Abstract
Муцины, что сильно гликозилированные белки, выстилающих поверхности слизистой оболочки, эволюционировали в качестве ключевого компонента врожденной защиты, защищая эпителий от вторжения патогенов. Основная роль этих макромолекул, чтобы облегчить улавливание частиц и зазор, продвигая смазывание слизистой оболочки. В процессе синтеза белков, муцинов претерпевают интенсивную О-гликозилирование и мультимеризацию, что значительно увеличивают массу и размер этих молекул. Эти посттрансляционные модификации являются критически важными для вязкоупругих свойств слизи. В результате сложного биохимического и биофизической природы этих молекул, работая с муцин обеспечивает множество проблем, которые не могут быть преодолены с помощью традиционных методов анализа белков. Например, их высокой молекулярной массы предотвращает электрофоретической миграции через регулярные полиакриламидном геле и их липкая природа вызывает адгезию к экспериментальному НКТ. Однако, исследуя роль муцинах в области здравоохранения(Например., Поддержание целостности слизистых оболочек) и болезни (например., Hyperconcentration, mucostasis, рак) в последнее время приобрел интерес и муцинов исследуются в качестве терапевтической мишени. Лучшее понимание производства и функции макромолекул муцин может привести к новым фармацевтическим подходам, например, ингибиторы муцина экзоцитоза гранул и / или муколитических агентов. Таким образом, последовательные и надежные протоколы для исследования муцин биологии имеют решающее значение для научного прогресса. Здесь мы описываем обычные методы для разделения муцин макромолекул электрофореза в агарозном геле, белка-переносчика в нитроцеллюлозную мембрану, и детектировать сигнал с муцин-специфических антител, а также инфракрасный считыватель флуоресцентный гель. Эти методы широко применяются для определения муцина, мультимеризацию количественный и испытать влияние фармакологических соединений на муцин.
Introduction
Муцины обычно получают поверхности слизистых оболочек, выстилающих полости подвергаются воздействию внешней среды (например., Органов дыхания, пищеварения, репродуктивная, поверхности глазного яблока), а также внутренних органов (например, поджелудочной железы, желчного пузыря, молочных желез). Присутствие этих гликопротеинов поддерживает гидратации поверхности и образует физический барьер против патогенов. Несмотря на то, муцин производства имеет важное значение для здоровья слизистых оболочек, муцина hyperconcentration и / или отклоняющиеся свойства слизи может привести к непроходимости протоков, бактериальной колонизации и хроническое воспаление, которое может привести к повреждению тканей необратимым. Подобный каскад событий , наблюдаются при некоторых заболеваниях, например., Муковисцидоз 1, хронический средний отит 2 и цервиковагинальными инфекции 3. Поэтому важно понять роль муцинах в отношении здоровья и болезни и установить обычные протоколы для идентификации белков.
Встретиться, 19 генов муцины были идентифицированы и кодируют для крупных полипептидных цепей в диапазоне от 1200 (например., MUC1) до 22000 (например, MUC16) аминокислоты. Муцина семейство генов можно разделить на два подтипа: мембрана-ассоциированной муцинов, участвующих в клеточной сигнализации и защиты поверхности, а также гелеобразующих муцинов, отвечает за вязкоупругих свойств слизи гелей. Ассоциированных с мембранами муцинов в основном мономерный и прикрепляются к поверхности клеток посредством гидрофобного трансмембранный домен. В противоположность этому, гелеобразующих муцинов обладают несколькими фактора фон Виллебранда (ФВ) -как и богатых цистеином домены, которые имеют важное значение для формирования динамических полимерных сетей. Большие гликаны прикреплены к серина и треонина, распределенных по всему apomucin. Эти плотные О-связанных олигосахаридов , может достигать до 80% от молекулярной массы 4. Внутри- и межмолекулярные дисульфидные связи, соединяющие муцин мономеры обеспечивают целостность муцин геля Networк. В результате тяжелой гликозилирования и мультимеризацию, муцинов являются одними из крупнейших молекул в животном мире и не могут быть проанализированы с помощью стандартного гель-электрофореза с использованием обычного геля ДСН-ПААГ-электрофорез в полиакриламидном и стандартные белковые лестницы. Эти методы решения / отдельные белки с молекулярными массами ниже 250 кДа, в то время как муцин мономеры могут доходить до 2 МДА в случае MUC16. Тем не менее, с высокой молекулярной массе белка лестницы могут быть использованы для изучения малых мономеров муцина (т.е.., MUC1).
