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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Kinetic Medição e visualização em tempo real de Reprogramação Somatic

Published: July 30, 2016 doi: 10.3791/54190
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Life Sciences Solutions, Thermo Fisher Scientific

Summary

O protocolo apresentado no presente estudo descreve métodos para a monitorização em tempo real da progressão reprogramação através da medição da cinética de marcadores de células estaminais pluripotentes positivos e negativos utilizando análise de citometria de fluxo. O protocolo também inclui a avaliação baseada em imagens da morfologia, e marcador ou expressão repórter durante a geração da IPSC.

Introduction

As células-tronco pluripotentes induzidas derivadas de doentes (iPSCs) são ferramentas promissoras para a terapia celular e triagem de drogas. Eles fornecem uma fonte de células autólogas para terapia. Além disso, elas abrangem um amplo conjunto de origens genéticas, permitindo uma análise detalhada in vitro de doenças genéticas além do que as linhas atuais células-tronco embrionárias (ESC) permitiria. Os avanços recentes levou ao desenvolvimento de vários métodos para gerar iPSCs, incluindo reprogramação com o vírus Sendai, plasmídeos epissomais ou ARNm 1,2. Notavelmente, os diferentes métodos de reprogramação são associados com diferentes níveis de eficiência e segurança, e é provável que diferem de outras formas que influenciam a sua adequação para várias aplicações. Com a disponibilidade de uma variedade de tecnologias de reprogramação, tornou-se importante o desenvolvimento de métodos para avaliar o processo de reprogramação. A maioria dos métodos existentes contam com a inspeção qualitativa da morfologia ou coloraçãocom corantes e anticorpos específicos de células-tronco. Um método recentemente desenvolvido faz uso de repórteres de fluorescência de lentivírus que são sensíveis à miARNs específicos do CPS ou de mRNAs específicos de células diferenciadas 3. Tais métodos de monitorização facilitar a selecção e optimização de técnicas de reprogramação para diferentes situações. Por exemplo, CDy1 foi usado como uma sonda fluorescente para os primeiros iPSCs, a fim de pesquisar moduladores de reprogramação 4. A capacidade de observar e comparar diferentes experiências de reprogramação também é crítico para a obtenção de uma melhor compreensão do próprio processo. Por exemplo, sabe-se agora que alguns tipos de células somáticas são mais fáceis de reprogramar 5 do que outros, e que as células passam por estados intermédios durante a reprogramação 6-8. Infelizmente, os mecanismos subjacentes ao processo de reprogramação ainda não estão completamente esclarecidos e, consequentemente, as diferenças exatas entre métodos de reprogramação também continuam a ser defined. Assim, métodos de monitorização, avaliação e comparação de eventos de reprogramação continuar a ser crítico para o campo das células estaminais.

Os métodos descritos no presente protocolo de permitir a monitorização e a avaliação do processo de reprogramação e ilustram como estas técnicas podem ser usadas para comparar diferentes conjuntos de reagentes de reprogramação. A primeira abordagem envolve a citometria de fluxo analisa utilizando combinações de anticorpos contra células-tronco pluripotentes positivo e negativo (PSC) marcadores. A segunda abordagem pares de imagens em tempo real e a medição da confluência total (área da superfície coberta por cento por as células) e confluência de sinais de marcador (por cento da área de superfície coberta pelos sinais fluorescentes).

