Summary
Protokollet presenteras i denna studie beskriver metoder för realtidsövervakning av omprogrammering progression via den kinetiska mätning av positiva och negativa pluripotenta stamceller markörer använder flödescytometrianalys. Protokollet innehåller också bildbaserad bedömning av morfologi, och markör eller reporter uttryck under iPSC generation.
Introduction
Patientgenererade inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) är lovande verktyg för cellterapi och läkemedelsscreening. De ger en autolog källa av celler för terapi. Dessutom är de omfattar en mycket bred uppsättning av genetiska bakgrunder, vilket möjliggör en detaljerad in vitro analys av genetiska sjukdomar utöver vad nuvarande embryonal stamcell (ESC) linjer skulle tillåta. Nyligen gjorda framsteg har lett till utvecklingen av flera metoder för att generera iPSCs, inklusive omprogrammering med Sendai-virus, episomala plasmider eller mRNA 1,2. Noterbart är olika omprogrammering metoder i samband med olika nivåer av effektivitet och säkerhet, och kommer sannolikt att skilja sig på andra sätt som påverkar deras lämplighet för olika tillämpningar. Med tillgängligheten av en mångfald omprogrammering teknik, har det blivit viktigt att utveckla metoder för att bedöma den omprogrammering processen. De flesta existerande metoder förlitar sig på kvalitativ kontroll av morfologi eller färgningmed stamceller cellspecifika färgämnen och antikroppar. En nyligen utvecklad metod använder sig av lentivirala fluorescens reportrar som är känsliga för PSC specifika miRNA eller differentierade cellspecifika mRNA 3. Sådana övervakningsmetoder underlättar val och optimering av omprogrammering tekniker för olika situationer. Till exempel, har CDy1 använts som en fluorescerande sond för tidiga iPSCs för att screena för omprogrammering modulatorer 4. Förmågan att observera och jämföra olika omprogrammering experiment är också avgörande för att få en bättre förståelse av själva processen. Exempelvis är det nu känt att vissa somatiska celltyper är lättare att programmera än andra 5, och att celler går igenom mellanlägen under omprogrammering 6-8. Tyvärr, mekanismerna bakom omprogrammering processen fortfarande inte helt klarlagda och därmed de exakta skillnaderna mellan omprogrammering metoder förblir också defined. Således, metoder för att övervaka, bedöma och jämföra omprogrammering händelser fortsätter att vara avgörande för stamcellsområdet.
De metoder som beskrivs i detta protokoll tillåta övervakning och utvärdering av den omprogrammering processen och illustrerar hur dessa tekniker kan användas för att jämföra olika typer av omprogrammering reagens. Den första metoden innebär flödescytometri analyser med hjälp av kombinationer av antikroppar mot positiv och negativ pluripotenta stamceller (PSC) markörer. Den andra metoden par realtid avbildning och mätning av totalt sammanflödet (den procentuella yta som täcks av cellerna) och sammanflödet av markeringssignaler (den procentuella yta som täcks av fluorescerande signaler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.Solution och Medium Framställning
- Basement Membrane Matrix (renat från Engelbreth-Holm-Swarm Tumör)
- Långsamt tina basalmembranet matrisen (5 ml) på is vid 4 ° C över natten.
- Späd stamlösningen 1: 1 med 5 ml iskall, steril DMEM / F-12-medium i en steril, för-kyld 15 ml koniska rör. Dispensera alikvoter in i pre-kylda, 1,5 ml sterila mikro centrifugrör och omedelbart lagra vid -20 ° C.
- Före användning, tina den frusna 1: 1 basalmembranmatrisen alikvot över natten vid 4 ° C. Vid tidpunkten för användning, ytterligare försvaga en: en alikvot en annan 50 gånger med iskall, steril DMEM / F-12-medium till en slutlig spädning av 1: 100.
- Tillsätt en lämplig mängd av den 1: 100 utspätt basalmembranet matrislösningen till den lämpliga vävnadskultur (TC) kärl och inkubera vid 37 ° C under 1 timme. Typiskt använda 3 ml av den utspädda basalmembranet matrislösningen för att belägga en TC skålen of 20 cm 2 ytarea, täcka alla andra typer av TC rätter / plattorna vid ett förhållande av 0,15 ml av utspätt matris per cm 2 ytarea. Aspirera den återstående lösningen före tillsats av något odlingsmedium och celler.
- fibroblast Medium
- Tina en 100 ml flaska ES kvalificerad fetalt bovint serum (ES-FBS) vid 4 ° C över natten.
- Tillsätt 50 ml av den tinade ES-FBS och 5 ml MEM icke-essentiell aminosyralösning (1 x) till 445 ml DMEM-medium. Sterilisera de kombinerade komponenterna genom ett 0,22 pm filter och lagra mediet vid 4 ° C under upp till 4 veckor.
- Imef Medium
- Tina en 100 ml flaska ES-FBS vid 4 ° C över natten.
- Tillsätt 50 ml av den tinade FBS, 5 ml av MEM icke-essentiella aminosyralösning (1 x), och 500 | il 2-merkaptoetanol till 445 ml DMEM-medium.
- Sterilisera kombinerade komponenterna genom ett 0,22 pm filter och lagra migDIUM vid 4 ° C under upp till 4 veckor.
