Abstract
Slimstoffer, tungt-glykosylert proteiner fôr slimhinneoverflater, har utviklet seg som en viktig del av medfødt forsvar ved å beskytte epitelet mot invaderende patogener. Den viktigste rollen til disse makromolekyler er å legge til rette partikkel fangst og rydding mens fremme smøring av slimhinnen. Under proteinsyntese, slimstoffer gjennomgå intens O-glykosylering og multimerization, noe som dramatisk øke massen og størrelsen av disse molekylene. Disse posttranslasjonelle modifikasjoner er kritisk for de viskoelastiske egenskapene til mucus. Som et resultat av den komplekse biokjemiske og biofysiske egenskapene til disse molekylene, som arbeider med slimstoffer gir mange utfordringer som ikke kan overvinnes ved konvensjonelle protein analysemetoder. For eksempel, forhindrer deres høye molekylvekt elektroforetisk migrering via vanlige polyakrylamidgeler og deres klebrige natur bevirker adhesjon til forsøksrøret. Men undersøker rollen til slimstoffer i helse(F.eks., Opprettholde mucosal integritet) og sykdom (f.eks., Hyperconcentration, mucostasis, kreft) har nylig fått interesse og slimstoffer blir etterforsket som et terapeutisk mål. En bedre forståelse av produksjon og funksjon av slimstoffmakromolekyler kan føre til nye farmasøytiske metoder, for eksempel, inhibitorer av mucin granule exocytose og / eller mukolytiske midler. Derfor konsekvente og pålitelige protokoller for å undersøke mucin biologi er avgjørende for vitenskapelige framgang. Her beskriver vi konvensjonelle metoder for å separere slimstoffmakromolekyler ved hjelp av elektroforese ved bruk av en agarosegel, overføres protein til nitrocellulosemembran, og påvisningssignal med mucin-spesifikke antistoffer, så vel som fluorescerende gel-leser. Disse teknikkene er allment gjeldende å bestemme mucin kvantifisering, multimerization og for å teste effekten av farmakologiske forbindelser på slimstoffer.
Introduction
Slimstoffer er vanligvis produsert av slimhinneoverflater som linje hulrom utsatt for ytre miljø (f.eks., Luftveier, fordøyelses, reproduktive traktater, okulær overflate) samt indre organer (f.eks, bukspyttkjertel, galleblæren, brystkjertlene). Tilstedeværelsen av disse glykoproteiner opprettholder overflaten fuktighet og danner en fysisk barriere mot patogener. Selv om mucin produksjon er viktig for slimhinne helse, mucin hyperconcentration og / eller avvikende slim egenskaper kan føre til duct obstruksjon, bakteriell kolonisering og kronisk betennelse, noe som kan føre til uopprettelig skade på vev. En lignende kaskade av hendelser er observert i flere sykdommer, f.eks., Cystisk fibrose 1, kronisk mellomørebetennelse 2 og cervicovaginal infeksjon 3. Derfor er det viktig å forstå rollen til slimstoffer i helse og sykdom, og for å etablere rutineprotokoller for protein identifikasjon.