Различные методы могут быть применены для изучения муцин размер, конформации и взаимодействия. Традиционно, получение биохимических характеристик муцинов осуществляется путем муцина развязки через изопикнического градиенте плотности центрифугирования в денатурирующем буфере, а затем гель- фильтрационной хроматографии и эксклюзионной иммунологического (например., Слот - блоттинга) 5. Динамические и / или рассеяния света многоугольных предоставляют информацию о олигомерного состояния муцина богатых образцов <SUP> 1. Кроме того, скорость-зональному центрифугированию в сочетании с иммунологического и просвечивающей электронной микроскопии, как правило , используются для определения макромолекулярную конформацию муцинами 6. Масс - спектрометрия также используется для количественного определения муцины, обнаружения протеолитического расщепления и анализа олигосахаридов состава 1,7,8. Такие методы требуют больших затрат, отнимает много времени и часто требуют больших объемов и / или высокие концентрации образца. Методика описана в данном документе, то есть., Муцин разделение с помощью электрофореза, воспроизводима, низкая стоимость и может быть использовано в исследованиях с высокой пропускной способностью, чтобы обеспечить относительную муцина и количественного изучения полимера в сборе. Тем не менее, этот анализ требует высокого сродства, высокой специфичности муцина антитела , которые не могут быть доступны для редких муцинах (например., MUC19) или некоторые виды (например., Свинья, хорек).
Агарозном вестерн-блоттинга подходит для решения широкого спектра муцин богатых образцов с Concentraции в диапазоне от 50 мкг / мл (например., Cell оврагам) до 5 мг / мл (например., мокрота). Этот анализ был введен в 1990 - е годы и была проведена лишь в нескольких специализированных лабораториях 9,10. Изначально этот метод позволил выявить субпопуляции мономеров муцина в дыхательных путей человека 11,12 и подтвердили процесса олигомеризации в бокаловидных клеток, которая состоит из димеров в эндоплазматической сети с последующим димера мультимеризацию в аппарате 13 Гольджи. Совсем недавно, поколение поликлональных антител против мышиных муцинах способствовали исследования на небольших животных моделях (например., Муцин несовершенные, βENaC, OVA-оспариваемые модели мыши) и открыли новую область исследований для проведения доклинических исследований тестирования фармакологических препаратов , направленных на удаление слизи из легкие 14-17 лет. В результате растущего интереса к биологии муцина и поколение романа, более специфические антитела муцин, мы опишем hereiп методология для разделения муцины с помощью электрофореза в агарозном геле, передачи вакуума к нитроцеллюлозы и двухцветной обнаружения инфракрасного флуоресцентного.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка буфера для муцин гель Вестерн-блоттинга
- Готовят 1 литр 50x TAE (Трис-ацетат-ЭДТА) буфере.
- В 700 мл дистиллированной воды (дН 2 O) добавляют 242 г трис - основания (0,4 м), 57,1 г ледяной уксусной кислоты (взвешивать жидкость) (0,2 М) и 14,61 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (50 мМ).
- Отрегулируйте рН до 8,0 и сделать объем до 1 л с дН 2 O.
- Приготовьте 10 мл 10-кратного буфера для загрузки.
- Приготовьте 5 мл буфера 1х ТАЕ. Для этого добавляют 5 мл глицерина (50%), 25 мг бромофенолового синего (0,25%), и 100 мг додецилсульфата натрия (SDS) (1%).
- Подготовьте 2 литра буфера 20x натрия физиологический раствор цитрата (SSC).
- В 1,5 л дН 2 O, добавляют 350,6 г NaCl (3 М) и 176,4 г тринатрийцитрата (Na 3 C 6 H 5 O 7) (0,3 М). Отрегулируйте рН до 7,0 и составляют объем до 2 л с дН 2 O.
- Готовят 1 л буфера 1 x TAE-0,1% SDS.
- Добавьте 20 мл 50x TAE до 980 мл дН 2 O. Добавляют 1 г SDS, чтобы сделать 0,1% раствора SDS-ТАЕ.
2. TAE-SDS агарозном геле Подготовка
- (Т. Е, 150 мл) Налейте достаточный объем 1x TAE-0,1% SDS буфера в Microwavable коническую колбу , чтобы сделать 5 - мм толщиной гель 7. Добавить 0,8% (1,2 г) в агарозном порошка.