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Protocol

1.Solution e Médias Preparação

  1. Membrana basal da matriz (purificada a partir de Engelbreth-Holm-Swarm tumor)
    1. Lentamente descongelar a matriz da membrana basal (5 ml) em gelo a 4 ° C durante a noite.
    2. Dilui-se a solução stock de 1: 1 com 5 mL de gelo frio, / meio F-12 DMEM estéril em um, pré-refrigerada tubo de 15 ml estéril. Distribuir aliquotas em pré-refrigerada, tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e armazenar estéreis imediatamente a -20 ° C.
    3. Antes da utilização, a descongelar congelado 1: 1 aliquota da membrana basal da matriz durante a noite a 4 ° C. No momento da utilização, diluir ainda mais a 1: 1 aliquota mais 50 vezes com gelo frio, DMEM estéril / meio F-12 para uma diluição final de 1: 100.
    4. Adicionar a quantidade apropriada da solução de 1: 100 da matriz da membrana basal diluída para a cultura de tecidos apropriado (TC) vasos e incubar a 37 ° C durante 1 h. Tipicamente, usar 3 ml da solução de matriz de membrana basal diluídas para revestir um TC O pratof 20 cm 2 de superfície, revestimento todos os outros tipos de pratos TC / placas em uma proporção de 0,15 ml de matriz diluído por cm2 de área de superfície. Aspirar a solução residual antes da adição de qualquer meio de cultura e as células.
  2. fibroblastos Médio
    1. Descongelar um frasco de 100 ml de ES qualificado de Soro Fetal Bovino (ES-FBS) a 4 ° C durante a noite.
    2. Adicionar 50 ml da descongeladas ES-FBS e 5 ml de MEM não-aminoácido essencial Solução (1x) para 445 ml de meio DMEM. Esterilizar os componentes combinados através de um filtro de 0,22 um e armazenar o meio a 4 ° C durante até 4 semanas.
  3. IMEF Médio
    1. Descongelar um frasco de 100 ml de ES-FBS a 4 ° C durante a noite.
    2. Adicionar 50 ml de FBS a descongeladas, 5 ml de solução de MEM aminoácidos não-essenciais (1x) e 500 ul de 2-mercaptoetanol a 445 ml de meio DMEM.
    3. Esterilizar os componentes combinados através de um filtro de 0,22 um e armazenar a mimdio a 4 ° C durante até 4 semanas.
  4. Solução de Factor de Crescimento de Fibroblastos básico (b-FGF)
    1. Adicionar 10 ml de substituição Serum para 990 mL de D-PBS e misture bem por pipetagem cima e para baixo.
    2. Adicionar os 1 ml da solução de substituição Serum 1% (v / v) para um frasco de 10 ug liofilizada b-FGF. Misture bem cuidado pipetando para cima e para baixo.
    3. Alíquota da solução de b-FGF / ml de 10 ug em 200 mL alíquotas em tubos de micro-centrifugação e armazenar a -20 ° C até serem necessários para um máximo de quatro semanas.
  5. Human Pluripotent Stem Cell (HPSC) Medium
    1. Descongelar um frasco de 100 ml de substituição Serum a 4 ° C durante a noite.
    2. Adiciona-se 100 ml de soro descongeladas a substituição, 5 ml de solução de MEM aminoácidos não-essenciais (1x) e 500 ul de 2-mercaptoetanol a 395 ml de meio DMEM / F-12.
    3. Esterilizar os componentes combinados através de um filtro de 0,22 um e armazenar a forma de4 ° C durante até 4 semanas.
    4. No momento da utilização, a pré-aquecer o meio HPSC a 37 ° C e completar com 4 ng / ml de bFGF.
  6. IMEF meio condicionado (CM)
    1. Adicionar 18 ml de gelatina a 0,1% a um balão de cultura T-175 e incubar a 37 ° C durante 1 h.
    2. Remover a solução de gelatina a 0,1% após uma hora de incubação. Adicionar 9,1 x 10 6 fibroblastos de rato embrionários mitoticamente inactivadas-(IMEF) em 45 ml de meio e incubar IMEF na incubadora 37 ° C durante a noite.
    3. Após incubação durante a noite, remover o meio velho IMEF e lavar uma vez com 25 ml de D-PBS durante 5 min à temperatura ambiente.
    4. Aspirar fora da D-PBS lavar e adicionar 90 ml de meio HPSC pré-aquecido, enriquecido com 4 ng / ml de bFGF. Incubar no 37 ° C incubadora para exatamente 24 horas.
    5. Após 24 h de incubação, o meio de remover assepticamente HPSC do balão IMEF e esterilizar através de um filtro de 0,22 um. Aliquota em 50 ml tubos cônicos e congelar a -20 ° C até ser necessário. IMEF CM pode ser armazenado durante até 6 meses à temperatura de -20 ° C.
    6. Adicionar mais 90 ml de meio HPSC pré-aquecido suplementado com 4 ng / ml de bFGF ao balão IMEF. Incubar no 37 ° C incubadora para exatamente 24 horas. Repita a colheita de CM por até 7 dias.
    7. No momento da utilização, a pré-aquecer o IMEF-cm a 37 ° C e completar com 4 ng / ml de bFGF.
  7. E8 Médio
    1. Descongelar um suplemento de 10 ml E8 a 4 ° C durante a noite.
    2. Retirar 10 ml do meio de base E8 e adicionar assepticamente o conteúdo do suplemento E8 descongelado para o meio basal remanescente. Misturar bem e esterilizar através de um filtro de 0,22 um. Armazenar o meio completo a 4 ° C durante até 2 semanas.
    3. No momento da utilização, pré-aquecer a alíquota do meio para ser utilizado à temperatura ambiente. Não é recomendado para pré-aquecer E8 médio a 37 ° C.
  8. Assim celularTampão rting
    1. Preparar tampão de triagem fresco imediatamente antes separação de células por adição de solução de EDTA (concentração final 1 mM), tampão HEPES (concentração 25 mM final), solução de Penicilina / Estreptomicina (100 unidades / ml de concentração final) e Albumina de Soro Bovino (1% de concentração final) em salina tamponada com fosfato de Dulbecco (cálcio e magnésio livre).
    2. Esteriliza-se o tampão através de um filtro de 0,22? M antes de utilizar.
  9. Separação de células Recuperação Médio
    1. Modificar 50 ml de Meio de fibroblastos através da adição de Penicilina / Estreptomicina (100 unidades / ml de concentração final) e Rock Inibidor Y-27632 (10 uM de concentração final). Pré-aquecer este meio a 37 ° C antes de semear as células separadas.

