Abstract
Las mucinas, las proteínas fuertemente glicosiladas que recubren las superficies mucosas, se han desarrollado como un componente clave en la defensa innata mediante la protección del epitelio contra los patógenos invasores. La función principal de estas macromoléculas es el de facilitar la captura de partículas y la limpieza, mientras que la promoción de la lubricación de la mucosa. Durante la síntesis de proteínas, las mucinas se someten intensa O-glicosilación y la multimerización, que aumentan dramáticamente la masa y el tamaño de estas moléculas. Estas modificaciones post-traduccionales son esenciales para las propiedades viscoelásticas de moco. Como resultado de la naturaleza compleja bioquímicas y biofísicas de estas moléculas, trabajando con mucinas ofrece muchos retos que no se pueden superar por métodos de análisis de proteínas convencionales. Por ejemplo, su alto peso molecular impide la migración electroforética a través de geles de poliacrilamida regulares y su naturaleza pegajosa provoca la adhesión a un tubo experimental. Sin embargo, la investigación del papel de las mucinas en la salud(Por ejemplo., El mantenimiento de la integridad de la mucosa) y la enfermedad (por ejemplo., Hiperconcentración, mucoestasis, cáncer) ha ganado recientemente el interés y las mucinas se están investigando como una diana terapéutica. Una mejor comprensión de la producción y función de macromoléculas de mucina puede conducir a enfoques farmacéuticos nuevos, por ejemplo, inhibidores de mucina exocitosis de gránulos y / o agentes mucolíticos. Por lo tanto, los protocolos coherentes y fiables para investigar la biología de mucina son fundamentales para el progreso científico. Aquí, se describen los métodos convencionales para separar macromoléculas de mucina por electroforesis utilizando un gel de agarosa, la transferencia de la proteína en la membrana de nitrocelulosa, y detectar la señal con anticuerpos de mucina específica, así como lector de gel fluorescente en el infrarrojo. Estas técnicas son ampliamente aplicables para determinar mucina cuantificación, la multimerización y para poner a prueba los efectos de compuestos farmacológicos sobre mucinas.
Introduction
Las mucinas se producen normalmente por las superficies de la mucosa que recubren las cavidades expuestas al ambiente externo (por ejemplo., Respiratorio, tracto digestivo, reproductivos, superficie ocular), así como los órganos internos (por ejemplo, páncreas, vesícula biliar, glándulas mamarias). La presencia de estas glicoproteínas mantiene la hidratación de la superficie y forma una barrera física contra los patógenos. Aunque la producción de mucina es esencial para la mucosa de la salud, hiperconcentración de mucina y / o propiedades del moco aberrantes puede conducir a la obstrucción de los conductos, la colonización bacteriana y la inflamación crónica, que puede causar daño irreversible del tejido. Una cascada de acontecimientos similares se observan en varias enfermedades, por ejemplo., Fibrosis quística 1, 2 otitis media crónica y la infección cervicovaginal 3. Por lo tanto, es importante entender el papel de las mucinas en la salud y la enfermedad y establecer protocolos de rutina para la identificación de proteínas.
Hasta la fecha, Se han identificado 19 genes mucinas y codifican cadenas de polipéptidos grandes que van desde 1200 (por ejemplo., MUC1) a 22.000 (por ejemplo, MUC16) aminoácidos. La familia de genes de mucina se puede dividir en dos subtipos: las mucinas asociadas a la membrana, que participan en la señalización celular y la superficie de blindaje, y las mucinas formadoras de gel, responsable de las propiedades viscoelásticas de los geles de moco. mucinas asociadas a la membrana son en su mayoría monomérica y se adhieren a las superficies de las células a través de un dominio que atraviesa la membrana hidrófoba. Por el contrario, las mucinas formadoras de gel poseen varios -como y dominios ricos en cisteína factor de von Willebrand (vWF) que son esenciales para la formación de redes poliméricas dinámicos. Grandes glicanos están unidos a residuos de serina y treonina distribuidos por todo el apomucina. Estos oligosacáridos O-ligados densos pueden contribuir hasta 80% del peso molecular 4. enlaces disulfuro intra- e inter-moleculares que conectan monómeros de mucina asegurar la integridad de la Networ gel de mucinak. Como resultado de la glicosilación pesada y multimerización, mucinas están entre las moléculas más grandes en el mundo animal y no pueden ser analizados por electroforesis en gel estándar utilizando gel de poliacrilamida SDS-PAGE convencional y escaleras de proteínas estándar. Estos métodos se resuelven / proteínas separadas con pesos moleculares inferiores a 250 kDa, mientras que los monómeros de mucina pueden alcanzar hasta 2 MDa en el caso de MUC16. Sin embargo, las escaleras de proteínas de alto peso molecular se pueden utilizar para estudiar pequeñas monómeros de mucina (es decir., MUC1).