- Basisk fibroblasttillväxtfaktor lösning (b-FGF)
- Tillsätt 10 pl Serum Byte till 990 pl D-PBS och blanda genom att pipettera upp och ned.
- Tillsätt 1 ml av 1% (v / v) Serum Byte lösning till en flaska med 10 mikrogram lyofiliserat B-FGF. Blanda noggrant genom att försiktigt pipettera upp och ner.
- Alikvotera 10 | j, g / ml b-FGF-lösning i 200 | il alikvoter i mikrocentrifugrören och lagra vid -20 ° C tills det behövs i upp till fyra veckor.
- Human pluripotenta stamceller (hPSC) Medium
- Tina en 100 ml flaska Serum Byte vid 4 ° C över natten.
- Tillsätt 100 ml av den tinade Serum Byte, 5 ml av MEM icke-essentiella aminosyralösning (1 x), och 500 | il 2-merkaptoetanol till 395 ml av DMEM / F-12-medium.
- Sterilisera kombinerade komponenterna genom ett 0,22 pm filter och lagra mediet vid4 ° C i upp till fyra veckor.
- Vid tiden för användning, för-värma hPSC medium till 37 ° C och komplettera med 4 ng / ml av bFGF.
- Imef Konditionerat medium (CM)
- Lägga 18 ml 0,1% gelatin till en T-175 odlingskolv och inkubera vid 37 ° C under 1 timme.
- Avlägsna gelatinlösning 0,1% efter en timmes inkubation. Lägg 9,1 x 10 6 mitotiskt inaktiverade mus embryonala fibroblaster (Imef) i 45 ml Imef medium och inkubera i 37 ° C inkubator över natten.
- Efter inkubation över natten, ta bort den gamla Imef mediet och tvätta en gång med 25 ml D-PBS i 5 min vid rumstemperatur.
- Sug bort den D-PBS tvätta och tillsätt 90 ml av förvärmda hPSC-medium, kompletterat med 4 ng / ml av bFGF. Inkubera i 37 ° C inkubator under exakt 24 timmar.
- Efter 24 h av inkubation, aseptiskt avlägsna hPSC mediet från Imef kolven och sterilisera genom ett 0,22 pm filter. Alikvot in i fem0 ml koniska rör och frys vid -20 ° C tills de behövdes. Imef CM kan förvaras i upp till 6 månader vid -20 ° C.
- Lägga till ytterligare 90 ml förvärmt hPSC medium kompletterat med 4 ng / ml av bFGF till Imef kolven. Inkubera i 37 ° C inkubator under exakt 24 timmar. Upprepa skörd av CM för upp till 7 dagar.
- Vid tiden för användning, för-värma Imef-CM till 37 ° C och komplettera med 4 ng / ml av bFGF.
- E8 Medium
- Tina en 10 ml E8 komplement vid 4 ° C över natten.
- Ta 10 ml av E8 basalmediet och tillsätt aseptiskt innehållet i den tinade E8 komplement till den återstående basala mediet. Blanda omsorgsfullt och sterilisera genom ett 0,22 pm filter. Lagra det kompletta mediet vid 4 ° C i upp till 2 veckor.
- Vid tiden för användning, för-värma alikvoten av det medium som skall användas till rumstemperatur. Det rekommenderas inte att i förväg varm E8 medium till 37 ° C.
- cell Sårting buffert
- Framställ färsk sorteringsbuffert precis innan cellsortering genom tillsats av EDTA-lösning (1 mM slutkoncentration), HEPES-buffert (25 mM slutkoncentration) penicillin / streptomycin-lösning (100 enheter / ml slutlig koncentration) och bovint serumalbumin (1% slutlig koncentration) in i Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (kalcium och magnesium free).
- Sterilisera bufferten genom ett 0,22 pm filter före användningen.
- Cellsortering Recovery Medium
- Modifiera 50 ml Fibroblast Medium genom tillsats av penicillin / streptomycin (100 enheter / ml slutlig koncentration) och Rock Inhibitor Y-27632 (10 pM slutkoncentration). Pre-värma detta medium för att 37 ° C före sådd de sorterade cellerna.
2. Sendai medierad Omprogrammering av humana fibroblaster
- 24 h före transduktion med de Sendai virus, ympa fibroblaster vid en densitet av 2 x 10 5 calnar per brunn till de önskade brunnarna i en 6-brunnars TC platta.
- Utföra transduktionen på dag 0 enligt följande.
- Pre-varma 2 ml Fibroblast Medium i ett 37 ° C vattenbad. Ta bort en uppsättning av Sendai-virus rören från -80 ° C lagring och tina varje rör en i taget genom att först sänka ned botten av röret i ett 37 ° C vattenbad i 5-10 sek, och sedan ta bort röret från vattnet bad och låt den tina vid rumstemperatur. När tinats, centrifugera kort röret och placera den omedelbart på is.
- Kommersiellt andra generationens Sendai virus genom att lägga till lämpliga volymer (enligt COA) för vart och ett av rören i syfte att uppnå följande infektionsmultiplicitet (MOI) till 1 ml förvärmda Fibroblast Medium per brunn för att omvandlas som följer : KOS = 5 x 10 6 CIU, hc-Myc = 5 x 10 6 CIU, hKlf4 = 3 x 10 6 CIU.
