Summary
在本研究中提出的协议描述用于通过使用流式细胞仪分析阳性和阴性的多能干细胞标志物的动力学测定的重编程级数的实时监测的方法。该协议还包括的iPSC产生过程中的形态和标志物或报告表达的基于成像的评估。
Introduction
源自患者的诱导多能干细胞（iPS细胞）是用于细胞治疗和药物筛选有希望的工具。它们提供了细胞治疗自体来源。此外，它们包括非常广泛的一套遗传背景，使得遗传疾病超出当前的胚胎干细胞（ESC）的线路将允许进行详细的体外分析。最近的进展已经导致几种方法的发展，用于产生iPSCs的，包括与仙台病毒，附加型质粒或mRNA的1,2-重新编程。值得注意的是，不同的重编程方法具有不同的效率和安全性的水平相关，并有可能在影响其是否适宜用于各种用途的其他方法不同。随着各种重编程技术的可用性，它已开发用于评估重编程过程的方法变得很重要。大多数现有的方法依赖于形态和染色质检查用干细胞特异性的染料和抗体。一个最近开发的方法使用的慢病毒荧光记者，是对特定的PSC-miRNA的或分化的细胞特异性的mRNA 3敏感。这种监测方法便于选择和重新编程的技术对不同的情况下的优化。例如，CDy1已经用作早期的iPSC的荧光探针以筛选重新编程调制器4。观察和比较不同的重编程实验的能力也更好地了解这个过程本身的关键。例如，现在已知的是一些体细胞类型更容易比其它5重新编程，并且使细胞重新编程6-8中经过中间状态。不幸的是，重编程过程所依据的机制仍然不完全了解，因此，重编程方法之间的确切的差别也仍然为defined。因此，对于监测方法，评估和比较重编程事件仍然是干细胞领域的关键。
在这个协议中所描述的方法允许监控和重编程过程的评估，并说明这些技术如何可以用来比较不同组的重编程试剂。第一方法涉及流式细胞仪使用针对阳性和阴性的多能干细胞（PSC）标记的抗体的组合进行分析。第二种方式耦合实时成像和总合流（被细胞覆盖的百分比表面积）和标记信号（由荧光信号所覆盖的百分比表面积）的合流的测量。
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Protocol
1.Solution和介质制备工艺
- 基底膜基质（从Engelbreth -霍尔姆-群肿瘤和纯化）
- 在4℃缓慢融化冰基底膜基质（5毫升）过夜。
- 稀释原液1:1在无菌，预先冷却的15毫升锥形管5 1ml冰冷，无菌的DMEM / F-12培养基中。分配等分入预冷的1.5毫升无菌微离心管，并立即在-20℃下储存。
- 过夜1基底膜基质等分试样在4℃：前使用，解冻冷冻的1。在使用时，进一步稀释1：1等份另外50倍用冰冷的，无菌的DMEM / F-12培养基以1:1的最终稀释度：100。
- 1适量添加：100稀释的基底膜基质溶液到适当的组织培养（TC）的容器和在37℃下孵育1小时。通常情况下，用3毫升稀释基底膜基质溶液的大衣一TC菜ØF 20厘米2表面面积，涂层的所有其他类型的TC菜/以0.15毫升，每表面积厘米2稀释基质的比板。吸除任何培养基和细胞的前向剩余溶液。
- 成纤维细胞中
- 在4℃解冻100毫升瓶装ES合格胎牛血清（ES-FBS）的过夜。
- 加50毫升解冻ES-FBS和5毫升的MEM非必需氨基酸溶液（1倍）的445的10ml DMEM培养基。通过0.22微米的过滤器消毒组合的组分，并在4℃下在介质储存最多至4周。
- IMEF中
- 在4℃下解冻的100毫升瓶的ES-FBS的过夜。
- 加50毫升解冻的FBS，加入5ml MEM非必需氨基酸溶液（1×），和500微升2-巯基乙醇至445的10ml DMEM培养基的。
- 通过0.22微米的过滤器消毒组合的组分和存储箱dium在4℃下长达4周。
- 碱性成纤维细胞生长因子溶液（b-FGF）
- 添加10微升血清替代的到990微升的D-PBS，并通过上下抽吸调匀。
- 的1毫升1％（V / V）血清替代溶液添加到10微克冻干B-FGF一小瓶。彻底轻轻吹打混匀。
- 直到需要长达4周在-20℃分装10微克/毫升的B-FGF溶液注入200微升等分试样在微离心管中，并存储。
- 人类多能干细胞（HPSC）中
- 在4℃解冻100毫升瓶血清替代的一夜。
- 加入100毫升解冻血清替代的，将5ml的MEM非必需氨基酸溶液（1×），和500微升2-巯基乙醇395的10ml DMEM / F-12培养基中的。