Una variedad de técnicas se pueden aplicar para estudiar el tamaño de mucina, la conformación y la interacción. Tradicionalmente, la caracterización bioquímica de las mucinas se logra mediante la mucina aislamiento mediante centrifugación isopícnica en gradiente de densidad en un tampón de desnaturalización, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño y la inmunodetección (por ejemplo., Transferencia slot) 5. y / o dispersión de luz multiángulo dinámico proporciona información sobre el estado oligomérico de muestras de mucina ricos <sup> 1. Además, la centrifugación de la velocidad zonal junto con la inmunodetección y microscopía electrónica de transmisión se utiliza comúnmente para determinar la conformación macromolecular de mucinas 6. La espectrometría de masas también se utiliza para cuantificar las mucinas, detectar la escisión proteolítica y analizar oligosacárido composición 1,7,8. Tales técnicas son costosas, consume tiempo y a menudo requieren grandes volúmenes y / o altas concentraciones de muestra. La metodología descrita en el presente documento, es decir., Mucina separación por electroforesis, es reproducible, de bajo coste y se puede utilizar en estudios de alto rendimiento para proporcionar la cuantificación relativa y mucina investigar montaje polímero. Sin embargo, este ensayo requiere de alta afinidad y de alta especificidad de mucina anticuerpos que pueden no estar disponibles para mucinas raras (por ejemplo., MUC19) o ciertas especies (por ejemplo., Cerdo, hurón).
Western Blot La agarosa es adecuado para resolver una amplia variedad de muestras de mucina ricos con concentraciónlas que van desde 50 mg / ml (por ejemplo., lavados de células) a 5 mg / ml (por ejemplo., esputo). Este ensayo fue introducido en la década de 1990 y sólo se realizó en pocos laboratorios especializados 9,10. Inicialmente, esta técnica ayudó a identificar subpoblaciones de monómeros de mucina en las secreciones respiratorias humanas 11,12 y confirmó el proceso de oligomerización en las células caliciformes, que consiste en la formación de dímeros en el retículo endoplasmático, seguido de multimerización dímero en el aparato de Golgi 13. Más recientemente, la generación de anticuerpos policlonales contra mucinas murinos facilitó los estudios en modelos animales pequeños (por ejemplo., Mucina, modelos de ratones desafiados con OVA βENaC, deficientes) y abrió un nuevo campo de investigación para los estudios preclínicos probar compuestos farmacológicos destinados a eliminar la mucosidad de los pulmones 14-17. Como resultado de un creciente interés en la biología de mucina y la generación de nuevo, los anticuerpos de mucina más específicos, que describen traducción de estasn la metodología para separar las mucinas por electroforesis en gel de agarosa, transferencia de vacío a nitrocelulosa y la detección fluorescente en el infrarrojo de dos colores.
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Protocol
1. Preparar Los tampones de mucina Gel Western Blotting
- Preparar 1 litro de 50x tampón TAE (Tris-acetato-EDTA).
- En 700 ml de agua destilada (dH 2 O) añadir 242 g de base Tris (0,4 M), 57,1 g de ácido acético glacial (peso de líquido) (0,2 M) y 14,61 g de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (50 mM).
- Ajustar el pH a 8,0 y completar el volumen hasta 1 litro con dH 2 O.
- Preparar 10 ml de tampón de carga 10x.