- Blanda den virala lösningen genom att pipettera blandningen försiktigt upp och ned. komplette nästa steg inom 5 min.
- Aspirera Fibroblast Medium från brunnen av de fibroblaster som skall omprogrammeras, och tillsätt 1 ml av den virala lösningen till varje brunn. Placera cellerna i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator och inkubera över natten.
- Efter inkubation över natten, aspirera av omvandlingsmediet och kassera den gamla mediet ordentligt (10% blekmedelslösning under 30 min). Ersätt med 2 ml förvärmd Fibroblast medium och fortsätta att odla de omvandlade cellerna.
- Kultur cellerna i 6 dagar, som ersätter det gamla mediet med färskt Fibroblast Medium varannan dag.
Obs: Inte passage de omprogrammerade celler tills 7 dagar efter transduktion. - Dag 6: tillaga dina rätter iPSC Generation
- För feeder beroende iPSC generation, tillsätt 1,5 ml av 0,1% gelatinlösning till varje brunn i en 6-brunnars vävnadsodlings (TC) skålen och inkubera vid 37 ° C under 1 timme.
- Ta bort 0,1% gelatin sålution efter 1 h av inkubation. Tillsätt 3 x 10 5 mitotiskt-inaktiverade mus embryonala fibroblaster (Imef) i 2 ml Imef medium per brunn och inkubera i 37 ° C inkubator över natt.
- För feeder oberoende iPSC generation, tillsätt 1,5 ml utspädd basalmembranmatris (1: 100 spädning) till varje brunn i en 6-brunnars vävnadsodlings (TC) skålen och inkubera vid 37 ° C under 1 timme.
- Sju dagar efter transduktion, skörda de omvandlade fibroblaster och åter plattan dem på de färdiga odlingsskålar för iPSC koloni generation.
- Sug bort den normala näringslösningen från fibroblaster, och tvätta cellerna en gång med 2 ml D-PBS.
- Sug bort den D-PBS tvätta och tillsätt 0,5 ml förvärmd 0,05% trypsin / EDTA. Inkubera cellerna i 3-5 min vid 37 ° C.
- När cellerna har avrundats uppåt, tillsätt 2 ml förvärmda Fibroblast medium i varje brunn för att stoppa trypsinisering. Lösgöra cellerna från brunnen genom att försiktigt pipettera than mediet över ytan av skålen. Samla cellsuspensionen i ett 15-ml koniskt centrifugrör.
- Centrifugera cellerna vid 200 xg under 2 min. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 2 ml färsk, förvärmda Fibroblast Medium.
- Räkna celler med önskad metod (hemocytometer eller automatisk cellräknare) och ympa förberedda odlingsskålar med 5 x 10 4 celler för feeder beroende villkor och 1 x 10 5 celler för feeder oberoende förhållanden per brunn i en 6 -Jo skålen och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 inkubator över natten.
- Efter inkubation över natten, ändra medellång till hPSC medium, E8 medium eller Imef konditionerade media, beroende på applikation. Byt ut det gamla mediet med färskt medium varje dag därefter.
3. Sendai omprogrammering av BGO1v hOct4-GFP Reporter mänskliga embryonala stamceller (hESC) Härledd Sekundära fibroblaster
- derive sekundära humanfibroblaster från BG01v hOct4-GFP reporter hESC linje enligt det ovan beskrivna förfarandet 9.
- Två dagar före transduktion, plåt BGO1v / hog härledda fibroblaster i två brunnar av en 6-brunnars platta med 2 x 10 5 celler per brunn, med användning av Fibroblast Medium.
- På dagen för transduktion, pre-varma 2 ml av Fibroblast Medium till 37 ° C.
- Ta bort en uppsättning av Sendai rören från -80 ° C lagring. Ta ut flaskorna ur påsen och tina varje rör en i taget genom att först sänka ned botten av röret i ett 37 ° C vattenbad i 5-10 sek, varefter, tillåter rören att tina vid rumstemperatur. När tinats, centrifugera kort röret och placera den omedelbart på is.
- Lägg de angivna volymer av var och en av de tre Sendai rören (se CoA för lämplig volym) till 2 ml Fibroblast Medium, förvärmda till 37 ° C och blanda den virala lösningen genom att pipettera upp och ned. Slutföra nästa step inom 5 min.
Obs: För detta experiment, en MOI av 5: 5: 6 användes. - Aspirera Fibroblast Medium från brunnar i fibroblaster som ska omvandlas. Tillsätt 1 ml av den virala suspensionen till vardera av två brunnar som skall transduceras. Placera cellerna i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator och inkubera över natten.
- Efter inkubation över natten, avlägsna omvandlingsmediet och kassera det på rätt sätt (10% blekmedelslösning under 30 min). Ersätt varje brunn med 2 ml förvärmd Fibroblast medium och fortsätta att odla de omvandlade cellerna.
- Kultur cellerna i 6 dagar, ändra gamla mediet med färskt Fibroblast Medium varannan dag.
- Sju dagar efter transduktion, skörda de omvandlade fibroblaster och åter plattan dem på de färdiga odlingsskålar för iPSC koloni generation.
- Sug bort den normala näringslösningen från fibroblaster, och tvätta cellerna en gång med 2 ml D-PBS.
