इस अध्ययन में प्रस्तुत प्रोटोकॉल सकारात्मक और नकारात्मक स्टेम सेल प्रवाह cytometry विश्लेषण का उपयोग कर मार्कर की गतिज माप के माध्यम से reprogramming प्रगति की वास्तविक समय की निगरानी के लिए तरीके का वर्णन है। प्रोटोकॉल भी IPSC पीढ़ी के दौरान आकृति विज्ञान, और मार्कर या संवाददाता अभिव्यक्ति की इमेजिंग के आधार पर मूल्यांकन भी शामिल है।
Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease phenotypes. Recent advances have identified more efficient and safe methods for introduction of reprogramming factors. However, there are few tools to monitor and track the progression of reprogramming. Current methods for monitoring reprogramming rely on the qualitative inspection of morphology or staining with stem cell-specific dyes and antibodies. Tools to dissect the progression of iPSC generation can help better understand the process under different conditions from diverse cell sources.
This study presents key approaches for kinetic measurement of reprogramming progression using flow cytometry as well as real-time monitoring via imaging. To measure the kinetics of reprogramming, flow analysis was performed at discrete time points using antibodies against positive and negative pluripotent stem cell markers. The combination of real-time visualization and flow analysis enables the quantitative study of reprogramming at different stages and provides a more accurate comparison of different systems and methods. Real-time, image-based analysis was used for the continuous monitoring of fibroblasts as they are reprogrammed in a feeder-free medium system. The kinetics of colony formation was measured based on confluence in the phase contrast or fluorescence channels after staining with live alkaline phosphatase dye or antibodies against SSEA4 or TRA-1-60. The results indicated that measurement of confluence provides semi-quantitative metrics to monitor the progression of reprogramming.
रोगी व्युत्पन्न प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) सेल चिकित्सा और दवा स्क्रीनिंग के लिए होनहार उपकरण हैं। वे चिकित्सा के लिए कोशिकाओं का एक ऑटोलॉगस स्रोत प्रदान करते हैं। इसके अलावा, वे आनुवंशिक पृष्ठभूमि की एक बहुत व्यापक सेट धरना, आनुवंशिक रोगों से परे वर्तमान भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी) लाइनों की अनुमति होगी की एक विस्तृत विश्लेषण के लिए इन विट्रो सक्षम करने से। हाल के अग्रिमों IPSCs पैदा करने, सेंडाइ वायरस, episomal plasmids या mRNAs 1,2 के साथ reprogramming सहित के लिए कई तरीके के विकास के लिए मार्ग प्रशस्त किया है। विशेष रूप से, अलग अलग तरीकों reprogramming दक्षता और सुरक्षा के स्तर पर अलग से जुड़ा हुआ है, और अन्य तरीके है कि विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए उनके औचित्य को प्रभावित में मतभेद होने की संभावना हैं। reprogramming प्रौद्योगिकियों के एक किस्म की उपलब्धता के साथ, यह महत्वपूर्ण हो गया है reprogramming प्रक्रिया का आकलन करने के लिए तरीके विकसित करने के लिए। अधिकांश मौजूदा तरीकों आकृति विज्ञान या धुंधला के गुणात्मक निरीक्षण पर भरोसास्टेम सेल विशिष्ट रंगों और एंटीबॉडी के साथ। एक हाल ही में विकसित विधि lentiviral प्रतिदीप्ति संवाददाताओं से कहा कि पीएससी-विशिष्ट miRNAs या अलग-अलग सेल विशिष्ट mRNAs 3 के प्रति संवेदनशील हैं का उपयोग करता है। इस तरह की निगरानी के तरीके के चयन और अलग अलग स्थितियों के लिए reprogramming तकनीकों के अनुकूलन की सुविधा। उदाहरण के लिए, CDy1 reprogramming modulators 4 के लिए स्क्रीन करने के क्रम में जल्दी IPSCs के लिए एक फ्लोरोसेंट जांच के रूप में इस्तेमाल किया गया है। निरीक्षण और विभिन्न प्रयोगों reprogramming तुलना करने की क्षमता भी खुद को इस प्रक्रिया का एक बेहतर समझ पाने के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, अब यह ज्ञात है कि कुछ दैहिक सेल प्रकार दूसरों की तुलना में 5 reprogram करने के लिए आसान कर रहे हैं, और कोशिकाओं 6-8 reprogramming दौरान मध्यवर्ती राज्यों के माध्यम से जाना है। दुर्भाग्य से, reprogramming प्रक्रिया अंतर्निहित तंत्र अभी भी पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं और इसके परिणामस्वरूप, reprogramming तरीकों के बीच सटीक मतभेद भी रहने घ जा करने के लिएefined। इस प्रकार, निगरानी के लिए विधियों, आकलन, और reprogramming की घटनाओं की तुलना स्टेम सेल क्षेत्र के लिए महत्वपूर्ण होना जारी है।
