Summary
Das Protokoll in dieser Studie präsentierten beschreibt Verfahren zur Echtzeit-Überwachung der Reprogrammierung Progression über die kinetische Messung von positiven und negativen pluripotenten Stammzellmarker Durchflusszytometrie-Analyse. Das Protokoll enthält auch die Imaging-basierte Beurteilung der Morphologie und Marker oder Reporter-Expression während der iPS-Generation.
Introduction
Patienten stammende induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) sind vielversprechende Werkzeuge für Zelltherapie und Wirkstoff-Screening. Sie bieten eine autologe Quelle von Zellen für die Therapie. Darüber hinaus umfassen sie ein sehr breites Spektrum an genetischen Hintergründen, eine detaillierte In - vitro - Analyse von genetischen Erkrankungen jenseits dessen, was Strom an embryonalen Stammzellen (ESC) Linien erlauben würde , zu ermöglichen. Jüngste Fortschritte haben zur Entwicklung verschiedener Methoden geführt iPSCs zur Erzeugung, einschließlich Umprogrammierung mit Sendai - Virus, episomalen Plasmiden oder mRNAs 1,2. Bemerkenswerterweise sind verschiedene Verfahren der Reprogrammierung zugeordnet Ebenen der Effizienz und Sicherheit Variation und sind wahrscheinlich auf andere Weise zu unterscheiden, die ihre Eignung für verschiedene Anwendungen beeinflussen. Mit der Verfügbarkeit von einer Vielzahl von Umprogrammierung Technologien hat es wichtig geworden, Methoden zu entwickeln, um die Reprogrammierung zu bewerten. Die meisten existierenden Verfahren stützen sich auf die qualitative Kontrolle der Morphologie oder Färbungmit Stammzell-spezifische Farbstoffe und Antikörper. Eine kürzlich entwickelte Methode nutzt lentiviralen Fluoreszenz - Reporter , die empfindlich auf PSC-spezifischen miRNAs oder differenzierte zellspezifischen mRNAs 3. Eine solche Überwachungsmethoden, die Auswahl und Optimierung der Reprogrammierung Techniken für unterschiedliche Situationen erleichtern. Zum Beispiel wurde als fluoreszierende Sonde für frühe iPSCs um zu screenen für Umprogrammierung Modulatoren 4 CDY1 verwendet. Die Fähigkeit, zu beobachten und verschiedene Umprogrammierung Experimente vergleichen ist auch entscheidend für sich ein besseres Verständnis des Verfahrens zu gewinnen. Zum Beispiel ist es nun bekannt , dass einige somatische Zelltypen leichter sind als andere umprogrammieren 5, und dass die Zellen gehen durch Zwischenzustände während 6-8 Neuprogrammierung. Leider sind die Mechanismen, die die Reprogrammierung Verfahren zugrundeliegenden noch nicht vollständig verstanden und folglich bleiben die genauen Unterschiede zwischen Umprogrammierung Methoden auch als defined. So Methoden zur Überwachung, Bewertung und Neuprogrammierung Ereignisse Vergleich weiterhin für die Stammzell-Feld kritisch zu sein.
Die Verfahren in diesem Protokoll beschrieben ermöglichen die Überwachung und Beurteilung der Umprogrammierung und zeigen, wie diese Techniken verwendet werden können, verschiedene Sätze von Umprogrammierung Reagenzien zu vergleichen. Der erste Ansatz beinhaltet Durchflusszytometrie analysiert Kombinationen von Antikörpern gegen positive und negative pluripotenten Stammzellen (PSC) Marker. Der zweite Ansatz Paare Echtzeit-Bildgebung und die Messung der Gesamt Einmündung (die Fläche Prozent Oberfläche durch die Zellen bedeckt) und Einmündung der Markierungssignale (Bereich Prozent Oberfläche durch die fluoreszierenden Signale abgedeckt).
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Protocol
1.Solution und Medium Vorbereitung
- Basalmembranmatrix (Gereinigt aus Engelbreth-Holm-Swarm - Tumor)
- tauen langsam Basalmembranmatrix (5 ml) auf Eis bei 4 ° C über Nacht.
- Von der Stammlösung 1: 1 mit 5 ml eiskaltem, sterilem DMEM / F-12-Medium in einem sterilen, vorgekühlte 15 ml konischen Röhrchen. Dispense Aliquots in vorgekühlte 1,5 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen und sofort bei -20 ° C.
- Vor Gebrauch, tauen die gefrorenen 1: 1 Basalmembranmatrix aliquoten über Nacht bei 4 ° C. Zur Zeit der Verwendung, verdünnt ferner das 1: 1-Aliquot ein anderes 50-fach mit eiskaltem, sterilem DMEM / F-12-Medium zu einer Endverdünnung von 1: 100.
- Fügen Sie die entsprechende Menge des 1: 100 verdünnt Basalmembranmatrix Lösung auf die entsprechende Gewebekultur (TC) Gefäße und Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde. Normalerweise verwenden 3 ml der verdünnten Basalmembranmatrix Lösung zur Beschichtung eines TC Schale of 20 cm 2 Oberfläche beschichten alle anderen Arten von TC Geschirr / Platten bei einem Verhältnis von 0,15 ml verdünntem Matrix pro cm 2 Oberfläche. Aspirieren die verbleibende Lösung vor der Zugabe irgendeines Kulturmedium und Zellen.
- Fibroblast Medium
- Tauen Sie eine 100 ml Flasche ES Qualified Fetal Bovine Serum (ES-FBS) bei 4 ° C über Nacht.
- 50 ml der aufgetauten ES-FBS und 5 ml MEM Non-Essential Aminosäurelösung (1x) zu 445 ml DMEM Medium. Sterilisieren der kombinierten Komponenten durch ein 0,22 um Filter und zu speichern, das Medium bei 4 ° C für bis zu 4 Wochen.
- Imef Medium
- Tauen Sie eine 100-ml-Flasche von ES-FBS über Nacht bei 4 ° C.