- Preparar 5 ml de tampón 1x TAE. Para ello, añadir 5 ml de glicerol (50%), 25 mg de azul de bromofenol (0,25%), y 100 mg de dodecilsulfato de sodio (SDS) (1%).
- Preparar 2 litros de tampón 20x de sodio citrato de solución salina (SSC).
- En 1,5 litros de H2O destilada, agregar 350,6 g de NaCl (3 M) y 176,4 g de citrato trisódico (Na 3 C 6 H 5 O 7) (0,3 M). Ajustar el pH a 7,0 y se alcance un volumen de 2 litros con dH2O
- Preparar 1 litro de tampón 1x TAE-0,1% de SDS.
- Añadir 20 ml de 50x TAE a 980 ml de dH2O Añadir 1 g de SDS para hacer una solución 0,1% de SDS-TAE.
2. TAE-SDS en gel de agarosa Preparación
- (. Es decir, 150 ml) Verter volumen suficiente de 1x TAE-0,1 tampón SDS% en un matraz Erlenmeyer de microondas para hacer un 5 - gel 7 mm de espesor. Añadir 0,8% (1,2 g) de polvo de agarosa.
- matraz de microondas en intervalos de 30 seg con agitación intermitente hasta que se disuelve por completo de agarosa (generalmente 1 - 3 minutos). Use toallas de mano caliente durante este proceso. Tenga cuidado de la ebullición mientras se agita.
- Deje que la solución de agarosa se enfríe durante 5 - 10 minutos a. Nota: La solución de agarosa estará listo para ser vertido al fondo del frasco se puede dejar en la palma de la mano durante 5 segundos.
- Preparar bandeja de fundición de electroforesis (10 x 15 cm) mediante el sellado de los bordes con cinta adhesiva y colocando así peine en posición.
- Verter lentamente solución de agarosa en tque la fundición de la bandeja para evitar la formación de burbujas. Eliminar las burbujas utilizando una punta de pipeta. Espere a que el gel se enfríe y solidifique por completo. Una vez solidificado, retire el peine lentamente para evitar el colapso de los pocillos mediante aspiración y retire la cinta de los bordes de la bandeja.
- Colocar en gel de agarosa en el cuadro de gel y llenar la unidad de electroforesis con tampón TAE 1x SDS-0,1% hasta que el gel esté completamente cubierto.
3. carga de la muestra y separación de electroforesis
Nota: En nuestro laboratorio, que comúnmente utilizamos muestras tanto del ratón y el ser humano, incluyendo el lavado broncoalveolar (BALF; ambas especies), lavados celulares a partir de células epiteliales bronquiales humanas (HBE), y muestras de saliva y esputo humanos. Las muestras pueden ser desnaturalizadas en 6 M urea a la recogida o almacenados por períodos cortos de tiempo (6 horas) mediante la adición de cóctel inhibidor de proteinasa.
- Preparar muestras para la carga mediante la adición de 10% de colorante de carga a cada muestra (es decir., 30 l de muestra y 3l de tinte). Homogeneizar las muestras de la pipeta hacia arriba y hacia abajo. Brevemente centrifugar los tubos a 5.000 rpm para recoger las gotas.
- Con cuidado, cargar un volumen igual de muestras en los pocillos.
- consejos pre-húmedas y / o utilizar pipetas de desplazamiento positivo para facilitar la carga de muestras altamente viscosas. Lentamente aspirado de 80 - 90% de solución de muestra de colorante (es decir, 27 a 30 l) para evitar burbujas de pipeteo.
- Lentamente carga en el fondo de los pocillos y se mueven progresivamente la punta de la pipeta hacia arriba. Para las muestras que permanecen unidas a la punta de la pipeta, dispensar en un ángulo de 45 ° y alargar recta por encima del bien o suavemente usar el lado del pozo para romper el mucosidad viscosa. No sobrecargue los pozos.
- Conectar los electrodos de la caja del gel de electroforesis el generador de energía. Asegúrese de que los electrodos están conectados correctamente (es decir., Cable rojo conectado a la salida positiva del generador) para permitir cargados negativamente mucinas para correr hacia lo positivo electrodo.
