Abstract
El cultivo in vitro de células humanas primarias del epitelio bronquial (HBE) usando condiciones de interfaz aire-líquido proporciona un modelo útil para estudiar los procesos de diferenciación celular de las vías respiratorias y la función. En los últimos años, el uso de vectores lentivirales para la entrega transgén se convirtió en una práctica común. Mientras que hay informes de la transducción de las células epiteliales de las vías respiratorias completamente diferenciadas con ciertas lentivirus seudo-tecleado sin infección por VIH, la eficiencia global de transducción es generalmente menos de 15%. El protocolo presentado aquí proporciona un método fiable y eficiente para producir lentivirus y para la transducción de células epiteliales bronquiales humanas primarias. El uso de células epiteliales bronquiales no diferenciadas, la transducción en medio de crecimiento epitelial bronquial, mientras que las células se adhieren, con una multiplicidad de infección de factor de 4 proporciona eficiencias de cerca de 100%. Este protocolo describe, paso a paso, la preparación y la concentración de los vectores de lentivirus de alto título y THproceso de transducción e. Se analizan los experimentos que determinaron las condiciones óptimas de cultivo para lograr la transducción de alta eficiencia de las células epiteliales bronquiales humanas primarias.
Introduction
El desarrollo de los lentivirus, pseudotyped replicación defectuosa (LV) ha proporcionado a los investigadores un método seguro y eficaz para entregar los transgenes in vitro 1. Debido a su expresión a largo plazo, estos LV también podría ser utilizado para la administración de agentes terapéuticos in vivo 2,3. La producción de LV requiere co-transfección de riñón embrionario humano (HEK) células con varios plásmidos: vector de transferencia, de la mordaza de embalaje / pol, rev embalaje, y el sobre vesicular glicoproteína del virus de la estomatitis (VSV-G) plásmidos. Sistemas de envasado de tercera generación se consideran más seguros que los sistemas de segunda generación porque el gen rev se codifica en un plásmido de empaquetamiento separado, reduciendo así la posibilidad de recombinación para producir un lentivirus de replicación competente. Aunque los sistemas de envasado de segunda generación producen cinco unidades de transducción totales más altos de plegado, la escisión del genoma viral original para crearel sistema de tercera generación se ha reducido el nivel de transducción sólo mínimamente 3,4.
Mientras que las líneas de células pueden ser transducidas con mayor facilidad y de manera eficiente, los investigadores han cambiado su enfoque a las células primarias, ya que estos son más representativos de tejidos in vivo 5,6. Sin embargo, las células primarias son refractarios a la transducción. Si bien se ha informado de la transducción de las células epiteliales de las vías respiratorias totalmente diferenciadas, la eficiencia global no ha superado el 15% 7.
Aquí se describe un protocolo que permite la producción de volúmenes lógicos de alto título. Un enfoque paso a paso se describe para alcanzar casi el 100% la eficacia de transducción en células primarias HBe. Más específicamente, el protocolo describe las condiciones de cultivo óptimas instrumentales para tener éxito 3. Brevemente, las células HEK 293T se transfectan con el vector de expresión lentiviral Pcdh con el objetivo EF-1 promotor que dirige la expresión de verde fluorescenteproteína (eGFP) o mCherry, una proteína fluorescente de color rojo, y un sistema de envasado de tercera generación. LV liberadas en los medios de comunicación se recogen de 24 a 72 horas más tarde. Las partículas de virus se concentran con polietilenglicol (PEG), un método conveniente y fácil de la concentración viral, antes de la estimación de título usando un kit de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima antígeno p24 (ELISA). Posteriormente, las células primarias HBe indiferenciadas son transducidas en medios de proliferación (medio de crecimiento epitelial bronquial o BEGM) 8, mientras que la fijación (después de ser tripsinizadas), a una multiplicidad de infección (MOI) factor de 4, la adición de bromuro de hexadimetrina e incubando durante 16 hr ( durante la noche). Las células se dejan a diferenciarse. Puesto que el transgén viral se expresa a largo plazo (mediante el promotor apropiado, véase la discusión), la expresión se mantendrá durante la diferenciación en un epitelio de las vías respiratorias pseudostratified o puede ser inducida (usando un promotor inducible) después de la diferenciación.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Etapa 1: Cultivo de células HEK 293T
- Preparar medios células HEK (referido como medios HEK) mediante la adición de 10% (v / v) de suero bovino fetal (FBS) y 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina al alto nivel de glucosa de Dulbecco Modificado de Eagle Medium (DMEM).