- 50 ml des aufgetauten FBS, 5 ml MEM Non-Essential Aminosäurelösung (1x) und 500 ul 2-Mercaptoethanol bis 445 ml DMEM Medium.
- Sterilisieren der kombinierten Komponenten durch ein 0,22-um-Filter und speichern Sie die mirdium bei 4 ° C für bis zu 4 Wochen.
- Basic Fibroblast Growth Factor - Lösung (b-FGF)
- In 10 ul Serumersatz bis 990 & mgr; l D-PBS und gründlich mischen durch Pipettieren von oben und unten.
- Fügen Sie die 1 ml der 1% (v / v) Serum Replacement-Lösung ein Fläschchen von 10 ug gefriergetrocknet, b-FGF. Gründlich mischen durch vorsichtiges Pipettieren nach oben und unten.
- Aliquot der 10 ug / ml b-FGF-Lösung in 200 ul-Aliquoten in Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C bis zu bis zu 4 Wochen benötigt.
- Humanen pluripotenten Stammzellen (HPSC) Medium
- Tauen über Nacht eine 100 ml Flasche Serumersatz bei 4 ° C.
- 100 ml der aufgetauten Serum Replacement, 5 ml MEM Non-Essential Aminosäurelösung (1x) und 500 ul 2-Mercaptoethanol bis 395 ml DMEM / F-12-Medium.
- Sterilisieren der kombinierten Komponenten durch ein 0,22 um Filter und speichern das Medium bei4 ° C für bis zu 4 Wochen.
- Zum Zeitpunkt der Verwendung, pre-warm das HPSC Medium auf 37 ° C und ergänzt mit 4 ng / ml bFGF.
- Imef konditioniertem Medium (CM)
- Hinzufügen 18 ml 0,1% Gelatine zu einem T-175 Kulturkolben und inkubieren bei 37 ° C für 1 Stunde.
- Entfernen Sie die 0,1% Gelatine-Lösung nach einer Stunde Inkubation. In 9,1 x 10 6 mitotisch inaktivierten embryonalen Maus - Fibroblasten (Imef) in 45 ml Imef Medium und Inkubation im 37 ° C - Inkubator über Nacht.
- Nach Inkubation über Nacht entfernen Sie die alte Imef Medium und waschen Sie einmal mit 25 ml D-PBS für 5 min bei Raumtemperatur.
- Absaugen der D-PBS waschen und 90 ml vorgewärmten HPSC Medium hinzufügen, mit 4 ng / ml bFGF ergänzt. Inkubieren in dem 37 ° C Inkubator für genau 24 Stunden.
- Nach 24 h Inkubation entfernen aseptisch das HPSC Medium aus dem Imef Kolben und zu sterilisieren durch einen 0,22 um-Filter. Aliquotieren in 50 ml konische Röhrchen und gefrier bei -20 ° C bis benötigt. Imef CM kann für bis zu 6 Monate bei -20 ° C gelagert werden.
- Fügen Sie weitere 90 ml vorgewärmten HPSC Medium mit 4 ng / ml bFGF zum Imef Kolben ergänzt. Inkubieren in dem 37 ° C Inkubator für genau 24 Stunden. Wiederholen Sie die Ernte von CM für bis zu 7 Tage.
- Zum Zeitpunkt der Verwendung, pre-warm die Imef-CM auf 37 ° C und ergänzt mit 4 ng / ml bFGF.
- E8 Medium
- Tauen Sie über Nacht ein 10 ml E8 Zuschlag bei 4 ° C.
- Entfernen Sie 10 ml des E8 Basalmedium und aseptisch den Inhalt der aufgetauten E8 Ergänzung zu den übrigen Grundmedium. Gut mischen und zu sterilisieren durch ein 0,22-um-Filter. Lagern Sie das komplette Medium bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen.
- Zum Zeitpunkt der Verwendung, vorge erwärmen das Aliquot des Mediums auf Raumtemperatur verwendet werden. Es ist nicht Vorwärmen E8 Medium bis 37 ° C empfohlen.
- Zelle , sorting Buffer
- Vorbereitung frischen Sortierpuffer kurz bevor durch Zugabe von EDTA-Lösung (1 mM Endkonzentration), HEPES-Puffer (25 mM Endkonzentration) Penicillin / Streptomycin-Lösung (100 Einheiten / ml Endkonzentration) und Rinderserumalbumin (1% Endkonzentration) Zellsortierung in Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (Calcium und Magnesium frei).
- Sterilisieren der Puffer durch einen 0,22 um Filter vor der Verwendung.
- Zellsortierung Recovery - Medium
- Ändern 50 ml Fibroblast Medium durch Zusatz von Penicillin / Streptomycin (100 Einheiten / ml Endkonzentration) und Rock-Inhibitor Y-27632 (10 & mgr; M Endkonzentration). Vorwärmen dieses Medium auf 37 ° C vor der sortierten Zellen Animpfen.
2. Sendai Mediated Reprogrammierung von menschlichen Fibroblasten
- 24 h vor den Sendai Viren Transduktion, die Fibroblasten bei einer Dichte von 2 × 10 5 c Seedingells pro Vertiefung in die gewünschten Vertiefungen einer 6-Well-Platte TC.
- Führen Sie die Übertragung am Tag 0 wie folgt.
- Vorwärmen 2 ml Fibroblast Medium in einem 37 ° C Wasserbad. Entfernen Sie einen Satz von Sendai-Virus-Röhrchen von -80 ° C Lagerung und auftauen jedes Rohr ein zu einer Zeit, indem zunächst in einem 37 ° C Wasserbad den Boden der Röhre eingetaucht wird 5 - 10 sec, und entfernen Sie den Schlauch aus dem Wasser Bad und lassen sie es bei Raumtemperatur auftauen. Nach dem Auftauen Zentrifuge kurz das Rohr und legen Sie sie sofort auf Eis.