- 通过0.22微米的过滤器消毒组合组件和介质存储在4℃长达4周。
- 在使用的时候，预暖HPSC介质至37℃，并补充有4ng / ml的bFGF中。
- IMEF条件培养基（CM）
- 加入18毫升0.1N％明胶的一个T-175培养瓶中，并在37℃下孵育1小时。
- 孵育一小时后取出0.1％明胶溶液。在45ml IMEF培养基添加9.1×10 6个有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞（IMEF），并在37℃培养箱中孵育过夜。
- 以下过夜温育后，除去旧IMEF介质和用25ml D-PBS洗一次，在室温下5分钟。
- 吸掉D-PBS洗涤并加入90毫升预热HPSC介质，辅以4纳克/毫升的bFGF。孵育37℃培养箱整整24小时。
- 后培养24小时，在无菌条件下从IMEF烧瓶取出HPSC介质，并通过0.22μm的过滤器消毒。分装成5直到需要0毫升锥形管并冷冻在-20℃。 IMEF CM可存放在-20℃达6个月。
- 添加另外的90毫升补充有4纳克/ ml的bFGF向IMEF烧瓶预热HPSC培养基。孵育37℃培养箱整整24小时。重复CM的收获长达7天。
- 在使用的时候，预暖IMEF-CM至37℃，并补充有4ng / ml的bFGF中。
- E8中
- 解冻在4℃10ml的E8补充过夜。
- 除去将10ml E8基础培养基和无菌解冻E8补充的内容添加到剩余的基础培养基。调匀，并通过一个0.22微米的过滤消毒。储存在4℃的完全培养基长达2周。
- 在使用的时候，预温热培养基的等分试样以用于室温。不建议预暖E8中等至37℃。
- 所以细胞rting缓冲区
- 制备新鲜的排序缓冲单元中加入EDTA溶液（终浓度为1mM），HEPES缓冲液（25mM终浓度）青霉素/链霉素溶液（100单位/ ml最终浓度）与牛血清白蛋白（1％终浓度）成排序权之前贝科的磷酸盐缓冲液（钙和镁的自由）。
- 消毒通过之前使用0.22微米过滤器的缓冲器。
- 细胞分选回收中
- 通过添加青霉素/链霉素（100单位/ ml终浓度）和ROCK抑制剂Y-27632（10μM最终浓度）修改50毫升成纤维细胞培养基。预温热该培养基至37℃至播种排序细胞之前。
2人成纤维细胞介导的仙台重编程
- 前24小时，用仙台病毒转导，以2×10 5℃的密度接种成纤维细胞厄尔每孔到6孔TC板的所需孔中。
- 第0天进行转如下。
- 预暖色调2 ml成纤维细胞培养基中37℃水浴中。 -80℃储存空间中移除一组仙台病毒管和通过首先浸渍管的底部在37℃水浴中5一次解冻每个管一 - 10秒，然后从水中取出管洗澡，并允许它在常温下解冻。一旦解冻，短暂离心管，并立即将其置于冰上。
- 通过以达到感染的以下复数（MOI）加入适当体积（按照COA）为每个管的使用市售第二代仙台病毒到1ml预热成纤维细胞培养基的每孔被转导作为遵循：KOS = 5×10 6 CIU，HC-Myc的= 5×10 6 CIU，物hKLF4 = 3×10 6 CIU。
- 彻底吹打混合物轻轻地向上和向下混合病毒解决方案。 COMPLE忒5分钟内的下一个步骤。
- 从重新编程的成纤维细胞的孔吸出成纤维细胞培养基，和1ml的病毒溶液添加到每个孔中。放置细胞在37℃，5％CO 2培养箱孵育过夜。
- 培养过夜后，吸掉传导介质和旧媒体正确（30分钟，10％的漂白粉溶液）的处理。用2毫升预热的成纤维细胞中的替换，并继续培养转导的细胞。
- 培养细胞6天，用新鲜的成纤维细胞中替换旧媒体隔日1次。
注意：不要通道重新编程的细胞到晚上7天后转导。 - 第6天：准备餐具的iPSC代
- 馈线依赖性的iPSC代，添加1.5毫升0.1％明胶溶液至6孔组织培养（TC）的培养皿的每个孔中，并在37℃下孵育1小时。
- 取下0.1％明胶等等孵化后的1小时（分辨率）。在2毫升每孔IMEF介质的添加3×10 5个有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞（IMEF），并在37℃培养箱中孵育过夜。
- 馈线无关的iPSC代，添加1.5毫升稀释基底膜基质（1：100稀释）到6孔的组织培养（TC）的培养皿的每个孔中，并在37℃下孵育1小时。