- Correr el gel a 80 voltios durante 90 min para un solo gel peine, o 60 a 75 min para un gel doble peine para evitar el solapamiento entre las dos filas.
- APAGUE el generador de energía y desconectar los electrodos de la fuente de alimentación.
- Retire cuidadosamente el gel de la caja de gel con una mano en cada lado de la bandeja de moldeo para asegurar que el gel permanece en su lugar.
4. Reducir en gel de agarosa para una transferencia eficaz de mucina
- Con cuidado, coloque la parte plana de gel en un recipiente de vidrio. Enjuague el gel con H2O destilada para eliminar los restos de tampón TAE-SDS.
- Preparar 1 litro de tampón SSC 4x añadiendo 200 ml de 20x SSC en 800 ml de dH 2 O. Hacer 200 ml de ditiotreitol 10 mM (DTT) solución 4x SSC mediante la adición de 309 mg de la TDT fresco en 200 ml de tampón de 4x SSC.
- Remojar el gel con tampón de TDT-4x SSC y la cubierta. Agite suavemente durante 20 min (10 rotaciones por minuto). Enjuague gel con TDT libre tampón SSC 4x.
- Preparar secante de vacío para la transferencia.
- Corte con cuidado la membrana de nitrocelulosa en dimensiones ligeramente más ancho que el gel (es decir., 10 x 15 cm).
- Estera porosa húmeda con dH2O y colocarlo suave del lado del plano en el papel secante.
- membrana de nitrocelulosa mojada con tampón SSC 4x TDT libre y colocarlo en el centro de la malla porosa.
- Cubrir la estera porosa con la junta de goma, dejando la abertura de la junta precisamente alineada con la membrana de nitrocelulosa. Si la placa porosa es aún visible, ajuste cuidadosamente la membrana para asegurar queda ningún hueco entre la junta y la membrana.
- colocar cuidadosamente el gel de agarosa en la parte superior de la membrana. Asegúrese de gel se forma un sello hermético con la junta y los pocillos del gel se colocan sobre la membrana para la transferencia.
- Evitar la formación de burbujas entre la membrana y el gel. Para minimizar elformación de burbujas, chorros unas gotas de 4x SSC tampón sobre la membrana y el gel se deslizan de arriba a abajo para eliminar cualquier burbuja formadas. Evite mover el gel sobre la membrana como proteínas comenzarán a borrar inmediatamente.
- Con cuidado, cubrir el gel con tampón SSC 4x.
- Iniciar la transferencia de mucina por succión.
- Girar secante de vacío y presión EN fijado en 40 - 50 mbar. Añadir unas gotas de tampón SSC 4x en el gel cada 5 - 10 minutos a para evitar que el gel se seque. transferencia de una duración de 90 min. Opcional: Al finalizar, marcar los pozos con un lápiz para la orientación.
- Deseche el gel y recuperar la membrana de nitrocelulosa utilizando pinzas de plástico en el borde de la membrana.
6. El bloqueo de la membrana y de detección
- Enjuague la membrana inmediatamente con solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS). No deje que la membrana se seque.
- Sumergir la membrana en 50 ml de 3% de leche-PBS solución amortiguadora de bloqueo y colocar en una rocker a temperatura ambiente durante 1 hr. Después de la incubación, desechar el tampón de bloqueo.
- Sumergir la membrana en solución de anticuerpo primario leche-PBS 1%. Incubar la membrana en la solución de anticuerpo primario durante la noche en un agitador a 4 ° C. Después de la incubación, desechar la solución de anticuerpo primario. Diluir los anticuerpos primarios a una proporción de 1: 2000 de solución de anticuerpo a tampón de bloqueo. Nota: Para las muestras procedentes de ratones, usamos UNC 222 de conejo anti-MUC5B y de cabra anti-proteína fluorescente verde (GFP). Para las muestras procedentes de seres humanos, utilizamos anticuerpos primarios anti-H300 MUC5B y 45M1 anti-MUC5AC.
- membrana Lavar 3 veces con PBS durante 10 min en un agitador.
