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Developmental Biology

काइनेटिक मापन और रीयल टाइम दैहिक Reprogramming के दृश्य

Published: July 30, 2016 doi: 10.3791/54190
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Life Sciences Solutions, Thermo Fisher Scientific

Summary

इस अध्ययन में प्रस्तुत प्रोटोकॉल सकारात्मक और नकारात्मक स्टेम सेल प्रवाह cytometry विश्लेषण का उपयोग कर मार्कर की गतिज माप के माध्यम से reprogramming प्रगति की वास्तविक समय की निगरानी के लिए तरीके का वर्णन है। प्रोटोकॉल भी IPSC पीढ़ी के दौरान आकृति विज्ञान, और मार्कर या संवाददाता अभिव्यक्ति की इमेजिंग के आधार पर मूल्यांकन भी शामिल है।

Introduction

रोगी व्युत्पन्न प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) सेल चिकित्सा और दवा स्क्रीनिंग के लिए होनहार उपकरण हैं। वे चिकित्सा के लिए कोशिकाओं का एक ऑटोलॉगस स्रोत प्रदान करते हैं। इसके अलावा, वे आनुवंशिक पृष्ठभूमि की एक बहुत व्यापक सेट धरना, आनुवंशिक रोगों से परे वर्तमान भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी) लाइनों की अनुमति होगी की एक विस्तृत विश्लेषण के लिए इन विट्रो सक्षम करने से। हाल के अग्रिमों IPSCs पैदा करने, सेंडाइ वायरस, episomal plasmids या mRNAs 1,2 के साथ reprogramming सहित के लिए कई तरीके के विकास के लिए मार्ग प्रशस्त किया है। विशेष रूप से, अलग अलग तरीकों reprogramming दक्षता और सुरक्षा के स्तर पर अलग से जुड़ा हुआ है, और अन्य तरीके है कि विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए उनके औचित्य को प्रभावित में मतभेद होने की संभावना हैं। reprogramming प्रौद्योगिकियों के एक किस्म की उपलब्धता के साथ, यह महत्वपूर्ण हो गया है reprogramming प्रक्रिया का आकलन करने के लिए तरीके विकसित करने के लिए। अधिकांश मौजूदा तरीकों आकृति विज्ञान या धुंधला के गुणात्मक निरीक्षण पर भरोसास्टेम सेल विशिष्ट रंगों और एंटीबॉडी के साथ। एक हाल ही में विकसित विधि lentiviral प्रतिदीप्ति संवाददाताओं से कहा कि पीएससी-विशिष्ट miRNAs या अलग-अलग सेल विशिष्ट mRNAs 3 के प्रति संवेदनशील हैं का उपयोग करता है। इस तरह की निगरानी के तरीके के चयन और अलग अलग स्थितियों के लिए reprogramming तकनीकों के अनुकूलन की सुविधा। उदाहरण के लिए, CDy1 reprogramming modulators 4 के लिए स्क्रीन करने के क्रम में जल्दी IPSCs के लिए एक फ्लोरोसेंट जांच के रूप में इस्तेमाल किया गया है। निरीक्षण और विभिन्न प्रयोगों reprogramming तुलना करने की क्षमता भी खुद को इस प्रक्रिया का एक बेहतर समझ पाने के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, अब यह ज्ञात है कि कुछ दैहिक सेल प्रकार दूसरों की तुलना में 5 reprogram करने के लिए आसान कर रहे हैं, और कोशिकाओं 6-8 reprogramming दौरान मध्यवर्ती राज्यों के माध्यम से जाना है। दुर्भाग्य से, reprogramming प्रक्रिया अंतर्निहित तंत्र अभी भी पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं और इसके परिणामस्वरूप, reprogramming तरीकों के बीच सटीक मतभेद भी रहने घ जा करने के लिएefined। इस प्रकार, निगरानी के लिए विधियों, आकलन, और reprogramming की घटनाओं की तुलना स्टेम सेल क्षेत्र के लिए महत्वपूर्ण होना जारी है।

तरीकों इस प्रोटोकॉल में वर्णित निगरानी की अनुमति और reprogramming प्रक्रिया का आकलन करने और वर्णन कैसे इन तकनीकों reprogramming अभिकर्मकों के विभिन्न सेट की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पहले दृष्टिकोण प्रवाह शामिल cytometry सकारात्मक और नकारात्मक स्टेम सेल (पीएससी) मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी के संयोजन का उपयोग का विश्लेषण करती है। दूसरा दृष्टिकोण युगल वास्तविक समय इमेजिंग और कुल संगम (प्रतिशत सतह क्षेत्र कोशिकाओं द्वारा कवर) और मार्कर संकेतों (प्रतिशत सतह क्षेत्र फ्लोरोसेंट संकेतों द्वारा कवर) के संगम की माप।