- Микроволновая колбу в 30-секундными интервалами с прерывистым закрученной до агарозном полностью не растворится (обычно 1 - 3 мин). Используйте горячие подушечки для рук во время этого процесса. Будьте осторожны с кипению в то время как закрученной.
- Дайте агарозу раствор остыть в течение 5 - 10 мин. Примечание: Решение агарозы будет готов заливать, когда дно колбы можно оставить на ладони в течение 5 сек.
- Подготовить электрофорез литья лоток (10 х 15 см), запечатывая края с лентой и размещения хорошо расчесать в положении.
- Налейте раствор агарозы медленно в тон литье лоток, чтобы избежать образования пузырьков. Удалите пузырьки с помощью пипетки. Подождите, пока гель для охлаждения и полностью затвердевает. После затвердевания удалить гребень медленно, чтобы избежать разрушения скважин с помощью отсоса и удалите ленту с краев лотка.
- Поместите агарозный гель в коробку геля и заполнить блок электрофорез с 1x TAE-буфера 0,1% SDS, пока гель не будет полностью покрыта.
3. Образец Загрузка и электрофорез Разделение
Примечание: В нашей лаборатории, мы обычно используем образцы от мыши, так и человека, в том числе БАЛ (БАЛ, оба вида), клеточные стирок из бронхиальных эпителиальных клеток человека (HBE) и слюне и мокроте образцов человека. Образцы могут быть денатурированный в 6 М мочевине при сборе или хранить в течение коротких периодов времени (6 ч) путем добавления ингибитора протеиназы коктейль.
- Приготовьте образцы для загрузки путем добавления 10% красителем для каждого образца (то есть., 30 мкл образца и 3мкл красителя). Однородный образцы с помощью пипетки вверх и вниз. Кратко спином вниз трубы при 5000 оборотов в минуту для сбора капель.
- Тщательно загрузить равный объем образцов в лунки.
- Предварительно влажные советы и / или использовать положительные пипеток смещения, чтобы облегчить загрузку высоковязких образцов. Медленно аспирата 80 - 90% раствора образца красителя (т.е. 27 - 30 мкл) , чтобы избежать пузырей пипетирования.
- Медленно загрузки в нижней части лунки и постепенно переместить вверх кончик пипетки. Для образцов, которые остаются прикрепленными к кончику пипетки, обойтись под углом 45 ° и вытянутые прямо над колодцем или осторожно использовать сторону колодца, чтобы разорвать тягучий слизь. Не перегружайте скважин.
- Подключите электроды из коробки гель-электрофорез генератора мощности. Убедитесь , что электроды подключены правильно (то есть., Красный провод подключен к положительному выходу генератора) , чтобы отрицательно заряженные муцины бежать к положительным электрод.
- Выполнить гель при 80В в течение 90 мин для одного геля расческой, или 60 - 75 мин в течение двойного геля гребенки для предотвращения перекрытия между двумя рядами.
- Включите генератор питание и отсоедините электроды от источника питания.
- Осторожно удалите гель из коробки гель с одной стороны, по обе стороны лотка для литья, чтобы обеспечить гель остается на месте.
4. Уменьшить агарозном геле для эффективного муцин Transfer
- Аккуратно положите плоскую гель в стеклянной таре. Промыть гель с дН 2 O , чтобы удалить следы буфера ТАЕ-SDS.
- Приготовьте 1 литр буфера 4x SSC путем добавления 200 мл 20x SSC в 800 мл дН 2 O. Сделать 200 мл 10 мМ дитиотреитола (DTT) 4x SSC раствора добавлением 309 мг свежего DTT в 200 мл буфера 4x SSC.
- Замочить гель с DTT-4x SSC буфером и крышкой. Осторожно покачайте в течение 20 мин (10 оборотов в минуту). Промойте гель с DTT-свободным буфером 4x SSC.
- Подготовить вакуумный папье для передачи.
- Аккуратно вырежьте нитроцеллюлозную мембрану на размеры немного шире , чем гель (то есть., 10 х 15 см).
- Влажные пористый мат с дН 2 O и поместите его гладкой стороной вверх в промокашки.
- Мокрый нитроцеллюлозную мембрану с ДТТ свободной 4x SSC буфера и поместить его в центре пористого мата.