- Sumergir la membrana en solución de anticuerpo secundario leche-PBS 1%. Diluir los anticuerpos secundarios a una proporción 1: 7500 de solución de anticuerpo a tampón de bloqueo y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hr en un agitador (por ejemplo, 700 anti-conejo y anti-cabra 680.). Proteger de la luz mediante la incubación de un compañero no transparententainer. Descartar la solución de anticuerpo secundario después de 1 hora.
- membrana Lavar 3 veces con PBS durante 5 min. Enjuague la membrana con H2O destilada para eliminar la sal.
- Leer la membrana en un sistema de fluorescencia de infrarrojos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
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Representative Results
Mostramos los resultados representativos de la expresión de mucina siguientes electroforesis en gel de agarosa en BALF de los pulmones de los ratones (Figura 1). En este ejemplo, se utilizó el gel de agarosa para mostrar la regulación positiva de la producción de mucina después del tratamiento de IL-13 de el modelo de ratón Tg-Muc5ac. La transferencia Western muestra una representación visual de la expresión de mucina, que puede ser utilizado para un análisis cuantitativo de multímero o intensidad de la señal de banda de monómero (Figura 2). Este método también puede ser usado para mostrar la expresión de mucinas en lavados humanos del epitelio bronquial (HBE) celulares y muestras de esputo humanos. Este método puede ser usado para mostrar la reducción de mucinas tras el tratamiento con agentes reductores. Mostramos los resultados representativos de los lavados HBE tratadas con concentraciones crecientes de TDT (Figura 3). Se cuantificó la pérdida de intensidad de la señal después de la reducción multímero mucina con el tratamiento con una edad reducirnt (Figura 4).
Figura 1. La regulación por incremento de la producción de mucina Después de IL-13 Tratamiento de la / proteína fluorescente verde Tg-Muc5ac (GFP) modelo de ratón Los ratones que sobreexpresan Muc5ac etiquetado con GFP se instilaron con PBS. (-) O IL-13 (+) para inducir la copa metaplasia celular y la producción de mucina aumento en los pulmones (n = 3 por grupo). BALF fueron cosechadas y se separa a través de mucina transferencia Western de agarosa. Membrana se sondeó con un anticuerpo policlonal de conejo anti-MUC5B (rojo) y un anticuerpo policlonal de cabra anti-GFP (verde). El sistema de infrarrojos se puede utilizar para mostrar los resultados como una superposición o como un único canal con la opción de cambiar las imágenes a blanco y negro. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Análisis cuantitativo de la mucina en gel de agarosa Mostrando Upregulation de la secreción de mucina en ratones de 13 Teñidos IL intensidad de la señal MUC5B se midió. Para cada carril del gel de mucina se muestra en la Figura 1. Los resultados muestran que la secreción de mucina se incrementó 5,1 veces con respecto los ratones tratados con PBS en animales IL-13 tratadas (n = 3, p <0,005). Los datos muestran como media ± SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Reducción de MUC5AC y MUC5B mucinas en lavados HBE tratadas con lavados TDT. HBE se trataron con 0, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 y 100 mM de DTT a 37 ° C durante 30 minutES. La membrana se sondeó con un anticuerpo policlonal de conejo anti-MUC5B (verde) y un anticuerpo policlonal de ratón anti-MUC5AC (rojo). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Análisis cuantitativo de la mucina en gel de agarosa Mostrando desaparición de la banda multimérico en lavados HBE tratados con TDT. MUC5AC y la intensidad de la señal MUC5B se midió para cada carril del gel de mucina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo de transferencia de Western de mucina se describe en este vídeo combina técnicas convencionales utilizados en biología molecular para separar y transferir grandes macromoléculas, tales como ADN, con las técnicas habituales para la detección de proteínas, es decir., Inmunotransferencia. La misma técnica se podría aplicar para estudiar la biología de los glicosaminoglicanos complejos, tales como la descomposición de ácido hialurónico de alto peso molecular 18. Aunque esta técnica podría ser utilizada en una amplia gama de ensayos, el éxito de la transferencia Western de agarosa se basa en una multitud de pasos que requieren acciones meticulosos y dependientes del tiempo. Con el fin de maximizar el éxito, algunos pasos críticos deben ser revisadas.
