Summary
본 연구에 제시된 프로토콜은 유세포 분석을 이용하여 양 및 음의 다 능성 줄기 세포 마커의 운동 측정을 통해 프로그래밍 진행의 실시간 모니터링 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 또한 IPSC 생성시 형태, 마커 또는 기자의 표현의 영상 기반의 평가를 포함한다.
Introduction
환자 유래 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 세포 치료 및 약물 검사를위한 유망한 도구입니다. 그들은 치료를위한 세포의자가 소스를 제공합니다. 또한, 이들은 현재 배아 줄기 세포 (ESC) 라인이 허용하는 것 이상의 유전 질환의 상세한 시험 관내 분석을 가능 유전 배경의 매우 광범위한 세트를 포함한다. 최근의 진보는 센다이 바이러스, 플라스미드 또는 에피 솜의 mRNA 1,2- 함께 프로그래밍 포함 iPSCs를 생성하는 여러 가지 방법의 개발을 이끌어왔다. 특히, 다양한 프로그래밍 방법은 효율성 및 안전성의 레벨 변화와 연관된 다양한 애플리케이션에 자신의 적합성에 영향을 미치는 다른 방법과 다를 가능성이있다. 프로그래밍 기술의 다양한 가용성, 상기 프로그래밍 프로세스를 평가하기위한 방법을 개발하는 것이 중요하게되었다. 대부분의 기존 방법은 형태 나 염색의 정성 검사에 의존줄기 세포 특이 염료 및 항체. 하나는 최근에 개발 된 방법은 PSC 별의 miRNAs 또는 분화 된 세포 고유의 mRNA 3에 민감한 렌티 바이러스 형광 기자를 사용합니다. 이러한 모니터링 방법은 선택과 다른 상황에 대한 재 프로그래밍 기술의 최적화를 용이하게한다. 예를 들어, 재 프로그래밍 CDy1 조절제 4 스크리닝하기 위해 초기 iPSCs하는 형광 프로브로서 사용되었다. 관찰하고 다른 프로그래밍 실험을 비교하는 기능은 프로세스 자체의 이해를 얻는데 중요하다. 예를 들어, 이제 일부 체세포 유형이 다른 5보다 쉽게 재 프로그래밍 것으로 알려져 있으며, 셀 6-8 재 프로그래밍 동안에 중간 상태를 끝까지. 불행하게도, 재 프로그래밍 절차의 기초가되는 메카니즘은 아직 완전히 이해되지 않으며, 따라서, 리 프로그래밍 방법의 정확한 차이 교리되도록 유지efined. 따라서, 모니터링 방법, 평가 및 재 프로그래밍 이벤트를 비교는 줄기 세포 분야에 대한 중요 할 것을 계속한다.
이 프로토콜에서 설명하는 방법은 모니터링을 허용하고, 프로그래밍 프로세스를 평가하고 이들 기술은 프로그래밍 시약의 상이한 세트를 비교하는 방법을 도시한다. 첫 번째 방법은 유세포 포함 양 및 음의 다 능성 줄기 세포 (PSC) 마커에 대한 항체의 조합을 사용하여 분석한다. 두 번째 방법 커플 실시간 영상 및 총 합류 (셀 적용 비율 표면적)와 마커 신호 (형광 신호에 의해 덮여 %의 표면적)의 합류 측정.
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Protocol
1.Solution 및 중간 준비
- 지하실 막 매트릭스 (Engelbreth-홀름 - 떼 종양에서 정제)
- 천천히 밤새 4 ° C에서 얼음에 지하실 막 매트릭스 (5 ㎖) 해동.
- 멸균, 사전 냉장 15 ML 원뿔 튜브 얼음 감기, 멸균 DMEM / F-12 배지 5 ㎖로 1 : 원액 1을 희석. 사전 냉장, 1.5 ml의 멸균 마이크로 원심 분리기 튜브에 분취 량을 분배하고 즉시 -20 ° C에 저장합니다.
- 4 ℃에서 밤새 1 기저막 매트릭스 분취 : 사용하기 전에, 1 냉동 해동. 분취 한 빙냉 1의 최종 희석 멸균 DMEM / F-12 배지에서 또 다른 50 배 : 100 사용시에, 상기 한 희석.
- 적당한 조직 배양 (TC) 100 배 희석 기저막 매트릭스 용액을 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다 : 1의 적당량을 추가한다. 일반적으로, 코팅 기술위원회 접시 O로 희석 기저막 매트릭스 용액 3 ㎖을 사용F 20cm 2 표면적 코트 TC 요리 다른 모든 유형 / 표면적이 cm 당 희석 매트릭스 0.15 ml의 비율로 플레이트. 종래 임의 배지와 세포의 첨가에 남은 용액을 흡인.
- 섬유 아세포 중간
- 4 ° C에서 하룻밤 ES 공인 태아 소 혈청 (ES-FBS)의 100 ㎖ 병을 녹여.
- (50) 해동 ES-FBS ㎖의 DMEM 배지 445 ml의에 MEM 비 필수 아미노산 용액 (1 배)의 5 ML을 추가합니다. 0.22 μm의 필터를 통해 결합 된 구성 요소를 소독하고 최대 4 주 동안 4 ° C에서 매체를 저장합니다.
- IMEF 중간
- 밤새 4 ° C에서 ES-FBS의 100 ㎖ 병을 녹여.
- 해동 FBS 50 ㎖, MEM 비 필수 아미노산 용액 5 ㎖ (1X) 및 DMEM 배지 445 mL로 2 머 캅토 에탄올 500 μL를 추가한다.
