine zu den größten Moleküle in der Tierwelt und nicht durch Standard-Gelelektrophorese unter Verwendung herkömmlicher SDS-PAGE Polyacrylamid-Gel und Standard-Proteinleitern analysiert werden kann. Diese Methoden lösen / getrennten Proteine mit Molekulargewichten unter 250 kDa, während Mucin Monomere können bis zu 2 MDa im Fall von MUC16 erreichen. Jedoch können hochmolekulare Proteinleitern verwendet werden , um kleine Mucin Monomeren zu untersuchen (dh., MUC1).
Eine Vielzahl von Techniken kann Mucin Größe, Konformation und Interaktion zu untersuchen angewendet werden. Traditionell wird durch Mucin - Isolierung über isopycnic Dichtegradientenzentrifugation in denaturierenden Puffer, gefolgt von Größenausschlusschromatographie und Immunnachweis (z. B. Schlitz - Blotting) biochemische Charakterisierung von Mucinen erreicht 5. Dynamische und / oder Mehrwinkellichtstreuung Informationen über den oligomeren Zustand von Mucin-reichen Proben zur Verfügung stellen <sup> 1. Zusätzlich geschwindigkeits Zonenzentrifugation verbunden mit Immunnachweis und Transmissionselektronenmikroskopie werden üblicherweise die makromolekulare Konformation von Mucinen 6 zu bestimmen. Die Massenspektrometrie ist auch proteolytischen Spaltung und analysieren Oligosaccharid - Zusammensetzung 1,7,8 verwendet Muzine zu quantifizieren, zu erfassen. Solche Techniken sind teuer, zeitaufwendig und oft große Mengen erfordern und / oder hohe Konzentrationen der Probe. Die Methodik hier beschrieben, dh., Mucin - Trennung durch Elektrophorese, ist reproduzierbar, kostengünstig und können in Hochdurchsatz - Studien verwendet werden , um relative Mucin Quantifizierung bereitzustellen und Polymeranordnung untersuchen. Allerdings erfordert dieser Test mit hoher Affinität und hoher Spezifität Mucin - Antikörper , die nicht für seltene mucins verfügbar sein können (z. B. MUC19) oder bestimmte Arten (z. B. Schwein, Frettchen).
Agarose Western-Blot geeignet ist, eine Vielzahl von Mucin-reichen Proben mit Konzentrationen aufzulösengen im Bereich von 50 & mgr; g / ml (z. B. Zell Wäschen) bis 5 mg / ml (z. B. Sputum). Dieser Test wurde in den 1990er Jahren eingeführt und wurde nur in wenigen Speziallabors 9,10 durchgeführt. Zunächst half diese Technik Atemwegssekreten 11,12 Subpopulationen von Mucin Monomeren in menschlichen identifizieren und bestätigte das Oligomerisierungsverfahren in Becherzellen, die im endoplasmatischen Retikulum gefolgt von Dimer Multimerisierung im Golgi - Apparat 13 von Dimer - Bildung besteht. In jüngerer Zeit von der Erzeugung von polyklonalen Antikörpern gegen Mäuse mucins erleichtert Studien an kleinen Tiermodellen (z. B. Mucin - defizienten, βENaC, OVA-herausgefordert Mausmodelle) und eröffnet ein neues Forschungsgebiet für präklinische Studien Verbindungen Testen pharmakologische auf die Beseitigung von Schleim ausgerichtet die Lunge 14-17. Als Ergebnis eines zunehmenden Interesses in biology Mucin und die Erzeugung neuer, spezifischere Mucin-Antikörper beschreiben wir herein die Methodik zu trennen Mucine durch Agarose-Gelelektrophorese, Vakuum Transfer auf Nitrocellulose und Zweifarben-Infrarot-Fluoreszenzdetektion.
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Protocol
1. Bereiten Sie Puffer für Mucin Gel Western Blotting
- Bereiten Sie 1 Liter 50x TAE (Tris-Acetat-EDTA) Puffer.