- Sug bort DPBS tvätta och tillsätt 0,5 ml av förvärmd 0,05% trypsin / EDTA. Inkubera cellerna i 3-5 min vid 37 ° C.
- När cellerna har avrundats uppåt, tillsätt 2 ml förvärmda Fibroblast medium i varje brunn för att stoppa trypsinisering. Lösgöra cellerna från brunnen genom att försiktigt pipettera mediet över ytan av skålen. Samla cellsuspensionen i ett 15-ml koniskt centrifugrör.
- Centrifugera cellerna vid 200 x g under 2 minuter. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i en lämplig mängd färsk, förvärmda Fibroblast Medium.
- Räkna celler med önskad metod (hemocytometer eller automatisk cellräknare).
- Ympa de transducerade cellerna vid en densitet av 1 x 10 5 celler per brunn i en basalmembranmatris -belagda 6-brunnar och inkubera i ett 37 ° C, 5% CO2 inkubator över natten.
- Efter inkubering över natten, ändra mediet för att Imef konditionerat medium, som kompletterats med 10 ng / ml B-FGF. Byt ut det gamla mediet med färskt Imef CM vardagen därefter.
- Tre veckor efter transduktion, mekaniskt dissekera och överföra de önskade kolonierna för klonal expansion eller använda för analys.
4. Levande cell imaging av Fibroblast Omprogrammering
- Realtidsövervakning
- 7 dagar efter transduktion med Sendai omprogrammering kit, utsäde den önskade mängden av celler på 6-brunnsskålar med de önskade medel och matrissystem såsom tidigare beskrivits. Placera seedade rätter inuti kameran, som ligger i en fuktad inkubator inställd på 37 ° C och 5% CO2.
- Ställ bildbehandlingsprogram för att fånga hela väl bilder av varje enskild brunn vid ett bestämt intervall (varje 6-8 h) kontinuerlig bildfångande för de närmaste 14 dagarna enligt tillverkarens protokoll.
Obs: Fas kontrastbildinställningar väljs för normal omprogrammering för att utvärdera koloni progression. I falletav BG01v / Hög härledda fibroblaster omprogrammering, är det bäst att ta bilder i fas kontrast och i det grönt fluorescerande kanal som återaktivering av den endogena Oct4-GFP reporter kan spåras hela omprogrammering processen. - Ändra mediet dagligen, kan det vara hPSC medium, E8 medium eller Imef-CM, beroende på experimentet, såsom beskrivits tidigare från dag 8-21 efter transduktion. Brunnarna kan analyseras ytterligare för kolonibildning med användning av indirekt immunofluorescens.
- Vid slutet av experimentet på dag 19-21, avlägsna odlingsmediet från varje brunn för att sonderas med antikroppar för fibroblast och stamcellsmarkörer av valet.
- Tvätta varje brunn en gång med 2 ml förvärmda DMEM / F-12-medium.
- Framställa alikvoter av vardera positiva / negativa primära par antikropps i 1 ml DMEM / F-12-medium enligt följande: anti-mus SSEA4 (1: 200) och anti-rått-CD44 (1:50), anti-mus-TRA-1- 60 (1: 200) och anti-rått-CD44 (01:50), och alkaliskt fosfatas Live Stain (01:50) och anti-rått-CD44 (01:50). Tillsätt 1 ml lösningar primär antikropp till varje motsvarande brunn. Inkubera vid 37 ° C under 45 min.
- Sug bort den primära antikroppslösningen och tvätta två gånger med förvärmda DMEM / F-12-medium.
- Förbereda sekundära antikroppslösningar (1 ml för varje brunn) med användning av get-anti-mus-Alexa Fluor 488-konjugerad sekundär (1: 500) för grön fluorescens och get-anti-rått-Alexa Fluor 594-konjugerad sekundär (1: 500) för röd fluorescens i DMEM / F-12-medium. Lägg till varje brunn efter den sista tvätten. Inkubera de sekundära antikropparna för 30 min vid 37 ° C.
Obs: På grund av alkaliskt fosfatas Live Stain s (APLs) transienta signalen, bör den anti-CD44 primär inkubation först utförs av sig själv och den APLs bör tillsättas vid tidpunkten för inkubation med de sekundära antikropparna - Efter den sekundära antikroppen inkubation aspirera bort lösningen och tvätta två gånger med DMEM / F-12-medium. Lägg färsk förvärmda DMEM / F-12medium till varje brunn före den slutliga bildfångst.
- Ställ kameran programvara för att förvärva hela och bilder av varje brunn med hjälp av alla tre inläsningsparametrarna: faskontrast, grön fluorescens och röd fluorescens. Skapa bilder på olika förstoringar och skapa tidsförlopp filmer med programvara för att övervaka tillväxt och markör uttryck. Använd tillverkarens protokoll.
- Med användning av analysmjukvara, utvärdera sammanflödet av brunnen över tiden i fas kontrast och grönt fluorescerande enheter för BG01v / HOG omprogrammering.
- Övervakning Omprogrammering intermediärer genom cellytemarkörer
- Övervaka omprogrammering händelser vid olika tidpunkter genom att sondera de omprogrammeringar rätter vid olika tidpunkter med antikroppar mot olika stamcells positiva / negativa markörer för att övervaka omprogrammering processen. Probe kulturer var 2 till 3 dagar beroende på tillgänglighet replikat. Sondera omprogrammeringar dishes på dag 19 till 21 med hjälp av dubbla färgnings strategi för att identifiera helt omprogrammerade IPSC kolonier och delvis omprogrammerade kolonier baserade på färgningsmönster.
