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Developmental Biology

Cinetica Misurazione e Tempo reale visualizzazione della riprogrammazione somatica

Published: July 30, 2016 doi: 10.3791/54190
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Life Sciences Solutions, Thermo Fisher Scientific

Summary

Il protocollo presentato in questo studio descrive metodi per il monitoraggio in tempo reale di progressione riprogrammazione tramite la misurazione cinetica dei marcatori di cellule staminali pluripotenti positivi e negativi usando analisi citofluorimetrica. Il protocollo include anche la valutazione di imaging basata su morfologia, e pennarello o espressione giornalista durante la generazione IPSC.

Introduction

Le cellule staminali pluripotenti indotte paziente-derivato (iPSCs) sono strumenti promettenti per la terapia cellulare e lo screening di stupefacenti. Essi forniscono una fonte autologa di cellule per la terapia. Inoltre, essi comprendono una vasta gamma di background genetico, che permette una dettagliata analisi in vitro di malattie genetiche di là di quanto attuali linee di cellule staminali embrionali (ESC) consentirebbe. I recenti progressi hanno portato allo sviluppo di diversi metodi per generare iPSCs, compresi riprogrammazione con virus Sendai, plasmidi episomale o mRNA 1,2. In particolare, diversi metodi di riprogrammazione sono associati a livelli di efficienza e sicurezza variabile, ed è probabile che differiscono in altri modi che influenzano la loro adeguatezza per varie applicazioni. Con la disponibilità di una varietà di tecnologie di riprogrammazione, è diventato importante sviluppare metodi per valutare il processo di riprogrammazione. La maggior parte dei metodi esistenti si basano su l'ispezione qualitativa della morfologia o macchiecon coloranti e gli anticorpi specifici di cellule staminali. Un metodo recentemente sviluppato si avvale di giornalisti fluorescenza lentivirali che sono sensibili a specifici miRNA-PSC o mRNA specifico per cellulari differenziate 3. Tali metodi di monitoraggio facilitano la selezione e l'ottimizzazione delle tecniche di riprogrammazione per situazioni diverse. Ad esempio, CDy1 è stato utilizzato come una sonda fluorescente per i primi iPSCs al fine di schermo per modulatori di riprogrammazione 4. La capacità di osservare e confrontare diversi esperimenti di riprogrammazione è anche fondamentale per ottenere una migliore comprensione del processo stesso. Ad esempio, è ormai noto che alcuni tipi di cellule somatiche sono più facili da riprogrammare di altri 5, e che le cellule passare attraverso stati intermedi durante riprogrammazione 6-8. Purtroppo, i meccanismi alla base del processo di riprogrammazione non sono ancora del tutto chiare e, di conseguenza, le differenze esatte tra i metodi di riprogrammazione rimangono anche essere defined. Così, i metodi per il monitoraggio, la valutazione e confronto eventi riprogrammazione continuano ad essere critica per il campo delle cellule staminali.

I metodi descritti in questo protocollo consentono il controllo e la valutazione del processo di riprogrammazione e illustrano come queste tecniche possono essere utilizzati per confrontare diverse serie di reagenti di riprogrammazione. Il primo approccio prevede la citometria a flusso analizza utilizzando combinazioni di anticorpi contro cellule staminali pluripotenti positiva e negativa (PSC) marcatori. L'immagine in tempo reale secondo coppie di avvicinamento e la misurazione di confluenza totale (la superficie cento coperta dalle cellule) e confluenza dei segnali marcatori (la superficie percentuale coperta dai segnali fluorescenti).