- In 700 ml destilliertem Wasser (dH 2 O) in 242 g Tris - Base (0,4 M), 57,1 g Eisessig (wiegen Flüssigkeit) (0,2 M) und 14,61 g (EDTA) (50 mM).
- Der pH - Wert auf 8,0 und das Volumen machen bis zu 1 Liter mit dH 2 O.
- Herstellung von 10 ml der 10fach-Beladungspuffer.
- Bereiten Sie 5 ml 1x TAE-Puffer. Dazu werden 5 ml Glycerin (50%), 25 mg Bromphenolblau (0,25%) und 100 mg Natriumdodecylsulfat (SDS) (1%).
- Bereiten Sie 2 Liter 20x Natrium Kochsalzcitrat (SSC) Puffer.
- In 1,5 l dH 2 O, fügen 350,6 g NaCl (3 M) und 176,4 g Trinatriumcitrat (Na 3 C 6 H 5 O 7) (0,3 M). Der pH - Wert auf 7,0 und das Volumen auf 2 Liter mit dH 2 O bilden
- Bereiten Sie 1 Liter 1x TAE-0,1% SDS-Puffer.
- 20 ml 50x TAE bis 980 ml dH 2 O. 1 g SDS zu einer 0,1% igen SDS-TAE-Lösung zu machen.
2. TAE-SDS-Agarose-Gel Vorbereitung
- (. Dh 150 ml) Gießen ausreichendes Volumen 1x TAE-0,1% SDS - Puffer in einem microwavable Erlenmeyerkolben , um eine 5-7 mm dicke Gel. Hinzufügen, 0,8% (1,2 g) Agarose-Pulver.
- Mikrowelle Kolben in 30 Sekunden-Intervallen mit intermittierender wirbelnden bis Agarose vollständig gelöst ist (normalerweise 1 - 3 Minuten). Verwenden Sie heiße Hand Pads während dieses Prozesses. Seien Sie vorsichtig, plötzliches Überkochen während wirbeln.
- Lassen Sie die Agarose-Lösung abkühlen 5 - 10 min. Hinweis: Die Agarose-Lösung bereit sein wird, gegossen werden, wenn Boden des Kolbens für 5 sec auf der Handfläche belassen werden.
- Bereiten Elektrophorese Gussschale (10 x 15 cm), indem Sie die Ränder mit Dichtband und Platzierung gut in Position kämmen.
- Gießen Sie langsam Agarose-Lösung in ter Gussschale die Bildung von Blasen zu vermeiden. Entfernen Sie Blasen, die eine Pipettenspitze. Warten Sie auf das Gel zu kühlen und vollständig zu verfestigen. Einmal verfestigt, nehmen Sie den Kamm langsam durch Absaugen kollabiert die Vertiefungen zu vermeiden, und das Band von den Rändern der Schale zu entfernen.
- Legen Agarose-Gel in das Gel Box und füllen Sie die Elektrophorese-Einheit mit 1x TAE-0,1% SDS-Puffer, bis das Gel vollständig bedeckt ist.
3. Probe geladen und Elektrophorese-Trenn
Hinweis: In unserem Labor haben wir häufig Proben verwenden, um von Maus und Menschen, einschließlich bronchoalveolären Lavage (BALF, beide Spezies), Zell-Waschungen aus humanen bronchialen Epithelzellen (HBE) und menschlichem Speichel und Sputum-Proben. Proben können durch Zugabe von Proteinase-Inhibitor-Cocktail in 6 M Harnstoff bei der Abholung oder gelagert für kurze Zeiträume (6 h) denaturiert werden.
- Vorbereiten Proben für die Beladung durch Zugabe von 10% der Lade Farbstoff zu jeder Probe (dh., 30 ul Probe und 3ul Farbstoff). Homogenisieren Proben von oben und unten Pipettieren. Spin Kurz Röhrchen bei 5.000 Umdrehungen pro Minute nach unten Tröpfchen zu sammeln.