- Verwenden Sie im Handel zweiten Generation Sendai-Viren durch die entsprechenden Volumina Zugabe (gemäß der COA) für jedes der Rohre, um die folgende Vielzahl der Infektion (MOI) auf 1 ml vorgewärmtes Fibroblast Medium zu erreichen pro Vertiefung werden transduzierten wie folgt : KOS = 5 x 10 6 CIU, hc-Myc = 5 x 10 6 CIU, hKlf4 = 3 x 10 6 CIU.
- Gründlich mischen, um die Virus-Lösung durch Pipettieren der Mischung sanft auf und ab. complete den nächsten Schritt innerhalb von 5 min.
- Saugen Sie das Fibroblast Medium aus dem Brunnen der Fibroblasten neu programmiert werden, und 1 ml der viralen Lösung zu jedem Well. Legen Sie die Zellen in einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator und Inkubation über Nacht.
- das Übertragungsmedium und entsorgen Sie das alte Medium richtig (10% Bleichlösung für 30 min) Nach der Inkubation über Nacht absaugen. Ersetzen mit 2 ml vorgewärmtes Fibroblast Medium und weiterhin die transduzierten Zellen zur Kultur.
- Kultur die Zellen für 6 Tage, jeden zweiten Tag das alte Medium mit frischem Fibroblast Medium zu ersetzen.
Hinweis: Nicht Passage die umprogrammiert Zellen bis 7 Tage Übertragung stellen. - Tag 6: Bereiten Sie Geschirr für iPS - Generation
- Für Feeder-abhängige iPSC Generation, fügen Sie 1,5 ml 0,1% Gelatine-Lösung in jede Vertiefung einer 6-Well-Gewebekultur (TC) Schale und Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde.
- Entfernen Sie die 0,1% Gelatine solution nach 1 Stunde Inkubation. In 3 x 10 5 mitotisch inaktivierten embryonalen Maus - Fibroblasten (Imef) in 2 ml Imef Medium pro Vertiefung und Inkubation im 37 ° C - Inkubator über Nacht.
- Für Feeder unabhängige iPSC Generation, fügen Sie 1,5 ml verdünntem Basalmembranmatrix (1: 100 Verdünnung) zu jeder Vertiefung einer 6-Well-Gewebekultur (TC) Schale und Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde.
- Sieben Tage nach der Transduktion, Ernte der transduzierten Fibroblasten und Wieder plattieren sie auf die vorgefertigten Kulturschalen für iPSC Kolonieerzeugung.
- Absaugen dem normalen Kulturmedium aus den Fibroblasten, und waschen Sie die Zellen einmal mit 2 ml D-PBS.
- Absaugen der D-PBS waschen und 0,5 ml vorgewärmten 0,05% Trypsin / EDTA hinzufügen. Inkubieren der Zellen für 3 bis 5 min bei 37 ° C.
- Wenn die Zellen abgerundet, 2 ml vorgewärmtes Fibroblast Medium in jede Vertiefung Trypsinierung zu stoppen. Vertreiben Sie die Zellen aus dem Bohrloch durch vorsichtiges Pipettieren ter Mediums über die Oberfläche der Schale. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15-ml konischen Zentrifugenröhrchen.
- Zentrifugieren der Zellen bei 200 · g für 2 min. Den Überstand aspirieren, und wieder die Zellen in 2 ml frisch, vorgewärmte Fibroblast Medium.
- Zählen Sie die Zellen die gewünschte Methode (Hämozytometer oder automatisierten Zellzähler) und Saatgut die vorbereiteten Kulturschalen mit 5 x 10 4 Zellen für Feederabhängigen Bedingungen und 1 x 10 5 Zellen für Feederunabhängigen Bedingungen pro Vertiefung einer 6 bei 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator über Nacht -Well Gericht und inkubiert.
- Nach der Inkubation über Nacht ändern, das Medium zu HPSC Medium, E8 Medium oder Imef-konditionierten Medien, je nach Anwendung. Ersetzen Sie das alte Medium mit frischem Medium jeden Tag danach.
3. Sendai Reprogrammierung von BGO1v hOct4-GFP-Reporter humanen embryonalen Stammzellen (hES) Abgeleitet Secondary Fibroblasten
- derive sekundären menschlichen Fibroblasten aus dem BG01v hOct4-GFP - Reporter hESC Linie gemäß dem Verfahren beschrieben zuvor 9.
- Zwei Tage vor der Transduktion Platte BGO1v / HOG abgeleiteten Fibroblasten in zwei Vertiefungen einer 6-Well - Platte mit 2 × 10 5 Zellen pro Vertiefung unter Verwendung von Fibroblast Medium.
- Am Tag der Transduktion vorwärmen 2 ml Fibroblast Medium auf 37 ° C.
- Entfernen Sie eine Reihe von Sendai Röhrchen aus dem -80 ° C Lagerung. Entfernen der Fläschchen aus dem Beutel und auftauen jedes Rohr eine zu einem Zeitpunkt, indem zunächst in einem 37 ° C Wasserbad den Boden des Röhrchens für das Eintauchen von 5 bis 10 sec, wonach die Küvetten auf Raumtemperatur auftauen. Nach dem Auftauen Zentrifuge kurz das Rohr und legen Sie sie sofort auf Eis.
- Fügen Sie die angegebenen Mengen von jedem der drei Sendai Rohre (die CoA für das entsprechende Volumen zu sehen) auf 2 ml Fibroblast Medium, auf 37 ° C vorgewärmt und gründlich die virale Lösung mischen durch Pipettieren von oben und unten. Füllen Sie das nächste step innerhalb von 5 min.
Anmerkung: Für dieses Experiment wurde eine MOI von 5: 5: 6 verwendet wurde. - Absaugen Fibroblast Medium aus den Vertiefungen der Fibroblasten transduziert werden. 1 ml der Virussuspension auf jedes von zwei Vertiefungen transduziert werden. Legen Sie die Zellen in einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator und Inkubation über Nacht.