2. Sendai Mediated reprogramação de fibroblastos humanos

  1. 24 h antes de transdução com o vírus Sendai, semear os fibroblastos a uma densidade de 2 x 10 5 Cells por poço nos poços desejados de uma placa TC de 6 poços.
  2. Realizar a transdução no dia 0 da seguinte maneira.
    1. Pré-aquecer 2 ml de Fibroblasto meio em um banho de água a 37 ° C. Remover um conjunto de tubos de vírus Sendai de armazenamento -80 ° C e descongelar a cada tubo de um de cada vez pela primeira imersão do fundo do tubo num banho de água a 37 ° C durante 5 - 10 segundos, e, em seguida, retirar o tubo da água banho e deixe-a descongelar à temperatura ambiente. Uma vez descongelada, centrifugar brevemente o tubo e colocá-lo imediatamente em gelo.
    2. Use vírus Sendai comercialmente segunda geração, adicionando os volumes adequados (como por COA) para cada um dos tubos, a fim de alcançar o seguinte multiplicidade de infecção (MOI) de 1 ml de pré-aquecida de fibroblastos de meio por poço a ser transduzido como siga : KOS = 5 x 10 6 OIC, hc-Myc = 5 x 10 6 OIC, hKlf4 = 3 x 10 6 OIC.
    3. Misture bem a solução viral pipetando a mistura suavemente para cima e para baixo. complete o próximo passo dentro de 5 min.
    4. Aspirar o meio de Fibroblasto do poço dos fibroblastos de ser reprogramadas, e adicionar 1 mL da solução virai para cada poço. Colocar as células em uma temperatura de 37 ° C, CO2 a 5% incubadora e incubar durante a noite.
  3. Após a incubação durante a noite, aspirar fora do meio de transdução e descartar o antigo médio adequadamente (solução de lixívia a 10% para 30 min). Substituir com 2 ml de pré-aquecida de fibroblastos Médio e continuar a cultura das células transduzidas.
  4. Cultura das células durante mais 6 dias, substituindo o meio de idade, com frescos de fibroblastos Médio em dias alternados.
    Nota: Não passagem as células reprogramadas até 7 dias após a transdução.
  5. Dia 6: preparar pratos para iPSC Generation
    1. Para a geração de iPSC dependente do alimentador, adicionar solução de gelatina a 1,5 ml de 0,1% a cada poço de cultura de tecidos de 6 poços (TC) do prato e incubar a 37 ° C durante 1 h.
    2. Remover a gelatina a 0,1% tãolução após 1 h de incubação. Adicionar 3 x 10 5 fibroblastos de rato embrionários mitoticamente inactivadas-(IMEF) em 2 ml de meio por poço e IMEF incubar na incubadora 37 ° C durante a noite.
    3. Para a geração independente de iPSC alimentador, adicionar 1,5 ml de matriz de membrana basal diluída (1: 100 de diluição) a cada poço de cultura de tecidos de 6 poços (TC) do prato e incubar a 37 ° C durante 1 h.
  6. Sete dias após a transdução, colher os fibroblastos transduzidas e re-placa-los sobre os pratos pré-fabricados de cultura para iPSC geração colônia.
    1. Aspirar fora do meio de cultura normal a partir de fibroblastos, e lave as células uma vez com 2 ml de D-PBS.
    2. Aspirar fora da D-PBS lavar e adicionar 0,5 ml de pré-aquecida de 0,05% de tripsina / EDTA. Incubar as células durante 3-5 minutos a 37 ° C.
    3. Quando as células foram arredondados para cima, adicione 2 ml de pré-aquecido a fibroblastos Médio em cada poço para parar tripsinização. Desalojar as células do poço pipetando suavemente tele forma em toda a superfície do prato. Recolha a suspensão celular num tubo de centrífuga cónico de 15 ml.
    4. Centrifugar as células a 200 xg durante 2 min. Aspirar o sobrenadante, e re-suspender as células em 2 ml de fresco, pré-aquecido a fibroblastos Médio.
    5. Contar as células usando o método desejado (hemocitómetro ou contador de células automatizado) e semear as placas de cultura pré-preparada com 5 x 10 4 células para condições dependentes do alimentador e 1 x 10 5 células por condições independente de alimentação, por poço de uma 6 -bem prato e incubar a 37 ° C, 5% de CO2 durante a noite.
    6. Após a incubação durante a noite, mudar o meio para meio HPSC, forma E8 ou meios IMEF-condicionado, dependendo da aplicação. Substituir o meio de idade com meio fresco todos os dias depois.

3. Sendai reprogramação das células-tronco BGO1v hOct4-GFP embrionárias Reporter Humano (hESC) Derivado fibroblastos secundários