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Protocol

1.Solution e Media Preparazione

  1. Matrice di membrana basale (purificata da Engelbreth-Holm-Swarm tumore)
    1. Lentamente scongelare la matrice membrana basale (5 ml) in ghiaccio a 4 ° C durante la notte.
    2. Diluire la soluzione madre 1: 1 con 5 ml di ghiaccio freddo, DMEM sterile / F-12 di media in un pre-raffreddata tubo da 15 ml sterile. Dispensare aliquote in pre-refrigerati, tubi micro centrifuga da 1,5 ml sterili ed immediatamente conservare a -20 ° C.
    3. Prima di utilizzo, scongelare il congelato 1: 1 membrana basale matrice aliquota notte a 4 ° C. Al momento dell'uso, diluire ulteriormente il 1: 1 aliquota un'altra 50 volte con ghiacciata, DMEM sterile / F-12 medio una diluizione finale di 1: 100.
    4. Aggiungere la quantità appropriata della 1: seminterrato soluzione diluita 100 matrice membrana per la coltura tissutale appropriato (TC) navi e incubare a 37 ° C per 1 ora. Tipicamente, utilizzare 3 ml della soluzione di matrice di membrana basale diluito per rivestire un piatto TC of 20 cm 2 di superficie, cappotto tutti gli altri tipi di piatti TC / piastre con un rapporto di 0,15 ml di matrice diluito per cm 2 di superficie. Aspirare la soluzione rimanente prima dell'aggiunta di qualsiasi supporto e cellule coltura.
  2. fibroblasti Media
    1. Scongelare un flacone da 100 ml di ES qualificato siero fetale bovino (ES-FBS) a 4 ° C durante la notte.
    2. Aggiungere 50 ml di scongelato ES-FBS e 5 ml di MEM non essenziali soluzione di acido (1x) a 445 ml di terreno DMEM. Sterilizzare i componenti combinati attraverso un filtro di 0,22 micron e conservare il terreno a 4 ° C per 4 settimane.
  3. IMEF Media
    1. Scongelare un flacone da 100 ml di ES-FBS a 4 ° C durante la notte.
    2. Aggiungere 50 ml di FBS scongelata, 5 ml di MEM non essenziali soluzione di acido (1x), e 500 ml di 2-mercaptoetanolo a 445 ml di terreno DMEM.
    3. Sterilizzare i componenti combinati attraverso un filtro di 0,22 micron e memorizzare il medium a 4 ° C per 4 settimane.
  4. Soluzione Fibroblast Growth Factor di base (b-FGF)
    1. Aggiungere 10 ml di siero di sostituzione a 990 ml di D-PBS e mescolare bene pipettando su e giù.
    2. Aggiungere i 1 ml di 1% (v / v) sostituzione siero ad un flaconcino di 10 mg liofilizzato b-FGF. Mescolare accuratamente pipettando gentilmente su e giù.
    3. Aliquota del / ml b-FGF soluzione 10 mg in 200 aliquote microlitri in tubi micro-centrifuga e conservare a -20 ° C fino al momento fino a 4 settimane.
  5. Umane pluripotenti Stem Cell (HPSC) Medium
    1. Scongelare un flacone da 100 ml di siero sostituzione a 4 ° C durante la notte.
    2. Aggiungere 100 ml di siero sostituzione scongelato, 5 ml di MEM non essenziali soluzione di acido (1x), e 500 ml di 2-mercaptoetanolo a 395 ml di DMEM / F-12 di media.
    3. Sterilizzare i componenti combinati attraverso un filtro di 0,22 micron e conservare il terreno al4 ° C per 4 settimane.
    4. Al momento dell'uso, pre-riscaldare il mezzo HPSC a 37 ° C e integrare con 4 ng / ml di bFGF.
  6. IMEF condizionata Medium (CM)
    1. Aggiungere 18 ml di 0,1% di gelatina in un pallone T-175 cultura e incubare a 37 ° C per 1 ora.
    2. Rimuovere la soluzione di gelatina 0,1% dopo un'ora di incubazione. Aggiungere 9,1 x 10 6 fibroblasti embrionali di topo mitoticamente-inattivato (Imef) in 45 ml di terreno Imef e incubare nel 37 ° C incubatore durante la notte.
    3. Dopo una notte di incubazione, rimuovere il vecchio mezzo Imef e lavare una volta con 25 ml di D-PBS per 5 minuti a temperatura ambiente.
    4. Aspirare off del D-PBS lavare e aggiungere 90 ml di mezzo HPSC pre-riscaldato, integrato con 4 ng / ml di bFGF. Incubare nel 37 ° C incubatore per esattamente 24 ore.
    5. Dopo 24 ore di incubazione, rimuovere asetticamente il medium HPSC dal pallone Imef e sterilizzare attraverso un filtro di 0,22 micron. Aliquota in 50 ml provette coniche e congelare a -20 ° C fino al momento dell'uso. IMEF CM può essere conservato per un massimo di 6 mesi a -20 ° C.
    6. Aggiungere altri 90 ml di terreno HPSC pre-riscaldato integrato con 4 ng / ml di bFGF al matraccio IMEF. Incubare nel 37 ° C incubatore per esattamente 24 ore. Ripetere la raccolta di CM per un massimo di 7 giorni.
    7. Al momento dell'uso, pre-riscaldare la Imef-CM a 37 ° C e integrare con 4 ng / ml di bFGF.
  7. E8 Media
    1. Scongelare un integratore 10 ml E8 a 4 ° C durante la notte.
    2. Rimuovere 10 ml del mezzo basale E8 ed aggiungere asetticamente il contenuto del supplemento E8 scongelato al mezzo basale rimanente. Mescolare accuratamente e sterilizzare attraverso un filtro di 0,22 micron. Conservare il mezzo completo a 4 ° C per 2 settimane.
    3. Al momento dell'uso, pre-riscaldare l'aliquota del supporto da utilizzare a temperatura ambiente. Non è raccomandato di controllare la validità caldo E8 medio a 37 ° C.
  8. Così cellularerting Buffer
    1. Preparare buffer di ordinamento fresco appena prima cellula di smistamento con l'aggiunta di soluzione di EDTA (1 mM concentrazione finale), tampone HEPES (concentrazione 25 mM finale) soluzione penicillina / streptomicina (100 unità / concentrazione finale ml) e albumina sierica bovina (1% concentrazione finale) in Dulbecco tampone fosfato (calcio e magnesio gratuito).
    2. Sterilizzare il buffer attraverso un filtro da 0,22 micron prima dell'uso.
  9. Cell sorting Recovery Media
    1. Modificare 50 ml di fibroblasti Media con l'aggiunta di penicillina / streptomicina (100 unità / ml concentrazione finale) e rock Inhibitor Y-27632 (10 micron concentrazione finale). Pre-riscaldare questo mezzo a 37 ° C prima di seminare le cellule ordinati.