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Protocol

1.Solution और मझौले तैयारी

  1. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (Engelbreth-होल्म-झुंड ट्यूमर से शुद्ध)
    1. धीरे-धीरे रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (5 एमएल) पिघलना।
    2. एक बाँझ, पूर्व ठंडा 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में बर्फ के ठंडे, बाँझ DMEM / F-12 माध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ 1: पतला शेयर समाधान 1। पूर्व ठंडा, 1.5 मिलीलीटर बाँझ सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूबों में aliquots बांटना और तुरंत -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 1 तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स विभाज्य: उपयोग करने से पहले, जमे हुए 1 पिघलना। 1 विभाज्य बर्फ के ठंडे, 1 की अंतिम कमजोर पड़ने के लिए बाँझ DMEM / F-12 के माध्यम से एक और 50 गुना: 100 उपयोग करने के समय, आगे 1 पतला।
    4. उचित टिशू कल्चर (टीसी) वाहिकाओं के लिए 100 पतला तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स समाधान और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं: 1 की उचित मात्रा में जोड़ें। आमतौर पर, कोट एक टीसी पकवान ओ को पतला तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स समाधान के 3 मिलीलीटर का उपयोगएफ 20 सेमी 2 सतह क्षेत्र, कोट टीसी व्यंजन के अन्य सभी प्रकार / सतह क्षेत्र के 2 सेमी पतला प्रति मैट्रिक्स के 0.15 मिलीलीटर के अनुपात में प्लेटें। किसी भी संस्कृति मध्यम और कोशिकाओं के अलावा करने से पहले शेष समाधान aspirate।
  2. fibroblast मझौले
    1. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर ते योग्य भ्रूण गोजातीय सीरम (ते-एफबीएस) की 100 मिलीलीटर की बोतल गला लें।
    2. thawed ते-FBS की 50 मिलीलीटर और DMEM माध्यम के 445 मिलीलीटर के सदस्य गैर आवश्यक अमीनो एसिड समाधान (1x) के 5 मिलीलीटर जोड़ें। एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से जीवाणुरहित संयुक्त घटकों और 4 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम दुकान।
  3. iMEF मझौले
    1. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर ते-FBS की 100 मिलीलीटर की बोतल गला लें।
    2. सदस्य गैर आवश्यक अमीनो एसिड समाधान के 5 मिलीलीटर (1x) thawed FBS की 50 मिलीलीटर, और DMEM माध्यम के 445 मिलीलीटर के लिए 2-मर्केप्टोइथेनाल के 500 μl जोड़ें।
    3. एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से जीवाणुरहित संयुक्त घटकों और मुझे दुकान4 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर dium।
  4. बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक समाधान (बी FGF)
    1. डी-पीबीएस के 990 μl के लिए सीरम रिप्लेसमेंट के 10 μl जोड़ें और अच्छी तरह से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण।
    2. 10 माइक्रोग्राम lyophilized बी FGF में से एक शीशी के लिए 1% (वी / वी) सीरम रिप्लेसमेंट समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें। अच्छी तरह से धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण।
    3. -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 माइक्रोग्राम / एमएल बी FGF सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब और दुकान में 200 μl aliquots में समाधान विभाज्य जब तक ऊपर से 4 सप्ताह के लिए की जरूरत है।
  5. मानव स्टेम सेल (hPSC) मध्यम
    1. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर सीरम रिप्लेसमेंट की 100 मिलीलीटर की बोतल गला लें।
    2. सदस्य गैर आवश्यक अमीनो एसिड समाधान के 5 मिलीलीटर (1x) thawed सीरम रिप्लेसमेंट की 100 मिलीलीटर, और DMEM / F-12 माध्यम के 395 मिलीलीटर के लिए 2-मर्केप्टोइथेनाल के 500 μl जोड़ें।
    3. एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से जीवाणुरहित संयुक्त घटकों और कम से मध्यम स्टोर4 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
    4. उपयोग के समय, पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस तक hPSC मध्यम और bFGF के 4 एनजी / एमएल के साथ पूरक।
  6. iMEF वातानुकूलित मध्यम (मुख्यमंत्री)
    1. एक टी-175 संस्कृति फ्लास्क 0.1% जिलेटिन की 18 मिलीलीटर जोड़ें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. ऊष्मायन के एक घंटे के बाद 0.1% जिलेटिन समाधान निकालें। 9.1 x 10 6 mitotically निष्क्रिय माउस भ्रूण fibroblasts (iMEF) iMEF माध्यम के 45 मिलीलीटर में जोड़ें और रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं।
    3. रात भर ऊष्मायन के बाद, वर्ष iMEF मध्यम हटाने और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए डी-पीबीएस के 25 मिलीलीटर के साथ एक बार धो लें।
    4. डी-पीबीएस बंद महाप्राण धोने और पूर्व गर्म hPSC माध्यम के 90 मिलीलीटर, bFGF के 4 एनजी / एमएल के साथ पूरक जोड़ें। ठीक 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं।
    5. ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद, aseptically iMEF कुप्पी से hPSC मध्यम हटाने और एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से बाँझ। 5 में अशेष0 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और फ्रीज -20 डिग्री सेल्सियस पर जरूरत तक। iMEF मुख्यमंत्री -20 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 6 महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है।
    6. पूर्व गर्म hPSC मध्यम iMEF फ्लास्क bFGF के 4 एनजी / एमएल के साथ पूरक का एक और 90 मिलीलीटर जोड़ें। ठीक 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं। अप करने के लिए 7 दिनों के लिए मुख्यमंत्री की कटाई को दोहराएँ।
    7. उपयोग के समय में, 37 डिग्री सेल्सियस तक iMEF-पूर्व मुख्यमंत्री गर्म और bFGF के 4 एनजी / एमएल के साथ पूरक।
  7. E8 मझौले
    1. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 10 मिलीलीटर E8 पूरक गला लें।
    2. E8 बेसल माध्यम के 10 मिलीलीटर निकालें और aseptically शेष बेसल मध्यम करने के लिए thawed E8 पूरक की सामग्री जोड़ें। अच्छी तरह मिक्स और एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से बाँझ। 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पूरा मध्यम स्टोर।
    3. उपयोग के समय, पूर्व गर्म माध्यम से विभाज्य कमरे के तापमान पर इस्तेमाल किया जाएगा। यह पूर्व गर्म करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक E8 माध्यम सिफारिश नहीं है।
  8. सेल तोrting बफर
    1. ताजा छँटाई बफर ठीक से पहले सेल EDTA समाधान (1 मिमी अंतिम एकाग्रता), HEPES बफर (25 मिमी अंतिम एकाग्रता) पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान (100 इकाइयों / एमएल अंतिम एकाग्रता) और गोजातीय सीरम albumin (1% अंतिम एकाग्रता) में जोड़कर छँटाई तैयार Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त)।
    2. एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करने से पहले के माध्यम से बफर जीवाणुरहित।
  9. सेल छंटनी वसूली मझौले
    1. पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 इकाइयों / एमएल अंतिम एकाग्रता) और रॉक अवरोध करनेवाला वाई 27,632 (10 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता) जोड़कर तंतुकोशिका माध्यम के 50 मिलीलीटर संशोधित करें। पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस के लिए इस माध्यम का हल कोशिकाओं बोने से पहले।