- Накройте пористый мат с резиновой прокладкой, в результате чего отверстие прокладки точно совмещенным с нитроцеллюлозной мембраной. Если пористый мат еще виден, тщательно отрегулировать мембрану для обеспечения нет зазора остается между прокладкой и мембраной.
- Осторожно поместите агарозу на верхней стороне мембраны. Обеспечить гель образует герметичное уплотнение с прокладкой и лунки геля расположены на мембране для переноса.
- Во избежание образования пузырьков между мембраной и гелем. Для того, чтобы минимизироватьобразование пузырей, впрыснуть несколько капель 4x SSC буфера на мембране и сдвиньте гель сверху вниз, чтобы смыть любые образовавшиеся пузырьки. Избегайте перемещения геля на мембране, как белки начнут немедленно промокните.
- Осторожно закрывают гель с буфером 4x SSC.
- Начните муцин передачу путем всасывания.
- Включите вакуумный папье и установите давление на 40 - 50 мбар. Добавьте несколько капель буфера 4x SSC на геле каждые 5 - 10 минут, чтобы предотвратить гель от высыхания. Запуск передачи в течение 90 мин. Дополнительно: После завершения, отметьте лунки карандашом для ориентации.
- Утилизацию геля и извлечения нитроцеллюлозную мембрану с использованием пластиковых пинцет на краю мембраны.
6. Мембрана блокировка и обнаружение
- Промыть мембрану сразу с 1x фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). Не позволяйте мембраны высохнуть.
- Погрузите мембрану в 50 мл 3% -ного молока-PBS блокирующего буфера и место на роcker при комнатной температуре в течение 1 часа. После инкубации, удалите блокирующий буфер.
- Погрузите мембрану в 1% растворе первичного антитела молока PBS. Инкубируйте мембраны в растворе первичного антитела в течение ночи на качалке при температуре 4 ° С. После инкубации, вылейте раствор первичного антитела. Развести первичных антител к соотношении 1: 2000 раствора антител в блокирующий буфер. Примечание: Для получения образцов, происходящих из мышей, мы используем UNC 222 кролика против Muc5b и козы против зеленого флуоресцентного белка (GFP). Для образцов, поступающих от людей, мы используем H300 анти-MUC5B и 45M1 анти-MUC5AC первичных антител.
- Промыть мембрана 3 раза PBS в течение 10 мин на качалку.
- Погрузите мембрану в 1% растворе вторичного антитела молочно-PBS. Разведите вторичные антитела к соотношении 1: 7500 раствора антител к блокирующим буфером и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч на качалку (например, 700 анти-кролик и 680 анти-козел.). Защита от света путем инкубирования в непрозрачном сотрудничествеntainer. Отменить решение вторичного антитела после 1 часа.
- Промыть мембрана 3 раза PBS в течение 5 мин. Промойте мембрану с дН 2 O , чтобы удалить соль.
- Прочитайте мембрану на инфракрасной системе флуоресценции в соответствии с инструкциями изготовителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы показываем репрезентативные результаты муцина экспрессии после электрофореза в агарозном геле в БАЛ из легких мышей (рисунок 1). В этом примере мы использовали агарозный гель, чтобы показать положительную регуляцию муцина производства следующих IL-13 обработки мышиной модели Тд-Muc5ac. Вестерн - блот показывает визуальное представление муцина выражение, которое может быть использовано для количественного анализа мультимеру или интенсивности сигнала полосы мономера (рисунок 2). Этот метод также может быть использован, чтобы показать экспрессию муцин в смывах человека бронхиальные эпителиальные (HBE) клеток и образцов мокроты человека. Этот метод может быть использован, чтобы показать снижение муцинами после лечения восстановителей. Мы показываем репрезентативные результаты от HBe стирок , обработанных с увеличением концентрации DTT (рисунок 3). Мы количественно потерю интенсивности сигнала мультимеров следующий муцина восстановлением обработкой восстанавливающим возрастант (Рисунок 4).