- Sorgfältig laden gleichen Volumen von Proben in die Vertiefungen.
- Vornässen Spitzen und / oder Verdrängungspipetten verwenden Laden von hochviskosen Proben zu erleichtern. Langsam absaugen 80-90% der Proben-Farbstofflösung (dh 27 bis 30 & mgr; l) Pipettieren Blasen zu vermeiden.
- am Boden der Wells laden langsam und schrittweise nach oben die Pipettenspitze zu bewegen. Bei Proben, die an der Pipettenspitze befestigt bleiben, in einem 45 ° Winkel verzichtet und gerade über dem Brunnen verlängern oder sanft auf die Seite des gut verwenden, um den sehnig Schleim brechen. Sie nicht die Brunnen überlasten.
- Verbinden Sie die Elektroden aus dem Gel Box auf der Elektrophorese-Stromerzeuger. Sicherstellen , dass die Elektroden korrekt angeschlossen sind (dh., Angeschlossen rote Kabel am positiven Ausgang des Generators) zu erlauben , negativ geladene Muzine in Richtung der positiven laufen Elektrode.
- Laufen um das Gel bei 80 Volt für 90 min für eine einzelne Kamm Gel oder 60-75 min nach einem Doppelkamm Gel Überlappung zwischen den beiden Reihen zu verhindern.
- Schalten Generatorleistung aus und trennen die Elektroden von der Stromquelle.
- Entfernen Sie vorsichtig das Gel aus dem Gel-Box mit einer Hand auf beiden Seiten der Gelträger das Gel bleibt an Ort und Stelle zu gewährleisten.
4. Reduzieren Agarose-Gel für die effiziente Übertragung Mucin
- Legen Sie das Gel flach in einem Glasbehälter. Spülen Sie das Gel mit dH 2 O Spuren von TAE-SDS - Puffer zu entfernen.
- Vorbereitung 1 Liter 4x SSC - Puffer durch Zugabe von 200 ml 20x SSC in 800 ml dH 2 O. Machen 200 ml von 10 mM Dithiothreitol (DTT) 4x SSC Lösung durch Zugabe von 309 mg von frischem DTT in 200 ml 4x SSC-Puffer.
- Weichen Sie das Gel mit DVB-T-4x SSC-Puffer und Deckel. sachte für 20 min (10 Umdrehungen pro Minute). Spülen Sie Gel mit DVB-T-freien Puffer 4x SSC.
- Bereiten Sie Vakuum Löscher für die Übertragung.
- Bei Abmessungen Nitrocellulosemembran etwas breiter als das Gel (dh., 10 x 15 cm) Schneiden Sie vorsichtig.
- Nasse poröse Matte mit dH 2 O und legen Sie es glatt Seite nach oben in die Kladde.
- Wet Nitrocellulosemembran mit DTT freien SSC-Puffer 4x und legen Sie sie in der Mitte der porösen Matte.
- Decken die poröse Matte mit der Gummidichtung, so dass die Öffnung der Dichtung präzise mit der Nitrocellulose-Membran ausgerichtet ist. Wenn poröse Matte noch sichtbar ist, stellen Sie vorsichtig die Membran kein Spalt bleibt zwischen Dichtung und Membran zu gewährleisten.
- Legen Sie das Agarose-Gel auf der Oberseite der Membran. Gewährleisten Gel bildet eine dichte Abdichtung mit der Dichtung und die Vertiefungen des Gels auf der Membran für die Übertragung angeordnet sind.
- Vermeiden die Bildung von Blasen zwischen der Membran und dem Gel. Zur Minimierung derBildung von Blasen, spritzen einige Tropfen 4x SSC auf die Membran puffern und das Gel von oben nach unten keine Blasen gebildet zu spülen gleiten. Vermeiden Sie das Gel auf die Membran bewegt, wie Proteine sofort auslöschen beginnt.
- Sorgfältig abdecken, das Gel mit Puffer 4x SSC.
- Beginnen Mucin Übertragung durch Absaugen.
