Abstract
Muciner, de tungt glykosylerade proteiner foder slemhinneytor, har utvecklats som en nyckelkomponent i medfödda försvar genom att skydda epitel mot invaderande patogener. Huvuduppgiften för dessa makromolekyler är att underlätta partikel fångst och avslut samtidigt främja smörjning av slemhinnan. Under proteinsyntesen, muciner genomgår intensiv O-glykosylering och multimerise, vilket dramatiskt öka massan och storleken av dessa molekyler. Dessa posttranslationella modifieringar är kritiska för de viskoelastiska egenskaperna hos slem. Som en följd av den komplexa biokemiska och biofysiska naturen hos dessa molekyler, som arbetar med muciner ger många utmaningar som inte kan övervinnas med hjälp av konventionella proteinanalysmetoder. Till exempel hindrar deras höga molekylvikt elektro migration genom regelbundna polyakrylamidgeler och deras klibbiga natur orsakar vidhäftning till experimentell slang. Men undersöker rollen av muciner i hälsa(Eg., Upprätthålla mucosal integritet) och sjukdom (eg., Hyperconcentration, mucostasis, cancer) har nyligen vunnit intresse och muciner utreds som ett terapeutiskt mål. En bättre förståelse för produktion och funktion av mucin makromolekyler kan leda till nya farmaceutiska metoder, till exempel, hämmare av mucin granulat exocytos och / eller slemlösande medel. Därför konsekventa och pålitliga protokoll undersöka mucin biologi är avgörande för vetenskapliga framsteg. Här beskriver vi konventionella metoder för att separera mucin makromolekyler genom elektrofores med användning av en agarosgel, överför protein in nitrocellulosamembran, och detekteringssignal med mucin-specifika antikroppar samt infraröda fluorescerande gel läsare. Dessa tekniker är allmänt tillämpas för att bestämma mucin kvantifiering, multimerise och för att testa effekterna av farmakologiska föreningar på muciner.
Introduction
Muciner normalt produceras av slemhinneytor som kantar hålrum exponeras för den yttre miljön (eg., Respiratoriskt, matsmältnings, reproduktiva skrifter, okulär yta) samt inre organ (t.ex. pankreas, gallblåsa, mjölkkörtlar). Närvaron av dessa glykoproteiner bibehåller ytan hydratisering och bildar en fysisk barriär mot patogener. Även mucin produktion är viktigt att mukosala hälsa, mucin hyperconcentration och / eller avvikande slem egenskaper kan leda till kanal obstruktion, bakteriell kolonisering och kronisk inflammation, vilket kan orsaka irreversibel vävnadsskada. En liknande kaskad av händelser observeras i flera sjukdomar, t ex., Cystisk fibros 1, kronisk otitis media 2 och cervicovaginal infektion 3. Därför är det viktigt att förstå vilken roll muciner i hälsa och sjukdom och att upprätta rutin protokoll för proteinidentifiering.
Hittills, 19 muciner gener har identifierats och kodar för stora polypeptidkedjor som sträcker sig från 1200 (eg., MUC1) till 22.000 (t.ex. MUC16) aminosyror. Mucin genfamiljen kan delas in i två undertyper: membranassocierade muciner, som är involverade i cellsignalering och yta avskärmning, och gelbildande muciner, som ansvarar för de viskoelastiska egenskaperna hos slem geler. Membran-associerade muciner är mestadels monomera och fäst till cellytorna via en hydrofob membranöverspännande domänen. I kontrast, gelbildande muciner har flera von Willebrand-faktor (vWF) -liknande och cysteinrika domäner som är väsentliga för bildningen av dynamiska polymera nätverk. Stora glykaner är knutna till serin och treonin-rester fördelade i apomucin. Dessa täta O-bundna oligosackarider kan bidra med upp till 80% av molekylvikten 4. Intra- och intermolekylära disulfidbindningar som förbinder mucin monomerer säkerställa integriteten hos mucin gel nätverk. Som ett resultat av tunga glykosylering och multimerise, muciner är bland de största molekylerna i djurvärlden och kan inte analyseras med standard gelelektrofores med användning av konventionell SDS-PAGE polyakrylamidgel och standardiserade protein stegar. Dessa metoder löser / separera proteiner med molekylvikter lägre än 250 kDa medan mucin monomerer kan nå upp till 2 MDa i fallet med MUC16. Emellertid kan med hög molekylvikt protein stegar användas för att studera små mucin-monomerer (dvs.., MUC1).
