Abstract
粘蛋白，重糖基化蛋白质衬粘膜表面，已经通过保护上皮细胞对入侵的病原体演变为先天防御的重要组成部分。这些大分子的主要作用是促进微粒收集和清除，同时促进粘膜的润滑。期间蛋白质的合成，粘蛋白经受激烈O-糖基化和多聚化，从而显着地提高这些分子的质量和尺寸。这些翻译后修饰对于粘液的粘弹性能是至关重要的。作为这些分子的复杂的生化和生物物理性质的结果，与粘蛋白的工作提供了不能由常规的蛋白质分析方法来克服许多挑战。例如，它们的高分子量防止电泳迁移通过普通的聚丙烯酰胺凝胶和它们的粘性性质导致密合性试验管。然而，调查在健康粘蛋白的作用（ 例如 ，保持粘膜完整性）和疾病（ 例如 ，高含沙，mucostasis癌症）最近获得利益和粘蛋白正在研究作为治疗靶。更好地理解的生产和粘蛋白大分子的功能可能会导致新的药物的方法， 例如 ，粘蛋白颗粒胞吐和/或粘液溶解剂的抑制剂。因此，一致和可靠的协议进行调查粘蛋白生物学是科学进步的关键。这里，我们描述的常规方法使用琼脂糖凝胶分离通过电泳粘蛋白大分子，转移蛋白成硝酸纤维素膜，并检测与特定的粘蛋白抗体信号以及红外荧光凝胶阅读器。这些技术广泛适用于确定粘蛋白定量，多聚化，并测试药理化合物对粘蛋白的影响。
Introduction
粘蛋白是由线暴露于外部环境的腔粘膜表面通常产（ 例如 ，呼吸，消化，生殖道，眼表面）以及内部器官（ 如 ，胰腺，胆囊，乳腺）。这些糖蛋白的存在下保持表面水合，并形成对病原体的物理屏障。虽然粘蛋白生产至关重要粘膜健康，粘蛋白高含沙和/或异常的粘液属性可导致管阻塞，细菌定植和慢性炎症，这可能会导致不可逆的组织损伤。事件的类似的级联在几种疾病中观察到， 例如 ，囊性纤维化1，慢性中耳炎2和宫颈阴道感染3。因此，要理解在健康和疾病粘蛋白的作用，并建立常规方案进行蛋白质鉴定是很重要的。
至今，19粘蛋白的基因已被确定和编码为大的多肽链从1200（ 例如 ，MUC1）至22,000（ 例如 ，MUC16）氨基酸。的粘蛋白基因家族可以分为两个亚型：所述膜相关粘蛋白，参与细胞信号传导和表面屏蔽，和凝胶形成粘蛋白，负责粘液凝胶的粘弹性性质。膜结合粘蛋白大多单体并经由疏水跨膜结构域附着于细胞表面。相反，凝胶形成粘蛋白具有这对于动态聚合物网络的形成至关重要几个血管性血友病因子（vWF）样和富含半胱氨酸的结构域。大聚糖连接到丝氨酸和整个核粘蛋白分布的苏氨酸残基。这些稠密O-连接的寡糖可以向多达分子量4的80％。分子内和分子间连接的粘蛋白单体二硫键确保粘蛋白凝胶BP网络在的完整性ķ。重糖基化和多聚化的结果是，粘蛋白是在动物世界上最大的分子间，并且不能由标准凝胶电泳使用常规的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶和标准蛋白质梯进行分析。这些方法解决与分子量大于250 kDa的低/分离蛋白质，而黏蛋白单体可在MUC16的情况下可达200丙二醛。然而，高分子量蛋白质梯可以用于研究小粘蛋白单体（ 即 ，MUC1）。
多种技术可用于研究粘蛋白的大小，构象和相互作用。传统上，粘蛋白的生化特性是通过在变性缓冲粘蛋白通过等密度密度梯度离心分离来完成，接着大小排阻层析和免疫检测（ 例如 ，狭线印迹法）5。动态和/或多角度光散射提供丰富的粘蛋白样品的寡聚状态信息<SUP> 1。此外，加上免疫检测和透射电子显微镜率区带离心通常用于确定粘蛋白6的大分子构象。质谱还用于量化粘蛋白，检测蛋白水解裂解和分析寡糖组合物1,7,8。这样的技术是昂贵的，耗时的，并且通常需要大量和/或高浓度的样品。本文中所描述的方法， 即 ，通过电泳粘蛋白的分离，是可重复的，成本低，能以高通量研究可以用于提供相对粘蛋白定量，并调查聚合物组件。然而，该测定需要可能不提供对稀有粘蛋白高亲和性，高特异性粘蛋白抗体（ 例如 ，MUC19）或某些物种（ 例如 ，猪，雪貂）。
琼脂糖免疫印迹法适用于解决各种与concentra丰富的粘蛋白样品系统蒸发散范围从50微克/毫升（ 例如 ，细胞洗涤）至5毫克/毫升（ 例如 ，痰）。此法是在20世纪90年代推出，只在少数专业的实验室进行9,10。最初，该技术有助于确定在人类呼吸道分泌物11,12粘蛋白单体的亚群，并确认在杯状细胞的低聚方法，其中包括在内质网随后在高尔基体13二聚体多聚二聚体形成的。最近，针对鼠粘蛋白多克隆抗体的产生，促进了小动物模型的研究（ 如 ，粘蛋白缺乏，βENaC，OVA挑战的小鼠模型），打开一个新的研究领域的临床前研究，旨在从去除黏液检测药物化合物肺部14-17。作为在粘蛋白生物学和新颖的产生越来越大的兴趣的结果，更具体的粘蛋白抗体，我们描述herein中的方法，以通过琼脂糖凝胶电泳，真空转移到硝化纤维素和双色红外荧光检测分离粘蛋白。