- 0.22 μm의 필터를 통해 결합 된 구성 요소를 소독하고 저를 저장최대 4 주 동안 4 ° C에서 dium.
- 염기성 섬유 아세포 성장 인자 용액 (b-FGF)
- D-PBS 990 μL에 세럼 교체 10 μl를 추가하고 철저로 pipetting 아래로 섞는다.
- 10 μg의 동결 건조 B-FGF의 한 유리 병에 1 % (v / v)의 혈청 대체 솔루션의 1 ML을 추가합니다. 철저하게 부드럽게 피펫 팅 아래로 섞는다.
- 최대 4 주 동안 필요할 때까지 -20 ℃에서 마이크로 원심 분리기 튜브 저장소 200 μL 분취 액에 10 μg의 / ㎖의 용액 B-FGF 나누어지는.
- 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSC) 중간
- 밤새 4 ° C에서 혈청 교체의 100 ㎖ 병을 녹여.
- 해동 세럼 교체 100 ㎖, MEM 비 필수 아미노산 용액 5 ㎖ (1 배) 및 DMEM / F-12 배지 395 ml를 2 - 머 캅토 에탄올 500 μl를 추가합니다.
- 0.22 ㎛의 필터를 통해 상기 결합 된 성분을 소독에 매체를 저장할최대 4 주 동안 4 ° C를.
- 사용시, 37 ° C에 hPSC 매체를 미리 따뜻하게 bFGF를 4 ng를 / ㎖로 보충합니다.
- IMEF 중간 (CM), 금연실
- 은 T-175 문화 플라스크에 0.1 % 젤라틴의 18 ML을 추가하고 1 시간 동안 37 ° C에서 품어.
- 부화 한 시간 후에 0.1 % 젤라틴 용액을 제거합니다. IMEF 매체의 45 ㎖에 9.1 × 10 6 mitotically - 불 활성화 된 마우스 배아 섬유 아세포 (IMEF)를 추가하고 밤새 37 ° C 배양기에서 배양한다.
- 밤새 배양 한 후, 이전 IMEF 배지를 제거하고 실온에서 5 분 동안 D-PBS 25 mL로 한번 세척 하였다.
- 는 D-PBS 오프 대기음은 씻어 bFGF를 4 ng를 / ㎖로 보충 사전 예열 hPSC 매체의 90 ml에 추가합니다. 정확히 24 시간 동안 37 °의 C 배양기에서 품어.
- 배양 24 시간 후, 무균 IMEF 플라스크에서 hPSC 배지를 제거하고 0.22 ㎛의 필터를 통해 살균. 5로 나누어지는-20 ° C에서 0 ML 원뿔 튜브 및 동결이 필요할 때까지. IMEF CM는 -20 ° C에서 최대 6 개월 동안 저장 될 수있다.
- IMEF 플라스크에 bFGF를 4 ng를 / ㎖로 보충 사전 예열 hPSC 매체의 또 다른 90 ML을 추가합니다. 정확히 24 시간 동안 37 °의 C 배양기에서 품어. 최대 7 일간 CM의 수확을 반복합니다.
- 사용시, 37 ° C에 IMEF-CM을 미리 따뜻하게 bFGF를 4 ng를 / ㎖로 보충합니다.
- E8 중간
- 밤새 4 ° C에서 10 ml의 E8 보충을 녹여.
- 나머지 기본 배지에 해동 E8 보충제의 내용을 추가 무균 E8 기초 배지 10 ㎖를 제거하고. 철저하게 믹스와 0.22 μm의 필터를 통해 살균. 최대 2 주 동안 4 ° C에서 완전 배지를 저장합니다.
- 사용시에, 배지의 분취 액을 실온으로 사용되는 사전에 가온. 37 ° C에 E8 중간 따뜻한을 미리하지 않는 것이 좋습니다.
- 셀 그래서rting 버퍼
- 셀 EDTA 용액 (1 mM의 최종 농도), HEPES 완충액 (25 mM의 최종 농도) 페니실린 / 스트렙토 마이신 용액 (100 단위 / ml의 최종 농도) 및 소 혈청 알부민 (1 % 최종 농도)에 추가하여 정렬 직전 신선한 정렬 버퍼를 준비 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (칼슘과 마그네슘 무료).
- 사용하기 전에 0.22 ㎛의 필터를 통해 멸균 버퍼.
- 셀 정렬 복구 중간
- 페니실린 / 스트렙토 마이신 (100 단위 / ml의 최종 농도)와 록 억제제 Y-27632 (10 μM 최종 농도)를 추가하여 섬유 아세포 보통 50 ㎖를 수정합니다. 사전 따뜻한 37 ° C에이 매체 정렬 세포를 파종하기 전에.
인간 섬유 아세포의 2 센다이 중재 재 프로그래밍
- 이전에 24 시간은, 센다이 바이러스에 전달 2 × 10 5 (c)의 밀도 섬유 아세포를 배정하는6 웰 TC 플레이트의 원하는 우물에 잘 당 ELL 학생.
- 다음 날 0의 전달을 수행합니다.
- 37 ° C의 물을 욕조에 섬유 아세포 중간의 사전 따뜻한 2ml를. -80 ° C에서 저장 장치로부터 센다이 바이러스 튜브의 한 세트를 제거하고 제 5, 37 ° C의 물을 용기에 튜브의 하단을 침지 시간에 각각의 튜브를 해동 - 10 초 후 물 튜브를 제거 목욕하고 실온에서 해동 할 수 있습니다. 해동 후, 간단히 튜브를 원심 분리 및 얼음에 즉시 배치합니다.