En mängd olika tekniker kan användas för att studera mucin storlek, konformation och interaktion. Traditionellt är biokemisk karakterisering av muciner åstadkommas genom mucin isolering via isopyknisk densitetscentrifugering i denaturering buffert, följt av storleks kromatografi och immunodetection (eg., Slot blotting) 5. Dynamisk och / eller flera vinklar ljusspridning ger information om oligomera tillstånd av mucin-rika prover <sup> 1. Dessutom är hastighets zonal centrifugering i kombination med immunodetektion och transmissionselektronmikroskopi som vanligen används för att bestämma den makromolekylära konformationen av muciner 6. Masspektrometri används också för att kvantifiera muciner, upptäcka proteolytisk klyvning och analysera oligosackarid sammansättning 1,7,8. Sådana tekniker är kostsamma, tidskrävande och kräver ofta stora volymer och / eller höga koncentrationer av provet. Den metod som beskrivs häri, dvs., Mucin separation genom elektrofores, är reproducerbar, låg kostnad och kan användas i hög genomströmning studier för att ge relativ mucin kvantifiering och undersöka polymerenhet. Emellertid kräver denna analys med hög affinitet, hög specificitet mucin antikroppar som inte finns för sällsynta muciner (eg., MUC19) eller vissa arter (t.ex.., Gris, iller).
Agaros Western blotting är lämplig för att lösa en mängd olika mucin-rika prover med koncentioner som sträcker sig från 50 | ig / ml (t ex., cell tvättar) och 5 mg / ml (t ex., sputum). Denna analys infördes på 1990-talet och endast utförs i ett fåtal specialiserade laboratorier 9,10. Initialt, hjälpte denna teknik identifiera subpopulationer av mucin-monomerer i humana luftvägssekretioner 11,12 och bekräftade oligomerisering processen i bägarceller, som består av dimerbildning i det endoplasmatiska retiklet följt av dimer multimerise i Golgi-apparaten 13. På senare tid, generering av polyklonala antikroppar mot murina muciner underlättas studier på små djurmodeller (t ex., Mucin bristfälliga, βENaC, OVA-utmanade musmodeller) och öppnade ett nytt fält av forskning för prekliniska studier testa farmakologiska substanser avsedda att avlägsna slem från lungorna 14-17. Som ett resultat av ett ökat intresse för mucin biologi och generering av nya, mer specifika mucin antikroppar, beskriver vi herein den metod för att separera muciner med agarosgelelektrofores, vakuumöverföring till nitrocellulosa och två-färg infraröda fluorescerande detektering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered buffertar för mucin Gel Western blotting
- Förbereda en liter 50x TAE (Tris-acetat-EDTA) buffert.
- I 700 ml destillerat vatten (dH 2 O) tillsätt 242 g Tris-bas (0,4 M), 57,1 g isättika (väga vätska) (0,2 M) och 14,61 g etylendiamintetraättiksyra (EDTA) (50 mM).
- Justera pH till 8,0 och fyll på vatten upp till 1 liter med dH 2 O.
- Förbered 10 ml av 10x laddningsbuffert.
- Förbered 5 ml 1x TAE buffert. För att göra detta, tillsätt 5 ml glycerol (50%), 25 mg bromofenolblått (0,25%), och 100 mg natriumdodecylsulfat (SDS) (1%).
- Förbered 2 liter 20x natrium saltlösning citrat (SSC) buffert.
- I 1,5 liter dH 2 O, tillsätt 350,6 g NaCl (3 M) och 176,4 g trinatriumcitrat (Na 3 C 6 H 5 O 7) (0,3 M). Justera pH till 7,0 och göra upp volymen till 2 liter med dH 2 O.
- Förbereda en liter 1x TAE-0,1% SDS-buffert.
- Tillsätt 20 ml av 50x TAE till 980 ml dH 2 O. Lägg 1 g av SDS för att göra en 0,1% SDS-TAE-lösning.