2. सेंडाइ मध्यस्थता मानव fibroblasts के reprogramming

  1. 24 घंटा पहले, सेंडाइ वायरस के साथ पारगमन के 2 × 10 5 ग घनत्व पर fibroblasts बीज के लिए6 अच्छी तरह से टीसी प्लेट के वांछित कुओं में अच्छी तरह से प्रति एल।
  2. इस प्रकार के रूप डे 0 पर पारगमन प्रदर्शन करना।
    1. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में तंतुकोशिका माध्यम से पूर्व गर्म 2 मिलीलीटर। -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण से सेंडाइ वायरस नलियों के समूह निकालें और पहली बार के लिए 5 एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूब के नीचे डुबो कर एक समय में प्रत्येक ट्यूब एक पिघलना - 10 सेकंड, और फिर पानी से ट्यूब निकालें स्नान और यह कमरे के तापमान पर पिघलना करने के लिए अनुमति देते हैं। एक बार thawed, संक्षेप में ट्यूब अपकेंद्रित्र और बर्फ पर तुरंत जगह है।
    2. पूर्व गर्म तंतुकोशिका माध्यम के 1 मिलीलीटर के लिए उचित मात्रा में आदेश संक्रमण के निम्नलिखित बहुलता (MOI) को प्राप्त करने में ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए जोड़ने (सीओए के अनुसार) से व्यावसायिक रूप से दूसरी पीढ़ी सेंडाइ वायरस का प्रयोग प्रति अच्छी तरह से पालन किया जाना है transduced : KOS = 5 x 10 6 CIU, कोर्ट-Myc = 5 x 10 6 CIU, hKlf4 = 3 एक्स 10 6 CIU।
    3. अच्छी तरह से मिश्रण धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा वायरल समाधान मिश्रण। comple5 मिनट के भीतर अगले कदम ते।
    4. fibroblasts reprogrammed किया जा करने का अच्छी तरह से तंतुकोशिका माध्यम Aspirate, और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए वायरल समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें। एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं की जगह और रातोंरात सेते हैं।
  3. रात भर ऊष्मायन के बाद, पारगमन मध्यम बंद aspirate और पुराने मध्यम ठीक से (30 मिनट के लिए 10% ब्लीच समाधान) के निपटान के। पूर्व गर्म तंतुकोशिका मध्यम 2 मिलीलीटर के साथ बदलें और transduced कोशिकाओं संस्कृति के लिए जारी है।
  4. संस्कृति 6 और दिनों के लिए कोशिकाओं, हर दूसरे दिन ताजा तंतुकोशिका मध्यम के साथ पुराने मध्यम की जगह ले।
    नोट: 7 दिनों के पारगमन के बाद जब तक पारित होने नहीं reprogrammed कोशिकाओं करो।
  5. दिन 6: IPSC पीढ़ी के लिए तैयार व्यंजन
    1. फीडर पर निर्भर IPSC पीढ़ी के लिए, 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर (टीसी) पकवान की हर अच्छी तरह से करने के लिए 1.5 0.1 मिलीलीटर% जिलेटिन समाधान जोड़ने और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. 0.1% जिलेटिन इसलिए हटायेlution ऊष्मायन के 1 घंटे के बाद। 3 एक्स 10 5 mitotically निष्क्रिय माउस भ्रूण fibroblasts (iMEF) अच्छी तरह से प्रति iMEF मध्यम 2 मिलीलीटर में जोड़ें और रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं।
    3. 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर (टीसी) पकवान की हर अच्छी तरह से करने के लिए: (100 कमजोर पड़ने 1) और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते फीडर स्वतंत्र IPSC पीढ़ी के लिए, पतला तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें।
  6. सात दिनों के पारगमन के बाद, transduced fibroblasts फसल और उन्हें IPSC कॉलोनी पीढ़ी के लिए पूर्व बनाया संस्कृति व्यंजन पर पुन प्लेट।
    1. महाप्राण fibroblasts से सामान्य संस्कृति के माध्यम से दूर है, और डी पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें।
    2. डी-पीबीएस बंद महाप्राण धोने और पूर्व गर्म 0.05% trypsin / EDTA के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट - 3 के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
    3. कोशिकाओं को गोल कर दिया है, trypsinization को रोकने के लिए प्रत्येक कुएं में पूर्व गर्म तंतुकोशिका मध्यम 2 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे टी pipetting द्वारा अच्छी तरह से कोशिकाओं को बेदखलवह मध्यम पकवान की सतह के पार। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में सेल निलंबन लीजिए।
    4. 2 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला Aspirate, और 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित ताजा, पूर्व गर्म तंतुकोशिका मध्यम।
    5. वांछित विधि (hemocytometer या स्वचालित सेल काउंटर) का उपयोग कोशिकाओं की गणना और एक 6 में से 5 एक्स 10 4 फीडर पर निर्भर स्थितियों के लिए फीडर स्वतंत्र स्थितियों के लिए 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं कोशिकाओं और साथ पूर्व तैयार संस्कृति बर्तन बीज, अच्छी तरह से प्रति डिश -अच्छी तरह से और 2 इनक्यूबेटर रात भर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ पर सेते हैं।
    6. रात ऊष्मायन के बाद, hPSC मध्यम, मध्यम या E8 iMEF वातानुकूलित मीडिया के लिए मध्यम बदल आवेदन पर निर्भर करता है। ताजा माध्यम के साथ पुराने मध्यम हर रोज उसके बाद बदलें।

3. BGO1v hOct4-GFP संवाददाता मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के सेंडाइ प्रोग्रामिंग (hESC) व्युत्पन्न माध्यमिक Fibroblasts

  1. डेरप्रक्रिया के अनुसार ive BG01v hOct4-GFP संवाददाता hESC लाइन से माध्यमिक मानव fibroblasts पहले 9 में वर्णित है।
  2. दो दिन पहले पारगमन, थाली BGO1v / हॉग अच्छी तरह से प्रति 2 एक्स 10 5 कोशिकाओं में 6 अच्छी तरह से थाली के दो कुओं में निकाली गई fibroblasts, fibroblast माध्यम का उपयोग कर।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पारगमन, पूर्व गर्म 2 तंतुकोशिका माध्यम मिलीलीटर के दिन।
    2. -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण से सेंडाइ नलियों के समूह निकालें। थैली से शीशियों निकालें और पहले 5 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूब के नीचे डुबो कर एक समय में प्रत्येक ट्यूब एक पिघलना -, 10 सेकंड जिसके बाद, ट्यूब कमरे के तापमान पर पिघलना करने के लिए अनुमति देते हैं। एक बार thawed, संक्षेप में ट्यूब अपकेंद्रित्र और बर्फ पर तुरंत जगह है।
    3. तीन सेंडाइ नलियों में से प्रत्येक का संकेत दिया खंडों को जोड़ने तंतुकोशिका मध्यम 2 मिलीलीटर (उचित मात्रा के लिए सीओए देखें), 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म और अच्छी तरह से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा वायरल समाधान मिश्रण। अगले काएं को पूरा करें5 मिनट के भीतर पी।
      नोट: इस प्रयोग के लिए, की एक MOI 5: 5: 6 उपयोग किया गया था।
    4. fibroblasts के कुओं से तंतुकोशिका माध्यम Aspirate transduced किया जाना है। जोड़े दो कुओं में से प्रत्येक के लिए वायरल निलंबन के 1 मिलीलीटर transduced किया जाना है। एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं की जगह और रातोंरात सेते हैं।
    5. रात भर ऊष्मायन के बाद, पारगमन मध्यम हटाने और ठीक से (30 मिनट के लिए 10% ब्लीच समाधान) इसे के निपटान। पूर्व गर्म तंतुकोशिका मध्यम 2 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से हर जगह है और transduced कोशिकाओं संस्कृति के लिए जारी है।
  3. संस्कृति 6 और दिनों के लिए कोशिकाओं, हर दूसरे दिन ताजा तंतुकोशिका मध्यम के साथ पुराने मध्यम बदल रहा है।
    1. सात दिनों के पारगमन पोस्ट, फसल transduced fibroblasts और उन्हें IPSC कॉलोनी पीढ़ी के लिए पूर्व बनाया संस्कृति व्यंजन पर फिर से थाली।
    2. महाप्राण fibroblasts से सामान्य संस्कृति के माध्यम से दूर है, और डी पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें।
    3. महाप्राण डीपी बंदबी एस धोने और पूर्व गर्म 0.05% trypsin / EDTA के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट - 3 के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
    4. कोशिकाओं को गोल कर दिया है, trypsinization को रोकने के लिए प्रत्येक कुएं में पूर्व गर्म तंतुकोशिका मध्यम 2 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे पकवान की सतह भर में मध्यम pipetting द्वारा अच्छी तरह से कोशिकाओं को बेदखल। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में सेल निलंबन लीजिए।
    5. पर 200 x कोशिकाओं अपकेंद्रित्र 2 मिनट के लिए जी। सतह पर तैरनेवाला Aspirate, और ताजा, पूर्व गर्म तंतुकोशिका माध्यम का एक उचित मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
    6. वांछित विधि (hemocytometer या स्वचालित सेल काउंटर) का उपयोग कोशिकाओं की गणना।
    7. एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के प्रति अच्छी तरह से 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं के घनत्व पर transduced कोशिकाओं बीज 6 अच्छी तरह से थाली में लिपटे और रात में एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में सेते हैं।
  4. रात भर ऊष्मायन के बाद, वातानुकूलित माध्यम iMEF के लिए माध्यम के परिवर्तन के साथ 10 एनजी / मी पूरकबी-FGF के एल। ताजा iMEF मुख्यमंत्री हर रोज के साथ पुराने मध्यम उसके बाद बदलें।
  5. तीन सप्ताह के बाद पारगमन, यंत्रवत् काटना और क्लोनल विस्तार के लिए वांछित कालोनियों हस्तांतरण या विश्लेषण के लिए इस्तेमाल करते हैं।