- Escudo una placa de 10 cm de cultivo de tejidos con colágeno I. Se mezclan 30 l de colágeno I en 2 ml de agua destilada. Corre la mezcla en el plato y se incuba durante 2 horas a 37 ° C y 5% de CO2.
- Retire la mezcla y dejar que el plato de seco en una cabina de flujo laminar durante 15 minutos.
- Células de la placa HEK sobre el plato recubierto a una densidad de células de 1 x 10 6 en 10 ml de medio HEK y se incuba a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Cuando las células HEK son 50-60% de confluencia (Figura 1a, 2-3 días después de la siembra), pasar a la Fase 2. Evaluación visual de la confluencia es suficiente. No se necesita la cuantificación.
Nota: las células HEK se cultivan en medio HEK (ver arriba). Cuando alcanzan la confluencia, tey se puede dividir (por ejemplo 1/5) o congelados para futuros usos.
2. Etapa 2: producción y concentración de lentivirus (LV) en células HEK
Nota: Los protocolos deben ser ejecutados de acuerdo con las normativas institucionales y gubernamentales bajo condiciones (+ mejoradas BSL-2) en el EE.UU. BSL-2.
- Transfectar usando un procedimiento de precipitación de calcio (lipofectamina y otros agentes de transfección no eran tan eficiente como el procedimiento de precipitación de calcio). Se recomienda el uso de un kit de transfección comercial para asegurar la reproducibilidad, aunque el procedimiento se modifica de la siguiente manera. Mantener los reactivos a temperatura ambiente. Este es el día 0.
- Para cada placa de 10 cm de células HEK293, mezclar 4,5 g de dotación de ADN PMD2-VSVG, 7,5 g de envases de ADN pMDLg / pRRE, 3,75 g de ADN pRSV- rev, 10 g de ADN del vector de expresión lentiviral, 86 l de una solución de calcio 2 M y agua estéril en un tubo de centrífuga de 15 ml hasta un volumen final de 700 l(Estas dos últimas soluciones se proporcionan en el kit de transfección comercial).
- Gota a gota, añadir 700 l de solución salina tamponada con HEPES (HBS 2x, proporcionados en el kit de transfección), mientras que un vórtex (en la campana de flujo laminar) y se incuba a temperatura ambiente durante 30 min (realizar el paso 4 a la espera).
- Durante el tiempo de incubación temprana, depósito de 5 l de la mezcla en un portaobjetos. Compruebe que la gota bajo un microscopio con un objetivo de 10X, centrándose lentamente hacia arriba y hacia abajo. Un precipitado fino debe ser visible, lo que confirma el proceso de precipitación de fosfato de calcio (Figura 1b).
- Detener la precipitación después de 30 minutos mediante la adición de 10 ml de células HEK medios de comunicación y la pipeta hacia arriba y abajo para mezclar.
- Sacar la fuente de las células HEK desde el paso 2,1-2,5, y se elimina el medio (día 0). Añadir la solución de precipitado de la etapa 2.5 con cuidado y lentamente a lo largo del borde del plato.
- Al día siguiente (día 1), retirar y desechar el medio que contiene el precipitado y reemplazarlo wITH 10 ml de medio HEK. Comprobar si el precipitado fino bajo el microscopio: debe ser visible en el plato en los espacios vacíos entre las células (Figuras 1c y D).
- En el día 2, los medios de comunicación recoger con una jeringa, filtro a través de un filtro de jeringa de 0,45 micras en un tubo de centrífuga de 15 ml que contiene 3,8 ml de un polietilenglicol 40% de solución (PEG). Invertir 5x para mezclar y almacenar a 4 ° C durante al menos 24 horas (para el PEG precipitar para formar, pero no más de 5 días) hasta que todas las colecciones de virus están completos.
- Repita el paso 2.8 en los días 3 y 4. En el día 4 no reemplazan con medio HEK pero descontaminar con un 10% de lejía y desechar el plato.