- Vid den önskade tidpunkten, aspirera av det normala tillväxtmediet från varje brunn för att sonderas med antikroppar för de markörer för val.
- Tvätta varje brunn en gång med 2 ml förvärmda DMEM / F-12-medium.
- Framställa alikvoter av vardera positiva / negativa primära par antikropps i 1 ml DMEM / F-12-medium enligt följande: SSEA4 konjugerad till det grönt fluorescerande fluoroforen (1: 200), TRA-1-60 konjugerad till det grönt fluorescerande fluoroforen (1: 50), Alkaline Live Stain (1: 500), CD24 konjugerad till ett grönt fluorescerande fluorofor (1:50), B2M konjugerat till ett grönt fluorescerande fluorofor (1:50), EpCAM konjugerat till ett grönt fluorescerande fluorofor (01:50) , mus CD73 (1: 100), som probades med anti-mus sekundär antikropp konjugerad till ett grönt fluorescerande fluorofor (en: 500), och rått-CD44 (01:50) som är probades medanti-rått sekundär antikropp konjugerad till den röda fluorescerande fluoroforen (1: 500). Tillsätt 1 ml lösningar primär antikropp till varje motsvarande brunn. Inkubera vid 37 ° C under 45 min.
- Sug bort den primära antikroppslösningen och tvätta två gånger med förvärmda DMEM / F12-medium.
- För okonjugerade antikroppar, gå vidare till användning av en två-stegsmetod genom framställning av de lämpliga lösningar sekundär antikropp och inkubera under 30 minuter vid 37 ° C. Kontrollera att sekundära antikroppar till de primära värdar och korsreagerar inte. Utföra ytterligare tvättsteg som beskrivits tidigare.
- Efter alla lämpliga tvättar, tillsätt färsk förvärmda DMEM / F-12-medium till varje brunn före den slutliga bildfångst.
- Fånga fluorescerande bilder under lämpligt filter vid 100 gångers förstoring med hjälp av en fluorescerande mikroskop och analysera bilder med hjälp av tillgängliga analysprogram.
5. Mätning av omprogrammering Kinetics Använda Flow Cytometry
- Kvantitativ Kinetic Mätning av omprogrammering använder cellytan Antikroppar
- Före omprogrammering, ställa in lämpligt antal omprogrammering experiment för varje tidpunkt. För mätning kinetiken av omprogrammering under de första 7 dagarna av omprogrammering, individuella transduktioner utförs för varje önskad tidpunkt. För tidpunkter efter Dag 7, utsäde tillräckligt mataroberoende tidpunkter att fortsätta att mäta omprogrammeringar händelser. En enda brunn i en 6-brunnars platta kommer att ge tillräckliga mängder av celler för utförande av flödescytometrianalys.
- Mät alla önskade omprogrammering tidpunkter från enskilda brunnar, eftersom detta är en slutpunkt analys. Aspirera bort Fibroblast Medium från det önskade väl. Tvätta en gång med D-PBS.
- Sug bort D-PBS-tvätt. Tillsätt 1 ml 0,05% trypsin-EDTA-lösning till brunnen som skall testas. Inkubera vid rumstemperatur under 5 min.
- Efter inkubationen dissociåt de celler till enstaka celler genom att spola en ml cellsuspensionen mot ytan av brunnen och överför suspensionen till ett 15 ml koniskt rör. Använd 3 ml D-PBS för att tvätta bort eventuella kvarvarande celler från brunnen och lägga till dem i 15 ml koniska. Använd 10 ml av ytterligare D-PBS för att ytterligare späda cellösningen i koniska rör.
- Centrifugera cellerna vid 200 xg under 2 min. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml DMEM / F-12-medium. Utföra en cellräkning som behövs för att skapa en standardcellsuspension som är mindre än 1 x 10 6 celler / ml.
- Förbereda varje alikvot av positiva / negativa direkt-konjugerade antikroppar av val i 1 ml DMEM / F-12-medium för mindre 1 x 10 6 celler / ml med användning av följande kombinationer: SSEA4 konjugerade till ett grönt fluorescerande fluorofor (en: 200) med CD44 konjugerad till PE-Cy5, eller CD44 konjugerad till ett grönt fluorescerande fluorofor och SSEA4 konjugerat till en långt röd fluorescerande fluoroforen. inkuberaantikropparna med cellsuspensionen under 45 min vid rumstemperatur.
- Aspirera den primära antikroppslösningen och tvätta två gånger med förvärmda DMEM / F-12-medium.
- Aspirera den slutliga tvättningen och återsuspendera cellpelleten i 1 ml D-PBS. Pipett innehållet i varje suspension i enskilda FACS rör.
- Med hjälp av lämpliga negativa kontroller (ofärgade och isotypkontrollerna), bekräfta rätt framåt och sidospridning profil och spänningar på cytometern. Ställ in spänningarna för motsvarande fluoroforer enligt de första enstaka fläck parametrar, så att de gröna fluoroforerna aktiveras av den blå laser och signaler som förvärvats i BL1 kanalen medan långt rött fluorescerande fluoroforen och PE-Cy5 fluoroforen aktiveras av röd laser och signaler som förvärvats i RL1 kanal. Förvärva den dubbla-färgade populationen för varje tidpunkt.