2. Sendai Mediated riprogrammazione di fibroblasti umani

  1. 24 ore prima di trasduzione con i virus Sendai, sementi i fibroblasti ad una densità di 2 × 10 5 cells per pozzetto nei pozzetti desiderati di una piastra TC 6-bene.
  2. Eseguire la trasduzione il giorno 0 come segue.
    1. Pre-caldo 2 ml di fibroblasti medio in un bagno d'acqua a 37 ° C. Rimuovere una serie di tubi virus Sendai da -80 stoccaggio ° C e scongelare ogni tubo una alla volta dalla prima immergendo il fondo della provetta in un bagno 37 ° acqua per 5 - 10 sec, quindi rimuovere il tubo dall'acqua bagno e permettono di scongelare a temperatura ambiente. Una volta scongelato, centrifugare brevemente la provetta e metterlo immediatamente in ghiaccio.
    2. Utilizza virus Sendai commercialmente seconda generazione aggiungendo i volumi appropriati (come da COA) per ciascuno dei tubi per ottenere la seguente molteplicità di infezione (MOI) di 1 ml di pre-riscaldato Fibroblast medio per pozzetto essere trasdotte come seguono : KOS = 5 x 10 6 CIU, hc-Myc = 5 x 10 6 CIU, hKlf4 = 3 x 10 6 CIU.
    3. Mescolare bene la soluzione virale pipettando la miscela delicatamente su e giù. compleTE alla fase successiva entro 5 min.
    4. Aspirare il fibroblasti Media dal pozzo dei fibroblasti da riprogrammati, e aggiungere 1 ml di soluzione virale in ogni pozzetto. Collocare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore e incubare durante la notte.
  3. Dopo una notte di incubazione, aspirare al largo della media trasduzione e smaltire correttamente il vecchio supporto correttamente (soluzione di candeggina al 10% per 30 min). Sostituire con 2 ml di pre-riscaldato fibroblasti Medium e continuare a coltivare le cellule trasdotte.
  4. Coltivare le cellule per altri 6 giorni, sostituendo il vecchio mezzo con fresca fibroblasti media ogni altro giorno.
    Nota: Non passare le cellule riprogrammate fino a 7 giorni dopo la trasduzione.
  5. 6 ° giorno: preparare piatti per iPSC Generation
    1. Per la generazione COPSI alimentatore-dipendente, aggiungere soluzione di gelatina 1,5 ml di 0,1% a ciascun pozzetto di una coltura tissutale da 6 pozzetti (TC) piatto e incubare a 37 ° C per 1 ora.
    2. Rimuovere la gelatina 0,1% cosìluzione dopo 1 ora di incubazione. Aggiungere 3 x 10 5 fibroblasti embrionali di topo mitoticamente-inattivato (Imef) in 2 ml di terreno Imef per pozzetto e incubare nel 37 ° C incubatore durante la notte.
    3. Per la generazione COPSI alimentatore indipendente, aggiungere 1,5 ml di matrice membrana basale diluito (diluizione 1: 100) a ciascun pozzetto di una coltura tissutale da 6 pozzetti (TC) piatto e incubare a 37 ° C per 1 ora.
  6. Sette giorni dopo la trasduzione, raccogliere i fibroblasti trasdotti e li ri-Plate sulle stoviglie pre-fatti di cultura per iPSC generazione colonia.
    1. Aspirare off mezzo di coltura normale dai fibroblasti, e lavare le cellule una volta con 2 ml di D-PBS.
    2. Aspirare al largo della D-PBS lavare e aggiungere 0,5 ml di pre-riscaldato 0,05% tripsina / EDTA. Incubare le cellule per 3-5 minuti a 37 ° C.
    3. Quando le cellule hanno arrotondato, aggiungere 2 ml di pre-riscaldato Fibroblasto medio in ciascun pozzetto per arrestare tripsinizzazione. Rimuovere le cellule dal ben pipettando delicatamente tha media sulla superficie del piatto. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga conica 15 ml.
    4. Centrifugare le cellule a 200 xg per 2 min. Aspirare il surnatante, e risospendere le cellule in 2 ml di fresco, pre-riscaldato Fibroblasto Media.
    5. Contare le cellule utilizzando il metodo desiderato (emocitometro o contatore di cellule automatizzato) e seminare i piatti della cultura pre-preparati con 5 x 10 4 cellule per le condizioni alimentatore ad dipendente e 1 x 10 5 cellule per le condizioni alimentatore ad autonomo, per pozzetto di un 6 -Beh piatto e incubare a 37 ° C, 5% di CO 2 incubatore durante la notte.
    6. Dopo la notte di incubazione, cambiare la media e medio HPSC, medio E8 o supporto Imef condizionata, a seconda dell'applicazione. Sostituire il vecchio mezzo con terreno fresco tutti i giorni da allora in poi.

3. Sendai riprogrammazione della BGO1v hOct4-GFP embrionali Reporter cellule staminali umane (hESC) Derivato fibroblasti secondari

