Abstract
Muciner, de stærkt glycosylerede proteiner foring slimhindeoverflader, har udviklet sig som et centralt element i medfødte forsvar ved at beskytte epitel mod invaderende patogener. Den vigtigste rolle disse makromolekyler er at lette partikel fældefangst og clearance samtidig fremme smøring af slimhinden. Under proteinsyntese, muciner undergår intens O-glycosylering og multimerisering, hvilket dramatisk øge massen og størrelse af disse molekyler. Disse post-translationelle modifikationer er afgørende for de viskoelastiske egenskaber af slim. Som følge af den komplekse biokemiske og biofysiske aktivitet af disse molekyler, der arbejder med muciner tilvejebringer mange udfordringer, som ikke kan overvindes ved konventionelle protein analysemetoder. For eksempel deres høje molekylvægt forhindrer elektroforetisk migration via regelmæssige polyacrylamidgeler og deres klæbrige karakter forårsager adhæsion til eksperimentel slange. Men undersøger rolle muciner i sundhed(F.eks., At opretholde slimhinde integritet) og sygdom (f.eks., Hyperconcentration, mucostasis, kræft) har for nylig fået interesse og muciner bliver undersøgt som et terapeutisk mål. En bedre forståelse af produktionen og funktionen af mucin makromolekyler kan føre til hidtil ukendte farmaceutiske metoder, fx inhibitorer af mucin-granula exocytose og / eller mucolytiske midler. Derfor er konsistente og pålidelige protokoller undersøge mucin biologi er kritiske for videnskabens fremskridt. Her beskriver vi konventionelle metoder til adskillelse af mucin makromolekyler ved elektroforese under anvendelse af en agarosegel, overføres protein til nitrocellulosemembran, og detekteringssignal med mucin-specifikke antistoffer samt infrarødt fluorescerende gel-læser. Disse teknikker er bredt anvendelig til bestemmelse mucin kvantificering, multimerisering og at afprøve virkningerne af farmakologiske forbindelser på muciner.
Introduction
Muciner normalt produceret af slimhinder, linje hulrum udsat for det ydre miljø (f.eks., Luftvejssygdomme, fordøjelsesproblemer, reproduktive skrifter, okulær overflade) samt indre organer (f.eks bugspytkirtel, galdeblære, mælkekirtler). Tilstedeværelsen af disse glycoproteiner opretholder overflade hydratisering og danner en fysisk barriere mod patogener. Selvom mucinproduktion er afgørende til mucosale sundhed, mucin hyperconcentration og / eller afvigende slim egenskaber kan føre til kanalen obstruktion, bakteriel kolonisering og kronisk inflammation, som kan forårsage irreversibel vævsskade. En lignende kaskade af begivenheder er observeret i flere sygdomme, f.eks., Cystisk fibrose 1, kronisk otitis media 2 og cervicovaginal infektion 3. Derfor er det vigtigt at forstå betydningen af muciner i sundhed og sygdom og etablere rutinemæssige protokoller til identifikation protein.
Til dato, 19 muciner gener er blevet identificeret og koder for store polypeptidkæder i området fra 1.200 (f.eks., MUC1) til 22.000 (f.eks MUC16) aminosyrer. Det mucin-genfamilien kan opdeles i to undertyper: de membranassocierede muciner, der er involveret i cellesignalering og skærmkontaktflade og de geldannende muciner, der er ansvarlig for de viskoelastiske egenskaber af slim geler. Membranassocierede muciner er for det meste monomere og tillægger celleoverfladerne via en hydrofob membran-udspændende domæne. I modsætning hertil geldannende muciner har flere von Willebrand faktor (vWF) -lignende og cysteinrige domæner, der er afgørende for dannelsen af dynamiske polymere netværk. Store glykaner er bundet til serin og threoninrester fordelt i apomucin. Disse tætte O-bundne oligosaccharider kan bidrage med op til 80% af molekylvægten 4. Intra- og inter-molekylære disulfid bindinger forbinder mucin monomerer sikre integriteten af mucin gel netværksindstillingerk. Som følge af kraftig glycosylering og multimerisering, muciner er blandt de største molekyler i dyreriget og ikke kan analyseres ved standard gelelektroforese ved anvendelse af traditionel SDS-PAGE polyacrylamidgel og standard protein stiger. Disse fremgangsmåder løse / separate proteiner med molekylvægte lavere end 250 kDa, mens mucin monomerer kan nå op til 2 MDa i sagen MUC16. Dog kan en høj molekylvægt protein stiger anvendes til at undersøge små mucin monomerer (dvs.., MUC1).