4. तंतुकोशिका Reprogramming का लाइव सेल इमेजिंग

  1. वास्तविक समय में निगरानी
    1. 7 दिन सेंडाइ reprogramming किट के साथ पारगमन पोस्ट, वांछित मध्यम और मैट्रिक्स प्रणाली के साथ 6 अच्छी तरह से व्यंजन पर कोशिकाओं के वांछित राशि बीज के रूप में पहले से वर्णन किया। इमेजर, एक humidified इनक्यूबेटर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट में स्थित अंदर वरीयता प्राप्त बर्तन रखें, और 5% सीओ 2।
    2. इमेजिंग सॉफ्टवेयर सेट एक सेट अंतराल पर प्रत्येक व्यक्ति को अच्छी तरह से की सारी अच्छी तरह से छवियों पर कब्जा करने के लिए - अगले 14 निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार दिन के लिए कब्जा निरंतर छवि के (हर 6 से 8 घंटा)।
      नोट: चरण विपरीत छवि सेटिंग्स कॉलोनी प्रगति का मूल्यांकन करने के लिए सामान्य reprogramming के लिए चुने गए हैं। यदिके BG01v / हॉग fibroblast reprogramming ली गई है, यह चरण विपरीत में और अंतर्जात OCT4-GFP संवाददाता के पुन: सक्रियण के रूप में हरी फ्लोरोसेंट चैनल में reprogramming प्रक्रिया में लगाया जा सकता है छवियों पर कब्जा करने के लिए सबसे अच्छा है।
    3. मध्यम दैनिक परिवर्तन, यह hPSC मध्यम, E8 मध्यम, या iMEF-मुख्यमंत्री हो सकता है, प्रयोग के आधार पर, पहले दिन 8 से 21 के बाद पारगमन के लिए वर्णित है। कुओं आगे अप्रत्यक्ष immunofluorescence का उपयोग कॉलोनी गठन के लिए विश्लेषण किया जा सकता है।
    4. 21 से 19 दिवस पर प्रयोग के अंत में, प्रत्येक अच्छी तरह से संस्कृति के माध्यम fibroblast के लिए एंटीबॉडी के साथ जांच किए जाने को हटाने और अपनी पसंद की सेल मार्कर स्टेम।
    5. पूर्व गर्म DMEM / F-12 के माध्यम से 2 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से एक बार प्रत्येक धो लें।
    6. इस प्रकार के रूप DMEM / F-12 के माध्यम से 1 मिलीलीटर में प्रत्येक के लिए सकारात्मक / नकारात्मक प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़े की aliquots तैयार: विरोधी माउस SSEA4 (1: 200) और विरोधी चूहा CD44 (1:50), विरोधी माउस टीआरए-1- 60 (1: 200) और विरोधी चूहा CD44 (1:50), और alkaline फॉस्फेट लीदाग (1:50) और विरोधी चूहा CD44 (1:50) किया है। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए इसी 1 मिलीलीटर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें। 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    7. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान बंद महाप्राण और पूर्व गर्म DMEM / F-12 के माध्यम के साथ दो बार धोने।
    8. (प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 1 मिलीलीटर) माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार बकरी-विरोधी माउस एलेक्सा स्त्राव 488 संयुग्मित माध्यमिक का प्रयोग करने में लाल प्रतिदीप्ति के लिए: (500 1) हरे रंग की रोशनी और बकरी-विरोधी चूहा एलेक्सा स्त्राव 594 संयुग्मित माध्यमिक के लिए (1 500) DMEM / F-12 मध्यम। अंतिम धोने के बाद एक अच्छी तरह से जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी सेते हैं।
      नोट: alkaline फॉस्फेट लाइव दाग है (APLS) क्षणिक संकेत के कारण, विरोधी CD44 प्राथमिक ऊष्मायन पहले स्वयं के द्वारा किया जाना चाहिए और APLS माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन के समय में जोड़ा जाना चाहिए
    9. माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन के बाद, समाधान निकालना और DMEM / F-12 के माध्यम के साथ दो बार धोने। जोड़े ताजा पूर्व गर्म DMEM / F-12प्रत्येक अच्छी तरह से अंतिम छवि पर कब्जा करने से पहले करने के लिए मध्यम।
    10. चरण विपरीत, हरे रंग की रोशनी और लाल प्रतिदीप्ति: प्रत्येक के पूरे अच्छी तरह से छवियों अच्छी तरह से सभी तीन स्कैनिंग मापदंडों का उपयोग हासिल करने के लिए इमेजर सॉफ्टवेयर सेट करें। विभिन्न आवर्धन पर चित्र बनाने और विकास और मार्कर अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए सॉफ्टवेयर के साथ समय व्यतीत फिल्में बनाने। निर्माता प्रोटोकॉल का प्रयोग करें।
    11. विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग, चरण विपरीत में और BG01v / हॉग reprogramming के लिए हरी फ्लोरोसेंट इकाइयों में समय पर अच्छी तरह से के संगम का मूल्यांकन।
  2. निगरानी Reprogramming मध्यवर्ती का उपयोग कर कोशिका की सतह मार्करों
    1. आदेश reprogramming प्रक्रिया पर नजर रखने के लिए अलग स्टेम सेल सकारात्मक / नकारात्मक मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ विभिन्न बिंदुओं पर समय reprogramming व्यंजन की जांच कर रही द्वारा अलग अलग समय बिंदुओं पर reprogramming घटनाओं पर नजर रखने। जांच संस्कृतियों हर 2 से 3 दिनों प्रतिकृति की उपलब्धता पर निर्भर करता है। reprogramming जिले जांच19 से 21 दिन में वह दोहरी रणनीति का प्रयोग पूरी तरह से धुंधला reprogrammed IPSC कालोनियों और धुंधला पैटर्न के आधार पर आंशिक रूप से reprogrammed कालोनियों की पहचान।
    2. वांछित समय बिंदु पर, प्रत्येक अच्छी तरह से पसंद की मार्करों के लिए एंटीबॉडी के साथ जांच किए जाने से सामान्य मध्यम विकास बंद aspirate।
    3. पूर्व गर्म DMEM / F-12 के माध्यम से 2 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से एक बार प्रत्येक धो लें।
    4. इस प्रकार के रूप DMEM / F-12 के माध्यम से 1 मिलीलीटर में प्रत्येक के लिए सकारात्मक / नकारात्मक प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़े की aliquots तैयार: हरी फ्लोरोसेंट fluorophore (1: 200) संयुग्मित SSEA4, टीआरए-1-60 हरी फ्लोरोसेंट fluorophore (1 संयुग्मित: 50), क्षारीय लाइव दाग (1: 500), CD24 एक हरी फ्लोरोसेंट fluorophore (1:50), B2M एक हरी फ्लोरोसेंट fluorophore (1:50), EpCAM एक हरी फ्लोरोसेंट fluorophore संयुग्मित संयुग्मित (1:50) संयुग्मित , माउस CD73 (1: 100) जो विरोधी माउस माध्यमिक एक हरी फ्लोरोसेंट fluorophore (1: 500) संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ जांच की थी, और चूहे CD44 (1:50) जो के साथ जांच कर रहा हैविरोधी चूहा माध्यमिक एंटीबॉडी लाल फ्लोरोसेंट fluorophore (: 500 1) संयुग्मित। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए इसी 1 मिलीलीटर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें। 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    5. महाप्राण प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान बंद और पूर्व गर्म DMEM / F12 मध्यम के साथ दो बार धो लें।
    6. unconjugated एंटीबॉडी के लिए, उचित माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करके एक 2-कदम विधि का उपयोग करने के लिए आगे बढ़ना है और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। पुष्टि करें कि माध्यमिक एंटीबॉडी प्राथमिक होस्ट करने के लिए कर रहे हैं और पार नहीं करते प्रतिक्रिया। के रूप में पहले से वर्णित अतिरिक्त धोने चरणों का प्रदर्शन।
    7. सभी उचित washes के बाद, अंतिम छवि पर कब्जा करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से पहले नए सिरे से पूर्व गर्म DMEM / F-12 के माध्यम जोड़ें।
    8. 100X बढ़ाई उपयुक्त फिल्टर के तहत फ्लोरोसेंट छवियों को एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग पर कब्जा है और उपलब्ध विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण।