til dags dato, 19 slimstoffer gener er identifisert og kode for store polypeptidkjeder som strekker seg fra 1200 (f.eks., MUC1) til 22.000 (f.eks MUC16) aminosyrer. Den slimstoff genfamilien kan deles inn i to undergrupper: membranassosierte slimstoffer, som er involvert i cellesignalisering og overflate skjerming, og de gel-dannende slimstoffer, er ansvarlig for de viskoelastiske egenskaper av slim geler. Membran-forbundet slimstoffer er stort sett monomere og feste til celleoverflaten via en hydrofob membran-omspennende domenet. I motsetning til dette, gel-dannende slimstoffer har flere von Willebrand-faktor (vWF) -lignende og cysteinrike domener som er viktig for dannelsen av dynamiske polymere nettverk. Store glykaner er festet til serin- og treoninresiduer fordelt over hele apomucin. Disse tette O-bundne oligosakkarider kan bidra med opp til 80% av molekylvekten 4. Intra- og inter-molekylære disulfidbindinger som forbinder mucin monomerer sikre integriteten av mucin gelen network. Som et resultat av tung glykosylering og multimerization, slimstoffer er blant de største molekylene i dyreverdenen og kan ikke bli analysert ved standard gel-elektroforese ved bruk av konvensjonelle SDS-PAGE polyakrylamid gel og standard protein stiger. Disse metoder løser / separate proteiner med molekylvekter lavere enn 250 kDa, mens mucin monomerer kan nå opp til 2 MDA i tilfelle av MUC16. Imidlertid kan høy molekylvekt protein stiger brukes til å studere små mucin-monomerer (f.eks., MUC1).
En rekke forskjellige teknikker kan anvendes for å studere mucin størrelse, konformasjon og interaksjon. Tradisjonelt er biokjemisk karakterisering av muciner oppnådd ved mucin isolering via isopyknisk densitet-gradient-sentrifugering i denaturerende buffer, etterfulgt av størrelse-eksklusjonskromatografi og immundeteksjon (f.eks., Spalte blotting) 5. Dynamisk og / eller multi-vinkel lysspredning gi informasjon om oligomere staten mucin rike eksempler <sup> 1. I tillegg er hastighets zonal sentrifugering kombinert med immundeteksjon og transmisjonselektronmikroskopi som vanligvis brukes for å bestemme den makromolekylære konformasjon av slimstoffer 6. Massespektrometri blir også brukt til å kvantifisere slimstoffer, detektere proteolytisk spaltning og analysere oligosakkarider sammensetning 1,7,8. Slike teknikker er kostbare, tidkrevende og krever ofte store volumer og / eller høye konsentrasjoner av prøven. Metodikken er beskrevet her, det vil si., Mucin separering ved elektroforese, er reproduserbar, lav pris og kan brukes i high-throughput studier for å tilveiebringe relativ mucin kvantifisering og undersøke polymer sammenstillingen. Dette krever imidlertid analysen høy affinitet, høy spesifisitet slimstoff antistoffer som ikke er tilgjengelige for sjeldne slimstoffer (f.eks., MUC19) eller enkelte arter (f.eks., Gris, ilder).
Agarose Western blotting er egnet til å løse en lang rekke av slimstoffrike prøver med konsensjoner som strekker seg fra 50 ug / ml (f.eks., celle vasker) til 5 mg / ml (f.eks., sputum). Denne analysen ble innført på 1990-tallet og ble bare utført i noen få spesialiserte laboratorier 9,10. Til å begynne med denne teknikken bidro til å identifisere subpopulasjoner av mucin monomerer i humane luftveissekreter 11,12 og bekreftet oligomerisering prosessen i slimceller, som består av dimerdannelse i det endoplasmatiske retikulum, etterfulgt av dimer multimerization i Golgi-apparatet 13. Flere nylig, generering av polyklonale antistoffer mot museslimstoffer tilrettelagt studier på små dyremodeller (f.eks., Slimstoffmangelfulle, βENaC, OVA-utfordret musemodeller) og åpnet et nytt forskningsfelt for prekliniske studier testing farmakologiske forbindelser som tar sikte på å fjerne slim fra lungene 14-17. Som et resultat av en økende interesse i mucin biologi og genereringen av nye, mer spesifikke antistoffer mucin, beskriver vi herein metode for å separere slimstoffer ved agarosegel-elektroforese, vakuum overføring til nitrocellulose og to-fargers infrarøde fluorescerende påvisning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered Buffere for mucin Gel Western blotting
- Forbered en liter av 50x TAE (Tris-acetat-EDTA) buffer.