Рисунок 1. Положительная регуляция муцина производства После IL-13 Лечение с Tg-Muc5ac / зеленого флуоресцентного белка (GFP) модели мыши Мыши сверхэкспрессией Muc5ac с меткой GFP закапывали с PBS. (-) Или IL-13 (+) , чтобы побудить бокаловидных клеточная метаплазия и увеличение производства муцина в легких (п = 3 в каждой группе). БАЛ собирали и разделяли с помощью муцина агарозном Вестерн-блоттинга. Мембрана зондировали с кроличьей поликлональной анти-Muc5b (красный) и козьи поликлональные анти-GFP (зеленый). Инфракрасная система может быть использована , чтобы показать результаты в виде наложения или в качестве одного канала с возможностью изменения изображения в черно-белое. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Количественный анализ муцин в агарозном геле Показывается повышающая регуляция муцин секрецией IL-13-обработанных мышей. Интенсивность сигнала Muc5b измеряли для каждой полосы геля муцина , показанного на фиг.1. Результаты показывают , что муцин секрецию вырос в 5,1 раза по сравнению PBS-обработанных мышей в IL-13 обработанных животных (п = 3, р <0,005). Данные представлены как средние значения ± SEM. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Снижение MUC5AC и MUC5B Муциньш в HBe стирок леченных с промывками ДТТ. HBe обрабатывали 0, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 и 100 мМ DTT при 37 & deg ; С в течение 30 Minutэс. Мембрана зондировали с кроликом поликлональных анти-MUC5B (зеленый) и поликлонального мыши анти-MUC5AC (красный). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Количественный анализ муцин агарозном геле показывает на исчезновение мультимерный полосы в HBe промывок , обработанных DTT. MUC5AC и интенсивности сигнала MUC5B измеряли для каждой полосы геля муцина. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол муцина Вестерн - блоттинга , описанного в этом видео сочетает в себе традиционные методы , используемые в молекулярной биологии для разделения и передачи больших макромолекулы, такие как ДНК, с регулярными методами для обнаружения белка, то есть., Иммуноблоттинга. Тот же метод может быть применен для изучения биологии сложных гликозаминогликанов, например, при пробое сверхвысокой молекулярной массы гиалуроновой кислоты 18. Хотя этот метод может быть использован в широком спектре анализов, успешно агарозы вестерн-блоттинга опирается на множество шагов, которые требуют тщательные и зависящие от времени действия. В целях максимального успеха, некоторые важные шаги должны быть пересмотрены.
Подготовка проб и гель загрузки являются критически важными шагами для получения точных результатов. Муцин-богатые образцы, то есть., Мокрота, являются, по своей природе, прилегающего к экспериментальной трубки, то есть., Пипеткой кончиков, центрифужные пробирки, фильтры. Использование положительных пипец перемещения и обработки перед транспортировкой-wetting пипеткой советы могут облегчить загрузку вязкоупругого материала в лунки. Такие образцы требуют особого внимания в связи с повышенной плавучести и клейкость этих материалов. Концентрированные образцы (выше 5 мг / мл) будет плохо мигрируют через поры размером агарозном геле 0,8% и может потребовать дальнейшего разбавления и / или денатурации в до 6 М мочевины. Тем не менее, во избежание запуска образцов денатурированного в гуанидинийхлорида (GuHCl) как гуанидиниевое будет осаждаться с SDS. Следовательно, образцы, хранящиеся в GuHCl требуют дополнительной стадии диализа. Для исследования неполимерными состояния, частичное восстановление (0,5 мМ DTT в течение 5 мин) позволит значительно улучшить миграцию концентрированных проб (смотри рисунок 3).
переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану является ключевым шагом для этого протокола, и, если не выполняется с точностью, может привести к окрашенном мембраны, слабый сигнал и ложных количественных результатов. Нитроцеллюлозные мембраны являются тонкими и легко загрязняется ивсегда следует работать в перчатках и ухода, чтобы избежать неспецифического связывания и повреждения. Размещение геля на мембрану требует точного выравнивания для создания герметичного уплотнения и предотвратить утечку передачи буфера, которое может привести к пятнам и снижению эффективности передачи. Образование пузырей между гелем и мембраной предотвратит передачу белка и его следует тщательно избегать.
Оптимальная иммунологического опирается на обладающими высоким сродством и высокой специфичности антител против белка основной цепи мишени муцина. В последнее время новая стратегия иммунизации, дизайн антиген и скрининговые технологии дают к увеличению успеха с поколением муцина антител и предоставили новые инструменты для изучения муцин биологии. Для того чтобы обнаружить два различных муцины на одном блоте, то есть., MUC5AC и MUC5B, две первичные антитела должны быть получены из различных видов хозяев, т.е. кролика и козы. Кроме того, вторичные антитела должны быть помечены различными флуорофораs, чтобы быть обнаружены и в 700 NM- и 800 нм-канала.