2. TAE-SDS Agarose Gel Preparation
- (. Dvs., 150 ml) pour tillräcklig volym för att i 1x TAE-0,1% SDS-buffert i en i mikrovågsugn Erlenmeyerkolv göra en 5-7 mm tjock gel. Lägg 0,8% (1,2 g) agaros pulver.
- Mikrovågsugn kolven i 30 sek intervaller med intermittent virvlande tills agarosen är fullständigt upplöst (vanligen 1-3 minuter). Använd heta hand kuddar under denna process. Var försiktig med överkokning medan virvlande.
- Låt agaroslösningen svalna i 5-10 min. Obs! Agaroslösningen kommer att vara redo att hällas när botten av kolven kan lämnas på handflatan i 5 sek.
- Förbered elektrofores gjutning facket (10 x 15 cm) genom att försegla kanterna med tejp och placera väl kamma på plats.
- Häll agaroslösningen långsamt i than gjutning facket för att undvika bildandet av bubblor. Avlägsna bubblor med användning av en pipettspets. Vänta på gelén svalna och helt stelna. När stelnat, ta bort kammen långsamt för att undvika kollaps brunnarna genom sugning och ta bort tejpen från kanterna av facket.
- Placera agarosgel i gelboxen och fylla elektroforesenheten med 1x TAE-0,1% SDS buffert tills gelen är helt täckt.
3. Prov Lastning och elektroforesseparation
Obs: I vårt laboratorium använder vi vanligen prover från både mus och människa, däribland bronkoalveolär sköljvätska (BALF, båda arter), celltvätt från humana bronkiala epitelceller (HBE) och mänsklig saliv och slemprov. Prover kan denatureras i 6 M urea vid insamling eller lagras under korta tidsperioder (6 timmar) genom att tillsätta proteinas cocktail hämmare.
- Framställning av prover för lastning genom att tillsätta 10% av laddningsfärg till varje prov (dvs., 30 pl prov och treil av färgämne). Homogenisera prover genom att pipettera upp och ned. snurra kort ner rören vid 5000 rpm för att samla droppar.
- Lasta lika stor volym av prover i brunnarna.
- Pre-våta tips och / eller använda förträngningspipetter för att underlätta lastning av högviskösa prover. Sakta aspirera 80-90% av prov-färglösningen (dvs 27-30 il) för att undvika pipettering bubblor.
- Långsamt ladda vid botten av brunnarna och successivt flytta pipettspetsen uppåt. För prover som förblir knutna till pipettspetsen, dosera vid en 45 ° vinkel och långsträckt rakt ovanför brunnen eller försiktigt använda sidan av brunnen för att bryta den trådiga slem. Inte överbelasta brunnarna.
- Ansluter elektroderna från gelén rutan till elektrofores kraftgenerator. Se till att elektroderna är korrekt anslutna (dvs., Blymönja ansluten till den positiva utgången på generatorn) för att tillåta negativt laddade muciner att köra mot den positiva elektrod.
- Kör gelen vid 80 volt under 90 min för en enda kam gel, eller 60: - 75 min för en dubbel kam gel för att förhindra överlappning mellan de två raderna.
- Slå generator strömmen och koppla bort elektroderna från strömkällan.
- Försiktigt bort gelén från gelén låda med en hand på vardera sidan om gjutningsfacket för att säkerställa att gelén förblir på plats.
4. Minska Agarose Gel för effektiv mucin Transfer
- Placera försiktigt gel lägenhet i en glasbehållare. Skölj gelén med dH 2 O för att avlägsna spår av TAE-SDS-buffert.
- Förbereda en liter 4x SSC-buffert genom att tillsätta 200 ml av 20x SSC i 800 ml dH 2 O. Göra 200 ml 10 mM ditiotreitol (DTT) 4x SSC-lösning genom att tillsätta 309 mg av färsk DTT i 200 ml 4x SSC-buffert.
- Blötlägg gelen med DTT-4x SSC-buffert och lock. Skaka under 20 minuter (10 varv per minut). Skölj gel med DTT-fria 4x SSC-buffert.
- Förbered vakuumläskpapper för överföring.
- Skär försiktigt nitrocellulosamembran vid dimensioner något bredare än gelen (dvs., 10 x 15 cm).
- Våt porös matta med dH 2 O och placera den släta sidan upp i läsk.
- Våt nitrocellulosamembran med DTT-fri 4x SSC-buffert och placera den i mitten av den porösa mattan.