  1. derive fibroblasti umani secondari dalla linea giornalista hESC BG01v hOct4-GFP secondo la procedura descritta in precedenza 9.
  2. Due giorni prima di trasduzione, piastra BGO1v / Hog derivata fibroblasti in due pozzetti di una piastra da 6 pozzetti a 2 x 10 5 cellule per pozzetto, utilizzando Fibroblasto medio.
    1. Il giorno di trasduzione, pre-riscaldare 2 ml di Fibroblast Medio a 37 ° C.
    2. Rimuovere una serie di tubi Sendai dal -80 ° C di stoccaggio. Rimuovere le fiale dalla busta e disgelo ogni tubo una alla volta dalla prima immergendo il fondo della provetta in un bagno d'acqua a 37 ° C per 5 - 10 secondi, dopo di che, permettere ai tubi scongelare a temperatura ambiente. Una volta scongelato, centrifugare brevemente la provetta e metterlo immediatamente in ghiaccio.
    3. Aggiungere i volumi indicati di ciascuno dei tre tubi Sendai (vedi CoA per il volume appropriato) per 2 ml di Fibroblast medio, pre-riscaldato a 37 ° C e mescolare la soluzione virale pipettando su e giù. Completa la prossima step entro 5 minuti.
      Nota: Per questo esperimento, un MOI di 5: 5: 6 è stato utilizzato.
    4. Aspirare il fibroblasti Media dai pozzi di fibroblasti da trasduzione. Aggiungere 1 ml di sospensione virale per ciascuno dei due pozzi da trasdotte. Collocare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore e incubare durante la notte.
    5. Dopo una notte di incubazione, rimuovere il mezzo di trasduzione e smaltirla in modo appropriato (soluzione di candeggina al 10% per 30 min). Sostituire ogni pozzetto con 2 ml di pre-riscaldato Fibroblast Medium e continuare a coltivare le cellule trasdotte.
  3. Coltivare le cellule per altri 6 giorni, cambiando il vecchio mezzo con fresca fibroblasti crescita ogni altro giorno.
    1. Sette giorni dopo la trasduzione, raccogliere i fibroblasti trasdotti e li ri-Plate sulle stoviglie pre-fatti di cultura per iPSC generazione colonia.
    2. Aspirare off mezzo di coltura normale dai fibroblasti, e lavare le cellule una volta con 2 ml di D-PBS.
    3. Aspirare al largo della DPBS lavare e aggiungere 0,5 ml di pre-riscaldato 0,05% tripsina / EDTA. Incubare le cellule per 3-5 minuti a 37 ° C.
    4. Quando le cellule hanno arrotondato, aggiungere 2 ml di pre-riscaldato Fibroblasto medio in ciascun pozzetto per arrestare tripsinizzazione. Rimuovere le cellule dal ben pipettando delicatamente il supporto sulla superficie del piatto. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga conica 15 ml.
    5. Centrifugare le cellule a 200 x g per 2 minuti. Aspirare il surnatante, e risospendere le cellule in una quantità appropriata di fresco, pre-riscaldato Fibroblasto Media.
    6. Contare le cellule utilizzando il metodo desiderato (emocitometro o contatore di cellule automatizzato).
    7. Seme le cellule trasdotte ad una densità di 1 x 10 5 cellule per pozzetto di una matrice di membrana basale Rivestiti 6 pozzetti e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore notte.
  4. Dopo la notte di incubazione, cambiare il mezzo per Imef mezzo condizionato, supplementato con 10 ng / ml di b-FGF. Sostituire il vecchio mezzo con fresco Imef CM tutti i giorni da allora in poi.
  5. Tre settimane dopo la trasduzione, sezionare meccanicamente e trasferire le colonie desiderati per l'espansione clonale o utilizzare per l'analisi.