- Analysera FCS-filer för varje tidpunkt med hjälp av lämplig analys programvara och använda redaktören att ARRANGE uppgifter att observera befolkningen uttryck förändras med tiden.
- Följ steg 5.1.1 till 5.1.6, om cellsortering önskas vid olika tidpunkter. Använd lämpliga fluoroforen kombinationer enligt konfiguration lasern av cellsorterare som ska användas.
- Efter den sista tvätten, återsuspendera cellpelleten i 1 ml av cellsortering buffert. Ställ in cellsorterare till rätt framåt och Side Scatter inställningar med en ofärgade kontroll. Använd de enskilda färgade kontroller för att ställa in rätt inställningar för varje fluorofor.
- Använda ett litet prov av den dubbel färgade cellsuspension; Välj 2 populationer som ska sorteras och tilldela respektive avgift för att säkerställa korrekt samling av de sorterade cellerna.
- Tillsätt 200 pl av cellutvinning mediet in i uppsamlingsrören för att säkerställa att den sorterade cellsuspension dämpas och skyddas vid tidpunkten för sortering. Skörda önskan antalet celler och överföra till nya Imef rätter som innehåller färskly beredd återställningsmedium.
- Ändra mediet efter inkubation över natten med återställningsmedium. Kulturerna måste matas därefter och rutinmässigt passe med användning hPSC medium innehållande penicillin / streptomycin (100 enheter / ml slutkoncentration).
6. Endpoint Analys
- Terminala Alkaline Phosphatase (AP) Färgning
- Använd terminal kromogen AP färgning för att korrelera observerade kinetiska och morfologiska händelser med slutliga omprogrammering effektivitet.
- Efter 21 dagars omprogrammering, avlägsna odlingsmediet från brunnen som skall färgas med terminala AP fläcken och tvätta en gång med 200 mM Tris-HCl (pH 8,0).
- Förbered lämplig mängd färglösningen enligt anvisningar från tillverkarens manual på 200 mM Tris-HCI.
- Suga ut tvätt och tillsätt 2 ml av den framställda färglösningen till varje brunn. Inkubera i 20 till 30 minuter vid rumstemperatur och bort från the ljus.
- Aspirera färgningslösningen och tvätta en gång med 200 mM Tris-HCl. Ta bort tvätt och tillsätt destillerat vatten före visualisering.
- Fånga kolorimetrisk signal med hjälp av en normal bild kamera. Räkna antalet positivt färgade kolonier för hand. Visualisera fläcken med fluorescerande analys i Trit-C-kanal, eftersom fläcken är också fluorescerande i naturen och utför hela brunnar avbildning och analyseras med hjälp av hela brunnar kameran. Använd tillverkarens protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Övervakning programmera Kinetics med flödescytometri
CD44 är en fibroblast markör medan SSEA4 är en PSC markör 6,10. Som förväntat från denna uttrycksmönster, flödescytometri av BJ fibroblaster visar en SSEA4 - CD44 + befolkning som underlättar skapandet av kvadrant grindar i kombination med den ofärgade provet. Under omprogrammering av DF1 fibroblaster med Sendai virus, är CD44 gradvis förlorat medan SSEA4 långsamt uttrycks. På dag 3 efter transduktion med Sendai virus, det finns en stor population av SSEA4 - CD44 + celler och en liten population av SSEA4 + CD44 + celler som blir tydligare vid dag 7 (Figur 1). På dag 13, övergår dubbelpositiva populationen mot SSEA4 + CD44 - tillstånd. Vid dag 17, en stor andel av den cells i kultur är redan SSEA4 + CD44 -. Denna kurs visar tids som Flödescytometri med CD44 och SSEA4 kan användas för att övervaka fortskridandet och hastigheten för omprogrammering.