Относительное обилие муцин и размер муцин может быть количественному непосредственно с программным обеспечением обработки изображений. Флуоресцентный сигнал прямо пропорционален количеству целевой муцина, что позволяет количественно оценить широкого круга образцов, от низкой (например., Cell смывки) до высокой (например., Мокрота) муцина концентрации. Тем не менее, абсолютная концентрация муцина требует очистки муциновых стандартов, которые не описаны в данном протоколе , как это длительный и сложный процесс , который был описан в Абдаллой и др. 19. Кроме того, в агарозном Вестерн-блоттинга обеспечивает возможность проведения анализов муцин сдвига для изучения процесса полимеризации или деполимеризации. Зависимость электрофоретической подвижности муцинами зависит от их полимерного состояния, то есть., Миграция крупных полимеров задерживается, и может быть определена количественно с помощью программного обеспечения визуализации. Например, восстановителей будет вызывать подвижность шIFT сигнала, который коррелирует с изменением биофизических свойств слизи. Такой анализ может быть использован для изучения муцин процесса 13 мультимеризация но и испытать фармакологические препараты , направленные на изменение муцина сети 11. В заключение, муцина агарозы Вестерн-блоттинга в сочетании с маркировкой флюоресценции существенно изменила наш подход к изучению муцины путем получения высоких качественных и количественных данных.
Общие проблемы с агарозы муцина Вестерн-блоттинга может привести к следующим результатам: низкой интенсивности сигнала, высокого фона и / или появление пунктатов на мембране. Существует несколько стратегий по устранению неисправностей могут быть использованы для улучшения муцин изображений геля. Интенсивность сигнала может быть увеличена путем загрузки больших объемов образцов и / или увеличение концентрации первичных и вторичных антител. Как правило, высокий фоновый сигнал обусловлен недостаточной блокированием и / или промывок, которые могут быть решены путем выполнения более длинный блок/ Мыть инкубацию, а также с оптимизированной блокировании буферов, которые являются коммерчески доступными. Появление пунктатов может быть результатом протяженных мембранных инкубирования при комнатной температуре, что способствует росту бактерий. Пунктатов также могут быть вызваны повреждением нитроцеллюлозные мембраны из раствора DTT вымачивания (этап 4.1), и ее можно избежать путем промывки агарозу тщательно перед передачей и / или уменьшением концентрации DTT до 5 мМ.
Основным ограничением агарозы муцина Вестерн-блоттинга является отсутствие белка лестницы для высокой молекулярной массы белков и муцина стандартов, что затрудняет абсолютную муцин количественной оценки. Большая часть результатов, опубликованных с муциновых агарозных гелей представляют собой сравнительные исследования по размеру и концентрации. Гель-проникающей хроматографии с рассеянием света в сочетании с показателем преломления является другой метод обычно используется для определения точного молекулярного веса и концентрации макромолекул. Тем не менее, этот метод является дорогостоящимй испытывает недостаток специфичности для муцин, следовательно, меры и другие крупные молекулы , включенные в образцах, например, ДНК. Кроме того, вытеснительной хроматографии не способен различать между муцин типов, то есть., MUC5AC против MUC5B, а меры и средняя концентрация и размер из смеси муцин , включенных в данном образце.