En række teknikker kan anvendes til at studere mucin størrelse, kropsbygning og interaktion. Traditionelt er biokemisk karakterisering af muciner opnås ved mucin isolation via isopyknisk densitet-gradient centrifugering i denaturerende puffer, efterfulgt af gelpermeationschromatografi og immunodetektion (f.eks., Slot blotting) 5. Dynamisk og / eller multi-vinkel lysspredning give oplysninger om oligomere tilstand af mucin-rige prøver <sup> 1. Desuden er hastigheden zoner centrifugering kombineret med immunpåvisning og transmissionselektronmikroskopi almindeligvis anvendes til at bestemme den makromolekylære konformation af muciner 6. Massespektrometri bruges også til at kvantificere muciner, opdage proteolytisk spaltning og analysere oligosaccharid sammensætning 1,7,8. Sådanne teknikker er dyre, tidskrævende og kræver ofte store mængder og / eller høje koncentrationer af prøve. Metodikken beskrevet heri, dvs.., Mucin separation ved elektroforese, er reproducerbar, lave omkostninger og kan anvendes i high-throughput undersøgelser til relativ mucin kvantificering og undersøge polymer samling. Men denne analyse kræver, høj affinitet, høj specificitet mucin antistoffer, som måske ikke er tilgængelige for sjældne muciner (f.eks., MUC19) eller visse arter (f.eks., Gris, fritte).
Agarose Western blotting er egnet til at løse en lang række af mucin-rige prøver med koncentioner i området fra 50 ug / ml (f.eks., cellevaske) til 5 mg / ml (f.eks. sputum). Dette assay blev introduceret i 1990'erne og blev kun udført i få specialiserede laboratorier 9,10. Oprindeligt denne teknik hjalp identificere subpopulationer af mucin monomerer i humane respiratoriske sekreter 11,12 og bekræftede oligomeriseringsprocessen i bægerceller, som består af dimerdannelse i det endoplasmatiske reticulum efterfulgt af dimer multimerisering i Golgi-apparatet 13. For nylig, generering af polyklonale antistoffer mod murine muciner lettet undersøgelser af små dyremodeller (fx., Mucin mangelfulde, βENaC, OVA-udfordrede musemodeller) og åbnede en ny forskningsfelt for prækliniske undersøgelser testning farmakologiske forbindelser til formål at fjerne slim fra lungerne 14-17. Som følge af en stigende interesse for mucin biologi og generering af hidtil ukendte, mere specifikke mucin antistoffer beskriver vi herein metoden til at adskille muciner ved agarosegelelektroforese, vakuum overførsel til nitrocellulose og tofarvet detektion infrarødt fluorescerende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered buffere for Mucin Gel vestlige Blotting
- Forberede 1 liter 50x TAE (Tris-acetat-EDTA) buffer.
- I 700 ml destilleret vand (dH 2 O) tilsættes 242 g Tris-base (0,4 M), 57,1 g iseddikesyre (vejer væske) (0,2 M) og 14,61 g ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) (50 mM).
- Justér pH til 8,0 og et rumfang på 1 liter med dH 2 O.
- Forbered 10 ml 10x loading buffer.
- Forbered 5 ml 1x TAE-buffer. For at gøre dette, tilsættes 5 ml glycerol (50%), 25 mg bromphenolblåt (0,25%), og 100 mg natriumdodecylsulfat (SDS) (1%).
- Forbered 2 liter 20x natrium saltvand citrat (SSC) buffer.
- I 1,5 liter dH2O, tilsættes 350,6 g NaCl (3 M) og 176,4 g trinatriumcitrat (Na 3 C 6 H 5 O 7) (0,3 M). Justér pH til 7,0 og der fyldes op til 2 liter med dH 2 O.
- Forberede 1 liter 1x TAE-0,1% SDS-buffer.
- Der tilsættes 20 ml 50x TAE til 980 ml dH 2 O. Tilsæt 1 g SDS at gøre en 0,1% SDS-TAE opløsning.