En kvantitativ jämförelse bekräftar att omprogrammering BJ fibroblaster med Sendai omprogrammering virus genererar SSEA4 + CD44 - celler i en annan takt än omprogrammering av BJ fibroblaster (Figur 2A). Data visar att en tidig jämförelse av andelen PSC liknande SSEA4 + CD44 - celler spårar utvecklingen av omprogrammering. Intressant vid dag 8 av DF1 fibroblast omprogrammering, sortering och separat odling av populationen av celler som är i färd med att uppreglera SSEA4 och nedreglera CD44 genererar AP + -kolonier 11 (Figur 2B). I motsats, den ursprungliga SSEA4 - CD44 + populationen genererar amn sådan mindre antal AP + kolonier vid dag 21 av omprogrammering, som är den typiska dagen för slutlig kolonianalys. Detta tyder på att det är möjligt att kvantifiera och jämföra övergår populationen i syfte att förutsäga skillnader i omprogrammering kinetik även innan SSEA4 + CD44 - populationen bildas. En viktig punkt att notera här är att omprogrammering är en variabel process som är beroende på flera faktorer, såsom utgångs somatisk cellpopulation, transduktion effektivitet, medium, etc. Men det allmänna mönstret och progression av de ovan beskrivna ytmarkörer är konsekvent mellan olika omprogrammering experiment och utgångs fibroblaster. Analysen av omprogrammering kinetik kan också göras med olika markörer, såsom de nyligen identifierade negativa PSC markörer CD73 och B2M 6, såväl som de etablerade PSC markörerna CD24 12,13 och EpCAM 14,15. I likhet med CD44, CD73 och B2M uttrycks i parental BJ fibroblaster, men är nedreglerade under omprogrammering, blir omöjlig att upptäcka i fullt omprogrammerade iPSCs (figur 3a). En flödescytometri tidsförloppet med hjälp av CD44 och CD73 eller CD44 och B2M visar att CD44 och CD73 är nedregleras i samma takt, medan B2M nedregleras snabbare än CD44 (figur 3B). I båda fallen kan man observera hastigheten för omprogrammering genom att mäta ackumulationen av den dubbla negativa populationen. I motsats till dessa negativa PSC markörer, CD24 och EpCAM är frånvarande i fibroblaster och uttrycks i iPSCs (figur 3A). I en flödescytometri tidsförloppet, CD24 - CD44 + och EpCAM - CD44 + fibroblaster bildar så småningom dubbelnegativa populationer som senare övergång in CD24 + CD44 - och EpCAM + CD44 - PSC-liknande celler, respektive (Figur 3B). Således, under omprogrammering, både positiva PSC marköreruttrycks efter CD44 nedregleras. I likhet med vad som observerades med SSEA4 och CD44, bildning och ackumulering av olika cellpopulationer visar utvecklingen av omprogrammering.
Spårning Omprogrammering Användning av realtids bildanalys
Realtid avbildning av omprogrammering kulturerna efter återsådd visar den gradvisa bildandet av kolonier (Figur 4A), vilket motsvarar en logaritmisk ökning av sammanflödet enligt faskontrast (figur 4B). Confluence enligt faskontrast ger således en annan mått för övervakning av omprogrammering kvantitativt, men det omfattar både de kolonier som är positiva för PSC markörer och den fortsatta spridningen av unreprogrammed eller delvis omprogrammerade celler (Figur 4A, sista panelen). Kvantifiera de områden som har färgats för pluripotens markörerTRA-1-60, SSEA4 och AP 6,10 vid dag 21 indikerar att iPSCs bara står för mindre än hälften av den totala sammanflödet (Figur 4B). För att mäta utvecklingen av omprogrammering strängare, är det möjligt att använda en reporter linje för omprogrammering. Här, var sekundära fibroblaster genereras från BG01v / HOG ESC linjen, som har konstruerats med en Oct4-GFP reporter 16. GFP uttrycks som cellerna omprogrammeras och som kolonier bildas (figur 5A). Mätning flödet i fas kontrast och gröna kanalerna visar att GFP sammanflödet ökar långsammare än den totala sammanflödet, och GFP sammanflödet vid dag 19 är mindre än hälften av den totala sammanflödet (Figur 5B), påminner om TRA-1-60, SSEA4 och AP färgning på dag 21.
Figur 1. Monitoring Progress av Omprogrammering med användning av flödescytometri. Flödescytometri punktdiagram för DF1 fibroblasts omprogrammeras med Sendai Virus enligt feeder-fria förhållanden. Celler skördades och färgades med SSEA4 och CD44-antikroppar vid olika intervall från Dag 3 (D3) och Dag 19 (D19) av omprogrammering processen. Kulturer vid dag 9 (D9) framåt analyserades efter cellerna såddes vid dag 7 (D7). Punktdiagram visar 8000 sing. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Figur 2. Utvärdera Omprogrammering Kinetics och effektivitet under Feeder fria förhållanden (A) Diagram som visar förändringar i andelen SSEA4 + CD44 - omprogrammeras celler efter transduktion DF1 fibroblasts och BJ fibroblaster med Sendai virus. Celler analyserades genom flödescytometri på dag 3-19 efter transduktion, med kulturer vid dag 9 och framåt som genomgår återsådd vid dag 7. (B) Pseudo-färg flödescytometri tomter för DF1 celler transducerade Sendai virus och färgades med SSEA4 och CD44-antikroppar. SSEA4 -. CD44 + celler (svart cirkel) och SSEA4 + celler (röd cirkel) sorterades vid dag 8 och tillåts växa fram till dag 19 innan färgning för alkalisk fosfatas (röd) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Observing programmera Kinetics of feeder-fria kulturer med användning av olika positiva och negativa PSC Markörer. (AD) Live färgningDag-18 DF1-härledda omprogrammering kulturer med användning av antikroppar för de positiva PSC markörerna CD24 och EpCAM och negativa PSC markörer CD44, CD73, och B2M. Ovanpanelema slå ihop de gröna och röda fluorescenskanaler medan de bottenpanelerna inkluderar faskontrastbilden. Skalstrecket representerar 200 | j, m. (E) Flödescytometri punktdiagram för DF1-härledda omprogrammering kulturer skördade och färgade med användning av samma markörer från dag 9 till 17 (D9 till D17) post-transduktion. Före analys, kulturer reseeded vid dag 7. punktdiagram visar 8000 sing. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Spårning programmera Kinetics genom mätning av totalt Confluence. (A) i realtid imaging av BJ-fibroblaster omprogrammeras med Sendai virus i matarfria förhållanden. Fas kontrastrika bilder av samma kolonier togs vid Dag 7 till 19, sedan på dag 21 med ytterligare färgning för CD44 och SSEA4, TRA-1-60 eller AP. Skala stapel motsvarar 400 nm. (B) Kvantifiering av total sammanflödet (faskontrast) som omprogrammering går från återsådd på dag 7 till dag 21. Totalt sammanflödet vid dag 21 jämfört med SSEA4, TRA-1-60 och AP signal sammanflödet ( grön kanal). klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Att bedöma Omprogrammering Kinetics genom att mäta Oct4-GFP Confluence. (A) i realtid avbildning av BG01v / HOG hESC-härledda fibroblaster programmeras medSendai virus i matarfria förhållanden. Faskontrast, grön fluorescens och sammanslagna bilder av samma kolonier genererades vid dag 7 till 19. Skala stapel motsvarar 400 | j, m. (B) Kvantifiering av total sammanflödet (faskontrast) och Oct4-GFP konfluens (grön kanal) som omprogrammering fortskrider från att åter sådd vid dag 7 till dag 21. klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare [RHQ, JSTA, KS, och UL] är anställda av Thermo Fisher Scientific, som producerar några av de reagenser och instrument som används i denna artikel.