Другие методы могут быть использованы для изучения муцины включая динамические и многоракурсный рассеяния света 1, изопикнического и скорости-зонального центрифугировани 6, электронной микроскопии, масс - спектрометрии 1,7,8. Однако при исследовании новых фармакологических агентов, ориентированных молекул муцина, крайне важно разработать надежные лабораторные методы для изучения муцин биологии. Агарозном муцина Вестерн - блоттинга является относительно простой и недорогой метод , который может быть использован для ответа на важные вопросы относительно муциновых процессов, то есть., Изменение в муцина бремени, размер и соотношение. Этот анализ будет использоватьсяв будущих приложениях , чтобы проверить эффективность лекарственного средства и токсичности для новых молекул , направленных на устранение прилипшие слизи в в пробирке и в естественных условиях модели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никакого конфликта раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris Base | Sigma | T6060-1kg | 1 kg |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | ARK2183-1L | 1 L |
| EDTA | Sigma | EDS-100g | 100 g |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | 1 L |
| Bromophenol Blue | Sigma | 114391-5g | 5 g |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Sigma | L6026-50g | 50 g |
| 20x SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer | Promega | V4261 | 1 L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1 kg |
| Trisodium Citrate (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1kg | 1 kg |
| 10 mM DTT (dithiothreitol) | Sigma | D0632 | 25 g |
| Milk Powder | Saco | Instant non-fat dry milk | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500 ml |
| Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples) | Rockland antibodies and assays | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples) | UNC | ||
| H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples) | Santa Cruz | sc-20119 | 200 μg |
| 45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples) | Abcam | ab3649 | 100 μg |
| Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0.5 mg |
| Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0.5 mg |
| Electrophoresis Gel Box and Casting Tray | Owl Seperation Systems | ||
| Power Supply Box | Biorad | Model 200/20 | |
| Membrane Blotting Paper | Amersham | 10600016 | |
| Whatman Paper and Nitrocellulose membrane | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230 v | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey Infrared Fluorescence System | LI-COR Biosciences |
References
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure. J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Preciado, D., et al. MUC5B Is the predominant mucin glycoprotein in chronic otitis media fluid. Pediatr Res. 68 (3), 231-236 (2010).
- Wang, Y. Y., et al. IgG in cervicovaginal mucus traps HSV and prevents vaginal herpes infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1036-1044 (2014).
- Linden, S. K., Sutton, P., Karlsson, N. G., Korolik, V., McGuckin, M. A. Mucins in the mucosal barrier to infection. Mucosal Immunol. 1 (3), 183-197 (2008).
- Thornton, D. J., et al. Mucus glycoproteins from 'normal' human tracheobronchial secretion. Biochem J. 265 (1), 179-186 (1990).
- Kesimer, M., Makhov, A. M., Griffith, J. D., Verdugo, P., Sheehan, J. K. Unpacking a gel-forming mucin: a view of MUC5B organization after granular release. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (1), L15-L22 (2010).
- Kesimer, M., Sheehan, J. K. Mass spectrometric analysis of mucin core proteins. Methods Mol Biol. 842, 67-79 (2012).
- van der Post, S., Thomsson, K. A., Hansson, G. C. Multiple enzyme approach for the characterization of glycan modifications on the C-terminus of the intestinal MUC2mucin. J Proteome Res. 13 (12), 6013-6023 (2014).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Methods Mol Biol. 32, 119-128 (1994).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Mol Biotechnol. 5 (2), 171-176 (1996).
- Sheehan, J. K., et al. Physical characterization of the MUC5AC mucin: a highly oligomeric glycoprotein whether isolated from cell culture or in vivo from respiratory mucous secretions. Biochem J. 347 Pt 1, 37-44 (2000).
- Thornton, D. J., Howard, M., Khan, N., Sheehan, J. K. Identification of two glycoforms of the MUC5B mucin in human respiratory mucus. Evidence for a cysteine-rich sequence repeated within the molecule. J Biol Chem. 272 (14), 9561-9566 (1997).
- Sheehan, J. K., et al. Identification of molecular intermediates in the assembly pathway of the MUC5AC mucin. J Biol Chem. 279 (15), 15698-15705 (2004).
- Ehre, C., et al. Overexpressing mouse model demonstrates the protective role of Muc5ac in the lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16528-16533 (2012).
- Livraghi, A., et al. Airway and lung pathology due to mucosal surface dehydration in {beta}-epithelial Na+ channel-overexpressing mice: role of TNF-{alpha} and IL-4R{alpha} signaling, influence of neonatal development, and limited efficacy of glucocorticoid treatment. J Immunol. 182 (7), 4357-4367 (2009).
- Martino, M. B., et al. The ER stress transducer IRE1beta is required for airway epithelial mucin production. Mucosal Immunol. 6 (3), 639-654 (2013).
- Nguyen, L. P., et al. Chronic exposure to beta-blockers attenuates inflammation and mucin content in a murine asthma model. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (3), 256-262 (2008).
- Papakonstantinou, E., et al. COPD exacerbations are associated with pro-inflammatory degradation of hyaluronic acid. Chest. , (2015).
- Abdullah, L. H., Wolber, C., Kesimer, M., Sheehan, J. K., Davis, C. W. Studying mucin secretion from human bronchial epithelial cell primary cultures. Methods Mol Biol. 842, 259-277 (2012).
