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Developmental Biology

Cinética Medición y visualización en tiempo real de la reprogramación somática

Published: July 30, 2016 doi: 10.3791/54190
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Life Sciences Solutions, Thermo Fisher Scientific

Summary

El protocolo presentado en este estudio se describen métodos para la monitorización en tiempo real de la progresión de la reprogramación a través de la medición cinética de marcadores de células madre pluripotentes positivas y negativas utilizando citometría de flujo análisis. El protocolo también incluye la evaluación basada en la obtención de imágenes de la morfología y la expresión del indicador o marcador durante la generación de IPSC.

Introduction

Las células madre pluripotentes inducidas derivados de los pacientes (iPSCs) son herramientas prometedoras para la terapia celular y la detección de drogas. Proporcionan una fuente autóloga de las células para la terapia. Además, abarcan un amplio conjunto de antecedentes genéticos, lo que permite un detallado análisis in vitro de enfermedades genéticas más allá de lo que las actuales líneas de células madre embrionarias (ESC) permitiría. Los avances recientes han conducido al desarrollo de varios métodos para la generación de iPSCs, incluyendo reprogramación con el virus Sendai, los plásmidos episomales o mRNAs 1,2. En particular, los diferentes métodos de reprogramación se asocian con diferentes niveles de eficiencia y seguridad, y es probable que difieran en otros aspectos que influyen en su idoneidad para diversas aplicaciones. Con la disponibilidad de una variedad de tecnologías de reprogramación, se ha convertido en importante desarrollar métodos para evaluar el proceso de reprogramación. La mayoría de los métodos existentes se basan en la inspección cualitativa de la morfología o la tincióncon colorantes y anticuerpos específicos de células madre. Un método recientemente desarrollado hace uso de la prensa de fluorescencia lentiviral que son sensibles a los miRNAs-PSC específico o ARNm específicos de células diferenciadas 3. Tales métodos de control facilitan la selección y optimización de técnicas de reprogramación para diferentes situaciones. Por ejemplo, CDy1 se ha utilizado como una sonda fluorescente para los primeros iPSCs con el fin de seleccionar moduladores de reprogramación 4. La capacidad de observar y comparar diferentes experimentos de reprogramación también es crítica para lograr una mejor comprensión del proceso en sí. Por ejemplo, ahora se sabe que algunos tipos de células somáticas son más fáciles de reprogramar que otros 5, y que las células pasan por estados intermedios durante la reprogramación 6-8. Desafortunadamente, los mecanismos que subyacen el proceso de reprogramación todavía no están completamente entendidos y en consecuencia, las diferencias exactas entre los métodos de reprogramación también quedan por defined. Por lo tanto, los métodos de supervisión, evaluación, y comparando los eventos de reprogramación siguen siendo crítico para el campo de células madre.

Los métodos descritos en este protocolo permiten el seguimiento y la evaluación del proceso de reprogramación e ilustran cómo estas técnicas se pueden utilizar para comparar diferentes conjuntos de reactivos de reprogramación. El primer enfoque implica la citometría de flujo se analiza usando combinaciones de anticuerpos contra (PSC) marcadores de células madre pluripotentes positivo y negativo. El segundo enfoque parejas en tiempo real de imágenes y la medición de la confluencia total (porcentaje de área de superficie cubierta por las células) y confluencia de señales de marcación (por ciento del área de superficie cubierta por las señales fluorescentes).