Preparación de la muestra y la carga de gel son pasos críticos para obtener resultados precisos. Muestras de mucina-ricos, es decir., Esputos, son, por naturaleza, adherente a la tubería experimental, es decir., Puntas de pipeta, tubos de centrífuga, filtros. El uso de pipetas de desplazamiento positivo y pre-wetting puntas de pipeta puede facilitar la carga de material viscoelástico en los pocillos. Estas muestras requieren una atención especial debido a la flotabilidad aumentada y la rigidez de estos materiales. muestras concentradas (por encima de 5 mg / ml) se mal migrar a través del tamaño de los poros de un gel de agarosa al 0,8% y pueden requerir una dilución adicional y / o desnaturalización en hasta 6 M urea. Sin embargo, no correr muestras desnaturalizadas en cloruro de guanidinio (GuHCl) como guanidinio precipitará con SDS. Por lo tanto, las muestras almacenadas en GuHCl requieren una etapa de diálisis adicional. Para los estudios de estado no poliméricos, reducción parcial (DTT 0,5 mM durante 5 min) mejorará en gran medida la migración de las muestras concentradas (ver Figura 3).
la transferencia de la proteína a la membrana de nitrocelulosa es un paso clave para este protocolo y, si no se ejecuta con precisión, puede conducir a la membrana teñida, señal débil y falsos resultados cuantitativos. Las membranas de nitrocelulosa son delicadas y fácilmente contaminada ysiempre debe ser manejado con guantes y cuidado para evitar la unión inespecífica y daños. La colocación del gel sobre la membrana requiere una alineación precisa para generar un sellado hermético y evitar fugas de tampón de transferencia, lo que resultaría en manchas y reducir la eficiencia de transferencia. La formación de burbujas entre el gel y la membrana impedirá la transferencia de proteínas y debe evitarse cuidadosamente.
inmunodetección óptima depende de alta afinidad, anticuerpos de alta especificidad contra el esqueleto de la proteína de la mucina de destino. Recientemente, las tecnologías de nueva estrategia de inmunización, de diseño antígeno y detección ceden a un mayor éxito con la generación de anticuerpos de mucina y proporcionan nuevas herramientas para estudiar la biología de mucina. Con el fin de detectar dos mucinas diferentes en una sola mancha, es decir., MUC5AC y MUC5B, los dos anticuerpos primarios deben ser derivadas de diferentes especies huésped, es decir, conejo y cabra. Además, los anticuerpos secundarios tienen que ser etiquetados con fluoróforo diferentes al detectarse tanto en NM- 700 y 800 nm-canal.
la abundancia relativa de mucina y tamaño mucina se pueden cuantificar directamente con el software de imágenes. Señal de fluorescencia es directamente proporcional a la cantidad de mucina de destino, lo que permite la cuantificación de una amplia gama de muestras, a partir de (por ejemplo., Lavados de células) bajo a alto (por ejemplo., Esputo) mucina concentración. Sin embargo, absoluta concentración mucina requiere la purificación de las normas de mucina, que no se describen en este protocolo, ya que es un proceso largo y difícil que se describió en Abdullah et al. 19. Además, agarosa transferencia Western ofrece la posibilidad de realizar ensayos de desplazamiento de mucina para estudiar el proceso de polimerización o despolimerización. La movilidad electroforética de mucinas depende de su estado polimérico, es decir., La migración de grandes polímeros se retrasa, y puede cuantificarse usando el software de imágenes. Por ejemplo, agentes reductores inducirá una sh movilidadift de la señal que se correlaciona con cambios en las propiedades biofísicas de la mucosidad. Tal ensayo se puede usar para estudiar el proceso de multimerización mucina 13, sino también para poner a prueba los agentes farmacológicos dirigidos a que afecta a la red de mucina 11. Para concluir, la mucina transferencia Western de agarosa junto con el etiquetado de fluorescencia ha cambiado significativamente nuestro enfoque para estudiar las mucinas mediante la producción de altos datos cualitativos y cuantitativos.