- Centrifugar todos los tubos de recogida (por lo general todas las colecciones reúnen en el día 5) a 1.650 xg durante 20 min a 4 ° C para sedimentar el virus. Retirar y desechar el sobrenadante, y girar de nuevo a 1.650 xg durante 5 min a 4 ° C para recoger y eliminar cualquier resto de PEG sobrenadante.
- ResusPend el sedimento de cada tubo en 200 l de medio de crecimiento epitelial bronquial (BEGM) sin anfotericina B 8. a un fondo común y la alícuota en 200 l. virus de la tienda a -80 ° C. Alícuota de un 10 l adicionales para llevar a cabo el VIH-1 Gag ensayo ELISA (p24) antígeno.
- El uso de un kit de ELISA comercial, realizar un ensayo de antígeno p24 según el protocolo del fabricante. El ensayo da una estimación de p24 viral en pg / ml.
3. Etapa 3: células de cultivo primario HBE
- Células de la placa HBE en 10 ml de medio BEGM (con 100 l de anfotericina B si se utilizan pasaje 0 células para eliminar la posible contaminación por hongos) a una densidad de células de 1 x 10 6 en un colágeno I recubren 10 cm placa de cultivo tisular. Se incuba a 37 ° C y 5% de CO2.
- Al día siguiente, se elimina el medio y reemplazar con 10 ml BEGM (con 100 l de anfotericina B para el paso 0 células) para un total de 4 días. Retorno a la incubadora.
- Después de 4 díasays, utilizan sólo BEGM sin medios anfotericina B. Cambio cada dos días.
- Cuando las células son 80-90% de confluencia (Figura 2a; ~ 7 días después de la siembra), siga los pasos de transducción (prestar atención a 3.5 para la preparación antes de la transducción). Una vez más, la evaluación visual de confluencia es suficiente. No se necesita la cuantificación.
- Antes de la transducción, capa los insertos de soporte permeable con una solución de colágeno IV diluye 1/10 con agua destilada estéril. Añadir 200 l de cada inserto y dejar secar durante la noche en la campana de flujo laminar.
4. Etapa 4: Transducción de células HBE
- Retire el medio, añadir 3 ml de 0,1% de tripsina en ácido etilendiaminotetraacético 1 mM en solución salina tamponada con fosfato (EDTA / PBS) y se incuba 5 min a 37 ° C y 5% de CO 2. Compruebe bajo el microscopio (objetivo de 10X) para ver si se desprenden todas las células. Si no es así, volver a la incubadora durante 5 minutos adicionales.
- Cuando se separan todas las células, añadir 3ml de inhibidor de tripsina de soja (SBTI 1 mg / ml), mezclar y transferir a un tubo de centrífuga de 15 ml. Sedimentar las células por centrifugación a 460 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
- Retire sobrenadante y el sedimento se vuelve a suspender en 3 ml de BEGM y proceder con el conteo.
- Resuspender las células HBE (ahora paso 1 o P1) en una proporción de 2 x 10 5 células por un inserto de soporte permeable 12 mm en 400 l de BEGM (ver Tabla 2). Extrapolar estos números basados en la cantidad de inserciones de soporte permeable que serán transducidas.
| Superficie | Área de superficie | recuento de células | Medios de comunicación | Volumen (medios de comunicación) |
| plato de 10 cm | 52,7 cm 2 | 1 x 10 6 | BEGM | 10 ml | </ Tr>
| filtro de 12 mm | 1.13 cm 2 | 2 x 10 5 | BEGM | 400 l |
| filtro de 24 mm | 4.52 cm 2 | 8 x 10 5 | BEGM | 800 l |
Tabla 2: Los medios de extrapolación por el recuento de células.
- El uso de una multiplicidad de infección de los factores (MOI) de 4, añadir el volumen apropiado de virus a la suspensión celular.
- Añadir bromuro de hexadimetrina a una concentración final 2 mg / ml.
- Dispensar 400 l de la mezcla (BEGM, HBE células, virus y bromuro de hexadimetrina) por inserto de soporte permeable en el compartimiento apical, y añadir 1 ml de BEGM solo al compartimiento basolateral. Incubar toda la noche a 37 ° C y 5% de CO 2. Las células Siempre placa HBE sin virus como el control y la selección de puromicina prueba si procede.
- En el día siguiente, remmedios apical y basolateral ove, se lavan con PBS y se reemplazan ambos compartimentos con interfaz de aire-líquido medios de comunicación (ALI) 8.