- I 700 ml destillert vann (dH 2 O) tilsett 242 g Tris-base (0,4 M), 57,1 g iseddik (veie væske) (0,2 M) og 14,61 g etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) (50 mM).
- Juster pH til 8,0 og gjøre volumet opp til 1 liter med dH 2 O.
- Forbered 10 ml 10x lasting buffer.
- Forbered 5 ml 1x TAE buffer. For å gjøre dette, legg til 5 ml glyserol (50%), 25 mg bromfenolblått (0,25%), og 100 mg natrium (SDS) (1%).
- Forbered 2 liter 20x natrium saltvann citrate (SSC) buffer.
- I 1,5 liter dH 2 O, tilsett 350,6 g NaCl (3 M) og 176,4 g trinatriumcitrat (Na 3 C 6 H 5 O 7) (0,3 M). Juster pH til 7,0 og gjøre opp volumet til 2 liter med dH 2 O.
- Forbered en liter 1x TAE-0,1% SDS buffer.
- Tilsett 20 ml 50x TAE til 980 ml dH 2 O. Tilsett 1 g av SDS for å lage en 0,1% SDS-løsning TAE.
2. TAE-SDS agarosegel Forberedelse
- (. Dvs. 150 ml) Hell tilstrekkelig volum av 1x TAE-0,1% SDS buffer i en mikrobølge erlenmeyerkolben å lage en 5-7 mm tykk gel. Legge til 0,8% (1,2 g) agarose pulver.
- Mikrobølgeovn kolbe i 30 sek intervaller med periodisk virvel til agarose er fullstendig oppløst (vanligvis 1 - 3 min). Bruk varme hånd pads under denne prosessen. Vær forsiktig med koking mens virvler.
- La agarose løsning for å kjøle ned i 5 - 10 min. Merk: agarose løsningen vil være klar til å bli strømmet når bunnen av flasken kan stå på håndflaten for 5 sek.
- Forbered elektroforese avstøpning skuffen (10 x 15 cm) ved å forsegle kantene med tape og plassere godt gre i posisjon.
- Hell agarose løsning sakte than avstøpning skuffen for å unngå dannelse av bobler. Fjern bobler med en pipette. Vent til gel avkjøles og helt stivne. Når stivnet, fjern kammen sakte for å unngå å kollapse brønnene ved suging og fjerne tapen fra kantene av brettet.
- Plasser agarosegel inn i gelen boksen og fylle elektroforeseenhet med 1x TAE-0,1% SDS buffer inntil gelen er helt dekket.
3. Prøve Lasting og elektroforese Separation
Merk: I vårt laboratorium, vi vanligvis bruker prøver fra både mus og mennesker, inkludert bronchoalveolar lavage væske (Balf, begge arter), celle vasker fra humane bronkiale epitelceller (HBE), og menneskelige spytt og slimprøver. Prøvene kan denaturert i 6 M urea ved henting eller lagres i korte perioder av gangen (6 timer) ved å legge proteinase cocktail-hemmer.
- Forbered prøvene for lasting ved å tilsette 10% av laste fargestoff til hver prøve (f.eks., 30 ul prøve og 3ul fargestoff). Homogeniseres prøvene ved å pipettere opp og ned. I korthet spinne ned rør ved 5000 rpm for å samle dråper.
- last omhyggelig like stort volum av prøvene i brønnene.
- Pre-våte tips og / eller bruke fortrengnings pipetter for å lette lasting av svært viskøse prøver. Sakte aspiratet 80-90% av prøve-fargeløsning (dvs. 27-30 mL) for å unngå pipettering bobler.
- Sakte last på bunnen av brønnene og gradvis bevege pipettespiss oppover. For prøver som forblir festet til pipettetuppen, avgis i en vinkel på 45 ° og langstrakt rett over brønnen eller forsiktig bruk på siden av brønnen for å bryte trevlet slim. Ikke over brønner.