- 예열 된 섬유 아세포 중간 1 ㎖로 감염 다음 다중성 (MOI)를 달성하기 위해 튜브의 각 (COA에 따라) 적절한 양을 첨가함으로써 상업적 번째 세대 센다이 바이러스를 사용하여 웰 당 다음과 같이 형질 될 : KOS = 5 × 10 6 CIU, HC-Myc와 = 5 × 10 6 CIU, hKlf4는 = 3 × 10 6 CIU.
- 철저하게 부드럽게 위아래로 혼합물을 피펫 팅에 의해 바이러스 솔루션을 섞는다. 공단5 분 이내에 다음 단계는 테.
- 재 프로그램 할 수있는 섬유 아세포의 우물에서 섬유 아세포 매체를 대기음, 그리고 각 웰에 바이러스 액 1ml를 추가합니다. 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 세포를 놓고 밤새 품어.
- 밤새 배양 한 후, 전달 매체를 흡인하고 이전 매체 제대로 (30 분 동안 10 % 표백제 용액) 폐기. 형질 도입 세포를 미리 예열 섬유 아세포 중간 2 ㎖로 교체과 문화를 계속합니다.
- 문화 매일 신선한 섬유 아세포 중간에 기존 매체를 대체 6 일 이상 세포.
참고 : 7 일 전달을 게시 할 때까지하지 통로에게 다시 프로그램 세포를 수행합니다. - 6 일 : IPSC 세대를위한 준비 요리
- 피더 의존 IPSC 생성을 위해, 6- 웰 조직 배양 (TC) 접시의 각 웰에 1.5 ml의 0.1 % 젤라틴 용액을 첨가하고, 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다.
- 그래서 0.1 % 젤라틴을 제거lution 배양 1 시간 후. 물론 당 IMEF 매체 2 ㎖에 3 × 10 5 mitotically - 불 활성화 된 마우스 배아 섬유 아세포 (IMEF)를 추가하고 밤새 37 ° C 배양기에서 배양한다.
- 6 잘 조직 문화 (TC) 접시의 각 웰에 : (100 희석 1)과 1 시간 동안 37 ° C에서 부화 장치에 독립적 인 IPSC 생성을 위해, 희석 기저막 행렬의 1.5 ml에 추가 할 수 있습니다.
- 이레 형질 도입 후 형질 섬유 아 세포를 수확하고 IPSC 식민지 생성을 위해 미리 만들어진 문화 요리에 그들을 다시는-판.
- 섬유 아세포로부터 정상 배지 대기음하고, D-PBS 2 ㎖ 회 세포를 세척 하였다.
- 는 D-PBS 오프 대기음은 씻어 미리 예열 0.05 % 트립신 / EDTA 0.5 ml에 추가 할 수 있습니다. 37 ° C에서 5 분 - 3 세포를 인큐베이션.
- 세포가 반올림 한 경우, 트립신을 중지 아니라 각에 미리 예열 섬유 아세포 중간 2 ㎖를 추가합니다. 부드럽게 t을 피펫 팅하여 잘에서 세포를 이동시키다그는 중간 접시의 표면을 가로 질러. 15 ml의 원추형 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 수집한다.
- 2 분 동안 200 XG에서 세포를 원심 분리기. 뜨는을 대기음, 신선한, 미리 예열 섬유 아세포 중간 2 ml의 세포를 재 - 일시 중지합니다.
- 원하는 방법 (혈구 또는 자동 세포 계수기)를 사용하여 세포를 세어 6 웰당 피더 의존 조건에 5 × 104 세포와 피더에 독립적 인 조건에서 1 × 105 세포로 미리 제조 된 배양 접시를 시드 요리 - 그럼 2 배양기 하룻밤 37 ° C, 5 % CO 부화.
- 밤새 배양 한 후, 용도에 따라, hPSC 매체 E8 매체 또는 IMEF 에어컨 미디어 매체를 변경. 매일 그 후 신선한 매체와 기존 매체를 교체합니다.
BGO1v hOct4-GFP 리포터 인간 배아 줄기 세포의 3 센다이 재 프로그래밍 (hESC의) 파생 보조 섬유 아세포
- 데르절차에 따라, BG01v hOct4-GFP 기자 hESC의 줄에서 보조 인간의 섬유 아세포를 필자는 이전에 9를 설명했다.
- 이틀 전달하기 전에, BGO1v / 돼지가 섬유 아세포 매체를 사용하여, 잘 당 2 × 10 5 세포에서 6 웰 플레이트의 두 우물에 섬유 아세포를 유도 판.
- 37 ° C에 섬유 아세포 매체의 전달, 사전 따뜻한 2 (M1)의 날.
- -80 ° C 저장 영역에서 센다이 튜브 한 세트를 제거합니다. 파우치에서 튜브를 제거하고 제 5, 37 ° C의 물을 용기에 튜브의 하단을 침지 시간에 각각의 튜브를 해동 - 10 초 후, 튜브를 실온에서 해동 할 수있다. 해동 후, 간단히 튜브를 원심 분리 및 얼음에 즉시 배치합니다.
- 세 센다이 튜브의 각 표시된 볼륨을 추가 섬유 아세포 중간 2 ㎖에 (해당 볼륨에 대한 CoA를 참조), 37 ° C로 미리은 예열하고 철저로 pipetting 아래로 바이러스 솔루션을 섞는다. 다음 인트를 완료5 분 내 페이지.
참고 :이 실험의 MOI 5 : 5 : 6이 사용되었다. - 섬유 아세포의 우물에서 섬유 아세포 매체를 대기음하는 형질 도입한다. 두 개의 웰 각각에 바이러스 현탁액 1 ㎖ 형질되도록 추가한다. 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 세포를 놓고 밤새 품어.