- Cuando las células son confluentes, extraer el líquido apical (conocido como el establecimiento de una interfaz aire-líquido). Continuar cambiando el medio (ALI) en el compartimento inferior cada dos días hasta que alcanzan su plena madurez; generalmente de 3 a 4 semanas más tarde.
Nota: Si el vector lentiviral contiene un gen de selección tal como puromicina, las células se pueden seleccionar mediante la adición de puromicina de acuerdo con una curva de concentración de selección. Para las células HBE, una concentración de 1 mg / ml se ha determinado que es ideal para la selección consistente de células transducidas. Sin embargo, esta concentración puede ser diferente para otras células o condiciones y debe ser determinado por matar curvas. Además de puromicina puede comenzar tan pronto como un día después de que los medios de comunicación ha sido sustituido por los medios de comunicación ALI o posterior (2-3 días) para permitir la plena expresión del gen de selección. Asegúrese de añadir puromicina a un inserto que hcomo no se han transducido. Puromicina se puede añadir hasta que las células están completamente diferenciadas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figura 1 representa diferentes pasos clave de la evaluación de las células y las soluciones durante el proceso de transfección. La Figura 1A muestra la confluencia óptima de las células HEK293T antes de la transfección para la producción de virus. Es importante que las células se distribuyen uniformemente por todo el plato. Figura 1b revela el precipitado en una gota de la mezcla de transfección usando la óptica de campo claro y un objetivo 10X. Cuanto más los precipitados parecen granos de arena en lugar de aglomerados, más eficiente será la transfección será. En esta imagen, el precipitado es un poco ásperas. El precipitado es un indicador fiable si la transfección producirá un alto título de virus. Si alguno de los componentes falta o de mala calidad (ADN del vector, por ejemplo), los aglomerados se forman, que es una mala señal. Si este es el caso, es más prudente para cancelar y reiniciar el procedimiento, asegurándose de quetodos los ingredientes están en la mezcla, y / o control de la calidad del ADN del vector y el ADN de envasado. La Figura 1C muestra el mismo plato como A, después de la incubación durante la noche. El precipitado es (y debe ser) visible en entre las células. Nos dimos cuenta de que las células no se multiplican mucho durante la 24 horas después de la transfección.
La figura 2 muestra cómo las células HBE se ven antes y 3 días después de la transducción. La Figura 2A representa las células HBE primaria confluentes aproximadamente 80% antes de la tripsinización y la transducción. Una placa de 10 cm a 80% de confluencia rinde aproximadamente 4 x 10 6 células. La figura 2b muestra que casi el 100% de transducción de las células indiferenciadas P1 HBE utilizando una MOI de 4 en el inserto de soporte permeable. Cuando las células HBE se colocan en estos insertos de soporte permeable, las células son relativamente plana. En esta imagen, la altura de las células es sólo unos pocos micrómetros, que explica por qué el0.4 micras poros son visibles a través de las células.
La Figura 3 muestra experimentos de optimización que conducen a la protocolo presentado. Todos los experimentos se han realizado por triplicado en pocillos recubiertos de colágeno I (placa de 24 pocillos), con 2 x 10 5 células primarias HBe por pocillo. La mayoría de los experimentos utilizaron una MOI de 0,4 con una concentración de 2 mg / ml final de hexadimetrina bromidein medios BEGM. células fluorescentes se contaron 3 días después de la transducción. A pesar de que la optimización inicial del protocolo se ha realizado en plástico, los resultados han sido confirmados en insertos de soporte permeable. Además, los intentos para transducir células P1 HBE completamente diferenciadas no tuvo éxito (datos no presentados), lo que confirma los informes anteriores. Como se ve en la figura 3a, un mayor porcentaje de células HBE se transducen en medios BEGM comparación con ALI. Si las células se cultivan en placas el día antes de la transducción en los medios BEGM, la eficienciase reduce significativamente en comparación con la transducción de células mientras que se Fijación (Figura 3b). Cuando las células P1 HBE se sembraron el día antes de la transducción en ALI medios de comunicación (en lugar de BEGM), la eficacia de transducción disminuye aún más (datos no mostrados). La diferencia entre estos 2 medios de comunicación es la concentración de calcio. BEGM de medios contiene una baja concentración de calcio (0,1 mM) en comparación con los medios de comunicación ALI (1 mM). Formas de calcio y mantiene las uniones estrechas y, por tanto, podrían hacer que sea difícil para las partículas de virus atravesar 9 y acceder a sus receptores en la membrana basolateral. De hecho, algunas infecciones tuvieron éxito a niveles bajos mediante la interrupción de las uniones estrechas utilizando ácido etilen glicol (EGTA), por ejemplo 10. Como se dijo anteriormente, las células P1 HBE completamente diferenciadas son refractarios y sólo pueden ser transducidas con bajas eficiencias de 5-7, lo que podría deberse a uniones estrechas en niveles altos de calcio que contiene los medios de comunicación. Otra explicación parabaja eficiencia de transducción en células completamente diferenciadas es un mecanismo de transporte mucociliar activa cuando el moco podrían actuar como una barrera. O, según lo informado por Bals et al., La etapa de diferenciación en la que las células HBE son, es un factor determinante de la eficacia de transducción 10. El hecho de que más células se transdujeron en BEGM que en los medios de comunicación ALI apoya esta afirmación (Figura 3a).