तरीकों इस प्रोटोकॉल में वर्णित निगरानी की अनुमति और reprogramming प्रक्रिया का आकलन करने और वर्णन कैसे इन तकनीकों reprogramming अभिकर्मकों के विभिन्न सेट की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पहले दृष्टिकोण प्रवाह शामिल cytometry सकारात्मक और नकारात्मक स्टेम सेल (पीएससी) मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी के संयोजन का उपयोग का विश्लेषण करती है। दूसरा दृष्टिकोण युगल वास्तविक समय इमेजिंग और कुल संगम (प्रतिशत सतह क्षेत्र कोशिकाओं द्वारा कवर) और मार्कर संकेतों (प्रतिशत सतह क्षेत्र फ्लोरोसेंट संकेतों द्वारा कवर) के संगम की माप।
This study provides strategies for monitoring and tracking of the reprogramming process using flow cytometry and real-time imaging-based analysis. The critical steps in the protocol are initiating reprogramming, measuring reprogramming progression based on marker expression and real-time monitoring of reprogramming. Any reprogramming method of choice can be used but here we focus on Sendai based reprogramming of human fibroblasts. The advantage of this method is the ease of use and consistent high efficiency of reprogram…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों उपयोगी विचार विमर्श के लिए चाड मैकआर्थर धन्यवाद।
DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | |
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16141-061 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts | Thermo Fisher Scientific | A24903 | |
Attachment Factor Protein (1X) | Thermo Fisher Scientific | S-006-100 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
Collagenase, Type IV, powder | Thermo Fisher Scientific | 17104-019 | |
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12563-011 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | |
Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | |
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0264 | |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | |
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260-037 | |
HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
InSolution Y-27632 | EMD Millipore | 688001 | |
CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | |
Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal | ATCC | CRL-2522 | |
DF1 Adult Human Dermal Fibroblast | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells | Thermo Fisher Scientific | R7799-105 | |
IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | ||
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | SSEA421 | |
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) | Thermo Fisher Scientific | A14810 | |
SSEA-4 Antibody (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | 41-4000 | |
TRA-1-60 Antibody (cl.A) | Thermo Fisher Scientific | 41-1000 | |
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A27094 | |
CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25528 | |
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) | Thermo Fisher Scientific | RM-5700 (no longer available) | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11007 | |
Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | |
TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25618 | |
CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate | Thermo Fisher Scientific | MHCD2401 | |
beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) | Thermo Fisher Scientific | A15737 | |
EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) | Thermo Fisher Scientific | A15755 | |
CD73 / NT5E Antibody (7G2) | Thermo Fisher Scientific | 41-0200 | |
VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-5100 | |
Zeiss Axio Observer.Z1 microscope | Carl Zeiss | 491912-0003-000 | |
FlowJo Data Analysis Software | FLOJO, LLC | N/A | |
Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser | Thermo Fisher Scientific | Use Attune NXT | |
S3e Cell Sorter (488/561 nm) | BIO-RAD | 1451006 | |
Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | |
Falcon 15 mL, high-clarity, dome-seal screw cap | Corning | 352097 | |
Falcon T-75 Flask | Corning | 353136 | |
Falcon T-175 Flask | Corning | 353112 | |
Falcon 6-well dish | Corning | 353046 | |
HERAEUS HERACELL CO2 ROLLING INCUBATOR | Thermo Fisher Scientific | 51013669 | |
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | AM12450 | ||
HulaMixer Sample Mixer | 15920D |