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Protocol

1.Solution y Mediana Preparación

  1. Membrana basal Matrix (purificada a partir de Engelbreth-Holm-Swarm tumor)
    1. descongelar lentamente la matriz de la membrana basal (5 ml) en hielo a 4 ° C durante la noche.
    2. Diluir la solución madre de 1: 1 con 5 ml de hielo frío, DMEM estéril / medio F-12 en un pre-refrigerada tubo cónico estéril, 15 ml. Dispensar alícuotas en pre-refrigerados, tubos de microcentrífuga de 1,5 ml estériles y almacenar inmediatamente a -20 ° C.
    3. Antes de su uso, el congeladas descongelar 1: 1 de la membrana basal de la matriz alícuota de la noche a 4 ° C. En el momento de su uso, diluir aún más la 1: 1 alícuota otra 50 veces con hielo frío, DMEM estéril / F-12 de medio a una dilución final de 1: 100.
    4. Añadir la cantidad apropiada de la solución 1: matriz de membrana basal diluida 100 a la de cultivo de tejido apropiado vasos (Tc) y se incuba a 37 ° C durante 1 hr. Típicamente, utilizar 3 ml de la solución de matriz de membrana basal diluido para recubrir una placa de TC of 20 cm 2 de superficie, cubrir todos los otros tipos de platos TC / placas a razón de 0,15 ml de matriz diluida por cm2 de superficie. Aspirar la solución restante antes de la adición de cualquier medio de cultivo y las células.
  2. Medio de fibroblastos
    1. Descongelar una botella 100 ml de ES Calificado suero bovino fetal (ES-FBS) a 4 ° C durante la noche.
    2. Añadir 50 ml de la descongelado ES-FBS y 5 ml de MEM no esenciales solución de aminoácidos (1x) a 445 ml de medio DMEM. Esterilizar los componentes combinados a través de un filtro de 0,22 micras y almacenar el medio a 4 ° C durante un máximo de 4 semanas.
  3. IMEF Medio
    1. Descongelar una botella 100 ml de ES-FBS a 4 ° C durante la noche.
    2. Añadir 50 ml de la FBS descongelado, 5 ml de MEM solución de aminoácidos no esenciales (1X), y 500 l de 2-mercaptoetanol a 445 ml de medio DMEM.
    3. Esterilizar los componentes combinados a través de un filtro de 0,22 micras y almacenar el meDium a 4 ° C durante un máximo de 4 semanas.
  4. Solución de factor básico de crecimiento de fibroblastos (FGF-b)
    1. Añadir 10 l de suero de reemplazo a 990 l de D-PBS y se mezcle con la pipeta hacia arriba y abajo.
    2. Añadir 1 ml de la solución de reemplazo de suero 1% (v / v) a un vial de 10 mg liofilizado b-FGF. Mezclar bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
    3. Alícuota de la solución b-FGF / ml 10 g en 200 ml de alícuotas en tubos de microcentrífuga y se almacena a -20 ° C hasta que se necesite para un máximo de 4 semanas.
  5. Humana de la célula madre pluripotente (HPSC) Mediano
    1. Descongelar una botella de 100 ml de suero de reemplazo a 4 ° C durante la noche.
    2. Añadir 100 ml de la Sustitución de suero descongelado, 5 ml de MEM solución de aminoácidos no esenciales (1X), y 500 l de 2-mercaptoetanol a 395 ml de medio DMEM / F-12.
    3. Esterilizar los componentes combinados a través de un filtro de 0,22 micras y almacenar el medio en4 ° C durante un máximo de 4 semanas.
    4. En el momento de uso, pre-calentar el medio HPSC a 37 ° C y complementar con 4 ng / ml de bFGF.
  6. IMEF medio condicionado (CM)
    1. Añadir 18 ml de 0,1% de gelatina a un matraz T-175 cultura y se incuba a 37 ° C durante 1 hr.
    2. Eliminar la solución de gelatina 0,1% después de una hora de incubación. Añadir 9,1 x 10 6 fibroblastos embrionarios de ratón mitóticamente inactivadas (IMEF) en 45 ml de medio IMEF e incubar en el incubador a 37ºC durante la noche.
    3. Después de la incubación durante la noche, se elimina el medio viejo IMEF y lavar una vez con 25 ml de D-PBS durante 5 min a temperatura ambiente.
    4. Aspirar el D-PBS lavar y añadir 90 ml de medio de HPSC pre-calentado, suplementado con 4 ng / ml de bFGF. Incubar en la incubadora a 37 ° durante exactamente 24 horas.
    5. Después de 24 horas de incubación, se elimina el medio asépticamente HPSC del matraz IMEF y esterilizar a través de un filtro de 0,22 micras. Alícuota en 50 ml tubos cónicos y se congelan a -20 ° C hasta que se necesite. IMEF CM se puede almacenar durante un máximo de 6 meses a -20 ° C.
    6. Añadir otros 90 ml de medio de HPSC pre-calentado suplementado con 4 ng / ml de bFGF al matraz IMEF. Incubar en la incubadora a 37 ° durante exactamente 24 horas. Repita la recolección de CM para un máximo de 7 días.
    7. En el momento de uso, pre-calentar el IMEF-CM a 37 ° C y complementar con 4 ng / ml de bFGF.
  7. E8 Medio
    1. Descongelar un suplemento de 10 ml E8 a 4 ° C durante la noche.
    2. Eliminar 10 ml del medio basal E8 y añadir asépticamente los contenidos del suplemento E8 descongelado al medio basal restante. Mezclar bien y esterilizar a través de un filtro de 0,22 micras. Almacenar el medio completo a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas.
    3. En el momento de uso, pre-calentar la alícuota del medio a ser usado a temperatura ambiente. No se recomienda comprobar la validez de tibia E8 medio a 37 ° C.
  8. Así celularrting Buffer
    1. Preparar tampón de clasificación fresco justo antes de clasificación de células mediante la adición de solución de EDTA (1 mM de concentración final), tampón HEPES (concentración 25 mM final) solución de penicilina / estreptomicina (100 unidades / ml de concentración final) y albúmina de suero bovino (1% de concentración final) en Phosphate Buffered Saline de Dulbecco (calcio y magnesio libre).
    2. Esterilizar el tampón a través de un filtro de 0,22 micras antes de usar.
  9. Cell Sorting Recuperación Medio
    1. Modificar 50 ml de fibroblastos Medium mediante la adición de penicilina / estreptomicina (100 unidades / ml de concentración final) y Rock inhibidor Y-27632 (10 mM de concentración final). Pre-calentar este medio para 37 ° C antes de la siembra de las células clasificadas.