  1. derive fibroblastos humanos secundários a partir da linha repórter hESC BG01v hOct4-GFP de acordo com o procedimento previamente descrito 9.
  2. Dois dias antes da transdução, placa BGO1v / porco derivado fibroblastos em dois poços de uma placa de 6 poços a 2 x 10 5 células por poço, usando Fibroblasto Médio.
    1. No dia da transdução, pré-aquecer 2 ml de Meio de fibroblastos a 37 ° C.
    2. Remover um conjunto de tubos de Sendai do -80 ° C armazenamento. Retirar os frascos da bolsa e descongelar cada tubo de um de cada vez pela primeira imersão do fundo do tubo num banho de água a 37 ° C durante 5 - 10 segundos, após o que, para permitir que os tubos de descongelar à temperatura ambiente. Uma vez descongelada, centrifugar brevemente o tubo e colocá-lo imediatamente em gelo.
    3. Adicionar os volumes indicados de cada um dos três tubos de Sendai (ver a CoA para o volume apropriado) a 2 mL de Meio de fibroblastos, pré-aquecido a 37 ° C e homogeneiza-se a solução virai por pipetagem para cima e para baixo. Concluir a próxima step dentro de 5 min.
      Nota: Para esta experiência, uma MOI de 5: 5: 6 foi utilizado.
    4. Aspirar o fibroblasto meio dos poços de f ibroblastos de ser transduzidas. Adicionar 1 ml da suspensão virai de cada um dos dois poços a serem transduzidas. Colocar as células em uma temperatura de 37 ° C, CO2 a 5% incubadora e incubar durante a noite.
    5. Após a incubação durante a noite, remover o meio de transdução e descartá-la adequadamente (solução de lixívia a 10% para 30 min). Substituir cada poço com 2 ml de pré-aquecida de fibroblastos Médio e continuar a cultura das células transduzidas.
  3. Cultura das células durante mais 6 dias, mudando o meio de idade, com frescos de fibroblastos Médio em dias alternados.
    1. Sete dias após a transdução, colher os fibroblastos transduzidas e re-placa-los sobre os pratos pré-fabricados de cultura para iPSC geração colônia.
    2. Aspirar fora do meio de cultura normal a partir de fibroblastos, e lave as células uma vez com 2 ml de D-PBS.
    3. Aspirar fora da DPBS lavar e adicionar 0,5 ml de pré-aquecida de 0,05% de tripsina / EDTA. Incubar as células durante 3-5 minutos a 37 ° C.
    4. Quando as células foram arredondados para cima, adicione 2 ml de pré-aquecido a fibroblastos Médio em cada poço para parar tripsinização. Desalojar as células do poço pipetando suavemente a forma em toda a superfície do prato. Recolha a suspensão celular num tubo de centrífuga cónico de 15 ml.
    5. Centrifugar as células a 200 x g durante 2 min. Aspirar o sobrenadante, e re-suspender as células em uma quantidade apropriada de fresco, pré-aquecido a fibroblastos Médio.
    6. Contar as células usando o método desejado (hemocitômetro ou contador de células automatizado).
    7. Semear as células transduzidas com uma densidade de 1 x 10 5 células por poço de uma matriz de membrana basal -Revestido placa de 6 poços e incuba-se num banho a 37 ° C, incubador de CO2 a 5% durante a noite.
  4. Após a incubação durante a noite, para alterar a forma IMEF meio condicionado, suplementado com 10 ng / ml de b-FGF. Substituir o meio de idade, com frescos IMEF CM todos os dias depois.
  5. Três semanas após a transdução, mecanicamente dissecar e transferir as colónias desejados para a expansão clonal ou utilizar para análise.