Reprogramming काइनेटिक्स की 5. मापन प्रवाह सी का प्रयोगytometry

  1. Reprogramming के मात्रात्मक मापन काइनेटिक कोशिका की सतह एंटीबॉडी का उपयोग
    1. reprogramming करने से पहले, हर समय बिंदु के लिए reprogramming प्रयोगों की उपयुक्त संख्या की स्थापना की। reprogramming के पहले 7 दिनों के लिए reprogramming के कैनेटीक्स को मापने के लिए, अलग-अलग transductions प्रत्येक वांछित समय बिंदु के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं। 7 दिन के बाद समय अंक के लिए, पर्याप्त फीडर स्वतंत्र समय अंक बीज reprogramming घटनाओं को मापने के लिए जारी रखने के लिए। 6 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से प्रवाह cytometry विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए कोशिकाओं की पर्याप्त मात्रा में निकलेगा।
    2. व्यक्तिगत कुओं से सभी वांछित reprogramming समय अंक उपाय, के रूप में यह एक अंत बिंदु परख है। अच्छी तरह से वांछित से तंतुकोशिका मध्यम बंद aspirate। डी-पीबीएस के साथ एक बार धो लें।
    3. डी-पीबीएस धोने बंद महाप्राण। अच्छी तरह से करने के लिए 0.05% trypsin EDTA समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें परीक्षण किया जाना है। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    4. ऊष्मायन के बाद, dissociअच्छी तरह से की सतह के खिलाफ 1 मिलीलीटर सेल निलंबन निस्तब्धता द्वारा एकल कक्षों में कोशिकाओं को खा लिया और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में निलंबन हस्तांतरण। अच्छी तरह से किसी भी शेष कोशिकाओं से धो लें और उन्हें 15 मिलीलीटर शंक्वाकार में जोड़ने के लिए डी-पीबीएस के 3 मिलीलीटर का प्रयोग करें। अतिरिक्त डी पीबीएस के 10 मिलीलीटर का प्रयोग करें और आगे शंक्वाकार ट्यूब में सेल समाधान कमजोर करने के लिए।
    5. 2 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और DMEM / F-12 के माध्यम से 1 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित। के रूप में एक मानक सेल निलंबन है कि कोशिकाओं / एमएल कम से कम 1 एक्स 10 6 बनाने की जरूरत है एक कोशिका गिनती प्रदर्शन करना।
    6. SSEA4 एक हरी फ्लोरोसेंट fluorophore (1: 200) संयुग्मित: के साथ कम 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / निम्न संयोजन का उपयोग कर मिलीलीटर के लिए DMEM / F-12 के माध्यम से 1 मिलीलीटर में पसंद की सकारात्मक / नकारात्मक सीधे संयुग्मित एंटीबॉडी के प्रत्येक विभाज्य तैयार CD44 पीई Cy5 संयुग्मित, या CD44 एक हरी फ्लोरोसेंट fluorophore और SSEA4 एक far- लाल fluorescing fluorophore संयुग्मित संयुग्मित। सेतेकमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए सेल निलंबन के साथ एंटीबॉडी।
    7. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान Aspirate और पूर्व गर्म DMEM / F-12 के माध्यम के साथ दो बार धोने।
    8. अंतिम धोने Aspirate और डी-पीबीएस के 1 मिलीलीटर में सेल गोली फिर से निलंबित। Pipet व्यक्ति FACS ट्यूबों में प्रत्येक निलंबन की सामग्री।
    9. उचित नकारात्मक नियंत्रण (बेदाग और निर्धारण नियंत्रण) का उपयोग करना, उचित आगे और पक्ष बिखराव प्रोफ़ाइल और voltages कोशिकामापी पर पुष्टि करें। , प्रारंभिक एकल दाग मापदंडों ऐसी है कि हरी fluorophores ब्लू लेजर और BL1 चैनल में अधिग्रहण संकेतों से सक्रिय कर रहे हैं के अनुसार इसी fluorophores के लिए voltages सेट है, जबकि अब तक लाल fluorescing fluorophore और पीई Cy5 fluorophore लाल लेजर द्वारा सक्रिय कर रहे हैं और RL1 चैनल में अधिग्रहण का संकेत है। हर समय बिंदु के लिए दोहरे दाग आबादी मोल।
    10. उचित विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग हर समय बिंदु के लिए एफसीएस फ़ाइलों का विश्लेषण करने के लिए और ARRA संपादक का उपयोगnge डेटा समय के साथ आबादी अभिव्यक्ति पारी निरीक्षण करने के लिए।
    11. , 5.1.6 के लिए कदम 5.1.1 का पालन करता है, तो सेल छँटाई अलग समय बिंदुओं पर वांछित है। सेल सॉर्टर की लेजर विन्यास इस्तेमाल किया जाएगा के अनुसार उचित fluorophore संयोजनों का प्रयोग करें।
    12. अंतिम धोने के बाद, सेल छँटाई बफर के 1 मिलीलीटर में सेल गोली फिर से निलंबित। एक अस्थिर नियंत्रण का उपयोग कर उचित आगे और पक्ष तितर बितर करने के लिए सेटिंग्स सेल सॉर्टर सेट करें। प्रत्येक fluorophore के लिए उचित सेटिंग्स स्थापित करने के लिए एकल दाग नियंत्रण का प्रयोग करें।
    13. डबल दाग सेल निलंबन का एक छोटा सा नमूना का उपयोग करें; 2 आबादी हल किया जाना चयन और हल कोशिकाओं के समुचित संग्रह सुनिश्चित करने के लिए संबंधित प्रभारी आवंटित।
    14. सुनिश्चित करने के लिए कि हल सेल निलंबन तकिये और छँटाई के समय में सुरक्षित है संग्रह ट्यूबों में सेल वसूली माध्यम के 200 μl जोड़ें। कोशिकाओं की इच्छा नंबर फसल और ताजा युक्त नए iMEF व्यंजन पर स्थानांतरितLy वसूली मध्यम तैयार किया।
    15. वसूली माध्यम के साथ रात ऊष्मायन निम्न मध्यम बदलें। संस्कृतियों बाद में खिलाया जाना चाहिए और नियमित पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 इकाइयों / एमएल अंतिम एकाग्रता) युक्त hPSC माध्यम का उपयोग कर passaged।