- 转导后七天，收获转导的成纤维细胞，并将它们再板到用于的iPSC集落生成的预先制作的培养皿。
- 吸掉来自成纤维细胞的正常培养基，并用2ml的D-PBS中洗一次细胞。
- 吸掉的D-PBS洗涤，并添加0.5预热0.05％胰蛋白酶/ EDTA的溶液中。孵育3细胞 - 5分钟，在37℃。
- 当细胞已围捕，加2ml预热的成纤维细胞培养基到每口井停止胰蛋白酶。逐出良好的细胞轻轻吹打Ť他遇到的菜表面的网上平台。收集在15毫升锥形离心管中的细胞悬浮液。
- 离心细胞，在200×g离心2分钟。吸出上清液，并在2毫升重新悬浮细胞新鲜，预热的成纤维细胞中。
- 算使用所需的方法（血球或自动细胞计数器）细胞，并用5×10 4个细胞用于馈有关的条件和1×10 5个细胞于馈线独立条件种子预先准备的培养皿，每孔6的-Well培养皿并在37℃，5％的CO孵育2培养箱过夜。
- 继温育过夜，根据应用改变介质HPSC介质，E8介质或IMEF条件培养基。此后每天更换新鲜培养基旧的网上平台。
3. BGO1v hOct4-GFP记者人类胚胎干细胞的重编程仙台（胚胎干细胞）衍生次级成纤维细胞
- 明镜香港专业教育学院从BG01V hOct4-GFP记者人类胚胎干细胞系继发人成纤维细胞按程序前面所述9。
- 转导的前两天，板块BGO1v /生猪，每孔2×10 5个细胞的成纤维细胞到6孔板的两口井，采用成纤维细胞中。
- 上的转导，暖Pre 2的ml成纤维细胞培养基的天至37℃。
- 从-80℃贮存取出一套仙台管。从袋中取出小瓶并通过首先浸渍管的底部在37℃水浴中5一次解冻每个管一 - 10秒，在这之后，允许所述管在室温下解冻。一旦解冻，短暂离心管，并立即将其置于冰上。
- 添加每三个仙台管的所指示的卷（见辅酶A为适当的体积）至2ml成纤维细胞培养基，预先加热到37℃，并通过上下抽吸病毒溶液充分混合。完成下一STE在5分钟内页。
注意：在这个实验中，一个MOI 5：5：6利用。 - 从成纤维细胞的孔中吸出成纤维细胞中进行转导。加入1ml的病毒悬浮液，以每两个井的被转导。放置细胞在37℃，5％CO 2培养箱孵育过夜。
- 培养过夜后，取出转导中，妥善处理（30分钟，10％的漂白粉溶液）。用2ml预热成纤维细胞培养基替换每个孔中，并继续培养转导的细胞。
- 培养细胞6天，用新鲜的成纤维细胞中改变旧媒体隔日1次。
- 七天后转导，收获转导的成纤维细胞，并将它们重新板到用于的iPSC集落生成的预先制作的培养皿。
- 吸掉来自成纤维细胞的正常培养基，并用2ml的D-PBS中洗一次细胞。
- 吸掉DPBS洗，并添加0.5预热0.05％胰蛋白酶/ EDTA的溶液中。孵育3细胞 - 5分钟，在37℃。
- 当细胞已围捕，加2ml预热的成纤维细胞培养基到每口井停止胰蛋白酶。轻轻吹打横跨盘的表面上的介质逐出井的细胞。收集在15毫升锥形离心管中的细胞悬浮液。
- 离心将细胞以200× 克2分钟。吸出上清液，并重新悬浮细胞在新鲜，预热的成纤维细胞中的一个适当的量。
- 算使用所需的方法（血球或自动细胞计数器）的细胞。
- 种子的转导的细胞以每一个基底膜基质孔的1×10 5个细胞的密度包被6孔板，并在37℃，5％CO 2培养箱孵育过夜。
- 继温育过夜，改变介质到IMEF条件培养基，补充有10纳克/立方米升B-FGF的。此后更换新IMEF CM日常旧媒体。
- 三周后转导，机械解剖并传送所需的菌落克隆扩增，或者使用用于分析。
成纤维细胞重编程的4活细胞成像
- 实时监控
- 后7天转导与仙台重新编程的试剂盒，种子细胞的所需量到与所需介质和基质系统6孔培养皿中，如前所述。放置晶种菜成像器，位于培养箱设定为37℃的内部，和5％ 的 CO 2。
- 设置成像软件在设定的时间间隔拍摄每一个人井全井图像 - 连续图像捕捉根据制造商的协议未来14天（每6小时8）。
注意：如果重新选择正常的重新编程，以评估进展殖民地相衬图像设置。在这种情况下的BG01V / HOG衍生的成纤维细胞的重新编程，这是最好的拍摄图像在相衬和作为内源OCT4-GFP报告的重新激活的绿色荧光通道可以在整个重编程过程进行跟踪。 - 每天更换介质，它可以是HPSC介质，E8介质或IMEF-CM，这取决于实验，如先前从第8天所述21转导后。井可以进一步分析使用间接免疫荧光的集落形成。