4. Imagens de células vivas de Fibroblasto Reprogramação

  1. Monitoramento em tempo real
    1. 7 dias após a transdução com o kit de reprogramação Sendai, sementes a quantidade desejada de células em placas de 6 poços com os sistemas de matriz e médias desejados como descrito anteriormente. Colocar as cápsulas inoculadas dentro do gerador de imagens, localizado numa incubadora humidificada fixada em 37 ° C, e 5% de CO 2.
    2. Defina o software de imagem para capturar imagens bem inteiras de cada poço individual em um intervalo definido (a cada 6-8 horas) de imagem contínua captura para os próximos 14 dias de acordo com o protocolo do fabricante.
      Nota: as configurações de imagem de contraste de fase são selecionadas para a reprogramação normais para avaliar a progressão colônia. No casode BG01v / porco derivada de fibroblastos de reprogramação, é melhor para capturar imagens em contraste de fase e no canal verde fluorescente como a re-activação do repórter OCT4-GFP endógena pode ser rastreada ao longo do processo de reprogramação.
    3. Mudar a forma diariamente, que pode ser HPSC forma, forma E8, ou IMEF-CM, dependendo da experiência, conforme anteriormente descrito a partir do dia 8 a 21 pós-transdução. Os poços pode ser ainda analisada para a formação de colónias através de imunofluorescência indirecta.
    4. No final da experiência no dia 19 a 21, remover o meio de cultura a partir de cada cavidade a ser sondado com anticorpos para fibroblastos e células estaminais marcadores de escolha.
    5. Lavar cada poço uma vez com 2 ml de meio pré-aquecido DMEM / F-12.
    6. Preparar alíquotas de cada pares de positivos / negativos primários de anticorpos em 1 ml de / meio F-12 DMEM como se segue: anti-murganho SSEA4 (1: 200) e anti-CD44 de rato (01:50), anti-ratinho TRA-1- 60 (1: 200) e anti-CD44 de rato (1:50), e fosfatase alcalina Live Stain (1:50) e CD44 anti-rato (1:50). Adicionar as soluções de anticorpo primário 1 ml a cada poço correspondente. Incubar a 37 ° C durante 45 min.
    7. Aspirar para fora da solução de anticorpo primário e lava-se duas vezes com DMEM pré-aquecido / meio F-12.
    8. Preparar soluções de anticorpo secundário (1 ml para cada poço) usando cabra-anti-rato Alexa Fluor 488 conjugado secundário (1: 500) para a fluorescência verde e de cabra anti-rato Alexa Fluor 594 conjugado secundário (1: 500) para a fluorescência vermelha DMEM / médio F-12. Adicionar a cada poço após a última lavagem. Incubar os anticorpos secundários durante 30 min a 37 ° C.
      Nota: devido a Fosfatase Alcalina de mancha vivo (SAF) sinal transiente, a incubação primária anti-CD44 deve ser realizada pela primeira vez por si só e o SAF deve ser adicionado no momento da incubação com os anticorpos secundários
    9. A seguir à incubação do anticorpo secundário, aspirar para fora da solução e lava-se duas vezes com DMEM / meio F-12. Adicionar fresco DMEM pré-aquecido / F-12meio a cada poço antes da captura da imagem final.
    10. Defina o software gerador de imagens para obter imagens bem inteiras de cada poço, usando todos os três parâmetros de digitalização: contraste de fase, fluorescência verde e fluorescência vermelha. Criar imagens em diversas ampliações e criar filmes de lapso de tempo com o software para monitorar o crescimento e expressão do marcador. Use o protocolo do fabricante.
    11. Utilizando o software de análise, avaliar confluência do bem ao longo do tempo, em contraste de fase e em unidades fluorescentes verdes para o / a reprogramação BG01v Hog.
  2. Monitoramento Reprogramação Intermediários Marcadores usando da superfície celular
    1. Monitorizar eventos de reprogramação em diferentes pontos de tempo através de sondagem os pratos de reprogramação em vários pontos de tempo com anticorpos contra marcadores positivos / negativos diferentes de células estaminais a fim de controlar o processo de reprogramação. culturas de sonda a cada 2 a 3 dias, dependendo da disponibilidade de repetições. Sondar os dis reprogramaçãohes no dia 19 a 21, utilizando a estratégia de dupla coloração para identificar colónias IPSC completamente reprogramadas colónias e parcialmente reprogramadas com base nos padrões de coloração.
    2. No ponto de tempo desejado, aspirar fora do meio de crescimento normal a partir de cada cavidade a ser sondado com anticorpos para os marcadores de escolha.
    3. Lavar cada poço uma vez com 2 ml de meio pré-aquecido DMEM / F-12.
    4. Preparar alíquotas de cada pares de positivos / negativos primários de anticorpos em 1 ml de / meio F-12 DMEM como se segue: SSEA4 conjugado com o fluoróforo verde fluorescente (1: 200), TRA-1-60 conjugado com o fluoróforo verde fluorescente (1: 50), mancha alcalina vivo (1: 500), CD24 conjugado com um fluoróforo verde fluorescente (01:50), B2M conjugado com um fluoróforo verde fluorescente (01:50), EpCAM conjugado com um fluoróforo verde fluorescente (1:50) , rato CD73 (1: 100) que foi sondada com o anticorpo secundário anti-ratinho conjugado com um fluoróforo verde fluorescente (1: 500), e CD44 de rato (1:50) que é sondado comanticorpo secundário anti-rato conjugado com o fluoróforo vermelho fluorescente (1: 500). Adicionar as soluções de anticorpo primário 1 ml a cada poço correspondente. Incubar a 37 ° C durante 45 min.
    5. Aspirar para fora da solução de anticorpo primário e lava-se duas vezes com meio DMEM / F12 de pré-aquecido.
    6. Para os anticorpos não conjugados, proceder ao uso de um método de dois passos, preparando as soluções de anticorpo secundário apropriado e incubar durante 30 min a 37 ° C. Confirmar que os anticorpos secundários são os hospedeiros primários e não reagem de forma cruzada. Executar as etapas de lavagem adicionais, como previamente descrito.
    7. Depois de todas as lavagens apropriadas, adicionar meio fresco pré-aquecido DMEM / F-12 a cada poço antes da captura da imagem final.
    8. Capturar as imagens fluorescentes sob o filtro apropriado no 100X utilizando um microscópio de fluorescência e analisar as imagens usando o software de análise disponíveis.