2. Sendai mediada por reprogramación de fibroblastos humanos

  1. 24 horas antes de la transducción con los virus Sendai, la semilla de los fibroblastos a una densidad de 2 × 10 5 cells por pocillo en los pocillos de una placa deseados TC de 6 pocillos.
  2. Realizar la transducción en el día 0 de la siguiente manera.
    1. Pre-caliente 2 ml de Medio de fibroblastos en un baño de agua a 37 °. Retire un conjunto de tubos de virus Sendai de -80 ° C y almacenamiento de descongelar cada tubo uno a la vez mediante la inmersión en primer lugar la parte inferior del tubo en un baño de agua de 37 ° 5 - 10 seg, y luego retire el tubo del agua cuarto de baño y deje que se descongele a temperatura ambiente. Una vez descongelado, centrifugar brevemente el tubo y colocarlo inmediatamente en hielo.
    2. Utilizan virus Sendai comercialmente segunda generación mediante la adición de los volúmenes apropiados (según la COA) para cada uno de los tubos con el fin de alcanzar la siguiente multiplicidad de infección (MOI) de 1 ml de pre-calentado de fibroblastos de medio por pocillo para ser transducidas como seguir : KOS = 5 x 10 6 CIU, hc-Myc = 5 x 10 6 CIU, hKlf4 = 3 x 10 6 CIU.
    3. Mezclar bien la solución viral pipeteando la mezcla suavemente hacia arriba y hacia abajo. compleTA El siguiente paso dentro de 5 minutos.
    4. Aspirar el fibroblasto Medio desde el pozo de los fibroblastos para ser reprogramado, y añadir 1 ml de la solución viral a cada pocillo. Colocar las células en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora y se incuba durante la noche.
  3. Después de la incubación durante la noche, Aspirar el medio de transducción y desechar el medio de edad correctamente (solución de lejía al 10% durante 30 min). Reemplazar con 2 ml de pre-calentado fibroblastos mediano y continuar para cultivar las células transducidas.
  4. Cultivar las células durante 6 días más, reemplazando el medio viejo con frescos de fibroblastos medio cada dos días.
    Nota: No paso de las células reprogramadas hasta 7 días después de la transducción.
  5. Día 6: preparar platos para IPSC Generación
    1. Para la generación de IPSC alimentador-dependiente, añadir solución de gelatina 1,5 ml de 0,1% a cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos (TC) y se incuba a 37 ° C durante 1 hr.
    2. Retire la gelatina 0,1% en lo quelución después de 1 h de incubación. Añadir 3 x 10 5 fibroblastos embrionarios de ratón mitóticamente inactivadas-(IMEF) en 2 ml de medio IMEF por pocillo y se incuban en la incubadora a 37ºC durante la noche.
    3. Para la generación de IPSC alimentador independiente, añadir 1,5 ml de la matriz de la membrana basal diluido (dilución 1: 100) a cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos (TC) y se incuba a 37 ° C durante 1 hr.
  6. Siete días después de la transducción, la cosecha de los fibroblastos transducidos y les re-placa en las placas de cultivo pre-hechos para la generación de colonias IPSC.
    1. Aspirar el medio de cultivo normal de los fibroblastos, y se lavan las células una vez con 2 ml de D-PBS.
    2. Aspirar el D-PBS lavar y añadir 0,5 ml de pre-calentado 0,05% de tripsina / EDTA. Se incuban las células durante 3 - 5 min a 37 ° C.
    3. Cuando las células se han redondeado hacia arriba, añadir 2 ml de pre-calentado fibroblastos mediana en cada pocillo para detener la tripsina. Desalojar las células de la bien pipeteando suavemente tél medio a través de la superficie del plato. Recoger la suspensión celular en un tubo de centrífuga cónico de 15 ml.
    4. Centrifugar las células a 200 xg durante 2 min. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en 2 ml fresco, precalentado fibroblastos Medio.
    5. Contar las células mediante el método deseado (hemocitómetro o un contador de células automatizado) y semillas de las placas de cultivo preparadas previamente con 5 x 10 4 células para las condiciones de alimentación dependiente y 1 x 10 5 células para las condiciones de alimentación independiente, por pocillo de una 6 -Bueno plato y se incuba a 37 ° C, 5% de CO2 durante la noche.
    6. Después de la incubación durante la noche, cambiar el medio a medio HPSC, medio E8 o medio acondicionado-IMEF, dependiendo de la aplicación. Reemplazar el viejo medio con medio fresco todos los días a partir de entonces.

3. Sendai reprogramación de células madre BGO1v hOct4-GFP embrionarias Reportero humano (células madre) Derivado fibroblastos secundarios