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Protocol
1.准备缓冲器，用于粘蛋白凝胶进行蛋白质印迹
- 制备1升50×TAE（Tris-乙酸-EDTA）缓冲液。
- 在将700ml蒸馏水（DH 2 O）添加242克Tris碱（0.4 M）的57.1克冰醋酸的（称量液体）（0.2M）和14.61克乙二胺四乙酸（EDTA）（50毫米）的。
- 调节pH至8.0并定容至1升卫生署2 O.
- 准备10毫升10X样缓冲液。
- 准备5毫升1X TAE缓冲。要做到这一点，添加5毫升甘油（50％），25毫克的溴酚蓝（0.25％），而100毫克的十二烷基硫酸钠（SDS）（1％）的。
- 制备2升20×钠柠檬酸盐（SSC）缓冲器。
- 1.5升的dh 2 O，加350.6克氯化钠（3M）和176.4克柠檬酸三钠（钠3 C 6 H 5 O 7）（0.3米）。调节pH至7.0，使音量2升与卫生署2 O.
- 1升1X TAE-0.1％SDS缓冲。
- 20毫升50X TAE添加到980毫升卫生署2 O的添加1克SDS，使0.1％的SDS-TAE溶液。
2. TAE-SDS琼脂糖凝胶的制备
- （ 即 ，150毫升）中倒入足量的可微波Erlenmeyer烧瓶1×TAE-0.1％SDS缓冲液，以使5 - 6毫米厚的凝胶。加0.8％（1.2克）的琼脂糖粉末。
- 在30秒的间隔间歇旋转，直到琼脂糖微波瓶中完全溶解（通常为1 - 3分钟）。在此过程中使用热手垫。小心爆发沸腾，而纷飞。
- 允许琼脂糖溶液冷却为5 - 10分钟。注意：琼脂糖溶液将准备倾倒时可以在手掌被放置5秒将烧瓶底部。
- 由边缘用胶带封好放入梳理位置准备电泳铸造托盘（10×15厘米）。
- 在T慢慢倒入琼脂糖溶液他铸造托盘，以避免气泡的形成。删除使用一个枪头气泡。等待凝胶冷却并完全固化。一旦固化，取出梳子缓慢，以避免由吸入压扁井和从托盘的边缘移除胶带。
- 将琼脂糖凝胶放入胶框，并用1X TAE-0.1％SDS缓冲液填充电泳单元，直到凝胶完全覆盖。
3.样和电泳分离
注意：在我们的实验室，我们通常使用来自小鼠和人类样品，包括支气管肺泡灌洗液（BALF;这两个物种），细胞洗液从人支气管上皮细胞（HBE），和人的唾液和痰样品。样品可以在6M尿素后收集变性或通过添加蛋白酶鸡尾酒抑制剂贮存的时间（6小时）短周期。
- 通过加入上样染料的10％至每个样品（ 即准备用于装载样品，样品和3的30微升染料微升）。通过上下吹打均匀样品。简而言之降速管在5000转，收集液滴。
- 谨慎地装载样品的等体积入井。
- 预湿的提示和/或使用正位移移液管，以促进高粘度样品的载荷。慢慢地吸80 -样品-染料溶液的90％（ 即 27 - 30微升），以避免移液气泡。
- 慢慢加载在孔的底部，并逐渐向上移动吸管尖。为保持连接到移液管尖的样品，取45°角和细长直上方的井或轻轻使用井的侧打破粘性粘液。不要超载井。
- 从凝胶方框电泳发电机连接的电极。确保电极正确地连接（ 即 ，插入到发生器的正输出铅丹），以允许带负电荷的粘蛋白朝着正运行电极。
- 运行在80伏特的凝胶90分钟为一个单梳凝胶，或60 - 75分钟为一个双梳凝胶，以防止两行之间的重叠。
- 关闭发电机电源并从电源断开电极。
- 小心地用一只手去除铸件托盘的任一侧从凝胶盒的凝胶，以确保凝胶保持在原位。
4.减少琼脂糖凝胶进行有效的粘蛋白转移
- 小心地将凝胶平在一个玻璃容器中。冲洗与卫生署2 O凝胶去除TAE-SDS缓冲的痕迹。
- 通过加入200ml 20×SSC的至800ml卫生署2 O的1升4×SSC缓冲液的使200毫升的10mM二硫苏糖醇（DTT）4倍的SSC溶液中加入309毫克新鲜的DTT入200ml 4倍的SSC缓冲液中。
- 用浸泡DTT-4X SSC缓冲和覆盖凝胶。轻摇20分钟（每分钟10圈）。冲洗DTT无4X SSC缓冲液凝胶。
- 准备真空记事簿转移。
- 在尺寸比凝胶（ 即 ，10×15厘米）稍宽小心切割硝酸纤维素膜上。
- 与卫生署2 O湿多孔垫，并把它光滑的正面朝上的记事簿。
- 用DTT - 自由4×SSC缓冲液湿硝酸纤维素膜，并将其放置在所述多孔垫的中心。