5. Medição da reprogramação Kinetics Usando Fluxo Cytometry

  1. Medição Quantitativa cinética de reprogramação utilizando anticorpos da superfície celular
    1. Antes de reprogramação, definir-se o número adequado de experiências de reprogramação para cada ponto de tempo. Para medir a cinética de reprogramação para os primeiros 7 dias de reprogramação, transduções individuais são executadas para cada ponto de tempo desejado. Para pontos de tempo após o dia 7, sementes pontos tempo suficiente independente de alimentação para continuar a medir os eventos de reprogramação. Um único poço de uma placa de 6 poços irá produzir uma quantidade suficiente de células para a realização de análise de citometria de fluxo.
    2. Medir todos os pontos de tempo de reprogramação desejados a partir de poços individuais, como este é um ensaio de ponto final. Aspirar fora do Fibroblasto Médio do poço desejado. Lavar uma vez com D-PBS.
    3. Aspirar fora da lavagem de D-PBS. Adicionar 1 ml de solução de tripsina-EDTA a 0,05% para o bem a ser testado. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
    4. Após a incubação, dissociComeram as células em células individuais através de lavagem da suspensão de células de 1 ml de encontro à superfície do poço e transferir a suspensão para um tubo de 15 ml. Use 3 ml de D-PBS para lavar quaisquer células remanescentes do bem e adicioná-los à 15 ml cônico. Utilizar 10 ml de adicional D-PBS para diluir ainda mais a solução de células no tubo cónico.
    5. Centrifugar as células a 200 xg durante 2 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de meio DMEM / F-12. Executar um número de células, conforme necessário para criar uma suspensão de células padrão que é menos do que 1 x 10 6 células / ml.
    6. Prepare a cada alíquota de anticorpos positivos / negativos directamente conjugados de escolha em 1 ml de / meio F-12 DMEM durante menos 1 x 10 6 células / ml, utilizando as seguintes combinações: SSEA4 conjugados com um fluoróforo verde fluorescente (1: 200) com CD44 conjugado a PE-Cy5 ou CD44 conjugado com um fluoróforo verde fluorescente e SSEA4 conjugado com um fluoróforo fluorescente vermelha Far. Incubaros anticorpos com a suspensão de células durante 45 minutos à temperatura ambiente.
    7. Aspirar a solução de anticorpo primário e lava-se duas vezes com meio pré-aquecido DMEM / F-12.
    8. Aspirar a lavagem final e re-suspender o sedimento de células em 1 ml de D-PBS. Pipete o conteúdo de cada suspensão em tubos de FACS individuais.
    9. Usando os controles negativos apropriados (controles não coradas e isotipos), confirmar a dispersão frontal e lateral do perfil e tensões adequada no citômetro. Ajustar as tensões para os fluoróforos correspondentes de acordo com os parâmetros de mancha única inicial, de tal forma que os fluoróforos verdes são activados pela Laser Azul e sinais adquiridos no canal de BL1, enquanto fluororo fluorescente vermelho longínquo e PE-Cy5 fluoróforo está activado pelo laser vermelho e sinais adquiridos no canal RL1. Adquirir a população dual-coradas para cada ponto de tempo.
    10. Analisar os arquivos de FCS para cada ponto de tempo usando o software de análise apropriada e usar o editor para arradados ESL para observar a mudança de expressão população ao longo do tempo.
    11. Siga os passos 5.1.1 a 5.1.6, se separação de células é desejado em diferentes pontos de tempo. Use as combinações de fluoróforos adequados de acordo com a configuração do laser do classificador de células a ser utilizada.
    12. Após a lavagem final, re-suspender o sedimento de células em 1 ml de tampão de separação de células. Configure o classificador de células para as configurações de dispersão frontal e lateral apropriados usando um controle sem mácula. Use os controles individuais coradas para configurar as definições adequadas para cada fluoróforo.
    13. Utilize uma pequena amostra da suspensão celular duplamente coradas; selecionar os 2 populações a serem classificados e atribuir a respectiva carga para garantir a coleta adequada das células classificadas.
    14. Adicionar 200 ul de meio de recuperação de células em tubos de colheita para assegurar que a suspensão de células classificadas é amortecido e protegida no momento da triagem. Colher o número desejo de células e transferir para novos pratos IMEF contendo frescoly preparados meio de recuperação.
    15. Mudar o meio após incubação durante a noite com o meio de recuperação. As culturas devem ser subsequentemente alimentado e rotineiramente passadas utilizando meio HPSC contendo penicilina / estreptomicina (100 unidades / ml de concentração final).

6. Análise Endpoint

  1. Terminal de fosfatase alcalina (AP) Coloração
    1. Use coloração cromogénico terminal de AP para correlacionar eventos cinéticos e morfológicos observados com eficiência de reprogramação finais.
    2. Após 21 dias de reprogramação, remover o meio de cultura a partir do bem a ser coradas com corante AP terminal e lavar uma vez com Tris-HCl 200 (pH 8,0).
    3. Preparar a quantidade apropriada de solução de coloração conforme indicado pelo manual do fabricante em Tris-HCl a 200.
    4. Aspirar a lavagem e adicionar 2 ml da solução de coloração preparado a cada poço. Incubar durante 20-30 minutos à temperatura ambiente e longe do the luz.
    5. Aspirar a solução de coloração e lavar uma vez com 200 mM de Tris-HCl. Remova a lavagem e adicionar água destilada antes da visualização.
    6. Captar o sinal colorimétrico usando uma câmera de imagem normal. Contar o número de colónias coradas positivamente com a mão. Visualize a mancha usando análise fluorescente no canal Trit-C, como a mancha também é fluorescente na natureza e realizar imagem de todo o bem e analisados ​​utilizando o gerador de imagens de todo o bem. Use o protocolo do fabricante.

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Representative Results

Monitoramento Kinetics reprogramação utilizando citometria de fluxo

CD44 é um marcador de fibroblastos enquanto SSEA4 é um marcador PSC 6,10. Como esperado a partir deste padrão de expressão, a citometria de fluxo de fibroblastos BJ mostra um SSEA4 - CD44 + da população que facilita a criação de portas de quadrante em combinação com a amostra não corado. Durante a reprogramação de fibroblastos DF1 com o vírus Sendai, CD44 é gradualmente perdida enquanto SSEA4 é expressa lentamente. No dia 3 após a transdução com os vírus Sendai, existe uma grande população de SSEA4 - células CD44 + e uma pequena população de células + CD44 + SSEA4 que se torna mais evidente no dia 7 (Figura 1). No dia 13, a população duplo positiva a transição para o SSEA4 + CD44 - estado. Por Dia 17, uma grande porcentagem do cells na cultura já estão SSEA4 + CD44 -. Este tempo de percurso mostra que a citometria de fluxo com CD44 e SSEA4 pode ser utilizado para monitorizar a progressão e taxa de reprogramação.