- 在第19天的试验结束至21，除去从每个孔的培养基中与成纤维细胞的抗体进行探测和干选择的细胞标记物。
- 用2ml预温热的DMEM / F-12培养基中洗各孔一次。
- 制备各正/负一级抗体对等分试样在1毫升的DMEM / F-12培养基中，如下所示：抗小鼠SSEA4（1：200）和抗大鼠CD44（1:50），抗小鼠TRA-1- 60（1：200）和抗大鼠CD44（1:50），和碱性磷酸酶李已经染色（1:50）和抗大鼠CD44（1:50）。添加1ml的初级抗体溶液到每个相应的孔。孵育在37℃下45分钟。
- 吸掉第一抗体溶液，并用预温热的DMEM / F-12培养基洗涤两次。
- （500 1）的绿色荧光和山羊抗鼠的Alexa Fluor 594缀合的二：对于红色荧光（1 500），使用羊抗鼠的Alexa Fluor 488缀合的二制备的二级抗体溶液（1毫升每孔） DMEM / F-12培养基。添加到每个孔中的最终洗涤之后。温育30分钟的二抗在37℃。
注：由于碱性磷酸酶活染色的（APLS）瞬时信号，所述抗CD44初级培养应首先由自身执行与APLS应在孵化与次级抗体时加入 - 以下的第二抗体温育后，吸出溶液，并用DMEM / F-12培养基洗涤两次。添加新鲜预热的DMEM / F-12介质到每个孔中之前，最终的图像捕获。
- 设置成像软件采集以及使用所有三种扫描参数每个全井图片：相衬，绿色荧光和红色荧光。创建以各种比例的图像和创建时间推移电影用软件来监控生长和标志物表达。使用制造商的协议。
- 利用分析软件，评估相衬，并为BG01V /猪重编程绿色荧光单位以及随着时间的推移汇合。
- 监测重新编程中间体使用细胞表面标志物
- 通过以监测重编程过程具有针对不同的干细胞阳性/阴性标记物的抗体探测在不同时间点重新编程菜监控在不同时间点重新编程的事件。探针培养，每2至3天，取决于重复的可用性。探测重编程DISHES第19天至21使用双染色策略，以确定完全重新编程的iPSC集落，并基于该染色模式部分重新编程集落。
- 在期望的时间点，吸断从每个孔到与所选择的标志物的抗体被探测的正常生长培养基中。
- 用2ml预温热的DMEM / F-12培养基中洗各孔一次。
- 制备各正/负一级抗体对等分试样在1毫升的DMEM / F-12培养基的如下：SSEA4缀合到绿色荧光的荧光团（1：200），TRA-1-60缀合到绿色荧光的荧光团（1： 50），碱性活染色（1：500），CD24缀合到绿色荧光的荧光团（1:50），B2M缀合到绿色荧光的荧光团（1:50），EpCAM的缀合到绿色荧光的荧光团（1:50）小鼠CD73被探测与和大鼠CD44（1:50）：其与缀合到绿色荧光的荧光团（500 1）的抗小鼠二次抗体探测（1 100）抗大鼠第二抗体缀合到红色荧光的荧光团（1：500）。添加1ml的初级抗体溶液到每个相应的孔。孵育在37℃下45分钟。
- 吸掉第一抗体溶液，并用预温热的DMEM / F12培养基清洗两次。
- 对于非共轭的抗体，继续使用两步法通过制备适当的二级抗体溶液，并在37℃下孵育30分钟。确认第二抗体是主要的主机和不交叉反应。如前所述执行额外的洗涤步骤。
- 所有适当洗涤后，新鲜预热的DMEM / F-12培养基到每个孔中之前，最终图像捕获添加。
- 捕获适当的过滤器下放大100倍，使用荧光显微镜，荧光图像和分析使用可用的分析软件中的图像。
使用流ç重编程动力学5.测量ytometry
- 利用细胞表面的抗体重编程的定量测量动力学
- 之前重新编程，设置的重新编程实验适当数量为每个时间点。为了测量重编程的动力学第7天重编程，个别转导是为每个所需时间点执行。对于第7天以后的时间点，种子足够馈线独立的时间点，以继续测量重编程事件。一个6孔板的单个孔将产生足够量的细胞进行流式细胞术分析进行流动。
- 测量从各个孔所有期望重新编程的时间点，因为这是一个终点检测。从所需以及吸掉成纤维细胞中。用D-PBS洗一次。
- 吸掉D-PBS洗。加入1ml 0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液添加到井进行测试。在室温下孵育5分钟。