4. cellulare Imaging in diretta di Fibroblasto Riprogrammazione

  1. Monitoraggio in tempo reale
    1. 7 giorni dopo trasduzione con il kit riprogrammazione Sendai, seme la quantità desiderata di cellule su 6 pozzetti piatti con gli impianti di medie e di matrice desiderati come precedentemente descritto. Porre le capsule seminati all'interno della termocamera, situato in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% CO 2.
    2. Impostare il software di imaging per catturare immagini e interi di ogni singolo bene a intervalli regolari (ogni 6-8 ore) di un'immagine continua cattura per i prossimi 14 giorni secondo il protocollo del produttore.
      Nota: le impostazioni di immagine contrasto di fase sono stati selezionati per la riprogrammazione normale per valutare la progressione colonia. Nel casodi BG01v / Hog derivata fibroblasti riprogrammazione, è meglio per catturare immagini a contrasto di fase e nel canale verde fluorescente come la ri-attivazione del endogena giornalista OCT4-GFP possono essere monitorati durante tutto il processo di riprogrammazione.
    3. Cambiare medio giornaliero, può essere medio HPSC, medio E8 o Imef-CM, secondo l'esperimento, come precedentemente descritto dal giorno 8 al 21 dopo trasduzione. I pozzi possono essere ulteriormente analizzati per la formazione di colonie usando immunofluorescenza indiretta.
    4. Alla fine dell'esperimento il giorno 19 a 21, rimuovere il mezzo di coltura da ciascun pozzetto per essere sondato con anticorpi per fibroblasti e cellule staminali marcatori di scelta.
    5. Lavare ogni pozzetto una volta con 2 ml di DMEM / F-12 medio pre-riscaldato.
    6. Preparare aliquote di ciascuna negativi coppie anticorpali positivi / primari in 1 ml di DMEM / F-12 medio come segue: anti-topo SSEA4 (1: 200) e anti-CD44 di ratto (1:50), anti-topo TRA-1- 60 (1: 200) e anti-topo CD44 (1:50), e fosfatasi alcalina Live Stain (1:50) e anti-topo CD44 (1:50). Aggiungere le soluzioni ml 1 anticorpo primario per ogni corrispondente bene. Incubare a 37 ° C per 45 min.
    7. Aspirare al largo della soluzione di anticorpo primario e lavare due volte con DMEM preriscaldata / F-12 di media.
    8. Preparare le soluzioni di anticorpo secondario (1 ml per ogni pozzetto) usando capra-anti-topo Alexa Fluor 488 coniugato secondario (1: 500) per fluorescenza verde e di capra-anti-topo Alexa Fluor 594 coniugato secondario (1: 500) per fluorescenza rossa in DMEM / mezzo F-12. Aggiungere ad ogni pozzetto dopo il lavaggio finale. Incubare gli anticorpi secondari per 30 minuti a 37 ° C.
      Nota: A causa alcalina di fosfatasi diretta Stain (APLS) segnale transitorio, l'incubazione primaria anti-CD44 dovrebbe essere prima eseguita da sé e la APLS deve essere aggiunto al momento della incubazione con gli anticorpi secondari
    9. Dopo l'incubazione anticorpo secondario, aspirare via la soluzione e lavare due volte con DMEM / F-12 medie. Aggiungere fresca DMEM preriscaldata / F-12media in ciascun pozzetto prima di cattura dell'immagine finale.
    10. Impostare il software imager per acquisire immagini e interi di ciascun pozzetto utilizzando tutti e tre i parametri di scansione: contrasto di fase, fluorescenza verde e fluorescenza rossa. Creare immagini a vari ingrandimenti e creare filmati time-lapse con il software per monitorare la crescita e l'espressione marcatore. Utilizzare il protocollo del produttore.
    11. Utilizzando il software di analisi, di valutare confluenza del pozzo nel tempo in contrasto di fase e in unità fluorescenti verdi per l'/ Hog riprogrammazione BG01v.
  2. Monitoraggio riprogrammazione Intermedi marcatori con superficie cellulare
    1. Monitorare gli eventi di riprogrammazione in diversi momenti sondando i piatti di riprogrammazione in vari momenti con anticorpi contro diversi marcatori di cellule staminali positivo / negativo, al fine di monitorare il processo di riprogrammazione. culture sonda ogni 2 o 3 giorni a seconda della disponibilità di repliche. La sonda dis riprogrammazionehes al giorno da 19 a 21 utilizzando la strategia duplice colorazione per identificare colonie completamente riprogrammati IPSC e colonie parzialmente riprogrammate in base ai modelli di marcatura.
    2. Al punto di tempo desiderato, aspirare fuori dal mezzo di crescita normale da ciascun pozzetto per essere sondato con anticorpi per i marcatori di scelta.
    3. Lavare ogni pozzetto una volta con 2 ml di DMEM / F-12 medio pre-riscaldato.
    4. Preparare aliquote di ciascuna negativi coppie anticorpali positivi / primari in 1 ml di DMEM / F-12 medio come segue: SSEA4 coniugata fluoroforo verde fluorescente (1: 200), TRA-1-60 coniugata fluoroforo verde fluorescente (1: 50), alcalina diretta Stain (1: 500), CD24 coniugato con un fluorocromo fluorescente verde (1:50), B2M coniugata ad un fluorocromo fluorescente verde (1:50), EpCAM coniugato con un fluorocromo fluorescente verde (1:50) , mouse CD73 (1: 100) che è stato sondato con anti-topo anticorpo secondario coniugato con un fluorocromo verde fluorescente (1: 500), e ratto CD44 (1:50), che viene controllato conanti-ratto anticorpo secondario coniugato con fluoroforo rosso fluorescente (1: 500). Aggiungere le soluzioni ml 1 anticorpo primario per ogni corrispondente bene. Incubare a 37 ° C per 45 min.
    5. Aspirare al largo della soluzione di anticorpo primario e lavare due volte con medio / F12 pre-riscaldato DMEM.
    6. Per gli anticorpi coniugati, procedere utilizzando un metodo 2-passo per la preparazione delle soluzioni di anticorpi secondari appropriati e incubare per 30 min a 37 ° C. Verificare che gli anticorpi secondari sono per i padroni di casa primarie e non attraversano reagire. Eseguire i passaggi di lavaggio aggiuntivi come descritto in precedenza.
    7. Dopo che tutti i lavaggi del caso, aggiungere fresca pre-riscaldato DMEM / F-12 di media per ciascun bene prima di cattura dell'immagine finale.
    8. Catturare le immagini fluorescenti sotto il filtro appropriato a ingrandimento 100X usando un microscopio a fluorescenza e analizzare le immagini utilizzando il software di analisi disponibili.