- 하룻밤 배양 후, 전달 매체를 제거하고 올바르게의 (30 분 10 % 표백제 용액)을 폐기하십시오. 형질 도입 세포를 미리 예열 섬유 아세포 중간 2 ㎖ 잘 각각의 교체와 문화를 계속합니다.
- 문화 매일 신선한 섬유 아세포 중간에 오래된 매체를 변경 6 일 이상 세포.
- 세븐 일 형질 도입 섬유 아 세포를 수확하고 IPSC 식민지 생성을 위해 미리 만들어진 문화 요리에 그들을 다시 접시, 전달을 게시 할 수 있습니다.
- 섬유 아세포로부터 정상 배지 대기음하고, D-PBS 2 ㎖ 회 세포를 세척 하였다.
- 민주당 오프 대기음BS는 씻어 미리 예열 0.05 % 트립신 / EDTA 0.5 ml에 추가 할 수 있습니다. 37 ° C에서 5 분 - 3 세포를 인큐베이션.
- 세포가 반올림 한 경우, 트립신을 중지 아니라 각에 미리 예열 섬유 아세포 중간 2 ㎖를 추가합니다. 부드럽게 접시의 표면을 가로 질러 매체 피펫 팅함으로써 웰로부터 세포를시키다. 15 ml의 원추형 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 수집한다.
- 200 X에서 세포를 원심 분리기 2 분 동안 g. 뜨는을 대기음, 신선한, 미리 예열 섬유 아세포 중간의 적절한 양의 세포를 재 - 일시 중지합니다.
- 원하는 방식 (또는 자동 혈구 세포 계수기)를 사용하여 세포를 카운트.
- 기저막 매트릭스의 웰 당 1 × 105 세포의 밀도로 형질 도입 된 세포를 시드 6 웰 - 코팅 플레이트를 밤새 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 배양한다.
- 밤새 배양 한 후, 10 NG / m 보충, 조정 배지를 IMEF하는 매체를 변경B-FGF의 리터. 그 후 신선한 IMEF CM의 일상과 기존 매체를 교체합니다.
- 3 주 기계적 해부 및 클론 확장을 원하는 식민지를 전송하거나 분석을 위해 사용, 전달을 게시 할 수 있습니다.
섬유 아세포 재 프로그래밍 4. 라이브 셀 이미징
- 실시간 모니터링
- 7 일 전술 한 바와 같이, 원하는 중간 매트릭스 시스템 6- 웰 접시에 세포를 원하는 양의 종자, 센다이 프로그래밍 키트 전달 게시. 37 ° C로 설정 가습 인큐베이터에있는 이미 저, 내부 시드 요리를 놓고, 5 % CO 2.
- 제조사의 프로토콜에 따라 다음 14 일 동안 연속 촬영 이미지 - (8 시간마다 6)에 일정 간격으로 각 웰의 전체 웰 이미지를 캡처하는 이미지 소프트웨어를 설정한다.
참고 : 위상 대비 이미지 설정이 식민지의 진행을 평가하는 일반적인 프로그래밍 선택됩니다. 경우에BG01v / 돼지가 섬유 아세포 재 프로그래밍을 유도, 그것은 재 프로그래밍 과정 전반에 걸쳐 추적 할 수 있습니다 위상 콘트라스트와 내생 OCT4-GFP 기자의 재 활성화와 녹색 형광 채널 이미지를 캡처하는 것이 가장 좋습니다. - 일일 매체 변경이 hPSC 매체 E8 매체 또는 IMEF-CM 수 있고, 이전에 전달 후 21 일에 8에서 설명한 바와 같이, 실험에 따라. 웰은 또한 간접적 인 면역 형광을 사용하여 콜로니 형성에 대해 분석 할 수있다.
- 21 일 19 일 실험의 끝에, 섬유 모세포에 대한 항체로 프로빙 각 웰에서 배지를 제거하고 원하는 세포 마커 줄기.
- 미리 예열 DMEM / F-12 배지 2 ㎖로 잘 한 번 각을 씻으십시오.
- 다음 DMEM / F-12 배지 1 ㎖에 각각 양 / 음 차 항체 쌍의 분취 량을 준비한다 : 항 - 마우스 SSEA4을 (1 : 200) 및 안티 - 쥐 CD44 (1시 50분), 항 - 마우스 TRA-1- 60 (1 : 200) 및 안티 - 쥐 CD44 (1시 50분) 및 알칼리성 포스파타제 리얼룩 (1시 50분) 및 안티 쥐 CD44 (1:50)했습니다. 각이 잘 대응하는 1 ml의 일차 항체 솔루션을 추가합니다. 45 분 동안 37 ° C에서 품어.
- 차 항체 용액 오프 기음과 미리 예열 DMEM / F-12 배지로 두 번 씻는다.
- 빨간색 형광 용 : (500 1) 녹색 형광 및 염소 안티 쥐 알렉사 플 루어 594 복합 보조를 위해 : (500 일) 염소 항 - 마우스 알렉사 플 루어 488 복합 보조를 사용하여 (각 웰에 1 ㎖) 이차 항체 솔루션을 준비 DMEM / F-12 배지. 최종 세척 후 각 웰에 추가합니다. 37 ° C에서 30 분 동안 이차 항체 인큐베이션.