2. TAE-SDS Agarose Gel Fremstilling
- (. Dvs 150 ml) Hæld tilstrækkelig volumen af 1x TAE-0,1% SDS buffer i en mikrobølgeovn Erlenmeyerkolbe at lave en 5-7 mm tyk gel. Tilføj 0,8% (1,2 g) agarose pulver.
- Mikroovn kolbe i 30 intervaller sek med intermitterende hvirvlende indtil agarose er helt opløst (normalt 1 - 3 ud min). Brug varm hånd puder under denne proces. Vær forsigtig med voldsom kogning mens hvirvlende.
- Lad agarose løsning til at køle af i 5 - 10 min. Bemærk: agarose løsning vil være klar til at blive hældt når bunden af kolben kan efterlades på håndfladen i 5 sek.
- Forbered elektroforese støbning bakke (10 x 15 cm) ved at forsegle kanterne med tape og anbringelse godt kam i position.
- Hæld agaroseopløsning langsomt i than casting bakken for at undgå dannelsen af bobler. Fjern boblerne ved hjælp af en pipettespids. Vent på gelen at afkøle og fuldstændigt at størkne. Når størknet, fjernes kammen langsomt for at undgå at kollapse brøndene ved sugning og fjerne tapen fra kanten af bakken.
- Placer agarosegel ind gelboksen og fyld elektroforese enhed med 1x TAE-0,1% SDS buffer, indtil gelen er helt dækket.
3. Prøve Loading og elektroforeseadskillelse
Bemærk: I vores laboratorium, vi normalt bruger prøver fra både mus og mennesker, herunder bronkoalveolærvaskevæsken (BALF; begge arter), celle vaskninger fra humane bronkiale epitelceller (HBE) og humant spyt og spytprøver. Prøver kan denatureres i 6 M urea ved afhentning eller opbevares til korte perioder (6 timer) ved tilsætning proteinase cocktail inhibitor.
- Fremstille prøver til påfyldning ved tilsætning af 10% af påføringsfarvestof til hver prøve (dvs.., 30 pi prøve og 3pi af farvestof). Homogenisere prøver ved pipettering op og ned. Kort fortalt spin ned rør ved 5.000 rpm at indsamle dråber.
- indlæse omhyggeligt tilsvarende volumen af prøver i brøndene.
- Pre-våde tips og / eller bruge positive forskydning pipetter til at lette lastning af højviskose prøver. Langsomt aspirer 80 - 90% af prøve-farveopløsning (dvs. 27 - 30 fil) for at undgå pipettering bobler.
- indlæses langsomt på bunden af brøndene og progressivt flytte pipettespidsen opad. For prøver, der forbliver knyttet til pipettespidsen, dispensere i en 45 ° vinkel og aflang lige over brønden eller forsigtigt bruge den side af brønden for at bryde den træede slim. Overbelast ikke brøndene.
- Forbind elektroderne fra gelen boksen til elektroforese strømgenerator. Sørg elektroderne er tilsluttet korrekt (dvs.., Røde ledning sluttet til den positive effekt af generatoren) for at muliggøre negativt ladede muciner at køre mod den positive elektrode.
- Gelen løbe ved 80 volt i 90 minutter for en enkelt kam gel, eller 60 - 75 min til en dobbelt kam gel for at forhindre overlapning mellem de to rækker.
- Sluk generator strømmen og frakoble elektroderne fra strømkilden.
- Gelen fjernes forsigtigt fra gelboksen med en hånd på hver side af støbning bakken for at sikre gelen forbliver på plads.
4. Reducer Agarose Gel for effektiv Mucin Transfer
- Læg forsigtigt gelen lejlighed i en glasbeholder. Skyl gelen med dH2O at fjerne spor af TAE-SDS puffer.
- Forberede 1 liter 4x SSC puffer ved tilsætning af 200 ml 20x SSC i 800 ml dH 2 O. Gør 200 ml 10 mM dithiothreitol (DTT) 4x SSC-opløsning ved at tilsætte 309 mg af frisk DTT i 200 ml 4x SSC puffer.
- Soak gelen med DTT-4x SSC buffer og dækning. Forsigtigt rocke i 20 min (10 omdrejninger i minuttet). Skyl gel med DTT-fri 4x SSC puffer.
- Forbered vakuum blotter til overførsel.
- Skær forsigtigt nitrocellulose membran på dimensioner lidt bredere end gelen (dvs.., 10 x 15 cm).
- Våd porøs måtte med dH 2 O og placere den glatte side opad i blotter.