Acknowledgments
Författarna tackar Tchad MacArthur för bra diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16141-061 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts | Thermo Fisher Scientific | A24903 | |
| Attachment Factor Protein (1x) | Thermo Fisher Scientific | S-006-100 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Collagenase, Type IV, powder | Thermo Fisher Scientific | 17104-019 | |
| TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12563-011 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0264 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260-037 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| InSolution Y-27632 | EMD Millipore | 688001 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal | ATCC | CRL-2522 | |
| DF1 Adult Human Dermal Fibroblast | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells | Thermo Fisher Scientific | R7799-105 | |
| IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | ||
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | SSEA421 | |
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) | Thermo Fisher Scientific | A14810 | |
| SSEA-4 Antibody (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | 41-4000 | |
| TRA-1-60 Antibody (cl.A) | Thermo Fisher Scientific | 41-1000 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A27094 | |
| CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25528 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) | Thermo Fisher Scientific | RM-5700 (no longer available) | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11007 | |
| Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | |
| TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25618 | |
| CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate | Thermo Fisher Scientific | MHCD2401 | |
| beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) | Thermo Fisher Scientific | A15737 | |
| EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) | Thermo Fisher Scientific | A15755 | |
| CD73 / NT5E Antibody (7G2) | Thermo Fisher Scientific | 41-0200 | |
| VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| Zeiss Axio Observer.Z1 microscope | Carl Zeiss | 491912-0003-000 | |
| FlowJo Data Analysis Software | FLOJO, LLC | N/A | |
| Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser | Thermo Fisher Scientific | Use Attune NXT | |
| S3e\ Cell Sorter (488/561 nm) | BIO-RAD | 1451006 | |
| Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | |
| Falcon 15 ml, high-clarity, dome-seal screw cap | Corning | 352097 | |
| Falcon T-75 Flask | Corning | 353136 | |
| Falcon T-175 Flask | Corning | 353112 | |
| Falcon 6-well dish | Corning | 353046 | |
| Heraeus Heracell CO2 Rolling Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51013669 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 ml | AM12450 | ||
| HulaMixer Sample Mixer | 15920D |
References
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
- Kamata, M., Liang, M., Liu, S., Nagaoka, Y., Chen, I. S. Live cell monitoring of hiPSC generation and differentiation using differential expression of endogenous microRNAs. PLoS One. 5, e11834 (2010).
- Vendrell, M., Zhai, D., Er, J. C., Chang, Y. T. Combinatorial strategies in fluorescent probe development. Chem Rev. 112, 4391-4420 (2012).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
- Quintanilla, R. H. Jr, Asprer, J. S., Vaz, C., Tanavde, V., Lakshmipathy, U. CD44 is a negative cell surface marker for pluripotent stem cell identification during human fibroblast reprogramming. PLoS One. 9, e85419 (2014).
- Papp, B., Plath, K. Reprogramming to pluripotency: stepwise resetting of the epigenetic landscape. Cell Res. 21, 486-501 (2011).
- Nefzger, C. M., Alaei, S., Knaupp, A. S., Holmes, M. L., Polo, J. M. Cell surface marker mediated purification of iPS cell intermediates from a reprogrammable mouse model. J Vis Exp. , e51728 (2014).
- Xu, C., et al. Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth. Stem Cells. 22, 972-980 (2004).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25, 803-816 (2007).
- Singh, U., et al. Novel live alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 8, 1021-1029 (2012).
- Naujok, O., Lenzen, S. A critical re-evaluation of CD24-positivity of human embryonic stem cells differentiated into pancreatic progenitors. Stem Cell Rev. 8, 779-791 (2012).
- Ramirez, J. M., et al. Brief report: benchmarking human pluripotent stem cell markers during differentiation into the three germ layers unveils a striking heterogeneity: all markers are not equal. Stem Cells. 29, 1469-1474 (2011).
- Huang, H. P., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) complex proteins promote transcription factor-mediated pluripotency reprogramming. J Biol Chem. 286, 33520-33532 (2011).
- Kolle, G., et al. Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling. Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).
- Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem Cells. 26, 119-126 (2008).