Como se ve en la Figura 3b, se observó un aumento de la eficiencia de transducción de casi el 50% cuando se transdujeron las células mientras se coloca en comparación con células cultivadas en placas el día antes. En su estudio, Ricks et al. Mostró un incremento del 20% cuando la transducción se realizó después de tripsinización 11. En conjunto, estos resultados sugieren que los medios de comunicación y el estado de maduración de las células es clave para el éxito de la transducción.
El panel en la figura3c, demuestra hexadimetrina bromideplaying papel atrivial en la eficiencia de transducción. Sin embargo, su uso está sugerido en este protocolo, ya que no tiene ningún impacto negativo, pero potencialmente podría ser beneficioso. Bromuro de hexadimetrina es un polímero catiónico que se utiliza en virología para mejorar las eficiencias de transducción de 12. Otros han publicado el uso de protamina, otro polímero catiónico, pero no se encontraron diferencias significativas con respecto a la eficacia de transducción en comparación con bromuro de hexadimetrina 13. Bromuro de hexadimetrina no tiene impacto en el crecimiento ni la diferenciación 14-16.
Por último, los diferentes MOIs se investigaron en la Figura 3d: la más alta eficiencia de la transducción se produjo con una MOI de 4. No hubo diferencia significativa entre MOI 0,4 y 4, sin embargo, MOI 4 transducida 100% de las células HBE mientras MOI 0,4 solamente transducidas 75%. El MOI define la cantidad de partículas de virus will tiene el potencial de infectar una célula. Existen diferentes métodos para determinar la MOI. Uno de ellos es para definir el número de unidades de transducción (UT). El uso de un ELISA, la cantidad de antígeno p24 se puede determinar en pg / ml. p24 viral en picogramos se puede convertir en TU, que son necesarios para calcular la MOI. La MOI se calcula dividiendo el número de TU por el número de células. Hay 10-100 unidades de transducción (UT) por p24 picogramo. Todas las referencias en el texto en relación con MOI se basan en cálculos con 100 UT por p24 picogramos. (Http://tronolab.epfl.ch/webdav/site/tronolab/shared/protocols/TUvsp24.html).