- Drehen Sie Vakuum blotter ein und setzen Sie Druck bei 40 - 50 mbar. Fügen Sie ein paar Tropfen 4x SSC-Puffer auf dem Gel alle 5 - 10 min, das Gel vor dem Austrocknen zu verhindern. Führen Sie Transfer für 90 min. Optional: Nach der Fertigstellung der Brunnen mit einem Bleistift zur Orientierung markieren.
- Entsorgen Sie das Gel und Abrufen von Nitrocellulosemembran auf dem Rand der Membran Kunststoff-Pinzette.
6. Membran Blocking und Nachweis
- Spülen Membran sofort mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Nicht die Membran austrocknen lassen.
- Tauchen Sie die Membran in 50 ml 3% Milch-PBS Blockierungspuffer und auf ein rocker bei Raumtemperatur für 1 Std. die Blockierungspuffer Nach der Inkubation verwerfen.
- Tauchen Membran in 1% Milch-PBS primären Antikörperlösung. Inkubieren der Membran in der primären Antikörperlösung über Nacht auf einem Schüttler bei 4 ° C. Nach der Inkubation verwerfen die primäre Antikörperlösung. Verdünne die primären Antikörper gegen ein 1: 2000 Verhältnis der Antikörperlösung Puffer zu blockieren. Anmerkung: Für Proben von Mäusen stammen, verwenden wir UNC 222 Kaninchen-anti-MUC5B und Ziege-anti-Green Fluorescent Protein (GFP). Bei Proben von Menschen stammen, verwenden wir H300 anti-MUC5B und 45M1 anti-MUC5AC primären Antikörper.
- Wasch Membran 3 mal für 10 min auf einer Wippe mit PBS.
- Tauchen Membran in 1% Milch-PBS sekundäre Antikörperlösung. Verdünne die Sekundärantikörper zu einer 1: 7.500 - Verhältnis von Antikörperlösung Puffer zu blockieren und Inkubation für 1 h auf einem Schüttler bei Raumtemperatur (beispielsweise 700 - Anti-Kaninchen und Anti-Ziege - 680.). Vor Licht durch in einem nicht transparenten Co Inkubationntainer. Entsorgen Sie die sekundären Antikörper-Lösung nach 1 Stunde.
- Waschen Sie die Membran 3 mal mit PBS für 5 min. Spülen Membran mit dH 2 O Salz zu entfernen.
- Lesen Sie die Membran auf einem Infrarot-Fluoreszenzsystem nach den Anweisungen des Herstellers.
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Representative Results
Wir zeigen repräsentative Ergebnisse von Muzinexpression folgende Agarose - Gelelektrophorese in BALF aus den Lungen von Mäusen (Abbildung 1). Folgende IL-13 Behandlung des Tg-MUC5AC Maus-Modell In diesem Beispiel verwendeten wir das Agarosegel upregulation zu zeigen, Produktion Mucin. Der Western - Blot zeigt eine visuelle Darstellung der Muzinexpression, die für eine quantitative Analyse von Multimer oder Monomerbande Signalintensität (Abbildung 2) verwendet werden kann. Dieses Verfahren kann auch in der menschlichen bronchialen Epithelzellen (HBE) -Zelle Waschungen und menschlichen Sputum-Proben die Expression von Mucin zu zeigen verwendet werden. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um die Reduktion von Mucinen mit Reduktionsmitteln nach der Behandlung zu zeigen. Wir zeigen repräsentative Ergebnisse aus HBE Waschungen behandelt mit steigenden Konzentrationen von DTT (Abbildung 3). Wir quantifizierten den Verlust der Signalintensität Multimer folgenden Mucin Reduktion mit Behandlung mit einem Reduktionsaltersnt (Abbildung 4).