- Våd nitrocellulosemembran med DTT-fri 4x SSC buffer og placere den i midten af det porøse underlag.
- Dæk porøse måtten med gummipakningen, efterlader åbningen af pakningen præcist rettet ind nitrocellulosemembranen. Hvis porøs mat er stadig synlige, omhyggeligt justere membranen for at sikre der ikke er mellemrum mellem pakningen og membran.
- Læg forsigtigt agarosegel oven på membranen. Sikre gel danner en tæt forsegling med pakningen og brøndene i gelen er på membranen til overførsel.
- Undgå dannelsen af bobler mellem membranen og gelen. For at minimeredannelse af bobler, sprøjte par dråber 4x SSC buffer på membranen og skub gelen fra top til bund for at skylle eventuelle dannede bobler. Undgå at flytte gelen på membranen som proteiner vil begynde at udviske straks.
- dækker omhyggeligt gelen med 4x SSC puffer.
- Begynd mucin overførsel ved sugning.
- Slå vakuum blotter ON og sæt tryk ved 40 - 50 mBar. Tilsæt et par dråber 4x SSC buffer på gelen hver 5 - 10 minutter for at forhindre gelen i at tørre ud. Kør overførsel i 90 min. Valgfrit: Ved afslutning, markerer brøndene med en blyant til orientering.
- Bortskaf gelen og hente nitrocellulosemembranen hjælp plastik pincet på kanten af membranen.
6. Membran Blokering og Detection
- Skyl membran straks med 1x phosphatpufret saltvand (PBS). Lad ikke membranen tørre ud.
- Fordyb membranen i 50 ml 3% mælk-PBS blokerende buffer og sted på en rocker ved stuetemperatur i 1 time. Efter inkubation kasseres blokerende buffer.
- Fordybe membran i 1% mælk-PBS primære antistofopløsning. Inkuber membranen i den primære antistofopløsning natten over på en rocker ved 4 ° C. Efter inkubation kassere det primære antistof løsning. Fortynd de primære antistoffer til en 1: 2.000 forhold mellem antistofopløsning til blokeringsbuffer. Bemærk: For prøver, der stammer fra mus, bruger vi UNC 222 kanin anti-Muc5b og gede anti-grønt fluorescerende protein (GFP). For prøver, der stammer fra mennesker, bruger vi H300 anti-MUC5B og 45M1 anti-MUC5AC primære antistoffer.
- Vask membran 3 gange med PBS i 10 min på en rocker.
- Fordybe membran i 1% mælk-PBS sekundær antistofopløsning. Fortynd de sekundære antistoffer mod en 1: 7.500 forhold mellem antistofopløsning til blokeringspuffer og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time på en vippe (f.eks 700 anti-kanin og 680 anti-ged.). Beskyt mod lys ved inkubation i en ikke-gennemsigtig container. Kassér det sekundære antistof opløsning efter 1 time.
- Vask membran 3 gange med PBS i 5 minutter. Skyl membran med dH 2 O for at fjerne salt.
- Læs membranen på en infrarød fluorescens ifølge producentens anvisninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi viser repræsentative resultater af mucinekspression følgende agarosegelelektroforese i BALF fra lungerne af mus (figur 1). I dette eksempel har vi benyttet agarosegel for at vise opregulering af mucinproduktion følgende IL-13 behandling af Tg-Muc5ac musemodel. Western blot viser en visuel repræsentation af mucin udtryk, der kan anvendes til en kvantitativ analyse af multimer eller monomer band signal intensitet (figur 2). Denne metode kan også bruges til at vise ekspression af muciner i humane bronkiale epitel (HBE) celle vaskninger og humane spytprøver. Denne metode kan bruges til at vise reduktion af muciner efter behandling med reduktionsmidler. Vi viser repræsentative resultater fra HBE vaskevæsker behandlet med stigende koncentrationer af DTT (figur 3). Vi kvantificerede tabet af multimer signalintensitet efter mucin reduktion med behandling med et reduktionsmiddel aldernt (figur 4).