- Nach Inkubation über Nacht, entfernen Sie das Übertragungsmedium und ordnungsgemäß entsorgen (10% Bleichlösung für 30 min). Ersetzen Sie jede Vertiefung mit 2 ml vorgewärmtes Fibroblast Medium und weiterhin die transduzierten Zellen zur Kultur.
- Kultur die Zellen für 6 Tage, jeden zweiten Tag das alte Medium mit frischem Fibroblast Medium zu verändern.
- Sieben Tage nach der Transduktion, der transduzierten Fibroblasten ernten und neu plattieren sie auf die vorgefertigten Kulturschalen für iPSC Kolonie Generation.
- Absaugen dem normalen Kulturmedium aus den Fibroblasten, und waschen Sie die Zellen einmal mit 2 ml D-PBS.
- Absaugen DPBS waschen und 0,5 ml vorgewärmten 0,05% Trypsin / EDTA hinzufügen. Inkubieren der Zellen für 3 bis 5 min bei 37 ° C.
- Wenn die Zellen abgerundet, 2 ml vorgewärmtes Fibroblast Medium in jede Vertiefung Trypsinierung zu stoppen. Verdrängen die Zellen aus dem Bohrloch durch vorsichtiges Pipettieren des Mediums über die Oberfläche der Schale. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15-ml konischen Zentrifugenröhrchen.
- Zentrifugieren der Zellen bei 200 x g für 2 min. die Zellen in einer geeigneten Menge frischen, vorgewärmten Fibroblast Medium ansaugen den Überstand und erneut suspendieren.
- Zählen Sie die Zellen unter Verwendung des gewünschten Methode (Hämozytometer oder automatisierten Zellzähler).
- Samen der transduzierten Zellen bei einer Dichte von 1 x 10 5 Zellen pro Vertiefung einer Basalmembranmatrix -beschichteten 6-Well - Platte und Inkubation in einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator über Nacht.
- Nach der Inkubation über Nacht das Medium ändern konditioniertem Medium zu Imef, ergänzt mit 10 ng / ml b-FGF. Ersetzen Sie das alte Medium mit frischem Imef CM jeden Tag danach.
- Drei Wochen nach der Transduktion, mechanisch sezieren und die gewünschten Kolonien für klonalen Expansion übertragen oder für die Analyse verwendet werden.
4. Live Cell Imaging von Fibroblast Reprogrammierung
- Echtzeitüberwachung
- 7 Tage nach der Transduktion mit der Neuprogrammierung Kit Sendai, die gewünschte Menge an Zellen auf 6-Well-Schalen mit den gewünschten mittleren und Matrixsystemen Samen wie zuvor beschrieben. Legen Sie die ausgesäten Gerichte in der Imager, befindet sich in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Legen Sie die Imaging-Software ganz gut Bilder jedes einzelnen gut in einem festgelegten Intervall zu erfassen (alle 6 - 8 h) kontinuierliches Bild für die nächsten 14 Tage die Erfassung nach dem Protokoll des Herstellers.
Hinweis: Die Phasenkontrast-Bildeinstellungen für normale Umprogrammierung ausgewählt werden Kolonie Progression zu bewerten. Im Fallevon BG01v / hog Fibroblasten Umprogrammierung abgeleitet, ist es am besten Bilder im Phasenkontrast und in dem grün fluoreszierenden Kanal wie die erneute Aktivierung der endogenen OCT4-GFP-Reporter zu erfassen können während des gesamten Umprogrammierung verfolgt werden. - Ändern des Mediums täglich, kann es HPSC Medium, E8 Medium oder Imef-cm, je nach Experiment, wie zuvor beschrieben von Tag 8-21 post-Transduktion. Die Vertiefungen können ferner zur Koloniebildung durch indirekte Immunofluoreszenz analysiert.
- Am Ende des Versuchs am Tag 19 bis 21, entfernen Sie das Kulturmedium aus jeder Vertiefung mit Antikörpern für Fibroblasten und Stammzellmarker der Wahl sondiert werden.
- Waschen Sie jede Vertiefung einmal mit 2 ml vorgewärmten DMEM / F-12-Medium.
- Bereiten Aliquots jeder positive / negative primären Antikörperpaare in 1 ml DMEM / F-12-Medium wie folgt: Anti-Maus SSEA4 (1: 200) und anti-Ratte-CD44 (1:50), anti-Maus-TRA-1- 60 (1: 200) und anti-Ratte-CD44 (1:50), und alkalische Phosphatase Live Stain (1:50) und anti-Ratte-CD44 (1:50). Fügen Sie die 1 ml primärer Antikörper-Lösungen in jede Vertiefung entspricht. für 45 min bei 37 ° C inkubieren.
- Absaugen der primären Antikörperlösung und wäscht zweimal mit vorgewärmten DMEM / F-12-Medium.
- Bereiten sekundären Antikörperlösungen (1 ml für jede Vertiefung) unter Verwendung von Ziege-anti-Maus-Alexa Fluor 488 konjugierten sekundären (1: 500) für grüne Fluoreszenz und Ziege-Anti-Ratten-Alexa Fluor 594 konjugierten sekundären (1: 500) für rote Fluoreszenz in DMEM / F-12-Medium. In jede Vertiefung nach der letzten Wäsche. Inkubieren der Sekundärantikörper für 30 min bei 37 ° C.
Anmerkung: Wegen Alkaline Phosphatase Live-Stain des (APLS) transientes Signal, das anti-CD44 primären Inkubation zuerst von selbst durchgeführt werden sollte, und die APLS sollten mit den Sekundärantikörper zum Zeitpunkt der Inkubation zugegeben werden, - Im Anschluss an den sekundären Antikörper Inkubation die Lösung absaugen und waschen zweimal mit DMEM / F-12-Medium. In frischem vorgewärmten DMEM / F-12Medium zu jeder Vertiefung vor der endgültigen Bildaufnahme.