6. समापन बिंदु विश्लेषण

  1. टर्मिनल alkaline फॉस्फेट (एपी) धुंधला
    1. अंतिम reprogramming क्षमता के साथ मनाया गतिज और रूपात्मक घटनाओं सहसंबंधी टर्मिनल chromogenic एपी धुंधला का प्रयोग करें।
    2. reprogramming के 21 दिनों के बाद, हटाने अच्छी तरह से संस्कृति के माध्यम से टर्मिनल एपी दाग ​​के साथ दाग हो और 200 मिमी Tris एचसीएल (पीएच 8.0) के साथ एक बार धो लें।
    3. के रूप में 200 मिमी Tris एचसीएल में निर्माता की पुस्तिका द्वारा निर्देशित धुंधला समाधान का उचित मात्रा में तैयार करें।
    4. धोने Aspirate और प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए तैयार धुंधला समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें। कमरे के तापमान पर 20 से 30 मिनट के लिए सेते हैं और वें से दूरई प्रकाश।
    5. धुंधला समाधान Aspirate और 200 मिमी Tris एचसीएल के साथ एक बार धो लें। धोने निकालें और दृश्य करने से पहले आसुत जल जोड़ें।
    6. वर्णमिति संकेत एक सामान्य कैमरे का उपयोग करके कब्जा। हाथ से सकारात्मक दाग कालोनियों की संख्या की गणना। दाग Trit-सी चैनल में फ्लोरोसेंट विश्लेषण का उपयोग कल्पना, के रूप में दाग भी प्रकृति में फ्लोरोसेंट है और पूरे अच्छी तरह से इमेजिंग प्रदर्शन और पूरे अच्छी तरह से इमेजर का उपयोग विश्लेषण। निर्माता प्रोटोकॉल का प्रयोग करें।

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Representative Results

निगरानी Reprogramming काइनेटिक्स से फ्लो का प्रयोग

CD44 एक fibroblast मार्कर, जबकि SSEA4 एक पीएससी मार्कर 6,10 है। इस अभिव्यक्ति पैटर्न से उम्मीद थी, बीजे fibroblasts की प्रवाह cytometry एक SSEA4 पता चलता है - CD44 + जनसंख्या कि बेदाग नमूना के साथ संयोजन में चतुर्थ भाग फाटक के निर्माण की सुविधा। सेंडाइ वायरस के साथ DF1 fibroblasts के reprogramming के दौरान, CD44 धीरे-धीरे जबकि SSEA4 धीरे से व्यक्त किया जाता है खो दिया है। CD44 + कोशिकाओं और SSEA4 + CD44 + कोशिकाओं की एक छोटी सी आबादी है कि 7 दिन (चित्रा 1) पर और अधिक विशिष्ट हो जाता है - सेंडाइ वायरस के साथ पारगमन के बाद 3 दिन में, वहाँ SSEA4 की एक बड़ी आबादी है। राज्य - 13 दिन में डबल सकारात्मक आबादी SSEA4 + CD44 की दिशा में बदलाव। द्वारा 17 दिन, सीई का एक बड़ा प्रतिशतसंस्कृति में lls पहले से ही SSEA4 + CD44 कर रहे हैं -। इस बार पाठ्यक्रम से पता चलता है कि CD44 और SSEA4 साथ प्रवाह cytometry प्रगति और reprogramming की दर पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