Figur 1. opregulering af mucinproduktion Efter IL-13 Behandling af Tg-Muc5ac / grønt fluorescerende protein (GFP) musemodel Mus overudtrykker Muc5ac mærket med GFP blev indpodet med PBS. (-) Eller IL-13 (+) for at inducere bæger celle metaplasi og forøgelse mucinproduktion i lungerne (n = 3 pr gruppe). BALF blev høstet og adskilt via mucin agarose Western blotting. Membranen blev probet med et kanin polyklonalt anti-Muc5b (rød) og et gede polyklonalt anti-GFP (grønt). Det infrarøde system kan bruges til at vise resultaterne som en overlejring eller som en enkelt kanal med mulighed for at ændre billeder til sort og hvid. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Kvantitativ analyse af mucin agarose gel, der viser opregulering af mucinudskillelse i IL-13-behandlede mus. Muc5b signalintensitet blev målt for hver bane af mucin gel vist i figur 1. Resultaterne viser, at mucin sekretion blev forøget 5,1 gange i forhold til PBS-behandlede mus i IL-13-behandlede dyr (n = 3, p <0,005). Data, der er vist som gennemsnit ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Reduktion af MUC5AC og MUC5B Muciner i HBE Vasker behandlet med DTT. HBE vaske blev behandlet med 0, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 og 100 mM DTT ved 37 ° C i 30 minutes. Membranen blev undersøgt med en kanin polyklonalt anti-MUC5B (grøn) og en mus polyklonalt anti-MUC5AC (rød). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Kvantitativ analyse af mucin agarose gel Viser forsvinding af det multimere Band i HBE Vasker behandlet med DTT. MUC5AC og MUC5B signal intensitet blev målt for hver bane af mucin gel. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen for mucin Western blotting beskrevet i denne video kombinerer traditionelle teknikker, der anvendes i molekylær biologi til at separere og overføre store makromolekyler, såsom DNA, med regelmæssige teknikker til protein påvisning, dvs.., Immunblotting. Den samme teknik kunne anvendes til at studere biologien af komplekse glycosaminoglycaner, såsom opdelingen af høj molekylvægt hyaluronsyre 18. Selv om denne teknik kan anvendes i en bred vifte af assays, vellykket agarose Western blotting er afhængig af en mangfoldighed af trin, der kræver omhyggelig og tidsafhængige handlinger. For at maksimere succes, bør revideres nogle kritiske trin.
Prøveforberedelse og gel lastning er kritiske trin for nøjagtige resultater. Mucin-rige prøver, dvs.., Sputa, er, af natur, klæbende til eksperimentel slanger, dvs.., Pipettespidser, centrifugerør, filtre. Anvendelsen af positiv fortrængning pipetter og præ-wetting pipettespidser kan lette læsning af viskoelastisk materiale i brøndene. Sådanne prøver kræver særlig opmærksomhed på grund af øget opdrift og klæbrighed af disse materialer. Koncentrerede prøver (over 5 mg / ml) vil dårligt vandre gennem porestørrelse en 0,8% agarosegel og kan kræve yderligere fortynding og / eller denaturering i op til 6 M urea. Men undgå at løbe prøver denatureret i guanidiniumchlorid (GuHCI) som guanidinium udfældes med SDS. Derfor prøver opbevaret i GuHCI kræver et ekstra dialysetrin. For ikke-polymere status studier, vil delvis reduktion (0,5 mM DTT i 5 minutter) i høj grad forbedre migration af koncentrerede prøver (se figur 3).
Protein overførsel til nitrocellulose membran er et vigtigt skridt for denne protokol, og hvis ikke udført med præcision, kan føre til farvede membran, svagt signal og falske kvantitative resultater. Nitrocellulosemembraner er sarte og let forurenet ogbør altid håndteres med handsker og omsorg for at undgå uspecifik binding og skader. Anbringelse af gelen på membranen kræver præcis opretning for at generere en tæt forsegling og forhindre overførsel buffer lækage, hvilket ville resultere i pletter og reducere overførsel effektivitet. Dannelse af bobler mellem gel og membran vil forhindre protein overførsel og bør nøje undgås.
Optimal immunpåvisning afhængig af høj affinitet, høj specificitet antistoffer mod proteinet rygraden af målet mucin. For nylig, roman immunisering strategi, antigen design og screening teknologier giver øget succes med generation af mucin antistoffer og forudsat nye værktøjer til at studere mucin biologi. For at kunne påvise to forskellige muciner på én skamplet, dvs.., MUC5AC og MUC5B, skal de to primære antistoffer være afledt af forskellige værtsarter, dvs. kanin og ged. Også, skal mærkes med forskellig fluorofor de sekundære antistoffers, der skal detekteres i både 700 nm- og 800 nm-kanal.