5. Misurazione della riprogrammazione Kinetics Utilizzando flusso Cytometry

  1. Quantitativa cinetica Misurazione della riprogrammazione cellulare utilizzando anticorpi di superficie
    1. Prima di riprogrammazione, impostare il numero appropriato di esperimenti di riprogrammazione per ogni punto di tempo. Per la misurazione cinetica di riprogrammazione per i primi 7 giorni di riprogrammazione, singoli trasduzione vengono eseguiti per ogni punto di tempo desiderato. Per punti di tempo dopo il giorno 7, semi di sufficienti punti di tempo di alimentazione indipendente di continuare a misurare gli eventi di riprogrammazione. Un singolo pozzo di un 6-pozzetti produrrà una quantità sufficiente di cellule per l'esecuzione di analisi di citometria a flusso.
    2. Misurare tutti i punti di tempo di riprogrammazione desiderati da singoli pozzi, in quanto questo è un test punto finale. Aspirare al largo della fibroblasti Media dal desiderato bene. Lavare una volta con D-PBS.
    3. Aspirare fuori il lavaggio D-PBS. Aggiungere 1 ml di 0,05% soluzione di tripsina-EDTA al pozzo da testare. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    4. Dopo l'incubazione, dissociate le cellule in singole cellule svuotando la sospensione cellulare 1 ml contro la superficie del pozzo e trasferire la sospensione in un tubo da 15 ml. Utilizzare 3 ml di D-PBS per lavare via tutte le cellule rimanenti dal pozzo e aggiungerli alla conica da 15 ml. Usare 10 ml di ulteriori D-PBS per diluire ulteriormente la soluzione cella nel tubo conico.
    5. Centrifugare le cellule a 200 xg per 2 min. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di DMEM / F-12 medie. Eseguire una conta di cellule necessario per creare una sospensione cellulare standard che è inferiore a 1 x 10 6 cellule / ml.
    6. Preparare ciascuna aliquota di / negative anticorpi direttamente coniugati positivi di scelta in 1 ml di DMEM / F-12 medio per inferiori a 1 x 10 6 cellule / ml utilizzando le seguenti combinazioni: SSEA4 coniugati con un fluorocromo verde fluorescente (1: 200) con CD44 coniugato a PE-Cy5, o CD44 coniugato a un fluorocromo verde fluorescente e SSEA4 coniugato ad una di vasta fluorescente fluoroforo rosso. covaregli anticorpi con la sospensione cellulare per 45 min a temperatura ambiente.
    7. Aspirare la soluzione di anticorpo primario e lavare due volte con pre-riscaldato DMEM / F-12 di media.
    8. Aspirare il lavaggio finale e risospendere del pellet di cellule in 1 ml di D-PBS. Pipettare il contenuto di ciascuna sospensione in tubi FACS individuali.
    9. Utilizzando i controlli negativi adeguati (controlli non colorati e isotipo), verificare il corretto profilo in avanti e scatter laterale e le tensioni sul citometro. Impostare le tensioni dei fluorofori corrispondenti secondo parametri macchia singoli iniziali, tale che i fluorofori verdi sono attivati ​​dal laser blu e segnali acquisiti nel canale BL1, mentre rosso lontano fluoroforo fluorescenti e PE-Cy5 fluoroforo sono attivati ​​dal laser rosso e segnali acquisiti nel canale RL1. Acquisire la popolazione doppia colorazione per ogni punto di tempo.
    10. Analizzare i file di FC per ogni punto di tempo utilizzando il software di analisi appropriata e utilizzare l'editor di ARRAdati ESN per osservare il turno di espressione della popolazione nel corso del tempo.
    11. Seguire i passaggi da 5.1.1 a 5.1.6, se l'ordinamento delle cellule è desiderato in diversi momenti. Utilizzare le combinazioni fluoroforo appropriate a seconda della configurazione del laser del cell sorter da utilizzare.
    12. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere il pellet cellulare in 1 ml di tampone di ordinamento cella. Impostare il cell sorter per le impostazioni di inoltro e scatter lato corretto utilizzando un controllo senza macchia. Utilizzare i singoli controlli macchiati per configurare le impostazioni corrette per ogni fluoroforo.
    13. Utilizzare un piccolo campione della sospensione a doppio macchiato cellulare; selezionare le 2 popolazioni da ordinare e assegnare la rispettiva carica per garantire la corretta raccolta delle cellule ordinati.
    14. Aggiungere 200 pl di mezzo di recupero delle cellule nei tubi di raccolta per garantire che la sospensione cellulare filtrate ammortizzato e protetto al momento dello smistamento. Raccolto il numero voglia di cellule e di trasferire su nuovi piatti IMEF contenenti frescoly preparato medio di recupero.
    15. Modificare il medium seguente notte di incubazione con il mezzo di recupero. Le colture devono essere successivamente nutriti e di routine diversi passaggi utilizzando medie HPSC contenente penicillina / streptomicina (100 unità / ml concentrazione finale).

6. Analisi degli endpoint

  1. Terminal fosfatasi alcalina (AP) La colorazione
    1. Utilizzare terminale cromogenico colorazione AP per correlare gli eventi cinetici e morfologici osservati con efficienze di riprogrammazione finali.
    2. Dopo 21 giorni di riprogrammazione, rimuovere il terreno di coltura dal pozzo da colorare con il terminale macchia AP e lavare una volta con 200 mM Tris-HCl (pH 8,0).
    3. Preparare la quantità appropriata di soluzione colorante come indicato dal manuale del costruttore in 200 mM Tris-HCl.
    4. Aspirare il lavaggio e aggiungere 2 ml di soluzione colorante preparata in ciascun pozzetto. Incubare per 20 a 30 minuti a temperatura ambiente e lontano da the luce.
    5. Aspirare la soluzione colorante e lavare una volta con 200 mM Tris HCl. Rimuovere il lavaggio e aggiungere acqua distillata prima di visualizzazione.
    6. Cattura il segnale colorimetrico utilizzando una normale macchina da presa. Contare il numero di colonie colorate positivamente a mano. Visualizzare la macchia mediante analisi fluorescente nel canale Trit-C, come la macchia è anche fluorescenti in natura ed effettuare intero ben imaging e analizzati utilizzando l'imager intero bene. Utilizzare il protocollo del produttore.

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Representative Results

Monitoraggio Cinetica Riprogrammazione citometria a flusso

CD44 è un marker fibroblasti mentre SSEA4 è un marker PSC 6,10. Come previsto da questo modello di espressione, citofluorimetria di fibroblasti BJ mostra un SSEA4 - CD44 + popolazione che facilita la creazione di cancelli quadranti in combinazione con il campione non colorato. Durante la riprogrammazione di fibroblasti DF1 con il virus Sendai, CD44 è progressivamente perso mentre SSEA4 si esprime lentamente. Al 3 ° giorno dopo trasduzione con i virus Sendai, vi è una vasta popolazione di SSEA4 - cellule CD44 + e una piccola popolazione di cellule CD44 + SSEA4 + che diventa più distinta al 7 ° giorno (Figura 1). Al 13 ° giorno, la popolazione doppio positiva transizione verso la SSEA4 + CD44 - stato. By Day 17, una grande percentuale del ceLLS in cultura sono già SSEA4 + CD44 -. Questa volta mostra corso che citometria a flusso con CD44 e SSEA4 possono essere utilizzati per monitorare la progressione e il tasso di riprogrammazione.