- 盖与橡胶垫圈的多孔垫，留下与硝化纤维素膜精确对准的垫圈的开口。如果多孔垫仍是可见的，仔细调整膜，以确保没有差距仍然垫圈和膜之间。
- 小心地将琼脂糖凝胶在膜的顶部。确保凝胶形式与垫圈紧密的密封和凝胶的孔被定位在膜上转让
- 避免在膜和凝胶之间的气泡的形成。为了尽量减少形成气泡，喷射4×SSC中的几滴缓冲在膜和从顶部滑动凝胶底部冲洗任何形成的气泡。避免对膜动凝胶蛋白质将立即开始涂抹。
- 仔细覆盖4X SSC缓冲液凝胶。
- 首先吸粘蛋白转移。
- 打开真空吸墨纸ON，并设置压力40 - 50毫巴。添加4倍SSC缓冲液几滴凝胶上每5 - 10分钟，以防止凝胶干燥。运行转印90分钟。可选：完成后，用标记定向铅笔井。
- 凝胶的处置，并使用在膜边缘的塑料镊子检索硝酸纤维素膜上。
6.膜封闭和检测
- 用1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）立即冲洗膜。不要让膜干燥。
- 浸没膜入50ml 3％乳的PBS上的滚装封闭缓冲液和地点克尔在室温下1小时。温育后，弃去封闭缓冲液。
- 浸泡在1％牛奶的PBS初级抗体溶液膜。孵育在4℃下摇杆过夜初级抗体溶液的膜。温育后，弃去第一抗体溶液。稀释的初级抗体以1：的抗体溶液2000比封闭缓冲液。注意：对于从小鼠始发样品，我们使用UNC 222兔抗MUC5B和山羊抗 - 绿色荧光蛋白（GFP）。从人类起源的样品中，我们使用H300抗MUC5B和45M1抗MUC5AC初级抗体。
- 洗膜3用PBS时间上的摇杆10分钟。
- 浸泡在1％牛奶的PBS二级抗体溶液膜。稀释二级抗体以1：的抗体溶液7500比封闭缓冲液，并在室温孵育一摇杆1小时（ 例如 ，700抗兔和680抗山羊）。通过在非透明共孵育避光ntainer。丢弃后1小时的二级抗体溶液。
- 洗膜3用PBS次，每次5分钟。与卫生署2 O冲洗膜去除盐分。
- 根据制造商的指令的红外荧光的系统上读取该膜。
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Representative Results
我们表明以下从小鼠的肺（ 图1）在BALF中琼脂糖凝胶电泳粘蛋白表达的代表性结果。在这个例子中，我们使用了琼脂糖凝胶显示粘蛋白产生以下的IL-13治疗的Tg组织Muc5ac小鼠模型的上调。 Western印迹显示了粘蛋白的表达，其可用于多聚体或单体带信号强度（ 图2）的定量分析的视觉表示。这种方法也可以用来显示在人支气管上皮（HBE）细胞洗涤和人痰样品粘蛋白的表达。这种方法可用于展示的粘蛋白在用还原剂处理的还原。我们显示从用DTT（ 图3）的浓度的增加处理HBE洗液代表性结果。我们量化多聚信号强度的损失以下粘蛋白减少治疗与还原剂年龄核苷酸（ 图4）。
图1.粘蛋白产生的上调继的Tg组织Muc5ac /绿色荧光蛋白IL-13治疗（GFP）小鼠模型小鼠过度组织Muc5ac标有绿色荧光蛋白用PBS灌输。（ - ）或IL-13（+）诱导的杯状细胞化生和增加粘蛋白产生在肺中（每组n = 3）。 BALF收获，并通过粘蛋白琼脂糖Western印迹分离。膜与兔多克隆抗MUC5B（红色）和山羊多克隆抗GFP（绿色）进行探测。红外系统可用于显示结果为覆盖或具有改变图像为黑色和白色选择一个通道。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.粘蛋白琼脂糖凝胶显示粘蛋白分泌的上调在IL-13处理的小鼠的定量分析。在图1所示的粘蛋白凝胶的每一泳道测定MUC5B信号强度，结果表明，粘蛋白分泌增加5.1倍以上在IL-13处理的动物PBS处理小鼠（n = 3，p <0.005）。显示为数据的平均值±SEM。 请点击此处查看该图的放大版本。
在用DTT。HBE洗涤治疗HBE淘MUC5AC和MUC5B粘蛋白的图3.还原用0，0.005，0.01，0.05，0.1，0.5，1，5，10，50和100mM DTT处理在37℃下进行30 minut上课。膜与兔多克隆抗MUC5B（绿色）和鼠标多克隆抗MUC5AC（红色）探测。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4是为黏液凝胶的每个泳道测量与DTT。MUC5AC和MUC5B信号强度治疗HBE淘多聚带的粘蛋白琼脂糖凝胶显示消失的定量分析 。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