Relativ mucin overflod og mucin størrelse kan kvantificeres direkte med imaging software. Fluorescerende signal er direkte proportional med mængden af mål mucin, hvilket muliggør kvantificering af et bredt udvalg af prøver, fra lav (f.eks., Cellevaske) til høj (f.eks., Sputum) mucin koncentration. Men absolut mucin koncentration kræver rensning af mucin standarder, som ikke var beskrevet i denne protokol, da det er en langvarig og vanskelig proces, der blev beskrevet i Abdullah et al. 19. Desuden agarose Western blotting giver mulighed for at udføre mucin ændring-assays til at studere processen med polymerisation eller depolymerisation. Elektroforetisk mobilitet for muciner afhænger af deres polymere tilstand, dvs.., Migration af store polymerer er forsinket, og kan kvantificeres under anvendelse af billedbehandlingssoftware. For eksempel vil reduktionsmidler inducerer en mobilitet shIFT af signalet, der korrelerer med ændringer i de biofysiske egenskaber af slim. Sådant assay kan anvendes til at studere mucin multimerisering proces 13, men også til at teste farmakologiske midler tilsigter at skade mucin-netværket 11. Til slut, mucin agarose Western blotting kombineret med fluorescens mærkningen markant ændret vores tilgang til at studere muciner ved at producere høje kvalitative og kvantitative data.
Almindelige problemer med agarose mucin Western blotting kan medføre følgende resultater: lav signalintensitet, høj baggrund og / eller udseendet af punctates på membranen. Adskillige strategier til fejlfinding kan anvendes til at forbedre mucin gelbilleder. Signal intensitet kan øges ved at indlæse større prøvevolumener og / eller øge primære og sekundære antistof koncentrationer. Typisk høj baggrundssignal skyldes utilstrækkelig blokering og / eller skyllevand, der kan løses ved at udføre længere blok/ Vask inkubationer, samt hjælp optimeret blokere buffere, der er kommercielt tilgængelige. Udseendet af punctates kan være resultatet af udvidede membran inkuberinger ved stuetemperatur, hvilket letter bakterievækst. Punctates kan også være forårsaget af skade nitrocellulosemembran fra DTT iblødsætning opløsning (trin 4.1) og kan undgås ved at skylle agarosegel grundigt før overførsel og / eller faldende DTT koncentration på 5 mM.
Den væsentligste begrænsning af agarose mucin Western blotting er manglen på protein stige for høj molekylvægt proteiner og mucin standarder, hvilket hindrer absolut mucin kvantificering. De fleste af de offentliggjorte resultater fra mucin agarosegeler er komparative studier for størrelse og koncentration. Gelpermeationskromatografi med lysspredning kombineret med brydningsindeks er en anden teknik der almindeligvis anvendes til at bestemme præcise molekylvægt og koncentration af makromolekyler. Denne teknik er kostbar ennd mangler specificitet for muciner dermed andre foranstaltninger store molekyler der indgår i stikprøverne, fx DNA. Desuden gelpermeationskromatografi er ude af stand til at skelne mellem mucin typer, dvs.., MUC5AC versus MUC5B, og foranstaltninger og gennemsnitlig koncentration og størrelse fra blandingen af muciner indgår i en given prøve.