  1. derive fibroblastos humanos secundarios de la línea de células madre reportero BG01V hOct4-GFP de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente 9.
  2. Dos días antes de la transducción, la placa BGO1v / HOG fibroblastos deriva en dos pocillos de una placa de 6 pocillos a 2 x 10 5 células por pocillo, utilizando fibroblastos Medio.
    1. En el día de la transducción, pre-cálidos 2 ml de fibroblastos de medio a 37 ° C.
    2. Retire un conjunto de tubos de Sendai desde el -80 ° C almacenamiento. Retirar los viales de la bolsa y descongelar cada tubo de una en una por inmersión primero la parte inferior del tubo en un baño de agua a 37 ° C durante 5 a 10 segundos, después de lo cual, permitir que los tubos se descongele a temperatura ambiente. Una vez descongelado, centrifugar brevemente el tubo y colocarlo inmediatamente en hielo.
    3. Añadir los volúmenes indicados de cada uno de los tres tubos de Sendai (ver la CoA para el volumen apropiado) a 2 ml de Medio de fibroblastos, previamente calentada a 37 ° C y mezclar a fondo la solución viral mediante la pipeta hacia arriba y hacia abajo. Complete el siguiente step dentro de 5 min.
      Nota: Para este experimento, una MOI de 5: 5: 6 se utilizó.
    4. Aspirar el de fibroblastos El medio de los pocillos de fibroblastos para ser transducidas. Añadir 1 ml de la suspensión viral a cada uno de dos pocillos para ser transducidas. Colocar las células en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora y se incuba durante la noche.
    5. Después de la incubación durante la noche, se elimina el medio de transducción y disponer de ella correctamente (solución de lejía al 10% durante 30 min). Reemplazar cada pocillo con 2 ml de pre-calentado de fibroblastos Medium y continuar para cultivar las células transducidas.
  3. Cultivar las células durante 6 días más, los cambios en el medio de edad, con frescos de fibroblastos medio cada dos días.
    1. Siete días después de la transducción, la cosecha de los fibroblastos transducidos y volver a placa en las placas de cultivo pre-hechos para la generación de colonias IPSC.
    2. Aspirar el medio de cultivo normal de los fibroblastos, y se lavan las células una vez con 2 ml de D-PBS.
    3. Aspirar la DPBS lavar y añadir 0,5 ml de pre-calentado 0,05% de tripsina / EDTA. Se incuban las células durante 3 - 5 min a 37 ° C.
    4. Cuando las células se han redondeado hacia arriba, añadir 2 ml de pre-calentado fibroblastos mediana en cada pocillo para detener la tripsina. Desalojar las células de la bien pipeteando suavemente el medio a través de la superficie del plato. Recoger la suspensión celular en un tubo de centrífuga cónico de 15 ml.
    5. Centrifugar las células a 200 x g durante 2 min. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en una cantidad apropiada de fresco, precalentado fibroblastos Medio.
    6. Contar las células mediante el método deseado (hemocitómetro o un contador de células automatizado).
    7. Sembrar las células transducidas a una densidad de 1 x 10 5 células por pocillo de una matriz de membrana basal recubiertas con placa de 6 pocillos y se incuban en un 37 ° C, 5% de CO2 durante la noche.
  4. Después de la incubación durante la noche, cambiar el medio a IMEF Medio Acondicionado, suplementado con 10 ng / ml de b-FGF. Vuelva a colocar el medio de edad con frescos IMEF CM todos los días a partir de entonces.
  5. Tres semanas después de la transducción, diseccionar mecánica y transferir las colonias deseadas para la expansión clonal o utilizar para el análisis.