- 继温育后，dissoci吃了细胞成单个细胞通过冲洗对井的表面1ml的细胞悬浮液，悬浮液转移入15ml锥形管中。使用3毫升的D-PBS中，以从井洗掉任何剩余的细胞，并将其添加到15毫升锥形。使用10毫升额外的D-PBS中，以进一步稀释在锥形管中的细胞溶液。
- 离心细胞，在200×g离心2分钟。吸出上清液并重新悬浮沉淀在1ml的DMEM / F-12培养基中。根据需要创建标准细胞悬浮液是小于1×10 6个细胞/ ml进行细胞计数。
- 制备所选择的正/负直接标记的抗体的每个等分试样在1毫升的DMEM / F-12培养基的少1×10 6个细胞/使用下列组合毫升：SSEA4缀合到绿色荧光的荧光团（1：200），用CD44缀合PE-Cy5的，或CD44缀合到绿色荧光的荧光团和SSEA4偶联至远红色荧光的荧光团。孵化抗体与细胞悬浮液在室温下45分钟。
- 吸出第一抗体溶液，并用预热的DMEM / F-12培养基洗涤两次。
- 吸出最后一次洗涤和于1ml D-PBS重新悬浮细胞沉淀。吸管在个别FACS管各悬浮液的内容。
- 使用适当的阴性对照（未染色和同种型对照），确认在流式细胞仪的正确的正向和侧向散射轮廓和电压。根据最初的单一色斑的参数，例如，绿色荧光团由蓝色激光与在BL1信道获取的信号激活设置为相应的荧光团上的电压，而远红荧光的荧光团和PE-Cy5的荧光团是由红色激光激活并在RL1渠道获得的信号。获得每个时间点的双重染色的群体。
- 使用相应的分析软件分析每个时间点的FCS文件，并使用编辑器ARRANGE数据来观察随着时间的推移人口转移的表达。
- 按照步骤5.1.1至5.1.6，如果细胞分选需要在不同时间点。根据所使用的细胞分选仪的激光配置使用适当的荧光团的组合。
- 以下最后的洗涤，重新悬浮在1ml的细胞分拣缓冲液的细胞沉淀。使用未染色的对照建立细胞分选到正确的前向和侧向散射设置。使用单染色控制为每个荧光团成立了正确的设置。
- 使用双染色细胞悬浮液中的一小样品;选择2群进行排序，并分配相应的充电，以确保选细胞的正确收集。
- 加入200微升细胞回收培养基到集合管，以确保排序细胞悬浮液被缓冲，并在分选的时间保护。收获细胞的欲望和数量转移到含有新鲜的新IMEF菜LY准备恢复网上平台。
- 在与恢复中过夜培养改变介质。培养必须随后馈送和用含有青霉素/链霉素（100单位/ ml最终浓度）HPSC介质常规传代。
6.端点分析
- 终端碱性磷酸酶（AP）染色
- 使用终端的显色AP染色与最终重编程效率观察到的动能和形态的事件相关联。
- 重新编程之后21天，取出井的培养基与终端AP染色染色，用200毫米的Tris-HCl（pH8.0）中洗一次。
- 制备染色溶液适量的指示制造商的在200毫摩尔Tris-盐酸手册。
- 吸出洗涤并加入2毫升制备的染色液的每个孔中。孵育20到30分钟，在室温下，并从第远e光。
- 吸出染色溶液，并用200毫摩尔Tris盐酸洗一次。取出洗净和可视化之前，加蒸馏水。
- 捕获使用普通摄影机的色度信号。计数染色阳性菌落用手工的数目。可视化在三叔C通道使用荧光分析污渍，如污渍在本质上也是荧光和执行整个井成像，并使用全井成像器进行分析。使用制造商的协议。
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Representative Results
监测重新编程动力学采用流式细胞仪
CD44是一种纤维原细胞标记，而SSEA4是PSC标记6,10。从该表达模式预期，流式细胞仪BJ成纤维细胞显示了一个SSEA4 - CD44 +群体便于与未染色的样品组合象限门的创作。在DF1成纤维细胞的仙台病毒的重新编程，CD44逐渐丧失，而SSEA4缓慢表示。在与仙台病毒转导后第3天，有SSEA4的人口众多- CD44 +细胞和SSEA4 + CD44 +细胞中的一小人口变成7天（ 图1）更明显。状态-在13日，双阳性人群对SSEA4 + CD44过渡。 17日，行政长官有很大比例在文化LLS已经SSEA4 + CD44 - 。这个时间过程表明，与CD44和SSEA4流式细胞仪可用于监测重编程的进展和速率。