Los problemas comunes de agarosa mucina Western Blot puede dar lugar a los siguientes resultados: baja intensidad de señal, de fondo y / o la aparición de punctates en la membrana. Varias estrategias de resolución de problemas se pueden usar para mejorar las imágenes de gel de mucina. la intensidad de la señal se puede aumentar mediante la carga de volúmenes de muestra más grandes y / o el aumento de las concentraciones de anticuerpos primarios y secundarios. Por lo general, la alta señal de fondo es atribuible al bloqueo y / o de lavado insuficiente, que puede ser resuelto mediante la realización de bloque más largo/ Lavado incubaciones, así como el uso optimizado tampones que están disponibles comercialmente de bloqueo. La aparición de punctates puede ser el resultado de las incubaciones de membrana extendidos a temperatura ambiente, lo que facilita el crecimiento bacteriano. Punctates también pueden ser causados por daño de la membrana de nitrocelulosa de la solución de remojo DTT (paso 4.1) y se pueden evitar mediante enjuague el gel de agarosa a fondo antes de la transferencia y / o disminuir la concentración de DTT a 5 mM.
La principal limitación de agarosa mucina transferencia Western es la falta de escalera de proteína para las proteínas de alto peso molecular y los estándares de mucina, lo que dificulta la cuantificación absoluta de mucina. La mayoría de los resultados publicados de geles de agarosa de mucina son estudios comparativos para el tamaño y la concentración. cromatografía de exclusión molecular con dispersión de luz junto con el índice de refracción es otra técnica utilizada para determinar el peso molecular precisa y la concentración de macromoléculas. Sin embargo, esta técnica es costosa unand carece de especificidad para las mucinas, por lo tanto, las medidas de otras moléculas grandes incluidas en las muestras, por ejemplo, ADN. Además, la cromatografía de exclusión por tamaño es incapaz de diferenciar entre tipos de mucina, es decir., MUC5AC frente MUC5B, y medidas y concentración media y el tamaño de la mezcla de mucinas incluido en una muestra dada.
Otras técnicas se pueden utilizar para estudiar las mucinas incluyendo la luz de ángulo múltiple dinámica y dispersión 1, centrifugaciones isopıcnica y de tipo zonal 6, microscopía electrónica, espectrometría de masas 1,7,8. Sin embargo, con la investigación de nuevos agentes farmacológicos dirigidos a moléculas de mucina, es imperativo desarrollar técnicas de laboratorio fiables para estudiar la biología de mucina. Agarosa mucina transferencia Western es una técnica relativamente fácil y de bajo costo que se puede utilizar para responder a las preguntas importantes con respecto a los procesos de mucina, es decir., Cambio en la mucina carga, tamaño y proporción. se utilizará Este ensayoen aplicaciones futuras para poner a prueba la eficacia del fármaco y la toxicidad de nuevas moléculas dirigidas a la eliminación de moco adherente en in vitro y en modelos in vivo.
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Disclosures
Los autores no tienen ningún conflicto de revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris Base | Sigma | T6060-1kg | 1 kg |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | ARK2183-1L | 1 L |
| EDTA | Sigma | EDS-100g | 100 g |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | 1 L |
| Bromophenol Blue | Sigma | 114391-5g | 5 g |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Sigma | L6026-50g | 50 g |
| 20x SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer | Promega | V4261 | 1 L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1 kg |
| Trisodium Citrate (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1kg | 1 kg |
| 10 mM DTT (dithiothreitol) | Sigma | D0632 | 25 g |
| Milk Powder | Saco | Instant non-fat dry milk | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500 ml |
| Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples) | Rockland antibodies and assays | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples) | UNC | ||
| H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples) | Santa Cruz | sc-20119 | 200 μg |
| 45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples) | Abcam | ab3649 | 100 μg |
| Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0.5 mg |
| Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0.5 mg |
| Electrophoresis Gel Box and Casting Tray | Owl Seperation Systems | ||
| Power Supply Box | Biorad | Model 200/20 | |
| Membrane Blotting Paper | Amersham | 10600016 | |
| Whatman Paper and Nitrocellulose membrane | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230 v | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey Infrared Fluorescence System | LI-COR Biosciences |
References
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