Abbildung 1. Hochregulation von Mucin Produktion nach IL-13 - Behandlung der Tg-MUC5AC / Green Fluorescent Protein (GFP) Mausmodell Mäuse überexprimieren MUC5AC mit GFP markiert wurden mit PBS eingeflößt. (-) Oder IL-13 (+) zu induzieren Becher Zelle Metaplasie und Erhöhung in der Lunge (n = 3 pro Gruppe) Mucinproduktion. BALF wurden mittels Agarose-Mucin Western-Blotting geerntet und getrennt. Membran wurde mit einem polyklonalen Kaninchen-anti-MUC5B (rot) sondiert und einem polyklonalen Ziegen-anti-GFP (grün). Das Infrarot - System kann verwendet werden , um die Ergebnisse als Overlay zu zeigen oder als Einzelkanal mit der Option , Bilder in Schwarzweiß zu ändern. Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Die quantitative Analyse von Mucin Agarose - Gel Zeige Hochregulation von Mucinsekretion in IL-13-behandelten Mäusen. MUC5B Signalintensität für jede Spur des Mucin - Gel in Abbildung 1 gemessen wurde gezeigt. Die Ergebnisse zeigen , dass Mucinsekretion erhöht wurde 5,1-fach über PBS-behandelten Mäusen in IL-13-behandelten Tieren (n = 3, p <0,005). Die gezeigten Daten als Mittelwert ± SEM. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3 Reduktion des MUC5AC und MUC5B Mucine in HBE Abziehmittel behandelt mit DTT. HBE Waschungen wurden behandelt mit 0, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 und 100 mM DTT bei 37 ° C für 30 minutes. Membran sondiert wurde mit einem polyklonalen Kaninchen - anti-MUC5B (grün) und einer Maus polyklonalen Anti-MUC5AC (rot). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Quantitative Analyse von Mucin Agarose - Gel Zeige Disappearance of Multimeric Band in HBE Wäscht Behandelt mit DTT. MUC5AC und MUC5B Signalintensität für jede Spur des Mucin - Gel gemessen wurde. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das Protokoll von Western - Blot in diesem Video kombiniert in der Molekularbiologie üblichen Techniken beschrieben Mucin große Makromoleküle zu trennen und zu übertragen, wie beispielsweise DNA, mit regelmäßigen Techniken zur Proteindetektion, dh., Immun - Blotting. Dieselbe Technik kann angewandt werden , die Biologie komplexer Glykosaminoglykanen zu studieren, wie beispielsweise den Abbau von hochmolekularen Hyaluronsäure 18. Obwohl diese Technik in einem breiten Bereich von Assays erfolgreich Agarose Western-Blotting verwendet werden könnte, beruht auf einer Vielzahl von Schritten, die sorgfältige und zeitabhängige Aktionen erfordern. Um den Erfolg zu maximieren, sollten einige wichtige Schritte überprüft werden.
Probenvorbereitung und Gel-Laden sind wichtige Schritte für genaue Ergebnisse. Mucin-reichen Proben, dh., Sputum, sind von Natur verwachsen experimentellen Schläuche, dh., Pipettenspitzen, Zentrifugenröhrchen, Filter. Die Verwendung von Verdrängerpumpen pipettiert und PrePipettenspitzen -wetting kann das Laden des viskoelastischen Materials in die Vertiefungen erleichtern. Solche Proben erfordern eine besondere Aufmerksamkeit aufgrund erhöhten Auftrieb und Klebrigkeit dieser Materialien. Konzentrierte Proben (mehr als 5 mg / ml) wird schlecht durch die Porengröße eines 0,8% Agarose-Gel wandern und erfordern eine weitere Verdünnung und / oder Denaturierung in bis zu 6 M Harnstoff. Vermeiden Sie jedoch Proben denaturiert in Guanidiniumchlorid (GuHCl) als Guanidinium mit SDS ausfällt läuft. Daher wird in GuHCl gelagerten Proben erfordern einen zusätzlichen Dialyseschritt. Für nicht-polymeren Status Studien, teilweise Reduktion (0,5 mM DTT für 5 min) wird die Migration von konzentrierten Proben erheblich verbessern (siehe Abbildung 3).