Figura 1:. La transfección de células HEK 293T (a) células HEK 293T cultivadas a 50-60% de confluencia como se ve bajo un objetivo de 10X. (B) precipitado visible en un 5 l caída de 5 minutos después de mezclar todos reageNTS bajo el microscopio (objetivo de 10X). (C) se precipita en el plato próxima a las células, después de la transfección durante la noche (objetivo 10X). (D) Ampliación de centro de (c). Blanco flecha apuntando a precipitar. Barra de escala = 100 micras; es la misma para a, b, c. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Transducción de células NHBE (a) células HBE cultivan en un plato recubiertos de colágeno I a 80-90% de confluencia (aproximadamente 4 x 10 6 células) en medio de BEGM durante 5 días (objetivo 10X).. Barra de escala = 100 micras. (B) eGFP transduced células HBE en insertos permeables de apoyo (12 mm), 3 días después de transducción (confocal, 20X). En este estado, cel HBE ls son planas y los poros de la membrana son visibles. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Optimización del protocolo de transducción (a) Impacto de los medios de comunicación en la eficiencia de transducción.. (B) Comparación de la transducción en las células HBE plateó el día anterior y la transducción de las células mientras se coloca. (C) Influencia de bromuro de hexadimetrina en la eficiencia de transducción. (D) Evaluación de la mejora de la eficiencia de transducción utilizando diferentes MOI. El análisis se realizó mediante la prueba t de Student o la prueba de comparación múltiple de Kruskal-Wallis y de Dunn. Las barras de error representan SE y representan todas * p <0,05.ww.jove.com/files/ftp_upload/54176/54176fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El protocolo descrito aquí asegura cerca de 100% de eficiencia de transducción. Sin embargo, hay algunos pasos durante el proceso que son importantes para lograr este objetivo. Por ejemplo, durante el proceso de transfección, la presencia de precipitados en la mezcla de transducción (caída) o en el plato de la días después de la transducción (Figuras 1b y d) son relevantes para una buena transfección. La ausencia de un precipitado o la presencia de aglomerados puede ser debido a una omisión de uno de los reactivos de transfección, un problema de pH, o una preparación de plásmido malo. Si el precipitado no está presente, hay una alta probabilidad de que ninguno será visible el día siguiente. Por otra parte, la adición de la mezcla de transfección o medios HEK demasiado rápido puede causar que las células HEK se separen, lo que dificulta la transfección y el rendimiento. Otra indicación de un buen rendimiento es al día 6 antes de la etapa de centrifugación: un precipitado blanco debe ser visible en el fondo del tubo. Un mal transfección con casisin virus no creará este precipitado blanco. Durante el proceso de transducción, es fundamental utilizar células primarias HBe que han sido disociados DE y que se encuentran en una de las células madre como el estado con el fin de lograr altas eficiencias de transducción. El uso de un vector que contiene una proteína fluorescente tal como eGFP o mCherry que se visualiza fácilmente puede ser una buena herramienta.
Las modificaciones pueden ser necesarias para que este protocolo para diferentes células primarias. Un enfoque sería reducir la concentración de calcio en los medios. Como se ve en la figura 3a, el uso de medios BEGM que contiene una menor concentración de calcio como resultado significativamente mayor eficacia de la transducción en las células primarias HBe. Otra posibilidad consistiría en aumentar el MOI. Como se muestra en la figura 3d, mayor es la MOI, mejor será la eficacia de transducción. Sin embargo, utilizando una MOI mayor podría llegar a ser tóxico para algunas células.
Sin embargo, hay algunos LIMITA ciones a este protocolo. Esta técnica ha sido desarrollada usando el paso 1 en las células HBE. Los pulmones rechazados para el trasplante se obtuvieron con el consentimiento apropiado para la conformación de investigación a las normas establecidas por la declaración de Helsinki. La obtención de células primarias HBe de fuentes comerciales puede ser costoso. Estas células son por lo general también sólo está disponible en un pasaje superior. Este protocolo no ha sido probado en los pasajes superiores a 2. Otro factor limitante es el ensayo ELISA de antígeno p24. Varias compañías ofrecen el kit, pero a un alto costo. Además, la concentración viral propuesta por el ensayo, es sólo un valor aproximado ya que la prueba detecta p24 lentivirus y p24 libre liberado durante la transfección transitoria 17. Por lo tanto, esta evaluación de la MOI es sólo una estimación. Por último, el uso de diferentes construcciones de expresión (más grande o más pequeño en tamaño) puede no dar los mismos resultados. Por ejemplo, diferentes eficiencias se registraron utilizando mCherry y eGFP (datos no mostrados).