Un confronto quantitativo conferma che riprogrammazione di fibroblasti BJ con virus di riprogrammazione Sendai genera SSEA4 + CD44 - cellule ad una velocità diversa rispetto riprogrammazione di fibroblasti BJ (Figura 2A). I dati dimostrano che un confronto tempestivo della percentuale di SSEA4 + CD44 PSC-like - cellule ascolti la progressione della riprogrammazione. È interessante notare, al giorno 8 di DF1 fibroblasti riprogrammazione, cernita e separatamente coltura popolazione di cellule che sono nel processo di upregulating SSEA4 e downregulating CD44 genera AP + colonie 11 (Figura 2B). Al contrario, la SSEA4 originale - CD44 + popolazione genera amale minor numero di AP + colonie al giorno 21 di riprogrammazione, che è il tipico giorno della definitiva colonia. Questo suggerisce che è possibile quantificare e confrontare la popolazione transizione al fine di prevedere le differenze nella cinetica di riprogrammazione, anche prima della SSEA4 + CD44 - la popolazione è formata. Un punto importante da notare qui è che la riprogrammazione è un processo variabile dipendente da diversi fattori come ad esempio a partire popolazione di cellule somatiche, efficienza di trasduzione, media, ecc, tuttavia lo schema generale e la progressione dei marcatori di superficie di cui sopra è coerente tra i diversi esperimenti di riprogrammazione e a partire fibroblasti. L'analisi delle cinetiche di riprogrammazione può essere effettuata anche con diversi marcatori, come i recentemente identificate marcatori negativi PSC CD73 e B2M 6, nonché i marcatori PSC stabiliti CD24 12,13 e 14,15 EpCAM. Simile a CD44, CD73 e B2M sono espressi nel parfibroblasti ental BJ, ma sono inibiti durante il corso di riprogrammazione, diventando rilevabile nel iPSCs completamente riprogrammate (Figura 3A). Un citometria a flusso corso tempo utilizzando CD44 e CD73 o CD44 e CD44 B2M dimostra che e CD73 sono inibiti a un ritmo simile, mentre B2M è downregulated più veloce di CD44 (Figura 3B). In entrambi i casi, il tasso di riprogrammazione può essere osservato misurando l'accumulo della popolazione doppio negativo. In contrasto con questi marcatori PSC negativi, CD24 e EpCAM sono assenti nei fibroblasti e sono espressi in iPSCs (Figura 3A). In un citometria a flusso corso del tempo, CD24 - CD44 + e EpCAM - CD44 + fibroblasti alla fine formano popolazioni doppio negativo che in seguito la transizione in CD24 + CD44 - e EpCAM + CD44 - cellule PSC-like, rispettivamente (Figura 3B). Così, durante la riprogrammazione, entrambi marcatori PSC positivisono espressi dopo CD44 è downregulated. Analogamente a quanto è stato osservato con SSEA4 e CD44, la formazione e l'accumulo delle diverse popolazioni cellulari indicano la progressione della riprogrammazione.

Monitoraggio Riprogrammazione Utilizzando in tempo reale Imaging Analysis

L'imaging in tempo reale di riprogrammare colture dopo reseeding mostra la progressiva formazione di colonie (Figura 4A), che corrisponde ad un aumento logaritmico confluenza in contrasto di fase (Figura 4B). Confluence sotto contrasto di fase prevede quindi un'altra metrica per monitorare la riprogrammazione quantitativamente, ma comprende sia, le colonie che sono positivi per i marcatori PSC e la continua proliferazione di cellule unreprogrammed o parzialmente riprogrammate (Figura 4A, ultimo pannello). Quantificare le aree che sono state colorate per i marcatori pluripotenzaTRA-1-60, SSEA4 e AP 6,10 al giorno 21 indica che iPSCs rappresentano solo per meno della metà del totale confluenza (Figura 4B). Per misurare il progresso della riprogrammazione più rigorosamente, è possibile utilizzare una linea reporter per la riprogrammazione. Qui, i fibroblasti secondari sono stati generati dalla linea BG01v / hog ESC, che è stato progettato con un reporter OCT4-GFP 16. GFP è espressa come le cellule vengono riprogrammate e come si formano colonie (Figura 5A). Misurazione confluenza in contrasto di fase e canali verde dimostra che la confluenza GFP aumenta più lentamente della confluenza totale, e la confluenza GFP al giorno 19 è inferiore alla metà del totale confluenza (Figura 5B), ricorda TRA-1-60, SSEA4 e AP colorazione al giorno 21.