Uma comparação quantitativa confirma que a reprogramação fibroblastos BJ com vírus Sendai reprogramação gera SSEA4 + CD44 - células, a uma taxa diferente do que a reprogramação da BJ fibroblastos (Figura 2A). Os dados demonstram que uma comparação início da percentagem de PSC-como SSEA4 + CD44 - células rastreia a progressão de reprogramação. Interessantemente, no dia 8 de reprogramação DF1 fibroblastos, triagem e separadamente a cultura da população de células que estão em processo de upregulating SSEA4 e regulação negativa de CD44 gera AP + 11 colónias (Figura 2B). Em contraste, o SSEA4 original - CD44 + população gera amdominam vários menor número de colônias AP + no dia 21 de reprogramação, que é o dia típico de análise colónia final. Isto sugere que é possível quantificar e comparar a população de transição, a fim de prever diferenças na cinética de reprogramação mesmo antes da SSEA4 + CD44 - população é formada. Um ponto importante a notar aqui é que a reprogramação é um processo variável dependente de vários factores, tais como a partir da população de células somáticas, eficiência de transdução, médio, etc. No entanto, o padrão geral e progressão dos marcadores de superfície acima descritos é consistente entre as diferentes experiências de reprogramação e a partir de fibroblastos. A análise da cinética de reprogramação também pode ser feito com diferentes marcadores, tais como os recentemente identificados marcadores negativos PSC CD73 e B2M 6, assim como os marcadores CD24 PSC estabelecidos 12,13 e 14,15 EPCAM. Semelhante a CD44, CD73 e B2M são expressos em parfibroblastos ental BJ, mas são regulados negativamente durante o curso de reprogramação, tornando-se indetectáveis ​​no iPSCs completamente reprogramadas (Figura 3A). Um curso de tempo de citometria de fluxo utilizando CD44 e CD73 ou CD44 e B2M mostra que CD44 e CD73 são regulados negativamente a uma taxa semelhante, ao passo que regulada negativamente B2M é mais rápido do que CD44 (Figura 3B). Em ambos os casos, a taxa de reprogramação pode ser observada por medição da acumulação de população negativa dupla. Em contraste com estes marcadores PSC negativas, de CD24 e EPCAM estão ausentes em fibroblastos e são expressos em iPSCs (Figura 3A). Em citometria de fluxo uma evolução no tempo, CD24 - e CD44 + EPCAM - CD44 + de fibroblastos, eventualmente, formar populações de dupla negativa que posteriormente transição para CD24 + CD44 - e CD44 + EpCAM - células PSC-semelhantes, respectivamente (Figura 3B). Assim, durante a reprogramação, ambos os marcadores PSC positivossão expressas após a CD44 é regulada negativamente. À semelhança do que foi observado com SSEA4 e CD44, a formação e acumulação das diferentes populações de células indicam a progressão da reprogramação.

Acompanhando reprogramação usando a análise de imagens em tempo real

A imagem em tempo real de reprogramação culturas após reseeding mostra a formação gradual de colónias (Figura 4A), o que corresponde a um aumento logarítmico na confluência sob contraste de fase (Figura 4B). Confluence sob contraste de fase proporciona, assim, outra métrica para monitorar reprogramação quantitativamente, mas engloba tanto, as colônias que são positivas para os marcadores PSC ea proliferação contínua de células unreprogrammed ou parcialmente reprogramadas (Figura 4A, último painel). Quantificando as áreas que foram coradas para marcadores de pluripotênciaTRA-1-60, SSEA4 e AP 6,10 no dia 21 indica que iPSCs representam apenas menos de metade da confluência total (Figura 4B). Para medir o progresso da reprogramação de forma mais rigorosa, é possível usar uma linha de repórter para a reprogramação. Aqui, os fibroblastos secundários foram gerados a partir da linha BG01v / HOG ESC, que foi projetado com um repórter OCT4-GFP 16. GFP é expressa como as células serão reprogramados e como colónias são formadas (Figura 5A). Medindo confluência sob contraste de fase e os canais verde demonstra que a confluência GFP aumenta mais lentamente do que a confluência total e a confluência GFP no Dia 19 é inferior a metade da confluência total (Figura 5B), reminiscente de TRA-1-60, coloração SSEA4 e AP no dia 21.