Andre teknikker kan anvendes til at studere muciner herunder dynamisk og multi-vinkel lysspredning 1, isopyknisk og rate-zone-centrifugeringer 6, elektronmikroskopi, massespektrometri 1,7,8. Men med undersøgelsen af nye farmakologiske midler rettet mod mucin molekyler, er det bydende nødvendigt at udvikle pålidelige laboratoriemetoder til at studere mucin biologi. Agarose mucin Western blotting er relativt let og billig teknik, der kan bruges til at besvare vigtige spørgsmål vedrørende mucin processer, dvs.., Ændring i mucin byrde, størrelse og forhold. Dette assay vil blive anvendti fremtidige applikationer for at teste narkotika effekt og toksicitet for nye molekyler til formål at fjerne vedhængende slim i in vitro og in vivo modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikt at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris Base | Sigma | T6060-1kg | 1 kg |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | ARK2183-1L | 1 L |
| EDTA | Sigma | EDS-100g | 100 g |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | 1 L |
| Bromophenol Blue | Sigma | 114391-5g | 5 g |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Sigma | L6026-50g | 50 g |
| 20x SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer | Promega | V4261 | 1 L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1 kg |
| Trisodium Citrate (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1kg | 1 kg |
| 10 mM DTT (dithiothreitol) | Sigma | D0632 | 25 g |
| Milk Powder | Saco | Instant non-fat dry milk | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500 ml |
| Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples) | Rockland antibodies and assays | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples) | UNC | ||
| H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples) | Santa Cruz | sc-20119 | 200 μg |
| 45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples) | Abcam | ab3649 | 100 μg |
| Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0.5 mg |
| Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0.5 mg |
| Electrophoresis Gel Box and Casting Tray | Owl Seperation Systems | ||
| Power Supply Box | Biorad | Model 200/20 | |
| Membrane Blotting Paper | Amersham | 10600016 | |
| Whatman Paper and Nitrocellulose membrane | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230 v | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey Infrared Fluorescence System | LI-COR Biosciences |
References
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure. J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Preciado, D., et al. MUC5B Is the predominant mucin glycoprotein in chronic otitis media fluid. Pediatr Res. 68 (3), 231-236 (2010).
- Wang, Y. Y., et al. IgG in cervicovaginal mucus traps HSV and prevents vaginal herpes infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1036-1044 (2014).
- Linden, S. K., Sutton, P., Karlsson, N. G., Korolik, V., McGuckin, M. A. Mucins in the mucosal barrier to infection. Mucosal Immunol. 1 (3), 183-197 (2008).
- Thornton, D. J., et al. Mucus glycoproteins from 'normal' human tracheobronchial secretion. Biochem J. 265 (1), 179-186 (1990).
- Kesimer, M., Makhov, A. M., Griffith, J. D., Verdugo, P., Sheehan, J. K. Unpacking a gel-forming mucin: a view of MUC5B organization after granular release. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (1), L15-L22 (2010).
- Kesimer, M., Sheehan, J. K. Mass spectrometric analysis of mucin core proteins. Methods Mol Biol. 842, 67-79 (2012).
- van der Post, S., Thomsson, K. A., Hansson, G. C. Multiple enzyme approach for the characterization of glycan modifications on the C-terminus of the intestinal MUC2mucin. J Proteome Res. 13 (12), 6013-6023 (2014).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Methods Mol Biol. 32, 119-128 (1994).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Mol Biotechnol. 5 (2), 171-176 (1996).
- Sheehan, J. K., et al. Physical characterization of the MUC5AC mucin: a highly oligomeric glycoprotein whether isolated from cell culture or in vivo from respiratory mucous secretions. Biochem J. 347 Pt 1, 37-44 (2000).
- Thornton, D. J., Howard, M., Khan, N., Sheehan, J. K. Identification of two glycoforms of the MUC5B mucin in human respiratory mucus. Evidence for a cysteine-rich sequence repeated within the molecule. J Biol Chem. 272 (14), 9561-9566 (1997).
- Sheehan, J. K., et al. Identification of molecular intermediates in the assembly pathway of the MUC5AC mucin. J Biol Chem. 279 (15), 15698-15705 (2004).
- Ehre, C., et al. Overexpressing mouse model demonstrates the protective role of Muc5ac in the lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16528-16533 (2012).
- Livraghi, A., et al. Airway and lung pathology due to mucosal surface dehydration in {beta}-epithelial Na+ channel-overexpressing mice: role of TNF-{alpha} and IL-4R{alpha} signaling, influence of neonatal development, and limited efficacy of glucocorticoid treatment. J Immunol. 182 (7), 4357-4367 (2009).
- Martino, M. B., et al. The ER stress transducer IRE1beta is required for airway epithelial mucin production. Mucosal Immunol. 6 (3), 639-654 (2013).
- Nguyen, L. P., et al. Chronic exposure to beta-blockers attenuates inflammation and mucin content in a murine asthma model. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (3), 256-262 (2008).
- Papakonstantinou, E., et al. COPD exacerbations are associated with pro-inflammatory degradation of hyaluronic acid. Chest. , (2015).
- Abdullah, L. H., Wolber, C., Kesimer, M., Sheehan, J. K., Davis, C. W. Studying mucin secretion from human bronchial epithelial cell primary cultures. Methods Mol Biol. 842, 259-277 (2012).