एक मात्रात्मक तुलना की पुष्टि करता है कि सेंडाइ reprogramming वायरस के साथ reprogramming बीजे fibroblasts SSEA4 + CD44 उत्पन्न करता है - बीजे fibroblasts (2A चित्रा) के reprogramming तुलना में एक अलग दर पर कोशिकाओं। डेटा दर्शाता है कि पीएससी की तरह SSEA4 + CD44 के प्रतिशत के शीघ्र - तुलना कोशिकाओं पटरियों reprogramming की प्रगति। दिलचस्प बात यह है DF1 fibroblast reprogramming के दिन 8, छंटाई और अलग से कोशिकाओं है कि SSEA4 upregulating की प्रक्रिया में हैं की आबादी संवर्धन और downregulating पर CD44 एपी + कालोनियों 11 (चित्रा 2 बी) उत्पन्न करता है। इसके विपरीत, मूल SSEA4 - CD44 + आबादी AM उत्पन्न करता हैreprogramming के दिन 21 एपी + कालोनियों की छोटी संख्या है, जो अंतिम कॉलोनी विश्लेषण के खास दिन है uch। यह पता चलता है कि यह मात्रा ठहराना और यहां तक कि SSEA4 + CD44 पहले reprogramming कैनेटीक्स में मतभेद की भविष्यवाणी करने के क्रम में संक्रमण की आबादी की तुलना करने के लिए संभव है - जनसंख्या का गठन किया है। यहाँ ध्यान दें करने के लिए एक महत्वपूर्ण मुद्दा यह है कि इस तरह के reprogramming दैहिक सेल की आबादी, पारगमन दक्षता, मध्यम, आदि हालांकि सामान्य पैटर्न और ऊपर वर्णित सतह मार्कर की प्रगति को विभिन्न प्रयोगों और reprogramming के बीच संगत है शुरू करने के रूप में कई कारकों पर एक चर प्रक्रिया निर्भर है fibroblasts शुरू। Reprogramming कैनेटीक्स का विश्लेषण भी इस तरह के नव पहचान नकारात्मक पीएससी मार्कर CD73 और B2M 6, के रूप में अच्छी तरह के रूप में स्थापित पीएससी मार्कर CD24 12,13 और 14,15 EpCAM के रूप में अलग मार्कर के साथ किया जा सकता है। बराबर में CD44, CD73 और B2M के लिए इसी प्रकार व्यक्त कर रहे हैंअंदरूनी बीजे fibroblasts, लेकिन reprogramming के दौरान downregulated कर रहे हैं, पूरी तरह से reprogrammed IPSCs (चित्रा 3 ए) में undetectable हो रहा है। CD44 और CD73 या CD44 और B2M का उपयोग कर समय बेशक एक प्रवाह cytometry, पता चलता है कि CD44 और CD73 एक समान दर पर downregulated कर रहे हैं, जबकि B2M CD44 (चित्रा 3 बी) की तुलना में तेजी downregulated है। दोनों ही मामलों में, reprogramming की दर डबल नकारात्मक आबादी के संचय को मापने के द्वारा देखा जा सकता है। इन नकारात्मक पीएससी मार्कर के विपरीत, CD24 और EpCAM fibroblasts में अनुपस्थित रहे हैं और IPSCs (चित्रा 3 ए) में व्यक्त कर रहे हैं। समय बेशक एक प्रवाह cytometry में, CD24 - CD44 + और ​​EpCAM - और EpCAM + CD44 - - पीएससी कोशिकाओं की तरह क्रमश: (चित्रा 3 बी) CD44 + fibroblasts अंत में डबल नकारात्मक आबादी है कि बाद में CD24 + CD44 में संक्रमण के रूप में। इस प्रकार, reprogramming के दौरान, दोनों सकारात्मक पीएससी मार्करबाद CD44 downregulated है व्यक्त कर रहे हैं। क्या SSEA4 और CD44, गठन और अलग सेल आबादी के संचय के साथ मनाया गया था के समान reprogramming की प्रगति का संकेत मिलता है।

ट्रैकिंग वास्तविक समय इमेजिंग विश्लेषण का उपयोग Reprogramming

शो कालोनियों की क्रमिक गठन (चित्रा -4 ए), जो चरण विपरीत (चित्रा 4 बी) के तहत संगम में एक लघुगणक वृद्धि से मेल खाती reseeding के बाद संस्कृतियों reprogramming की वास्तविक समय इमेजिंग। कालोनियों कि पीएससी मार्करों और unreprogrammed या आंशिक रूप से reprogrammed कोशिकाओं (चित्रा -4 ए, पिछले पैनल) के निरंतर प्रसार के लिए सकारात्मक रहे हैं चरण विपरीत तहत संगम इस प्रकार मात्रात्मक reprogramming की निगरानी के लिए एक और मीट्रिक प्रदान करता है, लेकिन यह दोनों शामिल हैं। क्षेत्रों है कि pluripotency मार्करों के लिए दाग दिया है बढ़ाताटीआरए-1-60, SSEA4 और एपी 6,10 21 दिन में इंगित करता है कि IPSCs केवल कुल संगम (चित्रा 4 बी) के आधे से भी कम के लिए खाते। अधिक इसरो reprogramming की प्रगति को मापने के लिए, यह reprogramming के लिए एक संवाददाता लाइन का उपयोग करना संभव है। इधर, माध्यमिक fibroblasts BG01v / हॉग ईएससी लाइन है, जो एक OCT4-GFP संवाददाता 16 के साथ अंजाम दिया गया है से उत्पन्न किया गया। GFP के रूप में कोशिकाओं reprogrammed रहे हैं और व्यक्त किया जाता है के रूप में कालोनियों का गठन कर रहे हैं (चित्रा 5 ए)। चरण विपरीत और हरे रंग चैनलों के तहत मापने संगम दर्शाता है कि GFP संगम कुल संगम की तुलना में अधिक धीरे-धीरे बढ़ता है, और 19 दिवस पर GFP संगम, कुल संगम (चित्रा 5 ब) के आधे से भी कम है टीआरए-1-60 की याद ताजा, 21 दिन में SSEA4 और एपी धुंधला हो जाना।