참고 때문에 알칼리성 포스파타제의 라이브 얼룩 (APLS) 과도 신호, 항 CD44 일차 배양 우선 자신에 의해 수행되어야하고 APLS 2 차 항체로 배양시에 첨가해야 - 이차 항체 배양 후, 솔루션을 기음과 DMEM / F-12 배지로 두 번 씻는다. 추가 신선한 미리 예열 DMEM / F-12최종 이미지 캡처에 각 웰 이전에 매체.
- 위상 콘트라스트, 녹색 형광과 빨간색 형광 : 잘 세 가지 검색 매개 변수를 사용하여 각각의 전체 웰 이미지를 수집하기 위해 이미 저 소프트웨어를 설정합니다. 다양한 배율의 이미지를 만들고 성장과 마커의 발현을 모니터링하는 소프트웨어와 함께 시간 경과 영화를 만들 수 있습니다. 제조 업체의 프로토콜을 사용합니다.
- 분석 소프트웨어를 활용, 위상 대비하고 BG01v / 돼지 프로그래밍을위한 녹색 형광 단위로 훨씬 넘는 시간의 합류를 평가한다.
- 재 프로그래밍 중간체 사용하여 세포 표면 마커 모니터링
- 리 프로그래밍 프로세스를 모니터링하기 위하여 다른 줄기 세포의 양 / 음 마커에 대한 항체로 다양한 시점에서 프로그래밍 요리를 프로빙하여 다른 시점에서 프로그래밍 이벤트를 모니터링. 프로브 문화마다 2 ~ 3 일 복제의 가용성에 따라 달라집니다. 재 프로그래밍의 창피 프로브이중 염색 전략을 사용하고 21 일 19시 HES 완전히 재 프로그램 IPSC 식민지와 염색 패턴에 따라 부분적으로 재 프로그램 식민지를 식별합니다.
- 목적하는 시점에서 잘 선택 마커에 대한 항체로 프로빙 각각으로부터 정상 성장 배지를 흡인.
- 미리 예열 DMEM / F-12 배지 2 ㎖로 잘 한 번 각을 씻으십시오.
- 다음과 같이 DMEM / F-12 배지 1 ㎖에 각각 양 / 음 차 항체 쌍의 분취 량을 준비 : 녹색 형광 형광 (1 : 200)에 접합 SSEA4을, TRA-1-60 녹색 형광 형광 (1 접합 : 50), 알카라인 라이브 얼룩 (1 : 500), CD24는 녹색 형광 형광 (1시 50분) 녹색 형광 형광 (1시 50분)는 EpCAM 녹색 형광 형광 접합 접합, B2M (1시 50분)에 접합 마우스 CD73과 프로빙하고, 쥐 CD44 (1:50) : 녹색 형광 형광 (500 1)에 접합 된 항 마우스 이차 항체로 프로브 (1 100)안티 쥐 이차 항체는 적색 형광 형광 (500 1)에 접합. 각이 잘 대응하는 1 ml의 일차 항체 솔루션을 추가합니다. 45 분 동안 37 ° C에서 품어.
- 대기음 차 항체 용액을 끄고 미리 예열 DMEM / F12 배지로 두 번 씻는다.
- 접합 항체 적절한 차 항체 용액을 제조함으로써 2 단계 방법을 사용하여 진행 및 37 ° C에서 30 분 동안 배양한다. 이차 항체가 기본 호스트로하고 교차 반응하지 않는 것이 확인합니다. 전술 한 바와 같이 추가 세척 단계를 수행합니다.
- 모든 적절한 세척 한 후, 최종 이미지 캡처에 각 웰 이전에 신선한 미리 예열 DMEM / F-12 배지를 추가합니다.
- 형광 현미경을 이용하여 100 배 배율의 적절한 필터 아래의 형광 이미지를 캡처 가능한 분석 소프트웨어를 이용하여 영상을 분석한다.
흐름 C를 사용하여 재 프로그래밍 속도론 5. 측정ytometry
- 재 프로그래밍의 양적 운동 측정 세포 표면 항체를 사용하여
- 프로그래밍 이전에, 각 시점에 대해 프로그래밍 실험의 적절한 수를 설정한다. 프로그래밍의 제 7 일간 프로그래밍의 동역학을 측정하는 개별 transductions 원하는 각 시점에 대해 수행된다. 7 일 후 시점 들어, 재 프로그래밍 이벤트를 계속 측정 할 수있는 충분한 공급 독립적 시점 시드. 6- 웰 플레이트 중 하나의 웰을 유세포 분석을 수행하기 위해 충분한 양의 세포를 수득한다.
- 이 종점 분석 한, 개별 웰에서 원하는 모든 프로그래밍 시점을 측정한다. 섬유 아세포 중간 잘 원하는으로부터 대기음. D-PBS로 한번 씻어.
- 는 D-PBS 세척 오프 기음. 잘 0.05 % 트립신 EDTA 용액 1 ml의 추가 테스트 할 수 있습니다. 실온에서 5 분간 인큐베이션.
- 배양에 따라, dissoci우물의 표면에 1 ㎖의 세포 현탁액을 세척하여 단일 세포로 세포를 먹고 15 ML 원뿔 관에 정지를 전송합니다. 우물에서 남아있는 세포를 씻어 15 ML 원뿔에 추가 D-PBS 3 ㎖를 사용합니다. 상기 원추형 튜브에 세포 용액을 희석하기 위해 추가적인 D-PBS 10 ㎖를 사용한다.
- 2 분 동안 200 XG에서 세포를 원심 분리기. 뜨는을 기음과 DMEM / F-12 배지 1 ㎖에 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 이하 1 × 106 이상의 세포 / ml 인 표준 세포 현탁액을 만들기 위해 필요한 세포 수를 수행한다.