4. Imágenes de células vivas de fibroblastos reprogramación

  1. Monitoreo en tiempo real
    1. 7 días después de la transducción con el kit de reprogramación Sendai, semilla de la cantidad deseada de las células en placas de 6 pocillos con los sistemas de media y matriz deseada como se describió previamente. Colocar las placas sembradas dentro de la cámara, que se encuentra en un incubador humidificado a 37 ° C, y 5% de CO 2.
    2. Ajuste el software de imagen para capturar imágenes completas así de cada pozo individual en un intervalo establecido (cada 6 - 8 horas) de captura de imágenes continua durante los siguientes 14 días de acuerdo con el protocolo del fabricante.
      Nota: Los ajustes de imagen de contraste de fase se seleccionan para la reprogramación normales para evaluar la progresión de la colonia. En el casode BG01V / HOG deriva reprogramación de fibroblastos, lo mejor es capturar imágenes de contraste de fase y en el canal verde fluorescente como la reactivación del reportero Oct4-GFP endógena se puede seguir todo el proceso de reprogramación.
    3. Cambiar el medio todos los días, puede ser medio HPSC, medio E8, o IMEF-CM, dependiendo del experimento, como se describe anteriormente a partir del día 8 a 21 después de la transducción. Los pozos pueden ser analizados para la formación de colonias mediante inmunofluorescencia indirecta.
    4. Al final del experimento en el día 19 a 21, eliminar el medio de cultivo de cada pocillo que se probaron con anticuerpos para los fibroblastos y los marcadores de células de elección madre.
    5. Lavar cada pocillo una vez con 2 ml de / media pre-calentado DMEM F-12.
    6. Preparar alícuotas de cada uno de los pares de positivos / negativos primarios de anticuerpos en 1 ml de DMEM / F-12 medio de la siguiente manera: anti-ratón SSEA4 (1: 200) y anti-CD44 de rata (01:50), anti-ratón TRA-1- 60 (1: 200) y anti-CD44 de rata (1:50), y fosfatasa alcalina Live la mancha (1:50) y CD44 anti-rata (1:50). Añadir las soluciones de anticuerpos primaria 1 ml a cada pocillo correspondiente. Incubar a 37 ° C durante 45 min.
    7. Aspirar la solución de anticuerpo primario y lavar dos veces con DMEM precalentado / F-12 medio.
    8. Preparar soluciones de anticuerpo secundario (1 ml para cada pocillo) usando anticuerpo de cabra anti-ratón de Alexa Fluor 488 conjugado secundario (1: 500) para la fluorescencia verde y de cabra anti-rata de Alexa Fluor 594 conjugado secundario (1: 500) para la fluorescencia roja en medio DMEM / F-12. Añadir a cada pocillo después del lavado final. Se incuban los anticuerpos secundarios durante 30 minutos a 37 ° C.
      Nota: Debido a alcalino de fosfatasa en vivo de la mancha (APLS) señal transitoria, la incubación primaria anti-CD44 se debe realizar primero por sí mismo y la APLS debe añadirse en el momento de la incubación con los anticuerpos secundarios
    9. Después de la incubación el anticuerpo secundario, aspirar fuera de la solución y se lava dos veces con DMEM / F-12 medio. Añadir DMEM precalentado fresco / F-12medio a cada pocillo antes de la captura de la imagen final.
    10. Configurar el software de imágenes para adquirir imágenes así enteras de cada pocillo utilizando los tres parámetros de análisis: contraste de fases, fluorescencia verde y roja de fluorescencia. Crear imágenes con distintos aumentos y crear películas a intervalos con el software para controlar el crecimiento y la expresión del marcador. Utilice el protocolo del fabricante.
    11. Utilizando el software de análisis, evaluar confluencia del bien con el tiempo en contraste de fase y en unidades fluorescentes verdes para el / la reprogramación BG01V Hog.
  2. Monitoreo de reprogramación Intermediarios de marcadores de superficie celular usando
    1. Supervisar los eventos de reprogramación en diferentes puntos de tiempo mediante el sondeo de los platos de reprogramación en diversos puntos de tiempo con anticuerpos contra marcadores positivos / negativos diferentes de células madre con el fin de controlar el proceso de reprogramación. culturas Probe cada 2 a 3 días dependiendo de la disponibilidad de repeticiones. Sondear el display de reprogramaciónhes en los días 19 a 21 utilizando la estrategia de doble tinción para identificar colonias totalmente reprogramadas IPSC y colonias parcialmente reprogramadas a partir de los patrones de tinción.
    2. En el punto de tiempo deseado, aspirar fuera el medio de crecimiento normal de cada pocillo que se probaron con anticuerpos para los marcadores de elección.
    3. Lavar cada pocillo una vez con 2 ml de / media pre-calentado DMEM F-12.
    4. Preparar alícuotas de cada uno de los pares de positivos / negativos primarios de anticuerpos en 1 ml de DMEM / F-12 medio de la siguiente manera: SSEA4 conjugado con el fluoróforo verde fluorescente (1: 200), TRA-1-60 conjugado con el fluoróforo verde fluorescente (1: 50), Alkaline vivo de la mancha (1: 500), CD24 conjugado con un fluoróforo fluorescente verde (01:50), B2M conjugado con un fluoróforo fluorescente verde (01:50), EpCAM conjugado con un fluoróforo fluorescente verde (01:50) , ratón CD73 (1: 100) que se sondeó con anticuerpos anti-ratón anticuerpo secundario conjugado con un fluoróforo verde fluorescente (1: 500), y CD44 de rata (1:50) que se sondeó conanti-rata anticuerpo secundario conjugado con el fluoróforo fluorescente de color rojo (1: 500). Añadir las soluciones de anticuerpos primaria 1 ml a cada pocillo correspondiente. Incubar a 37 ° C durante 45 min.
    5. Aspirar la solución de anticuerpo primario y lavar dos veces con medio / F12 pre-calentado DMEM.
    6. Para los anticuerpos no conjugados, proceder a la utilización de un método 2 a paso mediante la preparación de las soluciones de anticuerpo secundario apropiado e incubar durante 30 min a 37 ° C. Confirman que los anticuerpos secundarios son los huéspedes primarios y no tiene reacciones cruzadas. Realizar pasos adicionales de lavado como se ha descrito anteriormente.
    7. Después de todos los lavados adecuados, se añade medio fresco pre-calentado DMEM / F-12 a cada pocillo antes de la captura de la imagen final.
    8. Capturar las imágenes fluorescentes bajo el filtro adecuado en el aumento de 100X utilizando un microscopio de fluorescencia y analizar las imágenes utilizando el software de análisis disponibles.