- Koble elektrodene fra gelen boksen til elektroforese strømgenerator. Kontroller elektrodene er riktig tilkoblet (ie., Røde ledningen plugget til den positive utgangen av generatoren) for å tillate negativt ladet slimstoffer for å kjøre mot positive elektrode.
- Kjør gelen ved 80 volt i 90 min for en enkelt kam gel, eller 60-75 min for en dobbel kam gel for å forhindre overlapping mellom de to radene.
- Slå generator strømmen og koble elektrodene fra strømkilden.
- Fjern forsiktig gelen fra gel-esken med en hånd på hver side av støpe magasinet for å sikre at gelen forblir på plass.
4. Reduser agarosegel for Effektiv mucin Transfer
- Plasser forsiktig gel flat i en glassbeholder. Skyll gel med dH 2 O for å fjerne spor av TAE-SDS buffer.
- Forbered 1 liter 4x SSC buffer ved å legge 200 ml 20x SSC i 800 ml dH 2 O. Gjør 200 ml 10 mM ditiotreitol (DTT) 4x SSC oppløsning ved tilsetning av 309 mg frisk DTT i 200 ml 4x SSC buffer.
- Bløtlegg gel med DTT-4x SSC buffer og dekke. Rist forsiktig i 20 min (10 omdreininger i minuttet). Skyll gel med DTT-free 4x SSC buffer.
- Forbered vakuum blotter for overføring.
- Skjær forsiktig nitrocellulosemembran på dimensjoner er litt bredere enn gel (ie., 10 x 15 cm).
- Våt porøs matte med dH 2 O og plassere den glatt side opp i blotter.
- Våt nitrocellulosemembran med DTT-fri 4x SSC buffer og plassere den på midten av den porøse matten.
- Dekker den porøse matte med gummipakningen, slik at åpningen av pakningen nøyaktig innrettet med nitrocellulosemembranen. Hvis porøs matte er fortsatt synlig, justere nøye membranen for å sikre at ingen mellomrom mellom pakning og membran.
- Forsiktig agarose gel på toppen av membranen. Sikre gel danner en tett forsegling med pakningen og brønnene i gelen er plassert på membranen for overføringen.
- Unngå dannelse av bobler mellom membran og gel. For å minimeredannelse av bobler, å sprute noen dråper 4x SSC buffer på membranen og skyver gel fra topp til bunn for å tømme eventuelle dannede bobler. Unngå å flytte gelen på membranen som proteiner vil begynne å utslette umiddelbart.
- dekke nøye gelen med 4x SSC buffer.
- Begynn mucin overføring av sugekraft.
- Slå vakuum blotter på og satte press på 40 - 50 mBar. Tilsett noen dråper 4x SSC buffer på gel hver 5-10 min for å hindre gelen tørker ut. Kjør overføring i 90 min. Valgfritt: Ved ferdigstillelse, markerer brønner med en blyant til orientering.
- Kast gel og hente nitrocellulosemembran bruke plast pinsett på kanten av membranen.
6. Membran Blokkering og Detection
- Skyll membran straks med 1 x fosfatbufret saltvann (PBS). Ikke la membranen tørke ut.
- Fordyp membranen i 50 ml 3% melk-PBS blokkerer buffer og legg på en rocker ved romtemperatur i 1 time. Etter inkubasjon forkaste blokkeringsbuffer.
- Dyppe membranen i 1% melk-PBS primær antistoffoppløsning. Inkuber membranen i den primære antistoffløsning over natten på en vippe ved 4 ° C. Etter inkubasjon forkaste det primære antistoff oppløsningen. Fortynn de primære antistoffer mot en 1: 2000-forhold av antistoffløsning til blokkeringsbuffer. Merk: For prøver som stammer fra mus, bruker vi UNC 222 kanin anti-Muc5b og geit anti-grønt fluorescerende protein (GFP). For prøver som stammer fra mennesker, bruker vi H300 anti-MUC5B og 45M1 anti-MUC5AC primære antistoffer.