- Stellen Sie den Scanner-Software zu erwerben ganze auch Bilder von jeder Vertiefung mit allen drei Scan-Parameter: Phasenkontrast, grüne Fluoreszenz und rote Fluoreszenz. Erstellen Sie Bilder mit verschiedenen Vergrößerungen und Zeitraffer-Filme mit der Software zu erstellen Wachstum und Marker Ausdruck zu überwachen. Verwenden Protokoll des Herstellers.
- Mit Hilfe der Analysesoftware auswerten Einmündung der auch im Laufe der Zeit im Phasenkontrast und in grün fluoreszierenden Einheiten für die BG01v / hog Neuprogrammierung.
- Überwachung Reprogrammierung Intermediates mit Zelloberflächenmarker
- Überwachen Sie Umprogrammierung Ereignisse zu verschiedenen Zeitpunkten durch das Antasten der Umprogrammierung Gerichte zu verschiedenen Zeitpunkten mit Antikörpern gegen verschiedene Stammzell positive / negative Marker, um die Reprogrammierung zu überwachen. Probe Kulturen alle 2 bis 3 Tage, je nach Verfügbarkeit von Replikaten. Sonde, die die Reprogrammierung disvollständig umprogrammiert iPSC Kolonien zu identifizieren und teilweise neu programmiert Kolonien auf der Grundlage der Färbemustern hes am Tag 19 bis 21 die Doppelfärbung Strategie.
- Zum Zeitpunkt gewünscht absaugen normalem Wachstumsmedium aus jeder Vertiefung off mit Antikörpern für die Marker der Wahl sondiert werden.
- Waschen Sie jede Vertiefung einmal mit 2 ml vorgewärmten DMEM / F-12-Medium.
- Bereiten Aliquots jeder positive / negative primären Antikörperpaare in 1 ml DMEM / F-12-Medium wie folgt: SSEA4 dem grünen fluoreszierenden Fluorophor konjugiert ist (1: 200), TRA-1-60 konjugiert mit dem grün fluoreszierenden Fluorophor (1: 50), Alkaline Live-Stain (1: 500), konjugiert an ein CD24 green fluorescent Fluorophor (1:50), B2M konjugiert mit einem grün fluoreszierenden Fluorophor (1:50), EpCAM, konjugiert mit einem grün fluoreszierenden Fluorophor (1:50) , Maus CD73 (1: 100), die mit anti-Maus-Sekundär-Antikörper, konjugiert mit einem grün fluoreszierenden Fluorophor (1: 500) untersucht wurde, und Ratten-CD44 (1:50), die mit sondiertsekundäre anti-Ratte-Antikörper an die roten Fluoreszenz Fluorophor (500 1) konjugiert. Fügen Sie die 1 ml primärer Antikörper-Lösungen in jede Vertiefung entspricht. für 45 min bei 37 ° C inkubieren.
- Absaugen der primären Antikörperlösung und wäscht zweimal mit vorgewärmten DMEM / F12-Medium.
- Für unkonjugierten Antikörper, gehen über ein 2-Schritt-Verfahren, indem die entsprechenden Sekundärantikörperlösungen Herstellung und Inkubation für 30 min bei 37 ° C zu verwenden. Bestätigen Sie, dass Sekundärantikörper zu den primären Hosts sind und nicht kreuzreagieren. Führen zusätzliche Waschschritte wie zuvor beschrieben.
- Nach allen geeigneten Waschungen, fügen Sie frisch vorgewärmten DMEM / F-12-Medium zu jeder Vertiefung vor der endgültigen Bildaufnahme.
- Erfassen Sie die Fluoreszenzbilder unter dem entsprechenden Filter bei 100-facher Vergrößerung eines Fluoreszenzmikroskop und zu analysieren, die Bilder zur Verfügung Analyse-Software.
5. Messung der Reprogrammierung Kinetics Mit Flow-Cytometry
- Quantitative Kinetische Messung der Reprogrammierung Zelloberfläche unter Verwendung von Antikörpern
- Vor der Umprogrammierung, stellen Sie die entsprechende Anzahl der Reprogrammierung Experimente für jeden Zeitpunkt auf. Für Kinetik der Reprogrammierung in den ersten 7 Tagen nach der Umprogrammierung der Messung einzelner Transduktionen sind für jeden gewünschten Zeitpunkt durchgeführt. Für Zeitpunkten nach der 7. Tag, Samen ausreichend Feeder-unabhängige Zeitpunkten fortzusetzen, um die Neuprogrammierung Ereignisse zu messen. Eine einzelne Vertiefung einer 6-Well-Platte werden ausreichende Mengen an Zellen liefern Durchflusscytometrieanalyse zur Durchführung.
- Messen Sie alle gewünschten Umprogrammierung Zeitpunkten aus einzelnen Vertiefungen, da dies ein Endpunkt-Assay ist. Absaugen Fibroblast Medium von der gewünschten gut. Wasche einmal mit D-PBS.
- Absaugen der D-PBS zu waschen. 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA Lösung der gut getestet werden. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min.
- Nach der Inkubation dissociaß die Zellen in einzelne Zellen durch die 1 ml Zellsuspension gegen die Oberfläche des Bohrloches Spülung und die Suspension in einem 15 ml konischen Röhrchen übertragen. Verwenden Sie 3 ml D-PBS alle verbleibenden Zellen aus dem Brunnen zu waschen und fügen Sie sie in den 15-ml-Erlen. Verwenden 10 ml zusätzlicher D-PBS, um die Zellösung in dem konischen Rohr verdünnen.
- Zentrifugieren der Zellen bei 200 · g für 2 min. Den Überstand aspirieren und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml DMEM / F-12-Medium. Durchführen einer Zellzahl je nach Bedarf eine Standard - Zellsuspension zu erzeugen , die kleiner als 1 x 10 6 Zellen / ml.