- Täck den porösa mattan med gummipackningen, vilket lämnar öppningen hos packningen exakt inriktad med nitrocellulosamembranet. Om porös matta är fortfarande synliga, justera försiktigt membranet att säkerställa att ingen klyfta mellan packning och membran.
- Placera försiktigt agarosgel ovanpå membranet. Säkerställa gel bildas en tät tätning med packningen och brunnarna hos gelén är placerade på membranet för överföring.
- Undvika bildandet av bubblor mellan membranet och gelén. För att minimerabildandet av bubblor, spruta några droppar 4x SSC buffert på membranet och skjut gelén från topp till botten för att spola eventuella bildade bubblor. Undvik att flytta gel på membranet som proteiner kommer att börja torka omedelbart.
- Noggrant täcka gelen med 4x SSC-buffert.
- Börja mucin överföring genom sugning.
- Vrid vakuumläsk och ställ in trycket på 40 - 50 mbar. Tillsätt några droppar av 4x SSC-buffert på gelén var 5 - 10 min för att förhindra gelén från att torka ut. Kör överföring för 90 minuter. Valfritt: Efter avslutad, markera brunnarna med en penna för orientering.
- Förfoga över gelén och hämta nitrocellulosamembran med plast pincett på kanten av membranet.
6. Membran Blockering och Detection
- Skölj omedelbart membran med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Låt inte membranet torka ut.
- Sänk membranet i 50 ml 3% mjölk-PBS blockerande buffert och placera på en rocker vid rumstemperatur under 1 timme. Efter inkubation, kassera blockerande buffert.
- Sänk membran i 1% mjölk-PBS primär antikropp lösning. Inkubera membranet i den primära antikroppslösningen över natten på en rocker vid 4 ° C. Efter inkubation, kassera den primära antikroppen lösning. Späd de primära antikropparna till en 1: 2000 förhållande av antikroppslösningen till blockeringsbuffert. Obs: För prover med ursprung från möss, använder vi UNC 222 kanin anti-Muc5b och get-anti-grönt fluorescerande protein (GFP). För prover som härrör från människor, använder vi H300 anti-MUC5B och 45M1 anti-MUC5AC primära antikroppar.
- Tvätta membran 3 gånger med PBS under 10 minuter på en rocker.
- Sänk membran i 1% mjölk-PBS sekundär antikropp lösning. Späd de sekundära antikropparna till en 1: 7500 förhållande av antikroppslösningen till blockeringsbuffert och inkubera vid rumstemperatur i 1 h på en rocker (t.ex., 700 anti-kanin och 680 anti-get.). Skyddas från ljus genom inkubation i en icke-transparent samarbetentainer. Kassera den sekundära antikroppslösningen efter en timme.
- Tvätta membran 3 gånger med PBS under 5 min. Skölj membranet med dH 2 O för att avlägsna salt.
- Läs membranet på en infraröd fluorescens system enligt tillverkarens instruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi visar representativa resultat av mucin uttryck följande agarosgelelektrofores i BALF från lungorna hos möss (Figur 1). I det här exemplet har vi använt agarosgel för att visa uppreglering av mucin produktion efter IL-13 behandling av Tg-Muc5ac musmodell. Western blot visar en visuell representation av mucin uttryck som kan användas för en kvantitativ analys av multimer eller monomer-bandsignalen intensitet (Figur 2). Denna metod kan också användas för att visa uttrycket av muciner i humana bronkial epitel (HBE) celltvätt och mänskliga sputumprov. Denna metod kan användas för att visa en minskning av muciner efter behandling med reduktionsmedel. Vi visar representativa resultat från HBE tvätt behandlats med ökande koncentrationer av DTT (Figur 3). Vi kvantifierade förlusten av multimer signalintensitet efter mucin reduktion med behandling med ett reduktions åldernt (Figur 4).