5. Medición de la reprogramación Cinética Uso de Flujo Cytometry

  1. Quantitative Kinetic Medición de la reprogramación utilizando anticuerpos de superficie celular
    1. Antes de la reprogramación, establecer el número apropiado de experimentos de reprogramación para cada punto de tiempo. Para medir la cinética de reprogramación durante los primeros 7 días de reprogramación, transducción individuales son realizadas para cada punto de tiempo deseado. Para los puntos de tiempo después del día 7, sembrar suficientes puntos de tiempo de alimentación independiente para seguir midiendo los eventos de reprogramación. Un solo pocillo de una placa de 6 pocillos producirá una cantidad suficiente de células para llevar a cabo análisis de citometría de flujo.
    2. Medir todos los puntos de tiempo de reprogramación deseados de pozos individuales, ya que este es un ensayo de punto final. Aspirar el fibroblasto Medium del pozo deseada. Lavar una vez con D-PBS.
    3. Aspirar el lavado de D-PBS. Añadir 1 ml de solución de 0,05% de tripsina-EDTA al pozo para ser probado. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
    4. Después de la incubación, dissocicomieron las células en células individuales mediante el lavado de la suspensión de células 1 ml contra la superficie del pozo, y transferir la suspensión a un tubo cónico de 15 ml. Utilice 3 ml de D-PBS para lavar cualquier resto de las células del pozo y añadirlos a la cónico de 15 ml. Usar 10 ml de adicional D-PBS para diluir aún más la solución de células en el tubo cónico.
    5. Centrifugar las células a 200 xg durante 2 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de medio DMEM / F-12. Realizar un recuento de células como sea necesario para crear una suspensión de células estándar que es de menos de 1 x 10 6 células / ml.
    6. Prepare cada alícuota de negativos anticuerpos positivos / directamente conjugados de elección en 1 ml de DMEM / F-12 de menos de 1 x 10 6 células / ml usando las siguientes combinaciones: SSEA4 conjugados con un fluoróforo fluorescente verde (1: 200) con CD44 conjugado con PE-Cy5, o CD44 conjugado con un fluoróforo fluorescente verde y SSEA4 conjugado con un fluoróforo fluorescente roja FAR-. Incubarlos anticuerpos con la suspensión de células durante 45 min a temperatura ambiente.
    7. Aspirar la solución de anticuerpo primario y lavar dos veces con pre-calentado medio DMEM / F-12.
    8. Aspirar el lavado final y volver a suspender el sedimento celular en 1 ml de D-PBS. Pipetear el contenido de cada suspensión en tubos FACS individuales.
    9. El uso de los controles negativos apropiados (controles sin teñir y isotipo), confirme la dispersión frontal y lateral perfil y tensiones adecuada en el citómetro. Ajustar las tensiones de los fluoróforos correspondientes de acuerdo con los parámetros de manchas individuales iniciales, de tal manera que los fluoróforos verdes se activan por el láser azul y señales adquiridas en el canal BL1, mientras fluoróforo fluorescente rojo lejano y fluoróforo PE-Cy5 son activados por el láser rojo y señales adquiridas en el canal RL1. Adquirir la población con doble tinción para cada punto de tiempo.
    10. Analizar los archivos de FCS para cada punto de tiempo usando el software de análisis apropiado y usar el editor para ARRAlos datos de ESB para observar el cambio de expresión de la población a través del tiempo.
    11. Siga los pasos 5.1.1 a 5.1.6, si se desea la clasificación de células a diferentes puntos de tiempo. Use las combinaciones de fluoróforos apropiados de acuerdo a la configuración láser de la clasificador de células para ser utilizado.
    12. Tras el lavado final, re-suspender el sedimento celular en 1 ml del tampón de clasificación de células. Configurar el clasificador de células para la configuración adecuada dispersión frontal y lateral con un control sin teñir. Utilice los controles manchadas individuales para establecer los ajustes adecuados para cada fluoróforo.
    13. Use una pequeña muestra de la suspensión de doble manchado celular; seleccionar las 2 poblaciones que se ordenan y asignar el cargo respectivo, para poder recoger de las células clasificadas.
    14. Añadir 200 l de medio de recuperación de las células en los tubos de recogida para asegurar que la suspensión de células según se amortigua y protegido en el momento de la clasificación. Se recoge el número de deseo de las células y transferir a nuevos platos que contienen IMEF frescaLy preparar el medio de recuperación.
    15. Cambiar el medio después de la incubación durante la noche con el medio de recuperación. Los cultivos deben ser posteriormente alimentados y rutinariamente a pases utilizando medio HPSC que contiene penicilina / estreptomicina (100 unidades / ml de concentración final).

6. Análisis de seguridad

  1. Terminal de fosfatasa alcalina (AP) tinción
    1. Utilice terminal de tinción AP cromogénico para correlacionar eventos cinéticos y morfológicos observados con eficiencias de reprogramación finales.
    2. Después de 21 días de reprogramación, eliminar el medio de cultivo del pozo que se tiñó con tinción de terminales AP y lavar una vez con 200 mM Tris-HCl (pH 8,0).
    3. Preparar la cantidad apropiada de solución de tinción según las indicaciones del manual del fabricante en 200 mM Tris-HCl.
    4. Aspirar el lavado y añadir 2 ml de la solución de tinción preparado a cada pocillo. Incubar durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente y lejos del THe luz.
    5. Aspirar la solución de tinción y lavar una vez con Tris-HCl 200 mM. Retire el lavado y añadir agua destilada antes de su visualización.
    6. Capturar la señal colorimétrica usando una cámara de imagen normal. Contar el número de colonias teñidas positivamente con la mano. Visualizar la mancha utilizando el análisis de fluorescencia en el canal Trit-C, como la mancha también es fluorescente en la naturaleza y realizar las imágenes de toda pocillos y se analizaron utilizando el generador de imágenes de todo el bien. Utilice el protocolo del fabricante.

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Representative Results

Monitoreo Cinética reprogramación mediante citometría de flujo

CD44 es un marcador de fibroblastos mientras SSEA4 es un marcador PSC 6,10. Como se esperaba de este patrón de expresión, citometría de flujo de los fibroblastos BJ muestra un SSEA4 - CD44 + población que facilita la creación de puertas de cuadrante en combinación con la muestra sin teñir. Durante la reprogramación de fibroblastos DF1 con los virus Sendai, CD44 se pierde gradualmente mientras SSEA4 se expresa lentamente. En el día 3 después de la transducción con los virus Sendai, hay una gran población de SSEA4 - células CD44 + y una pequeña población de células + SSEA4 CD44 + que se hace más distinta en el día 7 (Figura 1). En el día 13, la población de doble positivo transición hacia la SSEA4 + CD44 - estado. Para el día 17, un gran porcentaje de la ceLLS en cultivo ya están SSEA4 + CD44 -. Este curso de tiempo muestra que citometría de flujo con CD44 y SSEA4 se pueden utilizar para controlar la progresión y la tasa de reprogramación.