Proteintransfer auf die Nitrocellulosemembran ist ein wichtiger Schritt für dieses Protokoll, und wenn nicht mit Präzision ausgeführt, kann gefärbten Membran, schwaches Signal und falsche quantitative Ergebnissen führen. Nitrocellulosemembranen sind empfindlich und leicht kontaminiert undsollte immer mit Handschuhen gehandhabt und Pflege unspezifische Bindung und Schäden zu vermeiden. Die Platzierung des Gels auf die Membran erfordert eine präzise Ausrichtung eine gute Abdichtung zu erzeugen und Transferpuffer Auslaufen zu verhindern, die in Flecken führen würde und Übertragungseffizienz zu reduzieren. Blasenbildung zwischen Gel und Membran Proteintransfer verhindern und sorgfältig vermieden werden sollte.
Optimale Immunnachweis beruht auf hochaffine, hochspezifische Antikörper gegen das Proteinrückgrat des Ziel-Mucin. Vor kurzem ergeben neuartigen Immunisierungsstrategie, Antigen Konstruktion und Screening-Technologien zu einem erhöhten Erfolg mit der Erzeugung von Mucin-Antikörper und lieferte neue Werkzeuge Mucin Biologie zu studieren. Um zwei unterschiedliche Mucine auf einem Fleck zu erkennen, dh., MUC5AC und MUC5B, die beiden primären Antikörper müssen aus verschiedenen Wirtsarten, dh, Kaninchen und Ziege abgeleitet werden. Auch müssen die Sekundärantikörper mit unterschiedlichen Fluorophor markiert werden,s sowohl im 700 nm- und 800 nm-Kanal erkannt werden.
Relative Mucin Fülle und Mucin Größe kann direkt mit Imaging-Software quantifiziert werden. Fluoreszierendes Signal ist zu der Menge des Ziel Mucin direkt proportional, so dass die Quantifizierung von einer Vielzahl von Proben, von niedrig (z. B. Zell Waschungen) zu hoch ist (z. B. Sputum) Mucin - Konzentration. Jedoch absolute Mucin Konzentration erfordert die Reinigung von Mucin - Standards, die nicht in diesem Protokoll beschrieben wurde , da es ein langwieriges und schwieriges Verfahren ist , das in Abdullah et al beschrieben ist . 19. Zusätzlich stellt Agarose Western-Blotting, die Möglichkeit Mucin-Shift-Assays durchzuführen, um den Prozess der Polymerisation oder Depolymerisation zu studieren. Die elektrophoretische Mobilität von Mucinen hängt von ihrer polymeren Zustand, dh., Migration großer Polymere verzögert wird , und kann mit der Imaging - Software quantifiziert werden. Zum Beispiel wird eine Mobilitäts sh Reduktionsmitteln induzierenift des Signals, das mit Änderungen in den biophysikalischen Eigenschaften des Schleims korreliert. Ein solcher Test kann Mucin Multimerisierung Prozess 13 , sondern auch zu testen , pharmakologische Wirkstoffe bei Auswirkungen auf die Mucin - Netzwerk 11 abzielen , zu prüfen verwendet werden. Zum Schluss, Agarose Western-Blot-Mucin gekoppelt mit Fluoreszenzmarkierung hat sich unser Ansatz wesentlich verändert Muzine zu studieren durch hohe qualitative und quantitative Daten zu erzeugen.
Häufige Probleme mit Agarose-Western-Blot-Mucin in den folgenden Ergebnissen führen kann: niedrige Signalintensität, hoher Hintergrund und / oder das Auftreten von Punktaten auf der Membran. Mehrere Fehlersuchstrategien können Mucin Gel Bilder zu verbessern verwendet werden. Die Signalstärke kann durch Laden größere Probenvolumina und / oder Erhöhung der primären und sekundären Antikörperkonzentrationen erhöht werden. Typischerweise ist hohes Hintergrundsignal zurückzuführen auf unzureichende Sperr- und / oder Waschlösungen, die durch Ausführen einer längeren Block aufgelöst werden kann/ Wäsche Inkubationen, sowie unter Verwendung von blockierenden Puffer optimiert, die im Handel erhältlich sind. Das Aussehen der Punktaten kann das Ergebnis von ausgedehnten Membran Inkubationen bei Raumtemperatur sein, die das Bakterienwachstum ermöglicht. Punktaten kann auch durch eine Nitrocellulosemembran Beschädigungen von DTT Tränklösung (Schritt 4.1) verursacht werden und durch Spülen der Agarosegel gründlich vor der Übertragung und / oder abnehm DTT-Konzentration auf 5 mM vermieden werden kann.