- SSEA4 녹색 형광 형광 물질 (1 : 200)에 접합 : 다음과 같은 조합을 사용하여 이하 1 × 106 세포 / ml에 대해 DMEM / F-12 배지 1 ㎖에 원하는 양 / 음 직접 접합 된 항체의 각각의 분취 량을 준비 CD44는-Cy5에를 PE에 결합, 또는 CD44는 멀리있는 빨간색 형광의 형광 접합 녹색 형광 형광 및 SSEA4에 접합. 품다실온에서 45 분 동안 세포 현탁액으로 항체.
- 차 항체 용액을 흡인하고 예열 된 DMEM / F-12 배지로 두 번 세척 하였다.
- 최종 세척 대기음 D-PBS 1 ml의 세포 펠렛을 다시 일시. 피펫 개별 FACS 튜브의 각 서스펜션의 내용.
- 해당 음성 대조군 (흠과 이소 컨트롤)를 사용하여 세포 계수기에 적절한 전방 및 측면 산란 프로파일 및 전압을 확인합니다. 상기 녹색 형광체는 청색 레이저 및 BL1 채널에서 취득 된 신호에 의해 활성화되도록 초기 단일 염색 파라미터에 따라 대응하는 형광체에 대한 전압을 설정까지 적색 형광을 형광 및 PE-Cy5에의 형광체가 적색 레이저에 의해 활성화되는 동안 및 RL1 채널에서 획득 한 신호. 각 시점에 대한 이중 염색 인구 획득.
- 적절한 분석 소프트웨어를 이용하여 각 시점에 대한 FCS 파일을 분석하고 ARRA하는 편집기를 사용하여NGE 데이터는 시간이 지남에 인구의 발현 변화를 관찰한다.
- 셀 분류가 서로 다른 시점에서 필요한 경우, 5.1.6에 단계 5.1.1을 따르십시오. 사용하는 셀 소터의 레이저 구조에 따라 적절한 형광 물질의 조합을 사용한다.
- 최종 세척 후, 세포 선별 완충액 1 ㎖의 세포 펠렛을 다시 일시. 흠없는 컨트롤을 사용하여 적절한 전방 및 측면 산란 설정으로 셀 소터를 설정합니다. 각 형광에 대한 적절한 설정을 설정하는 하나의 스테인드 컨트롤을 사용합니다.
- 이중 염색 세포 현탁액의 작은 샘플을 사용; 정렬 할 수있는이 인구를 선택하고 정렬 세포의 적절한 수집을 보장하기 위해 각각의 요금을 할당합니다.
- 분류 된 세포 현탁액 쿠션 및 정렬시 보호하기 위해 수집 튜브에 세포 회복 배지 200 μl를 추가한다. 세포의 욕망 번호를 수확하고 신선한 포함하는 새로운 IMEF 요리에 전송사라져 복구 매체를 준비했다.
- 복구 매체와 하룻밤 배양 한 다음 매체를 변경합니다. 배양 물은 계속해서 공급 일상적 페니실린 / 스트렙토 마이신 (100 단위 / ml의 최종 농도)를 함유 hPSC 매체를 이용하여 계대 배양해야한다.
6. 엔드 포인트 분석
- 터미널 알칼리성 포스파타제 (AP) 염색
- 최종 프로그래밍 효율성과 관찰 운동과 형태 학적 이벤트 상관 관계를 단말기 발색 AP 염색을 사용합니다.
- 프로그래밍 21 일에 이어, 우물에서 문화 매체가 터미널 AP 얼룩 염색 할 수 제거하고 200 mM Tris-HCl (pH8.0)을 한 번 씻는다.
- 200 mM 트리스 - 염산에 제조업체의 사용 설명서의 지시에 따라 염색 용액의 적당량을 준비한다.
- 세척을 기음과 각 웰에 제조 된 염색 액 2 ㎖를 추가합니다. 실온에서 20 내지 30 분 동안 인큐베이션 멀리 번째 행전자 빛.
- 염색 솔루션을 대기음, 200 mM 트리스 HCl로 한 번 씻는다. 세척을 제거하고 사전 시각화에 증류수를 추가합니다.
- 통상 화상 카메라를 사용하여 비색 신호를 캡처. 손으로 긍정적으로 염색 콜로니의 수를 계산합니다. 얼룩도 자연 속에서 형광 한, Trit-C 채널 형광 분석을 사용하여 얼룩을 시각화하고 전체 잘 이미징을 수행하고 전체 웰 이미 저를 사용하여 분석 하였다. 제조 업체의 프로토콜을 사용합니다.
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Representative Results
유동 세포 계측법을 사용하여 재 프로그래밍의 속도론을 모니터링
SSEA4는 PSC 마커 6,10 동안 CD44는 섬유 아세포 마커입니다. 이 표현식 패턴에서 예상대로, 세포 계측법 BJ 섬유 아세포의 흐름 SSEA4 보여줍니다 - 흠 샘플과 함께 사분면 게이트의 생성을 촉진 CD44 + 인구. SSEA4 천천히 표현하면서 센다이 바이러스와 DF1 섬유 아 세포의 리 프로그래밍 동안, CD44은 점차 소실된다. CD44 + 세포와 7 일 (그림 1)에서 더 두드러진다 SSEA4 + CD44 + 세포의 작은 인구 - 센다이 바이러스에 전달 후 3 일에서, SSEA4의 많은 인구가있다. 상태 - 데이 (13)에서 더블 양성 인구는 SSEA4 + CD44으로 전환. 날 (17), CE의 큰 퍼센티지문화의 재편은 이미 SSEA4 + CD44 있습니다 -. CD44 및 SSEA4으로 유세포 이번 과정 프로그램은 프로그래밍의 진행 및 레이트를 모니터링하기 위해 사용될 수있다.