Figur 1. Uppreglering av mucinproduktion Efter IL-13 Behandling av Tg-Muc5ac / grönt fluorescerande protein (GFP) musmodell Möss som överuttrycker Muc5ac taggade med GFP instillerades med PBS. (-) Eller IL-13 (+) för att inducera bägare cell metaplasi och ökar mucin produktion i lungorna (n = 3 per grupp). BALF skördades och separerades via mucin agaros Western blotting. Membranet sonderades med en kanin polyklonal anti-Muc5b (röd) och en get polyklonal anti-GFP (grön). Den infraröda system kan användas för att visa resultaten som ett överlägg eller som en enda kanal med möjlighet att ändra bilder till svartvitt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Kvantitativ analys av Mucin Agarose gel som visar uppreglering av mucinutsöndring i IL-13-behandlade möss. Muc5b signalintensiteten mättes för varje körfält på mucin-gel som visas i figur 1. Resultaten visar att mucin utsöndring ökades 5,1-faldigt över PBS-behandlade möss i IL-13-behandlade djur (n = 3, p <0,005). Data visas som medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Reduktion av MUC5AC och MUC5B Muciner i HBE Tvättar Behandlade med DTT. HBE tvättarna behandlades med 0, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 och 100 mM DTT vid 37 ° C under 30 minutes. Membran undersöktes med en kanin polyklonal anti-MUC5B (grön) och en mus polyklonal anti-MUC5AC (röd). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Kvantitativ analys av mucin agarosgel Visar försvinnande det multi Band i HBE Tvättar behandlade med DTT. MUC5AC och MUC5B signalintensiteten mättes för varje körfält på mucin gel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet av mucin Western blotting beskrivs i denna video kombinerar konventionella tekniker som används inom molekylärbiologi för att separera och överföra stora makromolekyler, såsom DNA, med regelbundna tekniker för proteindetektion, det vill säga., Immunoblotting. Samma teknik kan tillämpas för att studera biologi komplexa glykosaminoglykaner, såsom nedbrytningen av hög molekylvikt hyaluronsyra 18. Även om denna teknik skulle kunna användas i ett brett område av analyser förlitar sig framgångsrik agaros Western blotting på en mängd olika steg som kräver noggranna och tidsberoende åtgärder. För att maximera framgång bör vissa kritiska steg ses över.
Provberedning och gel lastning är viktiga steg för korrekta resultat. Mucin-rika prover, dvs., Sputa, är till sin natur, vidhäftande experimentell slang, dvs., Pipettspetsar, centrifugrör, filter. Användningen av förträngningspipetter och pre-wetting pipettspetsar kan underlätta lastning av viskoelastiskt material i brunnarna. Sådana prover kräver särskild uppmärksamhet på grund av ökad flytförmåga och klibbighet av dessa material. Koncentrerade prover (över 5 mg / ml) kommer dåligt migrera genom porstorleken hos en 0,8% agarosgel och kan kräva ytterligare utspädning och / eller denaturering i upp till 6 M urea. Men undvika att köra prover denature i guanidiniumklorid (GuHCl) som guanidinium kommer fällas med SDS. Därför prover lagrade i GuHCl kräver en ytterligare dialyssteg. För icke-polymera studier status kommer partiell reduktion (0,5 mM DTT under 5 min) avsevärt förbättra migration av koncentrerade prover (se figur 3).
Proteinöverföring till nitrocellulosamembranet är ett viktigt steg för detta protokoll och, om inte utförs med precision, kan leda till färgade membran, svag signal och falska kvantitativa resultat. Nitrocellulosamembran är känsliga och lätt förorenas ochbör alltid behandlas med handskar och omsorg för att undvika ospecifik bindning och skador. Placering av gelén på membranet kräver exakt inriktning för att generera en tät tätning och förhindra transferbuffert läckage, vilket skulle resultera i fläckar och minska överföringseffektiviteten. Bubbelbildning mellan gel och membran kommer att förhindra proteinöverföring och bör undvikas noggrant.
Optimal immunodetection förlitar sig på hög affinitet, hög specificitet antikroppar mot proteinet ryggraden i målet mucin. Nyligen nya immuniseringsstrategi, antigen design och screening teknik ger ökad framgång med genereringen av mucin antikroppar och gav nya verktyg för att studera mucin biologi. För att detektera två olika muciner på en blot, dvs., MUC5AC och MUC5B, måste de två primära antikroppar härledas från olika värdarter, det vill säga, kanin och get. Även de sekundära antikroppar måste märkas med olika fluorofors som skall detekteras i både 700 Nm och 800 nm-kanalen.