Una comparación cuantitativa confirma que la reprogramación fibroblastos BJ con virus Sendai de reprogramación genera SSEA4 + CD44 - células a una tasa diferente que una reprogramación de BJ fibroblastos (Figura 2A). Los datos demuestran que una comparación rápida del porcentaje de PSC-como SSEA4 + CD44 - células seguimiento de la progresión de la reprogramación. Curiosamente, en el día 8 de reprogramación DF1 de fibroblastos, clasificación y por separado el cultivo de la población de células que se encuentran en el proceso de la regulación al alza de SSEA4 y la regulación negativa de CD44 genera AP + colonias 11 (Figura 2B). En contraste, el SSEA4 original - población CD44 + genera amUCH menor número de colonias AP + en el día 21 de reprogramación, que es el día típico de fin de cuentas colonia. Esto sugiere que es posible cuantificar y comparar la población de transición con el fin de predecir diferencias en la cinética de reprogramación, incluso antes de la SSEA4 + CD44 - se forma la población. Un punto importante a destacar aquí es que la reprogramación es un proceso dependiente de la variable de varios factores como el inicio de la población de células somáticas, la eficacia de transducción, media, etc. Sin embargo, el patrón general y la progresión de los marcadores de superficie descrito anteriormente es consistente entre diferentes experimentos de reprogramación y a partir de fibroblastos. El análisis de la cinética de reprogramación también se puede hacer con diferentes marcadores, tales como los marcadores recién identificados negativos PSC CD73 y B2M 6, así como los marcadores establecidos PSC CD24 12,13 y 14,15 EPCAM. De manera similar a CD44, CD73 y B2M se expresan en el parental fibroblastos BJ, pero están regulados a la baja durante el curso de la reprogramación, llegando a ser indetectable en células iPS totalmente reprogramadas (Figura 3A). Una citometría de flujo evolución en el tiempo usando CD44 y CD73 o CD44 y B2M demuestra que CD44 y CD73 están regulados a la baja a un ritmo similar, mientras que B2M es downregulated más rápido que CD44 (Figura 3B). En ambos casos, la tasa de reprogramación puede observarse mediante la medición de la acumulación de la población doble negativo. En contraste con estos marcadores PSC negativos, CD24 y EPCAM están ausentes en los fibroblastos y se expresan en iPSCs (Figura 3A). En una citometría de flujo evolución en el tiempo, CD24 - CD44 + y EPCAM - CD44 + fibroblastos finalmente forman las poblaciones de doble negativo que posteriormente transición en CD24 + CD44 - CD44 + y EpCAM - células PSC-como, respectivamente (Figura 3B). Así, durante la reprogramación, ambos marcadores positivos PSCse expresan CD44 después se downregulated. De manera similar a lo observado con SSEA4 y CD44, la formación y acumulación de las diferentes poblaciones celulares indican la progresión de la reprogramación.

La reprogramación de seguimiento de Uso del análisis de imágenes en tiempo real

Formación de imágenes en tiempo real de la reprogramación de cultivos después de la resiembra muestra la formación gradual de las colonias (Figura 4A), lo que corresponde a un incremento logarítmico de confluencia bajo contraste de fases (Figura 4B). Confluencia bajo contraste de fase por lo tanto proporciona otra métrica para el seguimiento de reprogramación cuantitativamente, sino que engloba tanto, las colonias que son positivas para los marcadores del PSC y la continua proliferación de las células reprogramadas unreprogrammed o parcialmente (Figura 4A, el último panel). La cuantificación de las áreas que han sido teñidas para marcadores de pluripotenciaTRA-1-60, SSEA4 y AP 6,10 en el día 21 indica que iPSCs sólo representan menos de la mitad del total de la confluencia (Figura 4B). Para medir el progreso de reprogramación más estricta, es posible utilizar una línea reportero de reprogramación. Aquí, los fibroblastos secundarios se generaron a partir de la línea de BG01V / ESC HOG, que ha sido diseñado con un reportero de Oct4-GFP 16. GFP se expresa como se reprograman las células y como se forman colonias (Figura 5A). La medición de confluencia bajo contraste de fase y los canales verde demuestra que la confluencia de GFP aumenta más lentamente que la confluencia total y la confluencia de GFP en el día 19 es menos de la mitad del total de la confluencia (Figura 5B), que recuerda a TRA-1-60, SSEA4 y AP tinción en el día 21.