- Vask membran 3 ganger med PBS for 10 min på en rocker.
- Fordyp membran i 1% melk-PBS sekundært antistoff løsning. Fortynn de sekundære antistoffer mot en 1: 7500-forhold av antistoffløsning til blokkeringsbuffer og inkuber ved værelsestemperatur i 1 time på et vippe (f.eks, 700 anti-kanin og 680 anti-geit.). Beskytte mot lys ved inkubering i et ikke-transparent container. Kast det sekundære antistoff oppløsningen etter 1 time.
- Vask membran 3 ganger med PBS i 5 minutter. Skyll membran med dH 2 O for å fjerne salt.
- Les membranen på et infrarødt fluorescens system i henhold til produsentens instruksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi viser representative resultater fra slimstoffekspresjon etter agarosegel-elektroforese i Balf fra lungene til mus (figur 1). I dette eksempel brukte vi agarosegel for å vise oppregulering av slimstoffproduksjonen som følge av IL-13 behandlingen av Tg-MUC5AC-mus-modellen. Western blot viser en visuell representasjon av slimstoffekspresjon, som kan brukes for en kvantitativ analyse av multimeren eller monomer båndsignal intensitet (figur 2). Denne metoden kan også brukes for å vise ekspresjon av slimstoffer i humane bronkiale epitel (HBE) cellevaskinger og human spyttprøver. Denne fremgangsmåten kan brukes til å vise reduksjon av slimstoffer etter behandling med reduksjonsmidler. Vi viser representative resultater fra HBE vaskingene ble behandlet med økende konsentrasjoner av DTT (figur 3). Vi kvantifisert tap av multimeren signalintensitet følgende mucin reduksjon med behandling med et reduksjons aldernt (figur 4).
Figur 1. Oppregulering av mucin produksjonen som følge av IL-13 Behandling av Tg-MUC5AC / grønt fluorescerende protein (GFP) musemodell Mus som overuttrykker MUC5AC merket med GFP ble innpodet med PBS. (-) Eller IL-13 (+) for å indusere slim celle metaplasi og økning slimstoffproduksjon i lunger (n = 3 per gruppe). Balf ble høstet og separert via mucin agarose Western blotting. Membranen ble probet med et kanin polyklonalt anti-Muc5b (rød) og et polyklonalt geit anti-GFP (grønt). Det infrarøde systemet kan brukes til å vise resultatene som et overlegg, eller som en enkelt kanal med mulighet for å endre bilder til svart-hvitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Kvantitativ analyse av mucin agarosegel Viser Oppregulering av mucinsekresjonen i IL-13-behandlede mus. Muc5b signalintensitet ble målt for hvert kjørefelt av mucin gelen vist i figur 1. Resultatene viser at mucin sekresjon ble øket 5,1 ganger i løpet PBS-behandlede mus i IL-13-behandlede dyr (n = 3, p <0,005). Viste data som gjennomsnitt ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Reduksjon av MUC5AC og MUC5B slimstoffer i HBE vasker behandlet med DTT. HBe-vaskevæskene ble behandlet med 0, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 og 100 mM DTT ved 37 ° C i 30 minutes. Membran ble undersøkt med en kanin polyklonale anti-MUC5B (grønn) og en musepolyklonalt anti-MUC5AC (rød). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Kvantitativ analyse av mucin agarosegel Viser Forsvinning av det multi Band i HBE Vasker Behandlet med DTT. MUC5AC og MUC5B signalintensitet ble målt for hvert kjørefelt av mucin gel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen av mucin Western blotting som er beskrevet i denne video kombinerer konvensjonelle teknikker som brukes i molekylær biologi for å separere og overføre store makromolekyler, slik som DNA, med regelmessige teknikker for proteindeteksjon, f.eks., Immunoblotting. Den samme teknikken kan brukes til å studere biologi av komplekse glykosaminoglykaner, slik som nedbrytning av høy molekylvekt hyaluronsyre 18. Selv om denne teknikken kan brukes i et bredt spekter av analyser, avhenger vellykket agarose Western blotting på en rekke trinn som krever omhyggelig og tidsavhengige handlinger. For å maksimere suksess, bør noen kritiske trinn gjennomgås.