ent "> Hay ventajas de este protocolo sobre otros métodos. Uno de ellos es el proceso de transfección. De hecho, el protocolo propuesto puede producir este tipo de títulos de alta de virus que ya no tendrán que estar concentrados los medios recogidos contienen virus y se podría utilizar directamente para transducir células. el polietilenglicol (PEG), utilizado en este protocolo de concentrar virus, ha sido conocido por ser tóxico para las células de mamíferos 18. Además, si se utilizara de inercia más alto, esto aumentaría el riesgo de toxicidad aún más. Sin embargo, Si la etapa de concentración de PEG se vuelve obsoleto, los investigadores que no han tenido éxito para transducir debido a los efectos de toxicidad podría reconsiderar el uso de los lentivirus. Otra ventaja de este protocolo es la falta de diferencias en la eficiencia de transducción de plástico o inserciones de soporte permeable. el beneficio de estar capaz de transducir en plástico es que se necesitan menos células y partículas de virus. Como resultado, las células se pueden expandir después de transducción y se transfierenen insertos de soporte permeable cuando confluentes (datos no mostrados).La elección de los vectores depende de varios temas, tales como la selección de células transducidas con puromicina o la expresión de proteínas marcadoras como la proteína fluorescente verde (GFP). Existen múltiples vectores comerciales disponibles que son adecuados (pRRLsinPPT.CMV.MCS.Wpre, Pcdh-EF1-MCS-IRES-Puro, Pcdh-EF1-MCS-T2A-Puro, pGEM-T Easy) 15,19-21. La selección de promotores plantea retos, ya que el promotor de CMV utilizado comúnmente es silenciado en las células epiteliales de las vías respiratorias diferenciado 15. Para la expresión específica de las células ciliadas, se recomienda el uso del promotor del zorro-J1. Alternativamente, el promotor EF-1 se puede utilizar para la expresión en todas las células de las vías respiratorias 20,21. Si se busca sobreexpresión de la proteína, el tamaño de la pieza de inserción va a determinar, en parte, la eficacia de transducción. Sin embargo, los tamaños grandes pueden ser acomodados como se ve por transducción exitosa de larga duración ciclasa soluble ciclasa 22 .El laboratorio ha publicado varios sobreexpresión éxito construye 15,16,20-22. Para la expresión de shRNA (por lo general bajo la U6 o H1 promotor), múltiples construcciones tendrán que ser exploradas. Esto puede ser tedioso con las pruebas realizadas en el extremo de la diferenciación (PCR y Western Blot), pero el proceso no puede ser abreviado ya que las células no diferenciadas pueden no ser una buena representación de éxito para las células sometidas a diferenciación. Una vez más, el laboratorio ha publicado múltiples éxito shRNA construye 14,20,21,23.
El uso de este protocolo, más investigadores podrían tener la posibilidad de mejorar significativamente la transducción pobres anteriores. Algunos podrían considerar útil para aumentar la eficiencia al hacer algunos ajustes. Algunos podrían utilizar esta herramienta para descubrir nuevos procesos biológicos o para ser capaz de demostrar conceptos, tanto el uso de desmontables o sobreexpresión estrategias.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Agradecemos a la Alianza Agencia de Recuperación de Órganos Vida de la Universidad de Miami para proporcionar pulmones. También agradecemos al Dr. Lisa Künzi para la preparación de ADN utilizado para los experimentos se muestra en la Figura 2B y 3-D, el Dr. Ben Gerovac y Lisa Novak para el virus mCherry utilizado para los experimentos en las Figuras 3A a C. También se agradece a Gabriel Gaidosh desde la instalación de imágenes, Departamento de Oftalmología de la Universidad de Miami.
Este estudio ha sido patrocinado por subvenciones del NIH, la Fundación de FQ y la asistente de vuelo Instituto de Investigación Médica Dr. Matthias Salathe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | 12306C | use at 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | use at 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | dilute 1:75 in distilled water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfection kit containing 2 M Calcium solution, 2x HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O |
| Polythylene glycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock of 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | use at 1x |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12 mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | dilute 1:10 in distilled water |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | stock of 2 mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | use at 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentiviral expression vector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
References
- Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
- Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Jr Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors--design, biosafety, and production. Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnol. 13, (2013).
- Delenda, C. Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).
- Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).
- Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).
- Castillon, N., et al. Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells. J Gene Med. 6, 846-856 (2004).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. 107, 183-206 (2005).
- Gonzalez-Mariscal, L., et al. Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells. Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).
- Bals, R., et al. Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry. J Virol. 73, 6085-6088 (1999).
- Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).
- Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).
- Manzanares, D., et al. Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume. J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).
- Schmid, A., et al. Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells. J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).
- Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6, (2006).
- Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization. Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).
- Schmid, A., et al. Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP. J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).
- Manzanares, D., et al. Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone. J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).
- Manzanares, D., et al. IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).
- Chen, X., et al. A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).
- Ransford, G. A., et al. Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia. Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).