定量比较，证实了重新编程BJ成纤维细胞重编程的仙台病毒产生SSEA4 + CD44 -以不同速度比BJ成纤维细胞（ 图2A）的重编程细胞。该数据表明，PSC状SSEA4 + CD44的百分比的早期比较-细胞跟踪重新编程的进展。有趣的是，在DF1成纤维细胞重编程的第8天，分选和单独培养是在上调SSEA4过程细胞群和下调CD44生成AP +集落11（ 图2B）。与此相反，原始SSEA4 - CD44 +群体产生点UCH在重编程的第21天较少数量的AP +集落的，这是最后的集落分析的典型的一天。这表明，有可能量化和为了比较过渡人口预测连SSEA4 + CD44之前在重编程动力学差异-形成人口。这里要注意的重要一点是，重新编程是可变进程取决于几个因素，如起始体细胞群体，转导效率，介质等 ，但上述的表面标记的一般模式和进展是不同的重编程的实验和之间的一致性开始成纤维细胞。重编程动力学的分析也可以用不同的标记物进行，如新鉴定的阴性的PSC标记物CD73和B2M 6，以及已建立的PSC标记物CD24 12,13和EPCAM 14,15。以CD44，CD73和B2M类似在参数表示ental BJ成纤维细胞，但重编程的过程中下调，成为完全重新编程的iPSCs（ 图3A）检测不到。流式细胞仪使用CD44和CD73或CD44和B2M时间过程的流程表明CD44和CD73以类似的速度下调，而B2M比CD44（ 图3B）下调更快。在这两种情况下，重编程的速率可以通过测量双负人口的积累被观察到。相对于这些负PSC标记物，CD24和EPCAM是在成纤维细胞不存在，并且在iPSCs的（ 图3A）表示。在流式细胞仪时程的流程，CD24 - CD44 +和EPCAM - CD44 +成纤维细胞最终形成双阴性群后来过渡到CD24 + CD44 -和EPCAM + CD44 - PSC样细胞，分别为（ 图3B）。因此，重编程过程中，既有积极的PSC标记CD44被下调后表示。用SSEA4和CD44，形成与不同细胞群的积累所观察相似指示重新编程的进展。
跟踪重新编程使用实时成像分析
补播节目的殖民地逐渐形成（ 图4A），它对应于下相衬（ 图4B）的汇合对数增加后重新编程的文化实时成像。下相衬合流从而提供了用于定量地监测重编程其他指标，但它同时包括，是阳性的PSC标记和unreprogrammed或部分重编程的细胞（ 图4A，上面板）的持续增殖菌落。量化已染色多潜能标志物的区TRA-1-60，SSEA4及AP 6,10在第21天表示的iPSC只占小于总汇合（ 图4B）的一半。为了更严格测量重编程的进展，有可能使用报道线重新编程。这里，从该BG01V / HOG ESC线，其已被设计与OCT4-GFP报告16产生的二次成纤维细胞。 GFP被表达为细胞重新编程并作为菌落形成（ 图5A）。下相衬和绿色通道测量合流表明GFP的合流比总合流增加更慢，并且在第19天的GFP合流是小于总汇合（ 图5B）的一半，使人联想TRA-1-60的， SSEA4及AP染色在第21天。
图1. 墨nitoring重编程的使用流式细胞仪的研究进展。流式细胞仪散点图对DF1成纤维细胞与病毒仙台下无饲养条件下重新编程。收获细胞，并从第3天（D3）重编程过程的不同时间间隔19天（D19）与SSEA4和CD44抗体染色。在9日的文化（D9）起进行细胞在第7天（D7）进行了重新接种后进行分析。散点图显示8000汗衫。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2. 在无饲养条件评估重编程动力学和效率 （A）图表显示SSEA4 + CD44的百分比变化-转导DF1 FIB后重新编程的细胞roblasts和BJ成纤维细胞的仙台病毒。细胞通过流式细胞术在第3天至19转导后进行分析，在9日培养起经历在节7（B）的伪彩色补种流式细胞地块为导仙台病毒并用SSEA4和CD44抗体染色DF1细胞。 SSEA4 - CD44 +细胞（黑圈）和SSEA4 +细胞（红圈）在8日进行了梳理，并允许染色碱性磷酸酶（红色）前生长，直到19日请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 无饲养文化的重新编程观测动力学使用不同正负PSC标记。（AD）染色直播的使用抗体为阳性PSC标记物CD24日间18 DF1衍生的重编程的文化和EPCAM和负PSC标记物CD44，CD73，和B2M。顶端板合并的绿色和红色荧光通道，而底板还包括相位对比图像。