Prøveopparbeidelse og gel lasting er viktige skritt for nøyaktige resultater. Mucin-rike prøvene, altså., Slim, er, av natur, tilhenger til eksperimentell tubing, altså., Pipettespisser, sentrifugerør, filtre. Bruken av fortrengnings pipetter og prebefuktningsegenskaper pipettespisser kan lette lasting av viskoelastisk materiale i brønnene. Slike prøver krever spesiell oppmerksomhet på grunn av økt oppdrift og klebrighet av disse materialene. Konsentrerte prøver (over 5 mg / ml) blir dårlig migrere gjennom porestørrelsen i en 0,8% agarosegel, og kan kreve ytterligere fortynning, og / eller denaturering i opp til 6 M urea. Men unngå å kjøre prøvene denaturert i guanidinhydroklorid (GuHCI) som guanidinium vil utløse med SDS. Derfor prøver lagret i GuHCI kreve en ytterligere dialyse trinn. For ikke-polymere status studiene, vil delvis reduksjon (0,5 mM DTT i 5 min) i stor grad forbedre overføringen av konsentrerte prøver (se figur 3).
Protein overføring til nitrocellulosemembranen er et viktig skritt for denne protokollen, og, hvis den ikke utføres med presisjon, kan føre til flekker membran, svakt signal og falske kvantitative resultater. Nitrocellulosemembranene er delikat og lett forurenset ogskal alltid håndteres med hansker og omsorg for å unngå uspesifikk binding og skader. Plassering av gelen på membranen krever nøyaktig innretting for å generere en tett forsegling og hindrer lekkasje overføringsbuffer, noe som ville resultere i flekker og redusere overføringseffektivitet. Dannelse av bobler mellom gelen og membranen vil hindre proteinoverføring og bør unngås nøye.
Optimal immundeteksjon er avhengig av høy affinitet, høy spesifisitet av antistoffer mot proteinet ryggraden av målet mucin. Nylig har nye immunisering strategi, antigen utforming og for screening gi økt suksess med genereringen av slimstoff antistoffer og gitt nye verktøy for å studere mucin biologi. For å påvise to forskjellige slimstoffer på en klatt, f.eks., Og MUC5AC MUC5B, må de to primære antistoffer være avledet fra forskjellige vertsarter, dvs. kanin og geit. Også, de sekundære antistoffer må være merket med forskjellige fluoroforens for å bli detektert i både 700 nm- og 800 nm-kanal.
Relativ mucin overflod og mucin størrelse kan kvantifiseres direkte med bildebehandlingsprogrammer. Fluorescente signalet er direkte proporsjonal med mengden av target-mucin, som tillater kvantifisering av et bredt spekter av prøver, fra lav (f.eks., Cellevaskinger) til høy (f.eks., Sputum) slimstoffkonsentrasjon. Imidlertid krever absolutt mucin konsentrasjon rensing av mucin standarder, som ikke ble beskrevet i denne protokollen som det er en lang og vanskelig prosess som ble beskrevet i Abdullah et al. 19. I tillegg agarose Western blotting gir mulighet for å utføre mucin skift analyser for å studere fremgangs polymerisering eller depolymerisering. Elektroforetiske mobilitet av slimstoffer avhenger av deres polymere tilstand, det vil si., Migrering av store polymerer er forsinket, og kan kvantifiseres ved hjelp av bildebehandling. For eksempel vil reduksjonsmidler indusere en mobilitets shIFT av det signal som samsvarer med endringer i de biofysiske egenskapene til slim. En slik analyse kan benyttes til å studere mucin multimerization prosess 13, men også til å teste farmakologiske midler med sikte på å påvirke mucin nettverk 11. For å konkludere, mucin agarose Western blotting kombinert med fluorescens merking har vesentlig endret vår tilnærming til å studere slimstoffer ved å produsere høye kvalitative og kvantitative data.