Relativ mucin överflöd och mucin storlek kan kvantifieras direkt med bildbehandlingsprogram. Fluorescerande signal är direkt proportionell mot mängden mål-mucin, vilket möjliggör kvantifiering av ett brett intervall av prover, från låg (t ex., Celltvättningar) till hög (eg., Sputum) mucin koncentration. Kräver dock absolut mucin koncentration rening av mucin standarder, som inte beskrivs i detta protokoll eftersom det är en lång och svår process som beskrevs i Abdullah et al. 19. Dessutom agaros Western blotting ger möjlighet att utföra mucin skiftningsanalyser för att studera processen för polymerisation eller depolymerisation. Elektroforetisk mobilitet av muciner beror på deras polymera tillstånd, dvs., Migration av stora polymerer är försenad, och kan kvantifieras med hjälp av bildprogram. Till exempel, kommer reduktionsmedel inducerar en rörlighet shift för den signal som korrelerar med förändringar i biofysikaliska egenskaperna hos slem. Sådan analys kan användas för att studera mucin multimeriseprocessen 13 utan också för att testa farmakologiska medel som syftar till att påverka mucin nätet 11. Avslutningsvis mucin agaros Western blotting i kombination med fluorescensmärkning har kraftigt förändrat vår syn att studera muciner genom att producera höga kvalitativa och kvantitativa data.
Vanliga problem med agaros mucin Western blotting kan ge följande resultat: låg signalintensitet, hög bakgrund och / eller utseendet på punctates på membranet. Flera felsöknings strategier kan användas för att förbättra mucin gel bilder. Signalstyrka kan ökas genom att ladda större provvolymer och / eller ökande primära och sekundära antikroppskoncentrationer. Vanligtvis är hög bakgrundssignal kan tillskrivas otillräcklig blockering och / eller tvätt, som kan lösas genom att utföra längre blockera/ Tvätta inkubationer, samt med hjälp av optimerade blockerande buffertar som är kommersiellt tillgängliga. Utseendet på punctates kan vara resultatet av förlängd membran inkubationer vid rumstemperatur, vilket underlättar bakterietillväxt. Punctates kan också orsakas av nitrocellulosamembran skador från DTT blötläggningslösningen (steg 4,1) och kan undvikas genom att skölja agarosgelen ordentligt innan överföring och / eller minskande DTT koncentration till 5 mM.
Den största begränsningen av agaros mucin Western blotting är bristen på protein stege för hög molekylvikt proteiner och mucin standarder, som hindrar absolut mucin kvantifiering. De flesta av de resultat som publicerats av mucin agarosgeler är jämförande studier för storlek och koncentration. Storleksexklusionskromatografi med ljusspridning i kombination med brytningsindex är en annan teknik som vanligen användes för att bestämma exakta molekylvikt och koncentration av makromolekyler. Men är denna teknik kostsam ennd saknar specificitet för muciner därmed andra åtgärder stora molekyler som ingår i urvalet, till exempel DNA. Dessutom är gelkromatografi inte kan skilja mellan mucin typer, dvs., MUC5AC kontra MUC5B och åtgärder och genomsnittlig koncentration och storlek från blandningen av muciner ingår i en viss prov.
Andra tekniker kan användas för att studera muciner inklusive dynamisk och flera vinklar ljusspridning 1, isopyknisk och hastighets zoner centrifuge 6, elektronmikroskopi, masspektrometri 1,7,8. Men med utredningen av nya farmakologiska medel inriktade på mucin molekyler, är det absolut nödvändigt att utveckla tillförlitliga laboratorietekniker för att studera mucin biologi. Agaros mucin Western blotting är en relativt enkel och billig teknik som kan användas för att besvara viktiga frågor om mucin processer, dvs., Förändring av mucin börda, storlek och förhållande. Denna analys kommer att användasi framtida tillämpningar för att testa läkemedlets effektivitet och toxicitet för nya molekyler som syftar till att undanröja vidhäftande slem i in vitro och in vivo-modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen konflikt att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris Base | Sigma | T6060-1kg | 1 kg |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | ARK2183-1L | 1 L |
| EDTA | Sigma | EDS-100g | 100 g |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | 1 L |
| Bromophenol Blue | Sigma | 114391-5g | 5 g |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Sigma | L6026-50g | 50 g |
| 20x SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer | Promega | V4261 | 1 L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1 kg |
| Trisodium Citrate (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1kg | 1 kg |
| 10 mM DTT (dithiothreitol) | Sigma | D0632 | 25 g |
| Milk Powder | Saco | Instant non-fat dry milk | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500 ml |
| Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples) | Rockland antibodies and assays | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples) | UNC | ||
| H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples) | Santa Cruz | sc-20119 | 200 μg |
| 45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples) | Abcam | ab3649 | 100 μg |
| Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0.5 mg |
| Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0.5 mg |
| Electrophoresis Gel Box and Casting Tray | Owl Seperation Systems | ||
| Power Supply Box | Biorad | Model 200/20 | |
| Membrane Blotting Paper | Amersham | 10600016 | |
| Whatman Paper and Nitrocellulose membrane | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230 v | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey Infrared Fluorescence System | LI-COR Biosciences |
References
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure. J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Preciado, D., et al. MUC5B Is the predominant mucin glycoprotein in chronic otitis media fluid. Pediatr Res. 68 (3), 231-236 (2010).