比例尺条为200μm的（E）流式细胞仪点阵图为收获并使用从9日同一标记染色以17（D9至D17）DF1衍生重新编程培养转导后。在分析之前，在培养7天再接种了点图显示8000汗衫。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. 跟踪重编程动力学测量总合流。（A）实时IBJ的maging成纤维细胞无饲养条件下，用仙台病毒重新编程。同样的菌落相衬图像在7日被带到19，然后在21日与CD44和SSEA4，TRA-1-60或AP额外的染色。总合流（相差），为重编程的比例尺对应于400微米。（B）的定量从在第21天在第7天再接种到日21.总计合流进行过程中相比SSEA4，TRA-1-60和AP信号汇合（绿色通道）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5. 测量OCT4-GFP汇流评估重编程动力学。（A）和重新编程BG01V /猪胚胎干细胞成纤维细胞的实时成像仙台无饲养条件下的病毒。相衬，绿色荧光并且合并在第7天生成19.比例尺对应于400μm的相同菌落图像。（B）的总合流（相差）和OCT4-GFP融合（绿色通道）的定量为重编程的进展从7日重新播种到21日请点击此处查看该图的放大版本。
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Disclosures
所有作者[地区总部，JSTA，KS，和UL]是的Thermo Fisher Scientific，这产生了一些在这篇文章中所使用的试剂和仪器的员工。
Acknowledgments
作者感谢乍得麦克阿瑟有益的讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16141-061 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts | Thermo Fisher Scientific | A24903 | |
| Attachment Factor Protein (1x) | Thermo Fisher Scientific | S-006-100 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Collagenase, Type IV, powder | Thermo Fisher Scientific | 17104-019 | |
| TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12563-011 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0264 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260-037 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| InSolution Y-27632 | EMD Millipore | 688001 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal | ATCC | CRL-2522 | |
| DF1 Adult Human Dermal Fibroblast | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells | Thermo Fisher Scientific | R7799-105 | |
| IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | ||
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | SSEA421 | |
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) | Thermo Fisher Scientific | A14810 | |