Vanlige problemer med agarose mucin Western blotting kan resultere i følgende resultater: lav signalintensitet, høy bakgrunn og / eller utseendet av punctates på membranen. Flere feilsøkings strategier kan anvendes for å forbedre mucin gel bilder. Signalintensiteten kan økes ved å laste store prøvevolum og / eller øke primære og sekundære antistoffkonsentrasjoner. Vanligvis er høy bakgrunn signal skyldes utilstrekkelig blokkering og / eller vasker, som kan løses ved å utføre lengre blokk/ Vask inkubasjoner, samt bruke optimalisert blokkering buffere som er kommersielt tilgjengelig. Utseendet til punctates kan være et resultat av utvidet membran inkubasjoner ved romtemperatur, noe som letter bakterievekst. Punctates kan også være forårsaket av nitrocellulosemembranskade fra DTT soaking oppløsning (trinn 4.1) og kan unngås ved å skylle agarosegel grundig før overføring og / eller avtagende DTT-konsentrasjonen til 5 mM.
Den viktigste begrensning av agarose mucin Western blotting er det mangel på protein stige for høy molekylvekt proteiner og mucin standarder, som hindrer absolutt mucin kvantifisering. De fleste av de publiserte resultatene fra mucin agarosegeler er komparative studier for størrelse og konsentrasjon. Størrelse-utelukkelses-kromatografi med lysspredning kombinert med brytningsindeksen er en annen teknikk som vanligvis anvendes for å bestemme nøyaktig molekylvekt og konsentrasjon av makromolekyler. Imidlertid er denne teknikk kostbar ennd mangler spesifisitet for slimstoffer, dermed måler andre store molekyler med i prøvene, for eksempel, DNA. I tillegg er størrelse-utelukkelses-kromatografi ute av stand til å skille mellom slimstofftyper, det vil si., MUC5AC versus MUC5B, og tiltak og gjennomsnittskonsentrasjon og størrelse fra blandingen av slimstoffer som inngår i en gitt prøve.
Andre teknikker kan brukes til å studere slimstoffer inkludert dynamisk og multi-vinkel-lysspredning 1, isopyknisk og hastighets zonal sentrifugering 6, elektronmikroskopi, massespektrometri 1,7,8. Men med etterforskningen av nye farmakologiske midler rettet mot slimstoffmolekyler, er det viktig å utvikle pålitelige laboratorieteknikker for å studere mucin biologi. Agarose mucin Western blotting er en forholdsvis enkel og billig teknikk som kan brukes til å besvare viktige spørsmål angående mucin prosesser, det vil si., Endringer i slimstoffbelastning, størrelse og forhold. Denne analysen vil bli brukti fremtidige applikasjoner for å teste legemidlets effekt og toksisitet for nye molekyler som tar sikte på å fjerne adherente slim i in vitro- og in vivo-modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har noen konflikt å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris Base | Sigma | T6060-1kg | 1 kg |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | ARK2183-1L | 1 L |
| EDTA | Sigma | EDS-100g | 100 g |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | 1 L |
| Bromophenol Blue | Sigma | 114391-5g | 5 g |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Sigma | L6026-50g | 50 g |
| 20x SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer | Promega | V4261 | 1 L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1 kg |
| Trisodium Citrate (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1kg | 1 kg |
| 10 mM DTT (dithiothreitol) | Sigma | D0632 | 25 g |
| Milk Powder | Saco | Instant non-fat dry milk | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500 ml |
| Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples) | Rockland antibodies and assays | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples) | UNC | ||
| H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples) | Santa Cruz | sc-20119 | 200 μg |
| 45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples) | Abcam | ab3649 | 100 μg |
| Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0.5 mg |
| Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0.5 mg |
| Electrophoresis Gel Box and Casting Tray | Owl Seperation Systems | ||
| Power Supply Box | Biorad | Model 200/20 | |
| Membrane Blotting Paper | Amersham | 10600016 | |
| Whatman Paper and Nitrocellulose membrane | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230 v | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey Infrared Fluorescence System | LI-COR Biosciences |
References
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure. J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Preciado, D., et al. MUC5B Is the predominant mucin glycoprotein in chronic otitis media fluid. Pediatr Res. 68 (3), 231-236 (2010).