- Bereiten Sie jede aliquote Menge von positiven / negativen direkt-konjugierten Antikörpern der Wahl in 1 ml DMEM / F-12 - Medium für weniger 1 x 10 6 Zellen / ml unter Verwendung der folgenden Kombinationen: SSEA4 zu einem grün fluoreszierenden Fluorophor konjugiert ist (1: 200) mit CD44, konjugiert an PE-Cy5 oder CD44, konjugiert mit einem grün fluoreszierenden Fluorophor und SSEA4 zu einem weit rot fluoreszierendes Fluorophor konjugiert. bebrütendie Antikörper mit der Zellsuspension für 45 min bei Raumtemperatur.
- Saugen Sie das primäre Antikörperlösung und wäscht zweimal mit vorgewärmten DMEM / F-12-Medium.
- das Zellpellet in 1 ml D-PBS absaugen letzten Waschen und erneut suspendieren. Pipettieren der Inhalt jeder einzelnen Suspension in FACS-Röhrchen.
- Mit den entsprechenden Negativkontrollen (ungefärbten und Isotypkontrollen), bestätigen die richtige Vorwärts- und Seitenstreuprofil und Spannungen auf dem Zytometer. Stellen Sie die Spannungen für die entsprechenden Fluorophore nach ersten einzelnen Fleck Parameter, so dass die grüne Fluorophore durch die Blue Laser aktiviert werden und Signale im BL1 Kanal erworben, während weit rot fluoreszierendes Fluorophor und PE-Cy5-Fluorophor aktiviert werden durch den roten Laser-und Signale im RL1 Kanal erworben. Erwerben Sie die Dual-gefärbten Bevölkerung für jeden Zeitpunkt.
- Analysieren Sie die FCS-Dateien für jeden Zeitpunkt die entsprechende Analyse-Software und den Editor verwenden, um ARRAnge Daten der Bevölkerung Ausdruck Verschiebung im Laufe der Zeit zu beobachten.
- Führen Sie die Schritte 5.1.1 bis 5.1.6, wenn Zellsortierung zu verschiedenen Zeitpunkten erwünscht ist. Verwenden Sie die entsprechenden Fluorophors Kombinationen gemäß der Laserkonfiguration der Zellsortierer verwendet werden.
- Nach dem letzten Waschen resuspendieren das Zellpellet in 1 ml der Zellsortierungspuffer. Stellen Sie den Zellsortierer an die richtigen Vorwärts- und Seitenstreu Einstellungen mit Hilfe eines ungefärbten steuern. Verwenden Sie die einzelnen gefärbten Kontrollen, die richtigen Einstellungen für jedes Fluorophor einzurichten.
- Verwenden Sie eine kleine Probe der doppelt gefärbten Zellsuspension; Wählen Sie die 2 Populationen sortiert werden und weisen die jeweiligen Ladungs korrekte Erhebung der sortierten Zellen zu gewährleisten.
- Zugabe von 200 ul der Zellrückgewinnungsmittel in die Sammelröhrchen, um sicherzustellen, dass die sortierten Zellsuspension abgefedert wird und zum Zeitpunkt des Sortierens geschützt. Ernten Sie den Wunsch Anzahl der Zellen und Übertragung auf neue Imef Gerichte mit frischemly vorbereitet Recovery Medium.
- Ändern Sie das Medium folgende Inkubation über Nacht mit dem Recovery-Medium. Die Kulturen müssen anschließend zugeführt und agierten routinemßig HPSC Medium, enthaltend Penicillin / Streptomycin (100 Einheiten / ml Endkonzentration) verwendet wird.
6. Endpoint Analysis
- Terminal Alkalische Phosphatase (AP) Staining
- Verwenden Sie Terminal chromogenen AP-Färbung zu beobachteten kinetischen und morphologischen Ereignisse mit der endgültigen Umprogrammierung Effizienzen korrelieren.
- Nach 21 Tagen vor der Reprogrammierung, entfernen das Kulturmedium aus dem Brunnen mit Terminal AP Fleck und waschen Sie einmal mit 200 mM Tris-HCl (pH 8,0) gefärbt werden.
- Die geeignete Menge der Färbungslösung gemäß Herstelleranleitung in 200 mM Tris-HCl gerichtet.
- Saugen Sie das Waschen und 2 ml der vorbereiteten Färbungslösung in jede Vertiefung. Inkubieren für 20 bis 30 min bei Raumtemperatur und entfernt von the Licht.
- Saugen Sie die Färbelösung und waschen einmal mit 200 mM Tris-HCl. Entfernen Sie die Wäsche und mit destilliertem Wasser vor der Visualisierung.
- Nehmen Sie das kolorimetrisches Signal ein normales Bild Kamera. Zählen Sie die Anzahl der positiv gefärbten Kolonien von Hand. Visualisieren Sie den Fleck Fluoreszenzanalyse in der Trit-C-Kanal verwenden, da der Fleck in der Natur auch fluoreszierend ist, und führen Ganz gut Bildgebung und analysiert, um die Ganz gut Imager. Verwenden Protokoll des Herstellers.
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Representative Results
Überwachung Reprogrammierung Kinetics Mit Flow Cytometry
CD44 ist ein Fibroblasten - Marker während SSEA4 ein PSC Marker 6,10 ist. Wie aus diesem Expressionsmuster erwartet, Durchflusszytometrie von BJ Fibroblasten zeigt eine SSEA4 - CD44 + Population, die die Schaffung von Quadranten Toren in Kombination mit der ungefärbten Probe erleichtert. Während Reprogrammierung von DF1 Fibroblasten mit den Sendai-Viren, ist CD44 allmählich verloren, während SSEA4 langsam zum Ausdruck kommt. Am 3. Tag nach der Transduktion mit dem Sendai - Viren gibt es eine große Population von SSEA4 - CD44 + Zellen und eine kleine Population von SSEA4 + CD44 + Zellen, die am Tag 7 (Abbildung 1) deutlicher wird. Am Tag 13, geht die doppelt positiven Bevölkerung gegenüber dem SSEA4 + CD44 - Zustand. Mit dem 17. Tag, ein großer Prozentsatz der cells in Kultur sind bereits SSEA4 + CD44 -. Dieser Zeitverlauf zeigt, dass die Durchflusszytometrie mit CD44 und SSEA4 kann verwendet werden, um das Fortschreiten und die Geschwindigkeit der Reprogrammierung zu überwachen.