आकृति 1
चित्रा 1. मोReprogramming की प्रगति से फ्लो का प्रयोग nitoring। DF1 Fibroblasts के लिए से फ्लो डॉट भूखंडों फीडर मुक्त परिस्थितियों में सेंडाइ वायरस के साथ reprogrammed। प्रकोष्ठों काटा और reprogramming प्रक्रिया के दिन से दिन 3 (डी 3) से अलग अंतराल 19 (D19) में SSEA4 और CD44 एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। दिन 9 पर संस्कृतियों (D9) के बाद के बाद कोशिकाओं 7 दिन (D7) पर reseeded थे विश्लेषण किया गया। डॉट भूखंडों 8000 singlets दिखा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
। DF1 मिथ्या transducing के बाद reprogrammed कोशिकाओं - चित्रा 2 फीडर मुक्त परिस्थितियों में Reprogramming काइनेटिक्स और दक्षता का मूल्यांकन (ए) ग्राफ़ SSEA4 + CD44 के प्रतिशत में परिवर्तन दिखाroblasts और सेंडाइ वायरस के साथ बी.जे. fibroblasts। प्रकोष्ठों दिन 9 पर संस्कृतियों के बाद डे 7. (बी) के छद्म रंग में reseeding सेंडाइ वायरस transduced और SSEA4 और CD44 एंटीबॉडी के साथ दाग DF1 कोशिकाओं के लिए भूखंडों प्रवाह cytometry के दौर से गुजर साथ cytometry 19 के बाद पारगमन को 3 दिन में प्रवाह द्वारा विश्लेषण किया गया। SSEA4 -। CD44 + कोशिकाओं (काले वृत्त) और SSEA4 + कोशिकाओं (लाल वृत्त) दिवस 8 पर हल और क्षारीय फॉस्फेट (लाल) के लिए धुंधला हो जाना एक दिन पहले 19 तक बढ़ने की अनुमति दी गई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. अवलोकन Reprogramming फीडर मुफ्त संस्कृतियों के काइनेटिक्स विभिन्न सकारात्मक और नकारात्मक पीएससी मार्कर का उपयोग। (ई) लाइव धुंधलासकारात्मक पीएससी मार्करों के लिए एंटीबॉडी का उपयोग CD24 डे-18 DF1 व्युत्पन्न reprogramming संस्कृतियों और EpCAM और नकारात्मक पीएससी मार्कर CD44, CD73, और B2M की। शीर्ष पैनल हरे और लाल प्रतिदीप्ति चैनलों विलय जबकि नीचे पैनल भी चरण विपरीत छवि शामिल हैं। पैमाने बार 200 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। (ई) (D17 के लिए D9) काटा गया और 17 दिन 9 से ही मार्कर का उपयोग दाग DF1 व्युत्पन्न reprogramming संस्कृतियों के बाद पारगमन के लिए डॉट भूखंडों प्रवाह cytometry। विश्लेषण करने से पहले, संस्कृतियों डे 7. पर reseeded थे डॉट भूखंडों 8000 singlets दिखा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
मापने कुल संगम द्वारा चित्रा 4. ट्रैकिंग Reprogramming काइनेटिक्स। (ए) वास्तविक समय मैंबीजे की maging फीडर मुक्त परिस्थितियों में सेंडाइ वायरस के साथ reprogrammed fibroblasts। एक ही कालोनियों के चरण विपरीत छवियों CD44 और SSEA4, टीआरए-1-60 या एपी के लिए अतिरिक्त धुंधला के साथ, 19 को 7 दिवस पर ले जाया गया तो 21 दिन में। स्केल बार 400 माइक्रोन से मेल खाती है। (बी) के कुल संगम (चरण विपरीत) reprogramming के रूप में की मात्रा 21 दिन में करने के लिए डे 21. कुल संगम 7 दिवस पर reseeding से प्रगति SSEA4, टीआरए-1-60 और एपी संकेत संगम (की तुलना में है ग्रीन चैनल)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. मापने OCT4-GFP संगम द्वारा Reprogramming काइनेटिक्स का आकलन। साथ reprogrammed BG01v / हॉग hESC व्युत्पन्न fibroblasts की (ए) वास्तविक समय इमेजिंगसेंडाइ फीडर मुक्त परिस्थितियों में वायरस। चरण विपरीत, हरे रंग की रोशनी और विलय ही कालोनियों की छवियों 19. स्केल बार 400 माइक्रोन से मेल खाती करने के लिए 7 दिन में उत्पन्न हुए थे। (बी) के कुल संगम (चरण विपरीत) और OCT4-GFP संगम (ग्रीन चैनल) की मात्रा reprogramming प्रगति के रूप में डे 21 को 7 दिवस पर फिर से बोने से यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Disclosures

लेखकों [RHQ, JSTA, एस, और उल] के सभी थर्मो फिशर साइंटिफिक, जो अभिकर्मकों और इस लेख में इस्तेमाल के कुछ पैदा के कर्मचारी हैं।

Acknowledgments

लेखकों उपयोगी विचार विमर्श के लिए चाड मैकआर्थर धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10569-010
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin Thermo Fisher Scientific 16141-061
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher Scientific 11140-050
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red  Thermo Fisher Scientific 25300-054
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts Thermo Fisher Scientific A24903
Attachment Factor Protein (1x) Thermo Fisher Scientific S-006-100
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 10565-018
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828010
2-Mercaptoethanol (55 mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023
Collagenase, Type IV, powder Thermo Fisher Scientific 17104-019
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red  Thermo Fisher Scientific 12563-011
DPBS, no calcium, no magnesium  Thermo Fisher Scientific 14190-144
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413302
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0264
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575-020
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) Thermo Fisher Scientific 15260-037
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15630-080
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Thermo Fisher Scientific 15140-122
InSolution Y-27632 EMD Millipore 688001
CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A1378001
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A16517
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228
BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal ATCC CRL-2522
DF1 Adult Human Dermal Fibroblast Thermo Fisher Scientific N/A
BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells Thermo Fisher Scientific R7799-105
IncuCyte ZOOM Essen BioScience
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) Thermo Fisher Scientific SSEA421
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) Thermo Fisher Scientific A14810
SSEA-4 Antibody (MC813-70) Thermo Fisher Scientific 41-4000
TRA-1-60 Antibody (cl.A) Thermo Fisher Scientific  41-1000
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate Thermo Fisher Scientific A27094
CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging Thermo Fisher Scientific A25528
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) Thermo Fisher Scientific RM-5700 (no longer available)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Thermo Fisher Scientific  A-11029
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific  A-11007
Alkaline Phosphatase Live Stain Thermo Fisher Scientific A14353
TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging Thermo Fisher Scientific A25618
CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate Thermo Fisher Scientific MHCD2401
beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) Thermo Fisher Scientific A15737
EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) Thermo Fisher Scientific A15755
CD73 / NT5E Antibody (7G2) Thermo Fisher Scientific 41-0200
VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit Vector Laboratories SK-5100
Zeiss Axio Observer.Z1 microscope  Carl Zeiss 491912-0003-000
FlowJo Data Analysis Software FLOJO, LLC N/A
Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser Thermo Fisher Scientific Use Attune NXT 
S3e\ Cell Sorter (488/561 nm) BIO-RAD 1451006
Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap Corning 352235
Falcon 15 ml, high-clarity, dome-seal screw cap Corning 352097
Falcon T-75 Flask Corning 353136
Falcon T-175 Flask Corning 353112
Falcon 6-well dish Corning 353046
Heraeus Heracell CO2 Rolling Incubator Thermo Fisher Scientific 51013669
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 ml AM12450
HulaMixer Sample Mixer 15920D

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 113 Reprogramming प्रेरित pluripotent स्टेम सेल वास्तविक समय इमेजिंग प्रवाह cytometry स्टेम सेल मार्कर गतिज माप
काइनेटिक मापन और रीयल टाइम दैहिक Reprogramming के दृश्य
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Quintanilla Jr., R. H., Asprer, J.,… More

Quintanilla Jr., R. H., Asprer, J., Sylakowski, K., Lakshmipathy, U. Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming. J. Vis. Exp. (113), e54190, doi:10.3791/54190 (2016).

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