- Wang, Y. Y., et al. IgG in cervicovaginal mucus traps HSV and prevents vaginal herpes infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1036-1044 (2014).
- Linden, S. K., Sutton, P., Karlsson, N. G., Korolik, V., McGuckin, M. A. Mucins in the mucosal barrier to infection. Mucosal Immunol. 1 (3), 183-197 (2008).
- Thornton, D. J., et al. Mucus glycoproteins from 'normal' human tracheobronchial secretion. Biochem J. 265 (1), 179-186 (1990).
- Kesimer, M., Makhov, A. M., Griffith, J. D., Verdugo, P., Sheehan, J. K. Unpacking a gel-forming mucin: a view of MUC5B organization after granular release. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (1), L15-L22 (2010).
- Kesimer, M., Sheehan, J. K. Mass spectrometric analysis of mucin core proteins. Methods Mol Biol. 842, 67-79 (2012).
- van der Post, S., Thomsson, K. A., Hansson, G. C. Multiple enzyme approach for the characterization of glycan modifications on the C-terminus of the intestinal MUC2mucin. J Proteome Res. 13 (12), 6013-6023 (2014).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Methods Mol Biol. 32, 119-128 (1994).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Mol Biotechnol. 5 (2), 171-176 (1996).
- Sheehan, J. K., et al. Physical characterization of the MUC5AC mucin: a highly oligomeric glycoprotein whether isolated from cell culture or in vivo from respiratory mucous secretions. Biochem J. 347 Pt 1, 37-44 (2000).
- Thornton, D. J., Howard, M., Khan, N., Sheehan, J. K. Identification of two glycoforms of the MUC5B mucin in human respiratory mucus. Evidence for a cysteine-rich sequence repeated within the molecule. J Biol Chem. 272 (14), 9561-9566 (1997).
- Sheehan, J. K., et al. Identification of molecular intermediates in the assembly pathway of the MUC5AC mucin. J Biol Chem. 279 (15), 15698-15705 (2004).
- Ehre, C., et al. Overexpressing mouse model demonstrates the protective role of Muc5ac in the lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16528-16533 (2012).
- Livraghi, A., et al. Airway and lung pathology due to mucosal surface dehydration in {beta}-epithelial Na+ channel-overexpressing mice: role of TNF-{alpha} and IL-4R{alpha} signaling, influence of neonatal development, and limited efficacy of glucocorticoid treatment. J Immunol. 182 (7), 4357-4367 (2009).
- Martino, M. B., et al. The ER stress transducer IRE1beta is required for airway epithelial mucin production. Mucosal Immunol. 6 (3), 639-654 (2013).
- Nguyen, L. P., et al. Chronic exposure to beta-blockers attenuates inflammation and mucin content in a murine asthma model. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (3), 256-262 (2008).
- Papakonstantinou, E., et al. COPD exacerbations are associated with pro-inflammatory degradation of hyaluronic acid. Chest. , (2015).
- Abdullah, L. H., Wolber, C., Kesimer, M., Sheehan, J. K., Davis, C. W. Studying mucin secretion from human bronchial epithelial cell primary cultures. Methods Mol Biol. 842, 259-277 (2012).