Ein quantitativer Vergleich bestätigt , dass eine Umprogrammierung BJ Fibroblasten mit Sendai Umprogrammierung Viren erzeugt SSEA4 + CD44 - Zellen mit einer anderen Geschwindigkeit als Reprogrammierung von BJ Fibroblasten (2A). Die Daten zeigen , dass eine frühe Vergleich des Prozentsatzes von PSC-like SSEA4 + CD44 - -Zellen das Fortschreiten der Umprogrammierung aufspürt. Interessanterweise an Tag 8 von DF1 Fibroblasten Umprogrammierung, Sortieren und separat Züchten der Population von Zellen, die in dem Prozess sind SSEA4 von upregulating und Herunterregulieren CD44 erzeugt AP + Kolonien 11 (2B). Im Gegensatz dazu ist die ursprüngliche SSEA4 - erzeugt CD44 + -Population amuch kleinere Anzahl von AP + Kolonien am Tag 21 der Reprogrammierung, die die typischen Tag der endgültigen Kolonie - Analyse ist. Dies deutet darauf hin , dass es möglich ist , die transitioning Bevölkerung, um vorherzusagen , Unterschiede in der Umprogrammierung Kinetik noch vor dem SSEA4 + CD44 zu quantifizieren und zu vergleichen - Bevölkerung gebildet wird. Ein wichtiger Punkt hierbei ist , dass eine Anpassung einer variablen Prozess von mehreren Faktoren abhängig ist wie somatische Zellpopulation beginnt, Transduktionswirksamkeit, mittel, etc. Aber das allgemeine Muster und das Fortschreiten der oben beschriebene Marker Oberfläche zwischen verschiedenen Umprogrammierung Experimenten konsistent und Ausgangs Fibroblasten. Die Analyse der Kinetik Umprogrammierung kann auch mit verschiedenen Markern, wie beispielsweise die neu identifizierten negativen PSC Marker CD73 und B2M 6 sowie den etablierten PSC Marker CD24 12,13 und 14,15 EPCAM erfolgen. Ähnlich wie CD44, CD73 und B2M sind in Par ausgedrücktental BJ Fibroblasten, sind aber im Zuge der Neuprogrammierung downregulated, in vollständig neu programmiert iPSCs (3A) nicht nachweisbar werden. Eine Durchflusszytometrie Zeitverlauf mit CD44 und CD73 oder CD44 und B2M zeigt , dass CD44 und CD73 mit einer ähnlichen Rate nach unten reguliert werden, während B2M schneller als CD44 (3B) nach unten reguliert wird. In beiden Fällen kann die Geschwindigkeit der Umprogrammierung durch Messen der Akkumulation der negativen Doppel Population beobachtet werden. Im Gegensatz zu diesen negativen PSC Marker CD24 und EPCAM fehlen in Fibroblasten und in iPS - Zellen (3A) zum Ausdruck gebracht. In einer Durchflusszytometrie Zeitverlauf, CD24 - CD44 + und EPCAM - CD44 + Fibroblasten bilden schließlich doppelt negativen Populationen, die später Übergang in CD24 + CD44 - und CD44 + EPCAM - PSC-ähnliche Zellen, bzw. (3B). Somit kann während Neuprogrammierung, sowohl positive als PSC-Markerausgedrückt werden nach CD44 herunter reguliert wird. Ähnlich dem, was mit SSEA4 und CD44, die Bildung und Akkumulierung der verschiedenen Zellpopulationen zeigen das Fortschreiten der Umprogrammierung beobachtet wurde.
Tracking - Reprogrammierung Mit Imaging Analysis in Echtzeit
Echtzeit - Bildgebung der Kulturen Umprogrammieren nach zeigt die allmähliche Bildung von Kolonien (4A) Nachsaat, die in Zusammenfluß unter Phasenkontrast (4B) zu einer logarithmischen Zunahme entspricht. Confluence unter Phasenkontrast bietet somit eine weitere Metrik für die Überwachung der Umprogrammierung quantitativ, aber es umfasst sowohl die Kolonien , die für PSC - Marker positiv sind und die fortgesetzte Proliferation von unreprogrammed oder teilweise umprogrammiert Zellen (4A, letzter Teil). Die Quantifizierung der Bereiche, die für Pluripotenz Marker gefärbt wurdenTRA-1-60, SSEA4 und AP 6,10 am Tag 21 zeigt an, dass iPSCs machen nur weniger als die Hälfte der Gesamt Konfluenz (4B). Um den Fortschritt der Reprogrammierung mehr stringent zu messen, ist es möglich, eine Reporter Linie für eine Neuprogrammierung zu verwenden. Hier wurden sekundären Fibroblasten aus der BG01v / hog ESC Linie erzeugt, die mit einem OCT4-GFP - Reporter 16 entwickelt wurde. GFP wird ausgedrückt als die Zellen reprogrammiert werden , und als Kolonien gebildet werden (5A). Mess Einmündung zeigt unter Phasenkontrast und die grünen Kanäle , dass die GFP Einmündung langsamer als die Gesamtzusammenfluss erhöht, und das GFP - Mündung am Tag 19 ist weniger als die Hälfte der Gesamt Einmündung (5B), erinnert an TRA-1-60, SSEA4 und AP-Färbung an Tag 21.