Figura 1
Figura 1. MoMonitoraggio di Progress di riprogrammazione in citometria a flusso. Parcelle Citometria a Flusso punto per DF1 fibroblasti riprogrammato con Sendai virus in condizioni di libero-Feeder. Le cellule sono state raccolte e colorate con anticorpi SSEA4 e CD44 a diversi intervalli da 3 ° giorno (D3) a Giorno 19 (D19) del processo di riprogrammazione. Culture a 9 ° giorno (D9) in poi sono stati analizzati dopo le cellule sono state reseeded a 7 giorni (D7). Trame Dot mostrano 8.000 canottiere. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
. Figura 2. Valutare Riprogrammazione Cinetica ed efficienza in condizioni di libero-Feeder (A) Grafico che mostra variazioni nelle percentuali di SSEA4 + CD44 - cellule riprogrammate dopo trasduzione DF1 fibroblasts e fibroblasti BJ con il virus Sendai. Le cellule sono state analizzate mediante citometria di flusso al giorno 3-19 post-trasduzione, con le culture a 9 ° giorno in poi sottoposti a nuova semina al Day 7. (B) Pseudo-colore citometria a flusso trame per le cellule trasdotte DF1 virus Sendai e colorate con anticorpi SSEA4 e CD44. SSEA4 -. + Cellule CD44 (cerchio nero) e le cellule SSEA4 + (cerchio rosso) sono stati ordinati al giorno 8 e permesso di crescere fino al giorno 19 prima della colorazione per la fosfatasi alcalina (rosso) Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Osservando le Riprogrammazione Cinetica di culture senza Feeder utilizzando diversi marker PSC positivo e negativo. (AD) colorazione dal vivodi culture Day-18 DF1-derivati ​​di riprogrammazione utilizzando anticorpi per i marcatori PSC positive CD24 e EpCAM e marcatori PSC negativi CD44, CD73, e B2M. I pannelli superiori si fondono i canali di fluorescenza verde e rosso, mentre i pannelli inferiori comprendono anche l'immagine a contrasto di fase. La barra di scala rappresenta 200 micron. (E) citometria a flusso trame di punti per le culture di riprogrammazione DF1-derivati ​​raccolte e colorati con gli stessi marcatori dal giorno 9 a 17 (D9 a D17) post-trasduzione. Prima di analisi, colture sono state reseeded al giorno 7. trame Dot mostrano 8.000 canottiere. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. monitoraggio Riprogrammazione Cinetica misurando Confluence totale. (A) in tempo reale iMaging di BJ fibroblasti riprogrammato con virus Sendai in condizioni di assenza di alimentazione. immagini a contrasto di fase delle stesse colonie sono state prese a 7 giorni a 19, poi a giorno 21 con colorazione aggiuntivo per CD44 e SSEA4, TRA-1-60 o AP. Barra della scala corrisponde a 400 micron. (B) Quantificazione di confluenza totale (contrasto di fase) come riprogrammazione progredisce da risemina alle 7 Giorno per Giorno 21. confluenza Totale al Giorno 21 viene confrontato con SSEA4, TRA-1-60 e il segnale AP confluenza ( canale verde). clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. Valutare riprogrammazione Cinetica misurando OCT4-GFP Confluence. (A) di immagini in tempo reale dei fibroblasti BG01v / Hog hESC derivate riprogrammate conSendai virus in condizioni di assenza di alimentazione. A contrasto di fase, fluorescenza verde e fuse le immagini delle stesse colonie sono stati generati a 7 giorni a 19. Scala bar corrisponde a 400 micron. (B) Quantificazione di confluenza totale (contrasto di fase) e confluenza OCT4-GFP (canale verde) come riprogrammazione progredisce da re-semina a 7 Giorno per Giorno 21. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Disclosures

Tutti gli autori [RHQ, JSTA, KS, e UL] sono dipendenti di Thermo Fisher Scientific, che produce alcuni dei reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano Chad MacArthur per le discussioni utili.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10569-010
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin Thermo Fisher Scientific 16141-061
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher Scientific 11140-050
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red  Thermo Fisher Scientific 25300-054
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts Thermo Fisher Scientific A24903
Attachment Factor Protein (1x) Thermo Fisher Scientific S-006-100
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 10565-018
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828010
2-Mercaptoethanol (55 mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023
Collagenase, Type IV, powder Thermo Fisher Scientific 17104-019
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red  Thermo Fisher Scientific 12563-011
DPBS, no calcium, no magnesium  Thermo Fisher Scientific 14190-144
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413302
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0264
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575-020
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) Thermo Fisher Scientific 15260-037
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15630-080
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Thermo Fisher Scientific 15140-122
InSolution Y-27632 EMD Millipore 688001
CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A1378001
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A16517
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228
BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal ATCC CRL-2522
DF1 Adult Human Dermal Fibroblast Thermo Fisher Scientific N/A
BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells Thermo Fisher Scientific R7799-105
IncuCyte ZOOM Essen BioScience
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) Thermo Fisher Scientific SSEA421
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) Thermo Fisher Scientific A14810
SSEA-4 Antibody (MC813-70) Thermo Fisher Scientific 41-4000
TRA-1-60 Antibody (cl.A) Thermo Fisher Scientific  41-1000
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate Thermo Fisher Scientific A27094
CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging Thermo Fisher Scientific A25528
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) Thermo Fisher Scientific RM-5700 (no longer available)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Thermo Fisher Scientific  A-11029
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific  A-11007
Alkaline Phosphatase Live Stain Thermo Fisher Scientific A14353
TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging Thermo Fisher Scientific A25618
CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate Thermo Fisher Scientific MHCD2401
beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) Thermo Fisher Scientific A15737
EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) Thermo Fisher Scientific A15755
CD73 / NT5E Antibody (7G2) Thermo Fisher Scientific 41-0200
VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit Vector Laboratories SK-5100
Zeiss Axio Observer.Z1 microscope  Carl Zeiss 491912-0003-000
FlowJo Data Analysis Software FLOJO, LLC N/A
Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser Thermo Fisher Scientific Use Attune NXT 
S3e\ Cell Sorter (488/561 nm) BIO-RAD 1451006
Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap Corning 352235
Falcon 15 ml, high-clarity, dome-seal screw cap Corning 352097
Falcon T-75 Flask Corning 353136
Falcon T-175 Flask Corning 353112
Falcon 6-well dish Corning 353046
Heraeus Heracell CO2 Rolling Incubator Thermo Fisher Scientific 51013669
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 ml AM12450
HulaMixer Sample Mixer 15920D

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Cinetica Misurazione e Tempo reale visualizzazione della riprogrammazione somatica
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Quintanilla Jr., R. H., Asprer, J., Sylakowski, K., Lakshmipathy, U. Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming. J. Vis. Exp. (113), e54190, doi:10.3791/54190 (2016).

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