Die Hauptbeschränkung von Agarose Western-Blotting Mucin ist der Mangel an Protein Leiter für hochmolekulare Proteine und Mucin-Standards, die absolute Quantifizierung Mucin behindert. Die meisten Ergebnisse von Mucin Agarosegelen veröffentlicht sind Vergleichsstudien für die Größe und Konzentration. Grßenausschlußchromatographie mit Lichtstreuung gekoppelt mit einem Brechungsindex ist eine andere Technik, die üblicherweise eingesetzt, um präzise Molekulargewicht und die Konzentration von Makromolekülen zu bestimmen. Jedoch ist diese Technik teuer and fehlt Spezifität für Mucine daher Maßnahmen andere große Moleküle in den Proben enthalten sind , beispielsweise DNA. Zusätzlich Grßenausschlußchromatographie kann nicht zwischen Mucin Typen zu differenzieren, das heißt., MUC5AC gegen MUC5B sowie Maßnahmen und durchschnittliche Konzentration und Größe aus dem Gemisch von Mucinen in einer gegebenen Probe enthalten.
Andere Techniken können mucins einschließlich dynamischer und Multi-Angle - Licht zu studieren Streuung 1, isopycnic und Rate-zonale Zentrifugationen 6, Elektronenmikroskopie, Massenspektrometrie 1,7,8 verwendet werden. Doch mit der Untersuchung von neuen pharmakologischen Mitteln Mucin Moleküle abzielen, ist es zwingend notwendig, zuverlässige Labortechniken zu entwickeln Mucin Biologie zu studieren. Agarose Western - Blotting Mucin ist eine relativ einfache und kostengünstige Technik , die verwendet werden können , wichtige Fragen hinsichtlich Mucin Prozesse zu beantworten, dh., Veränderung der Mucin Belastung, Größe und Verhältnis. Dieser Test wird verwendet,in zukünftigen Anwendungen Arzneimittel Wirksamkeit und Toxizität für neue Moleküle bei der Entfernung von haftenden Schleim in in vitro und in vivo Modellen gerichtet zu testen.
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Disclosures
Die Autoren haben keinen Konflikt offen zu legen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris Base | Sigma | T6060-1kg | 1 kg |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | ARK2183-1L | 1 L |
| EDTA | Sigma | EDS-100g | 100 g |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | 1 L |
| Bromophenol Blue | Sigma | 114391-5g | 5 g |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Sigma | L6026-50g | 50 g |
| 20x SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer | Promega | V4261 | 1 L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1 kg |
| Trisodium Citrate (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1kg | 1 kg |
| 10 mM DTT (dithiothreitol) | Sigma | D0632 | 25 g |
| Milk Powder | Saco | Instant non-fat dry milk | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500 ml |
| Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples) | Rockland antibodies and assays | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples) | UNC | ||
| H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples) | Santa Cruz | sc-20119 | 200 μg |
| 45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples) | Abcam | ab3649 | 100 μg |
| Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0.5 mg |
| Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0.5 mg |
| Electrophoresis Gel Box and Casting Tray | Owl Seperation Systems | ||
| Power Supply Box | Biorad | Model 200/20 | |
| Membrane Blotting Paper | Amersham | 10600016 | |
| Whatman Paper and Nitrocellulose membrane | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230 v | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey Infrared Fluorescence System | LI-COR Biosciences |
References
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