Abbildung 1. Mochungs den Fortschritt der Reprogrammierung Mit Durchflusszytometrie. Flow Cytometry Dot - Plots für DF1 Fibroblasten Reprogrammierte mit Sendai - Viren unter Feeder freien Bedingungen. Die Zellen wurden geerntet und gefärbt mit SSEA4 und CD44 - Antikörper in unterschiedlichen Intervallen von Tag 3 (D3) bis Tag 19 (D19) des Umprogrammierung. Kulturen am Tag 9 (D9) wurden weiter analysiert, nachdem die Zellen am Tag 7 (D7) reseeded wurden. Dot Plots zeigen 8.000 singlets. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
. Abbildung 2. Bewertung Reprogrammierung Kinetics und Effizienz unter Feeder freien Bedingungen (A) Grafik , die Änderungen in dem Prozentsatz der SSEA4 + CD44 - umprogrammiert Zellen nach DF1 fib transduzierendenroblasts und BJ Fibroblasten mit den Sendai-Viren. Die Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie am Tag 3 bis 19 post-Transduktion mit Kulturen an Tag 9 ab laufen analysiert am 7. Tag (B) Pseudo-Farbe - Zytometrie - Plots für DF1 transduzierten Zellen Sendai Viren und gefärbt mit SSEA4 und CD44 Antikörper fließen Nachsaat. SSEA4 -. CD44 + Zellen (schwarzer Kreis) und SSEA4 + Zellen (roter Kreis) wurden am Tag sortiert 8 und bis Tag 19 wachsen gelassen , bevor sie für die alkalische Phosphatase (rot) Färbung Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Observing Reprogrammierung Kinetik der Feeder-freien Kulturen unter Verwendung verschiedener Positive und Negative PSC - Markierungen. (AD) Live - Färbungvon Day-18 DF1-derived Umprogrammierung Kulturen Antikörper für die positiven PSC Marker CD24 und EPCAM und negative PSC Marker CD44, CD73 und B2M verwenden. Die oberen Platten verschmelzen die grünen und roten Fluoreszenzkanäle, während die Bodenplatten auch die Phasenkontrastbild enthalten. Der Maßstab entspricht 200 & mgr; m. (E) Durchflusszytometrie Dot - Plots für DF1-derived Umprogrammierung Kulturen geerntet und gefärbt mit den gleichen Markierungen von Tag 9 bis 17 (D9 bis D17) post-Transduktion. Vor der Analyse wurden die Kulturen an Tag reseeded 7. Dot Plots zeigen 8.000 singlets. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Tracking - Reprogrammierung Kinetics von Total Confluence Messung. (A) Echtzeit - imaging von BJ Fibroblasten mit Sendai-Viren unter Feeder freien Bedingungen neu programmiert werden. Phasenkontrastbilder der gleichen Kolonien wurden am Tag 7 bis 19, dann an Tag 21 mit zusätzlichen Färbung für CD44 und SSEA4, TRA-1-60 genommen oder AP. Maßstabsbalken entspricht 400 & mgr; m. (B) Quantifizierung der Gesamt Einmündung (Phasenkontrast) als Umprogrammierung schreitet von an Tag Nachsaat 7 bis Tag 21. Insgesamt Einmündung am Tag 21 im Vergleich zu SSEA4, TRA-1-60 und AP - Signal Einmündung ( grün - Kanal). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Reprogrammierung Kinetics Beurteilung von Mess OCT4-GFP Confluence. (A) Echtzeit - Bildgebung von BG01v / hog hESC-abgeleiteten umprogrammiert Fibroblasten mitSendai-Viren unter Feeder freien Bedingungen. Phasenkontrast, grüne Fluoreszenz und fusionierte Bilder derselben Kolonien an Tag erzeugt wurden 7 bis 19 Maßstabsbalken 400 & mgr; m entspricht. (B) Quantifizierung der Gesamt Konfluenz (Phasenkontrast) und OCT4-GFP Konfluenz (grünen Kanal) als Umprogrammierung schreitet von re-Seeding an Tag 7 bis Tag 21. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Disclosures
Alle Autoren [RHQ, JSTA, KS, und UL] sind Mitarbeiter von Thermo Fisher Scientific, die in diesem Artikel einige der verwendeten Reagenzien und Instrumente produziert.
Acknowledgments
Die Autoren danken Chad MacArthur für hilfreiche Diskussionen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16141-061 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts | Thermo Fisher Scientific | A24903 | |
| Attachment Factor Protein (1x) | Thermo Fisher Scientific | S-006-100 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Collagenase, Type IV, powder | Thermo Fisher Scientific | 17104-019 | |
| TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12563-011 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0264 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260-037 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| InSolution Y-27632 | EMD Millipore | 688001 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal | ATCC | CRL-2522 | |
| DF1 Adult Human Dermal Fibroblast | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells | Thermo Fisher Scientific | R7799-105 | |
| IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | ||
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | SSEA421 | |
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) | Thermo Fisher Scientific | A14810 | |
| SSEA-4 Antibody (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | 41-4000 | |
| TRA-1-60 Antibody (cl.A) | Thermo Fisher Scientific | 41-1000 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A27094 | |
| CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25528 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) | Thermo Fisher Scientific | RM-5700 (no longer available) | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11007 | |
| Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | |
| TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25618 | |
| CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate | Thermo Fisher Scientific | MHCD2401 | |
| beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) | Thermo Fisher Scientific | A15737 | |
| EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) | Thermo Fisher Scientific | A15755 | |
| CD73 / NT5E Antibody (7G2) | Thermo Fisher Scientific | 41-0200 | |
| VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| Zeiss Axio Observer.Z1 microscope | Carl Zeiss | 491912-0003-000 | |
| FlowJo Data Analysis Software | FLOJO, LLC | N/A | |
| Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser | Thermo Fisher Scientific | Use Attune NXT | |
| S3e\ Cell Sorter (488/561 nm) | BIO-RAD | 1451006 | |
| Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | |
| Falcon 15 ml, high-clarity, dome-seal screw cap | Corning | 352097 | |
| Falcon T-75 Flask | Corning | 353136 | |
| Falcon T-175 Flask | Corning | 353112 | |
| Falcon 6-well dish | Corning | 353046 | |
| Heraeus Heracell CO2 Rolling Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51013669 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 ml | AM12450 | ||
| HulaMixer Sample Mixer | 15920D |
References
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