Figura 1
Figura 1. Monitoring el Progreso de la reprogramación mediante citometría de flujo. Parcelas Citometría de Flujo Dot para DF1 Los fibroblastos reprogramados con el virus Sendai en condiciones libres de alimentador. Se recogieron las células y se tiñeron con anticuerpos SSEA4 y CD44 en diferentes intervalos de Día 3 (D3) hasta el día 19 (D19) del proceso de reprogramación. Los cultivos en el día 9 (D9) en adelante se analizaron después las células se sembraron de nuevo en el día 7 (D7). Las gráficas de puntos muestran 8.000 maillots. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
. Figura 2. Evaluación de reprogramación Cinética y Eficiencia en condiciones libres de alimentador (A) Gráfico que muestra los cambios en el porcentaje de CD44 + SSEA4 - células reprogramadas después de la transducción de DF1 fibroblasts y fibroblastos BJ con los virus de Sendai. Las células se analizaron mediante citometría de flujo en el día 3 y 19 después de la transducción, con cultivos en el día 9 en adelante sometidos a la resiembra en el Día 7. (B) Pseudo-color de la citometría de flujo parcelas para las células transducidas DF1 virus Sendai y teñidas con anticuerpos CD44 y SSEA4. SSEA4 -. Células CD44 + (círculo negro) y células SSEA4 + (círculo rojo) fueron ordenados en el día 8 y se dejan crecer hasta el día 19 antes de la tinción de fosfatasa alcalina (roja) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Cinética de observación reprogramación de cultivos libres de alimentador, utilizando diferentes marcadores PSC positivo y negativo. (AD) tinción Vivode cultivos derivados-DF1 Día-18 de reprogramación utilizando anticuerpos para los marcadores CD24 positivas PSC y EPCAM y marcadores PSC negativos CD44, CD73, y B2M. Los paneles superiores se unen los canales de fluorescencia verde y rojo, mientras que los paneles inferiores también incluyen la imagen de contraste de fase. La barra de escala representa 200 micras. (E) La citometría de flujo gráficos de puntos para los cultivos derivados de reprogramación-DF1 cosechadas y teñidas utilizando los mismos marcadores desde el día 9 al 17 (D9 a D17) después de la transducción. Antes del análisis, los cultivos se sembraron de nuevo en el día 7. Las gráficas de puntos muestran 8.000 maillots. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Seguimiento de reprogramación Cinética midiendo Confluencia total. (A) en tiempo real iforjamagia de fibroblastos BJ reprogramado con virus Sendai en condiciones libres de alimentador. imágenes de contraste de fase de las mismas colonias se tomaron en el día 7 a 19, a continuación, en el día 21 con la tinción adicional para CD44 y SSEA4, TRA-1-60 o AP. La barra de escala corresponde a 400 micras. (B) Cuantificación de confluencia totales (contraste de fases) como reprogramación progresa de resiembra en el día 7 al día 21. confluencia total en el día 21 se compara con SSEA4, TRA-1-60 y la confluencia señal de AP ( canal verde). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Evaluación de reprogramación Cinética midiendo Oct4-GFP Confluencia. (A) de imágenes en tiempo real de los fibroblastos derivados de células madre BG01V / HOG reprogramadas conSendai virus en condiciones libres de alimentador. El contraste de fases, la fluorescencia verde y se fusionó imágenes de la misma colonias se generaron en el Día 7 a 19. Escala de barra corresponde a 400 micras. (B) Cuantificación de confluencia total (contraste de fase) y la confluencia OCT4-GFP (canal verde) como reprogramación progresa de la re-siembra en el día 7 al día 21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Disclosures

Todos los autores [RHQ, JSTA, KS, y UL] son ​​empleados de Thermo Fisher Scientific, que produce algunos de los reactivos e instrumentos utilizados en este artículo.

Acknowledgments

Los autores agradecen a Chad MacArthur útil para los debates.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10569-010
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin Thermo Fisher Scientific 16141-061
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher Scientific 11140-050
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red  Thermo Fisher Scientific 25300-054
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts Thermo Fisher Scientific A24903
Attachment Factor Protein (1x) Thermo Fisher Scientific S-006-100
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 10565-018
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828010
2-Mercaptoethanol (55 mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023
Collagenase, Type IV, powder Thermo Fisher Scientific 17104-019
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red  Thermo Fisher Scientific 12563-011
DPBS, no calcium, no magnesium  Thermo Fisher Scientific 14190-144
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413302
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0264
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575-020
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) Thermo Fisher Scientific 15260-037
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15630-080
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Thermo Fisher Scientific 15140-122
InSolution Y-27632 EMD Millipore 688001
CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A1378001
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A16517
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228
BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal ATCC CRL-2522
DF1 Adult Human Dermal Fibroblast Thermo Fisher Scientific N/A
BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells Thermo Fisher Scientific R7799-105
IncuCyte ZOOM Essen BioScience
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) Thermo Fisher Scientific SSEA421
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) Thermo Fisher Scientific A14810
SSEA-4 Antibody (MC813-70) Thermo Fisher Scientific 41-4000
TRA-1-60 Antibody (cl.A) Thermo Fisher Scientific  41-1000
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate Thermo Fisher Scientific A27094
CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging Thermo Fisher Scientific A25528
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) Thermo Fisher Scientific RM-5700 (no longer available)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Thermo Fisher Scientific  A-11029
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific  A-11007
Alkaline Phosphatase Live Stain Thermo Fisher Scientific A14353
TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging Thermo Fisher Scientific A25618
CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate Thermo Fisher Scientific MHCD2401
beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) Thermo Fisher Scientific A15737
EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) Thermo Fisher Scientific A15755
CD73 / NT5E Antibody (7G2) Thermo Fisher Scientific 41-0200
VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit Vector Laboratories SK-5100
Zeiss Axio Observer.Z1 microscope  Carl Zeiss 491912-0003-000
FlowJo Data Analysis Software FLOJO, LLC N/A
Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser Thermo Fisher Scientific Use Attune NXT 
S3e\ Cell Sorter (488/561 nm) BIO-RAD 1451006
Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap Corning 352235
Falcon 15 ml, high-clarity, dome-seal screw cap Corning 352097
Falcon T-75 Flask Corning 353136
Falcon T-175 Flask Corning 353112
Falcon 6-well dish Corning 353046
Heraeus Heracell CO2 Rolling Incubator Thermo Fisher Scientific 51013669
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 ml AM12450
HulaMixer Sample Mixer 15920D

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Quintanilla Jr., R. H., Asprer, J., Sylakowski, K., Lakshmipathy, U. Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming. J. Vis. Exp. (113), e54190, doi:10.3791/54190 (2016).

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