BJ 섬유 아세포 (그림 2A)의 재 프로그래밍과는 다른 속도로 세포 - 정량적 비교 센다이 재 프로그래밍 바이러스와 재 프로그래밍 BJ 섬유 아세포가 SSEA4 + CD44을 생성하는 확인합니다. 세포 리 프로그래밍의 진행을 추적 - 데이터는 PSC 형상 SSEA4 CD44 +의 비율의 초기 비교 것을 보여준다. 흥미롭게도, DF1 섬유 아세포의 재 프로그래밍의 8 일, 정렬 및 별도 SSEA4를 상승 조절의 과정에있는 세포의 인구를 배양하고 하향 조절에 CD44는 AP + 식민지 (11) (그림 2B에게)를 생성한다. 반면에, 일본어에서는 SSEA4 - CD44 + 집단은 AM 생성최종 식민지 분석의 전형적인 하루 프로그래밍의 날 (21)에서 AP + 식민지의 작은 수를 UCH. 인구가 형성되고, - 이는 정량 심지어 SSEA4 + CD44 전에 프로그래밍 동력학 차이를 예측하기 위해 전이 집단과 비교하는 것이 가능하다는 것을 암시한다. 여기에서 주목해야 할 중요한 점은 재 프로그래밍은 상기 표면 마커의 일반적인 패턴과 진행은 다른 프로그래밍 실험 간의 일치하지만 등 체세포 인구, 전달 효율, 매체를 시작으로 여러 가지 요인에 변수 과정 의존한다는 것입니다 섬유 아세포를 시작. 프로그래밍 동력학의 분석은 또한 새로 식별 PSC 네거티브 마커 CD73 및 B2M (6)뿐만 아니라, 기존의 PSC 마커 CD24 12, 13 및 14, 15는 EpCAM 같은 다른 마커에 수행 될 수있다. CD44, CD73 및 B2M 유사은 파 표현된다ental BJ 섬유 아세포는 있지만 완전히 재 프로그래밍 iPSCs (그림 3A)에서 탐지되고, 프로그래밍의 과정에서 하향 조절된다. B2M은 CD44 (그림 3B)보다 빠르게 하향 조절되는 반면, CD44 및 CD73 또는 CD44와 B2M를 사용하여 시간 코스 세포 계측법 흐름은, CD44 및 CD73가 비슷한 비율로 하향 조절되는 것을 알 수있다. 두 경우 모두에서 프로그래밍 속도는 더블 네거티브 인구의 축적을 측정함으로써 관찰 할 수있다. 이러한 부정적인 PSC 마커 달리, CD24과는 EpCAM 섬유 아세포에 존재하고 iPSCs (도 3a)로 표현된다. 시간 코스 세포 계측법 흐름에서, CD24 - CD44 +와는 EpCAM - 그리고는 EpCAM + CD44 - - PSC와 같은 세포, 각각 (그림 3B) CD44 + 섬유 아세포는 결국 나중에 CD24 + CD44로 전환 더블 부정적인 집단을 형성한다. 따라서, 재 프로그램하는 동안, 모두 긍정적 인 PSC 마커CD44가 하향 조절 한 후 표현된다. SSEA4와 CD44, 형성과 서로 다른 세포 집단의 축적으로 관찰 한 것과 유사하게 재 프로그램의 진행을 나타냅니다.
추적 실시간 영상 분석을 사용하여 재 프로그래밍
방송을 위상차 (도 4b) 이하 합류점의 대수의 증가에 대응하는 콜로니의 점진적인 형성 (도 4A)를 리 시드 배양 후에 재 프로그래밍 실시간 이미징. 위상차에서 합류 따라서 정량적으로 재 프로그래밍을 모니터링하기위한 또 다른 메트릭을 제공하지만 모두를 포함, PSC 마커와 unreprogrammed 또는 부분적으로 다시 프로그램 세포 (그림 4A, 마지막 패널)의 지속적인 확산을위한 긍정적 인 식민지. 만능 마커에 대한 염색 된 부분을 정량화TRA-1-60, 일 21시 SSEA4와 AP 6,10는 iPSCs는 총 합류 (그림 4B)의 절반 이하를 차지하고 있음을 나타냅니다. 보다 엄격하게 프로그래밍의 진행을 측정하기 위해, 프로그래밍을위한 리포터 라인을 사용하는 것이 가능하다. 여기서, 이차 섬유 아세포는 OCT4-GFP 기자 (16)와 함께 설계되었습니다 BG01v / 돼지 ESC 라인에서 발생했다. GFP는 세포 리 프로그래밍되는 표현 콜로니가 형성 될 때 (도 5a)된다. 위상 콘트라스트와 녹색 채널에서 측정 합류는 GFP의 합류는 총 합류보다 더 느리게 증가하고, 하루 19에서 GFP의 합류는, TRA-1-60 연상 총 합류 (그림 5B)의 절반보다 작다는 것을 보여줍니다 주 (21)에서 SSEA4와 AP 염색.