figura 1
Figura 1. Monitoring o Progresso da reprogramação utilizando citometria de fluxo. Terrenos Citometria de Fluxo ponto para DF1 fibroblastos reprogramada segundo Sendai vírus em condições livres de alimentação. As células foram recolhidas e coradas com anticorpos SSEA4 e CD44 em diferentes intervalos de Dia 3 (D3) para o dia 19 (D19) do processo de reprogramação. Culturas no Dia 9 (D9) em diante foram analisados ​​após as células foram re-semeadas no dia 7 (D7). Gráficos de pontos mostram 8.000 interiores. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
. Figura 2. Avaliando Reprogramação Kinetics e Eficiência em condições livres de alimentador (A) Gráfico mostrando mudanças no percentual de SSEA4 + CD44 - células reprogramadas depois da transdução DF1 lorotaroblasts e fibroblastos BJ com o vírus Sendai. As células foram analisadas por citometria de fluxo no dia 3 a 19 de pós-transdução, com as culturas no dia 9 em diante submetidos reseeding no dia 7. (B) Pseudo-color citometria de fluxo parcelas para células DF1 transduzidas vírus Sendai e corados com anticorpos SSEA4 e CD44. SSEA4 -. CD44 + células (círculo preto) e SSEA4 + células (círculo vermelho) foram ordenados no dia 8 e permitiu a crescer até o dia 19 antes da coloração para a fosfatase alcalina (vermelho) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Observando reprogramação Cinética de culturas sem alimentador utilizando diferentes marcadores PSC positivos e negativos. (AD) coloração ao vivode culturas Day-18 DF1 derivados de reprogramação utilizando anticorpos para os marcadores PSC positivas CD24 e EPCAM e marcadores PSC negativos CD44, CD73, e B2M. Os painéis de topo fundir os canais de fluorescência verde e vermelha, enquanto os painéis de fundo incluem a imagem de contraste de fase. A barra de escala representa 200 m. (E) Citometria de fluxo gráficos de pontos para as culturas de reprogramação DF1 derivados colhidos e corados utilizando os mesmos marcadores de dia 9 a 17 (D9 a D17) pós-transdução. Antes da análise, as culturas foram replantadas no dia 7. Os gráficos de pontos mostram 8.000 interiores. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Rastreamento reprogramação Kinetics medindo Confluence total. (A) em tempo real imaging de BJ fibroblastos reprogramado com vírus Sendai em condições livres de alimentadores. imagens de contraste de fase das mesmas colónias foram tomadas no Dia 7 a 19, em seguida, no dia 21 com coloração adicional para CD44 e SSEA4, TRA-1-60 ou AP. Barra de escala corresponde a 400 mm. (B) Quantificação da confluência total (contraste de fase), como a reprogramação progride de sementeiras no dia 7 ao dia 21. confluência total no dia 21 é comparado com SSEA4, TRA-1-60 e AP confluência de sinal ( canal verde). por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Avaliação Reprogramação Kinetics medindo OCT4-GFP Confluence. (A) imagens em tempo real de fibroblastos BG01v / HOG hESC-derivados reprogramadas comSendai vírus em condições livres de alimentadores. O contraste de fase, a fluorescência verde e fundiu-se imagens dos mesmos foram gerados colónias ao dia 7 a 19. Barra de escala corresponde a 400 ^ m. (B) Quantificação da confluência total (contraste de fase) e confluência OCT4-GFP (canal verde) como reprogramação progride a partir de re-semeadura no dia 7 ao dia 21. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Disclosures

Todos os autores [RHQ, JSTA, KS, e UL] são funcionários da Thermo Fisher Scientific, que produz alguns dos reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.

Acknowledgments

Os autores agradecem Chad MacArthur para discussões úteis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10569-010
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin Thermo Fisher Scientific 16141-061
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher Scientific 11140-050
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red  Thermo Fisher Scientific 25300-054
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts Thermo Fisher Scientific A24903
Attachment Factor Protein (1x) Thermo Fisher Scientific S-006-100
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 10565-018
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828010
2-Mercaptoethanol (55 mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023
Collagenase, Type IV, powder Thermo Fisher Scientific 17104-019
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red  Thermo Fisher Scientific 12563-011
DPBS, no calcium, no magnesium  Thermo Fisher Scientific 14190-144
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413302
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0264
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575-020
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) Thermo Fisher Scientific 15260-037
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15630-080
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Thermo Fisher Scientific 15140-122
InSolution Y-27632 EMD Millipore 688001
CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A1378001
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A16517
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228
BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal ATCC CRL-2522
DF1 Adult Human Dermal Fibroblast Thermo Fisher Scientific N/A
BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells Thermo Fisher Scientific R7799-105
IncuCyte ZOOM Essen BioScience
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) Thermo Fisher Scientific SSEA421
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) Thermo Fisher Scientific A14810
SSEA-4 Antibody (MC813-70) Thermo Fisher Scientific 41-4000
TRA-1-60 Antibody (cl.A) Thermo Fisher Scientific  41-1000
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate Thermo Fisher Scientific A27094
CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging Thermo Fisher Scientific A25528
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) Thermo Fisher Scientific RM-5700 (no longer available)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Thermo Fisher Scientific  A-11029
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific  A-11007
Alkaline Phosphatase Live Stain Thermo Fisher Scientific A14353
TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging Thermo Fisher Scientific A25618
CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate Thermo Fisher Scientific MHCD2401
beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) Thermo Fisher Scientific A15737
EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) Thermo Fisher Scientific A15755
CD73 / NT5E Antibody (7G2) Thermo Fisher Scientific 41-0200
VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit Vector Laboratories SK-5100
Zeiss Axio Observer.Z1 microscope  Carl Zeiss 491912-0003-000
FlowJo Data Analysis Software FLOJO, LLC N/A
Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser Thermo Fisher Scientific Use Attune NXT 
S3e\ Cell Sorter (488/561 nm) BIO-RAD 1451006
Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap Corning 352235
Falcon 15 ml, high-clarity, dome-seal screw cap Corning 352097
Falcon T-75 Flask Corning 353136
Falcon T-175 Flask Corning 353112
Falcon 6-well dish Corning 353046
Heraeus Heracell CO2 Rolling Incubator Thermo Fisher Scientific 51013669
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 ml AM12450
HulaMixer Sample Mixer 15920D

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