| SSEA-4 Antibody (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | 41-4000 | |
| TRA-1-60 Antibody (cl.A) | Thermo Fisher Scientific | 41-1000 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A27094 | |
| CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25528 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) | Thermo Fisher Scientific | RM-5700 (no longer available) | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11007 | |
| Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | |
| TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25618 | |
| CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate | Thermo Fisher Scientific | MHCD2401 | |
| beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) | Thermo Fisher Scientific | A15737 | |
| EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) | Thermo Fisher Scientific | A15755 | |
| CD73 / NT5E Antibody (7G2) | Thermo Fisher Scientific | 41-0200 | |
| VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| Zeiss Axio Observer.Z1 microscope | Carl Zeiss | 491912-0003-000 | |
| FlowJo Data Analysis Software | FLOJO, LLC | N/A | |
| Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser | Thermo Fisher Scientific | Use Attune NXT | |
| S3e\ Cell Sorter (488/561 nm) | BIO-RAD | 1451006 | |
| Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | |
| Falcon 15 ml, high-clarity, dome-seal screw cap | Corning | 352097 | |
| Falcon T-75 Flask | Corning | 353136 | |
| Falcon T-175 Flask | Corning | 353112 | |
| Falcon 6-well dish | Corning | 353046 | |
| Heraeus Heracell CO2 Rolling Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51013669 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 ml | AM12450 | ||
| HulaMixer Sample Mixer | 15920D |
References
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