그림 1. 모유동 세포 계측법을 사용하여 재 프로그래밍의 진행을 nitoring. DF1 섬유 아세포에 대한 유동 세포 계측법 도트 플롯. 공급이없는 조건에서 센다이 바이러스로 재 프로그램 세포를 수확하고 재 프로그래밍 과정의 일에 3 일 (D3)에서 다른 간격 19 (D19)에 SSEA4와 CD44 항체로 염색 하였다. 세포가 7 일 (D7)에 시드 한 후 9 일에 문화 (D9)는 이후 분석 하였다. 도트 플롯은 8,000 단봉을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
. DF1의 FIB 열 변환 한 후 다시 프로그램 세포 - 공급 장치가없는 조건에서 재 프로그래밍 속도론과 효율성을 평가 그림 2. (A) 그래프 SSEA4 + CD44의 비율의 변화를 보여주는센다이 바이러스와 roblasts 및 BJ 섬유 아세포. 세포는 이후 센다이 바이러스를 형질 도입 및 SSEA4와 CD44 항체로 염색 DF1 세포 플롯 유동 세포 계측법의 날 (7) (B) 의사 색상에 시드 받고 9 일에서 문화로, 세포 계측법 (19) 이후 전달에 3 일에 흐름에 의해 분석 하였다. SSEA4 -. CD44 + 세포 (검은 색 원)과 SSEA4 + 세포 (빨간색 원) 8 일에 분류 및 알칼리 포스 파타 아제 (적색)을위한 염색하기 전에 날 19까지 성장시켰다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 피더없는 문화의 3 관측 재 프로그래밍 속도론 다른 양극과 음극 PSC 마커를 사용하여. (AD) 라이브 염색일-18 DF1 파생 재 프로그래밍 CD24 긍정적 인 PSC 마커에 대한 항체를 사용하여 문화와는 EpCAM 음의 PSC 마커 CD44, CD73, 및 B2M의. 하단 패널은 또한 위상차 이미지를 포함하는 반면, 상부 패널은 녹색 및 적색 형광 채널을 병합. 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다. (E) (D17에 D9) (17)에 수확 9 일에서 같은 마커를 사용하여 염색 DF1 파생 재 프로그래밍 배양 후 전달을 위해 도트 플롯 유동 세포 계측법. 분석에 앞서, 문화는 도트 플롯은 8,000 단봉을 보여 주 7에서 시드 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
총 합류를 측정하여 그림 4. 추적 재 프로그래밍 속도론을. (A) 실시간 전BJ의 maging은 공급이없는 상태에서 센다이 바이러스에 다시 프로그램 섬유 아세포. 같은 식민지의 위상 콘트라스트 이미지는 CD44과 SSEA4, TRA-1-60 또는 AP에 대한 추가 염색과 다음 날 21, 19 일 7시에 촬영했다. 프로그래밍 등 총 합류 (위상차)의 스케일 바는 400 μm의에 해당한다. (B) 정량이 날 21 일 (21) 총 합류로 7 일에서 시드에서 진행 SSEA4, TRA-1-60과 AP 신호 합류 (비교된다 녹색 채널). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
OCT4-GFP 합류를 측정하여 재 프로그래밍 속도론을 평가 그림 5.로 재 프로그램 BG01v / 돼지 hESC의 유래 섬유 아세포의 (A) 실시간 영상센다이는 공급이없는 상태에서 바이러스. 위상 콘트라스트, 녹색 형광과 같은 식민지의 이미지를 줄이 400 μm의에 해당하는 19 스케일로 7 일에서 생성 된 합병했다. 총 합류 (위상차) 및 OCT4-GFP 합류 (녹색 채널)의 (B) 정량을 재 프로그래밍이 진행됨에 따라 주 (21)에 7 일에 다시 파종에서 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Disclosures
저자 [RHQ, JSTA, KS 및 UL] 모두는이 문서에서 사용되는 시약 및 악기의 일부를 생산 써모 피셔 사이언 티픽의 직원입니다.
Acknowledgments
저자는 도움이 토론 차드 맥아더 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16141-061 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts | Thermo Fisher Scientific | A24903 | |
| Attachment Factor Protein (1x) | Thermo Fisher Scientific | S-006-100 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Collagenase, Type IV, powder | Thermo Fisher Scientific | 17104-019 | |
| TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12563-011 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0264 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260-037 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| InSolution Y-27632 | EMD Millipore | 688001 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal | ATCC | CRL-2522 | |
| DF1 Adult Human Dermal Fibroblast | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells | Thermo Fisher Scientific | R7799-105 | |
| IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | ||
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | SSEA421 | |
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) | Thermo Fisher Scientific | A14810 | |
| SSEA-4 Antibody (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | 41-4000 | |
| TRA-1-60 Antibody (cl.A) | Thermo Fisher Scientific | 41-1000 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A27094 | |
| CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25528 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) | Thermo Fisher Scientific | RM-5700 (no longer available) | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11007 | |
| Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | |
| TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25618 | |
| CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate | Thermo Fisher Scientific | MHCD2401 | |
| beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) | Thermo Fisher Scientific | A15737 | |
| EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) | Thermo Fisher Scientific | A15755 | |
| CD73 / NT5E Antibody (7G2) | Thermo Fisher Scientific | 41-0200 | |
| VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| Zeiss Axio Observer.Z1 microscope | Carl Zeiss | 491912-0003-000 | |
| FlowJo Data Analysis Software | FLOJO, LLC | N/A | |
| Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser | Thermo Fisher Scientific | Use Attune NXT | |
| S3e\ Cell Sorter (488/561 nm) | BIO-RAD | 1451006 | |
| Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | |
| Falcon 15 ml, high-clarity, dome-seal screw cap | Corning | 352097 | |
| Falcon T-75 Flask | Corning | 353136 | |
| Falcon T-175 Flask | Corning | 353112 | |
| Falcon 6-well dish | Corning | 353046 | |
| Heraeus Heracell CO2 Rolling Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51013669 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 ml | AM12450 | ||
| HulaMixer Sample Mixer | 15920D |
References
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