粘蛋白在该视频描述Western印迹的协议结合分子生物学用于分离和转移大分子，如DNA，以用于蛋白质检测常规技术， 即 ，免疫印迹的常规技术。同样的技术可以应用到研究复杂的糖胺聚糖，如高分子量的透明质酸18的击穿的生物学。虽然这种技术能够在广泛试验的使用，成功琼脂糖Western印迹依赖于需要细致和时间依赖性的动作步骤的多个。为了最大限度地取得成功，一些关键步骤进行审查。
样品制备和凝胶装载是准确结果的关键步骤。丰富的粘蛋白样品， 即 ，痰，是在本质上，附着在油管实验， 即 ，枪头，离心管，过滤器。采用容积式吸管和预-wetting枪头可以促进粘弹性材料的装载到孔中。这些样品需要特别注意，由于浮力加剧以及这些材料的粘性。浓缩的样品（大于5毫克/毫升）将很差通过0.8％琼脂糖凝胶的孔尺寸迁移，并可能需要高达6M尿素进一步稀释和/或变性。然而，要避免在运行氯胍（盐酸胍）变性样品作为胍将与SDS沉淀。因此，存储在盐酸胍的样品需要额外的透析步骤。对非聚合状态的研究中，部分还原（0.5毫摩尔DTT，5分钟），将大大提高浓缩的样品（参见图3）的迁移。
蛋白质转移到硝化纤维素膜是该协议的一个关键步骤，如果不具有精度执行时，会导致染色的膜，弱信号和假定量结果。硝酸纤维素膜非常脆弱，容易受到污染，应始终带手套处理和护理，以避免非特异性结合和损坏。凝胶在膜的放置需要精确对准以产生一个紧密的密封，并防止转移缓冲液泄漏，这将导致污渍和降低转印效率。凝胶和膜之间的气泡的形成会阻止蛋白转移，应小心避免。
最佳免疫依靠高亲和力，高特异性针对目标粘蛋白的蛋白骨架的抗体。近日，新的免疫策略，抗原的设计和筛选技术，产量增加成功的黏液抗体的产生，提供了新的工具来研究生物学的黏液。为了检测在一个印迹， 即 ，MUC5AC和MUC5B两种不同的粘蛋白，这两个初级抗体必须从不同宿主物种， 即 ，兔和羊得到。此外，第二抗体需要用不同的荧光团来标记在这两个NM-700和800 nm的通道被检测到秒。
相对粘蛋白丰度和粘蛋白的大小可以直接与图像软件进行定量。荧光信号成正比靶粘蛋白的量，允许范围广泛的样品的定量，从低（ 例如 ，细胞洗涤）到高（ 例如 ，痰）粘蛋白浓度。然而，绝对的粘蛋白浓度需要粘蛋白标准，这不是在本协议中所述的净化，因为这是在阿卜杜拉等19所说明一个漫长而艰难的过程。此外，琼脂糖Western印迹提供执行粘蛋白移位测定来研究聚合或解聚的方法的可能性。粘蛋白的电泳迁移率取决于它们的聚合状态， 即 ，大的聚合物的迁移被延迟，并且可以使用成像软件进行量化。例如，还原剂会诱发的移动性的sh与粘液的生物物理特性的变化相关的信号的IFT。这种测定可用于研究粘蛋白多聚13的方法，还可以测试旨在影响粘蛋白网络11的药理学试剂。最后，粘蛋白加上荧光标记琼脂糖印迹已经显著改变了我们的方法，通过生产高定性和定量数据来研究粘蛋白。
常见的问题琼脂糖粘蛋白Western印迹可导致以下的结果：低信号强度，高的背景和/或punctates的在膜的外观。若干故障策略可以被用来改善粘蛋白的凝胶图像。信号强度可以通过加载更大的样品体积和/或增加初级和次级抗体浓度增加。典型地，高背景信号是归因于阻塞和/或洗涤不足，这可以通过执行长块来解决/洗孵育，以及使用优化的阻塞的市售缓冲器。 punctates的外观可以是在室温下，这有利于细菌生长的延伸膜孵育的结果。 Punctates也可以通过从DTT浸泡液硝化纤维素膜损伤（步骤4.1）所引起，并可以通过漂洗琼脂糖凝胶转移前彻底和/或减小的DTT浓度至5mM被避免。
琼脂糖粘蛋白印迹的主要限制是缺乏蛋白质梯，高分子量蛋白和粘蛋白标准，这阻碍了绝对粘蛋白定量。从大多数粘蛋白琼脂糖凝胶公布的结果是大小和浓度进行比较研究。尺寸排阻色谱法配上折射率的光散射是常用来确定精确的分子量和大分子的浓度的另一种技术。然而，该技术是昂贵的一ND缺乏特异性，粘蛋白，因此，包括样品， 例如 ，在DNA措施的其他大分子。此外，大小排阻层析是无法粘蛋白类型之间进行区分， 即 ，MUC5AC与MUC5B，和措施以及从粘蛋白的混合物平均浓度和尺寸包括在给定样本。
其他技术可用于研究粘蛋白包括动态和多角度光散射1，等密度和速率纬向离心6，电子显微镜，质谱1,7,8。然而，随着新型药物制剂靶向黏蛋白分子的调查，当务之急是要制定可靠的实验室技术研究粘蛋白生物学。琼脂糖粘蛋白Western印迹是一种相对简单和廉价的技术，该技术可以被用来回答有关粘蛋白的过程的重要问题， 即 ，在粘蛋白负担，尺寸和比例的改变。此测定法将被用来在未来的应用，以测试药物的疗效和毒性为旨在在体外和体内模型中除去粘附粘液新分子。
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Disclosures
作者有没有冲突披露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris Base | Sigma | T6060-1kg | 1 kg |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | ARK2183-1L | 1 L |
| EDTA | Sigma | EDS-100g | 100 g |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | 1 L |
| Bromophenol Blue | Sigma | 114391-5g | 5 g |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Sigma | L6026-50g | 50 g |
| 20x SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer | Promega | V4261 | 1 L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1 kg |
| Trisodium Citrate (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1kg | 1 kg |
| 10 mM DTT (dithiothreitol) | Sigma | D0632 | 25 g |
| Milk Powder | Saco | Instant non-fat dry milk | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500 ml |
| Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples) | Rockland antibodies and assays | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples) | UNC | ||
| H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples) | Santa Cruz | sc-20119 | 200 μg |
| 45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples) | Abcam | ab3649 | 100 μg |
| Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0.5 mg |
| Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0.5 mg |
| Electrophoresis Gel Box and Casting Tray | Owl Seperation Systems | ||
| Power Supply Box | Biorad | Model 200/20 | |
| Membrane Blotting Paper | Amersham | 10600016 | |
| Whatman Paper and Nitrocellulose membrane | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230 v | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey Infrared Fluorescence System | LI-COR Biosciences |
References
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