- Wang, Y. Y., et al. IgG in cervicovaginal mucus traps HSV and prevents vaginal herpes infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1036-1044 (2014).
- Linden, S. K., Sutton, P., Karlsson, N. G., Korolik, V., McGuckin, M. A. Mucins in the mucosal barrier to infection. Mucosal Immunol. 1 (3), 183-197 (2008).
- Thornton, D. J., et al. Mucus glycoproteins from 'normal' human tracheobronchial secretion. Biochem J. 265 (1), 179-186 (1990).
- Kesimer, M., Makhov, A. M., Griffith, J. D., Verdugo, P., Sheehan, J. K. Unpacking a gel-forming mucin: a view of MUC5B organization after granular release. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (1), L15-L22 (2010).
- Kesimer, M., Sheehan, J. K. Mass spectrometric analysis of mucin core proteins. Methods Mol Biol. 842, 67-79 (2012).
- van der Post, S., Thomsson, K. A., Hansson, G. C. Multiple enzyme approach for the characterization of glycan modifications on the C-terminus of the intestinal MUC2mucin. J Proteome Res. 13 (12), 6013-6023 (2014).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Methods Mol Biol. 32, 119-128 (1994).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Mol Biotechnol. 5 (2), 171-176 (1996).
- Sheehan, J. K., et al. Physical characterization of the MUC5AC mucin: a highly oligomeric glycoprotein whether isolated from cell culture or in vivo from respiratory mucous secretions. Biochem J. 347 Pt 1, 37-44 (2000).
- Thornton, D. J., Howard, M., Khan, N., Sheehan, J. K. Identification of two glycoforms of the MUC5B mucin in human respiratory mucus. Evidence for a cysteine-rich sequence repeated within the molecule. J Biol Chem. 272 (14), 9561-9566 (1997).
- Sheehan, J. K., et al. Identification of molecular intermediates in the assembly pathway of the MUC5AC mucin. J Biol Chem. 279 (15), 15698-15705 (2004).
- Ehre, C., et al. Overexpressing mouse model demonstrates the protective role of Muc5ac in the lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16528-16533 (2012).
- Livraghi, A., et al. Airway and lung pathology due to mucosal surface dehydration in {beta}-epithelial Na+ channel-overexpressing mice: role of TNF-{alpha} and IL-4R{alpha} signaling, influence of neonatal development, and limited efficacy of glucocorticoid treatment. J Immunol. 182 (7), 4357-4367 (2009).
- Martino, M. B., et al. The ER stress transducer IRE1beta is required for airway epithelial mucin production. Mucosal Immunol. 6 (3), 639-654 (2013).
- Nguyen, L. P., et al. Chronic exposure to beta-blockers attenuates inflammation and mucin content in a murine asthma model. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (3), 256-262 (2008).
- Papakonstantinou, E., et al. COPD exacerbations are associated with pro-inflammatory degradation of hyaluronic acid. Chest. , (2015).
- Abdullah, L. H., Wolber, C., Kesimer, M., Sheehan, J. K., Davis, C. W. Studying mucin secretion from human bronchial epithelial cell primary cultures. Methods Mol Biol. 842, 259-277 (2012).
