Abstract
الضامة والخلايا الجذعية (DCS) هي خلايا المناعة الفطرية الموجودة في الأنسجة والأعضاء اللمفاوية التي تلعب دورا رئيسيا في الدفاع ضد مسببات الأمراض. ومع ذلك، فهي من الصعب عزل بأعداد كافية لدراستها بالتفصيل، لذلك، وضعت في المختبر النماذج. في المختبر ثقافات العظام الضامة المشتقة من نخاع والخلايا الجذعية هي طرق قيمة راسخة والدراسات المناعية. هنا، يتم وصف طريقة لزراعة وتحديد كل من البلدان النامية والضامة من ثقافة واحدة من خلايا نخاع العظام باستخدام الأساسي خلوى محببة بلعم عامل تحفيز مستعمرة (GM-CSF). ويستند هذا البروتوكول على إجراءات المتبعة أول من وضعه لوتز وآخرون. في عام 1999 للعظام البلدان النامية المشتقة من نخاع. الثقافة هي غير متجانسة، وتستخدم MHCII وحمض الهيالورونيك fluoresceinated (FL-HA) للتمييز الضامة من البلدان النامية غير الناضجة والناضجة. تستمد هذه GM-CSF الضامة المواليةبنصيحة مصدر مناسب من الضامة في المختبر المشتقة التي تشبه البلاعم السنخية في كل من النمط الظاهري وظيفة.
Introduction
وقد وصفت العديد من الطرق الثقافة في المختبر لتوليد العظام الضامة المشتقة من نخاع (BMDMs) والعظام البلدان النامية المشتقة من نخاع (BMDCs) باستخدام واحد أو مزيج من عوامل النمو. BMDMs يمكن توليدها عن طريق زراعة خلايا نخاع العظام باستخدام إما بلعم مستعمرة عامل تحفيز (M-CSF) أو GM-CSF 1،2. لBMDCs، إضافة FLT3 يجند للثقافة نخاع العظام يثير البلدان النامية الكلاسيكية وبلازماوية الشكل غير ملتصقة (CD11c وعالية / MHCII عالية وCD11c والصغرى، B220 + على التوالي) بعد 9 أيام في الثقافة 3،4. في المقابل، الخلايا غير ملتصقة ولدت بعد 7-10 أيام في الثقافة مع GM-CSF وحدها 5،6، GM-CSF و IL-4 7، أو GM-CSF وFLT3 يجند 8،9 توليد BMDCs تشبه عن كثب البلدان النامية التهابات (الأعلى CD11c و، MHCII مرتفعة CD11b +) 10. في حين تستخدم هذه في المختبر الثقافات لتوليد الضامة أوالبلدان النامية، فمن غير الواضح إذا كان كل ثقافة يثير مجموعات نقية. على سبيل المثال، على الرغم من وصفها الخلايا الملتصقة في الثقافات GM-CSF أن يكون الضامة 5، الخلايا غير ملتصقة من نفس الثقافة وتستخدم البلدان النامية 6،11-13، مع افتراض أنها متجانسة وأي تقلب ملاحظتها نظرا لمراحل مختلفة من التنمية 14،15. وعلاوة على ذلك، وقد وجدت الدراسات GM-CSF لانه عامل نمو أساسي للتنمية البلاعم السنخية في الجسم الحي 16،17، ويمكن استخدامها في المختبر لتوليد الضامة مثل السنخية 16،17،18.
البعض من الالتزام، والإجراءات لتوليد الضامة والبلدان النامية من GM-CSF تعامل الثقافات نخاع العظم هي مشابهة جدا مما يشير إلى عدم التجانس قد تكون موجودة داخل GM-CSF الثقافات نخاع العظام. هذا يبدو في الواقع أن هذا هو الحال كما أفادت ورقتين وجود BMDMs في جزء غير ملتصقة الثقافات BMDC. في ورقة واحدة، فإنها identifiإد يبلغ عدد سكانها الخلايا كما CD11c و+، CD11b +، MHCII منتصف، MerTK +، وCD115 +، الذي أعرب عن التعبير توقيع الجينات التي تشبه كثيرا الضامة السنخية وكان انخفاض القدرة على تنشيط خلايا T 19. الورقة الثانية تستخدم MHCII وFL-HA لتحديد السكان مثل بلعم السنخية (CD11c و+، MHCII منتصف / منخفضة، وارتفاع FL-HA) التي كانت متميزة من غير ناضجة (CD11c و+، MHCII منتصف، FL-HA منخفض) وناضجة البلدان النامية (CD11c و+، MHCII عالي)، سواء ظاهريا وظيفيا 18. توضح هذه الأوراق على حد سواء أن الثقافات GM-CSF BMDC غير متجانسة، تحتوي على كل بلعم وسكان العاصمة مشيرا إلى أن ينبغي الحرص عند تفسير البيانات من الثقافات BMDC.
يصف هذا البروتوكول كيفية عزل نخاع العظم، خلايا نخاع العظام الثقافة في GM-CSF، وتحديد السنخية مثل بلعمالسكان من البلدان النامية غير الناضجة والناضجة في ثقافة نخاع العظام عن طريق التدفق الخلوي باستخدام FL-HA ملزمة والتعبير MHCII. ويستند هذا الإجراء على الإجراء المعمول بها لوتز وآخرون (6) وغير قادرة على توليد 5 - 10 × 10 6 خلايا غير ملتصقة في يوم 7 من ثقافة 10 مل. الثقافة هي قابلة للاستخدام من أيام 7-10 وينتج مجموعة متغايرة من الضامة، البلدان النامية غير الناضجة والناضجة، وكذلك بعض الأسلاف في يوم 7. وهذا يوفر طريقة بسيطة لزراعة وعزل في المختبر الضامة السنخية مثل بكميات كبيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
والموت الرحيم الفئران وفقا للمجلس الكندي للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان لأبحاث الحيوان الأخلاقي الإجراءات المعتمدة من قبل الجامعة لجنة رعاية الحيوان كولومبيا البريطانية.
1. الحصول على خلية واحدة نخاع العظم تعليق من الفأر عظم الفخذ والساق
- التبديل على مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (BSC) لمدة 15 دقيقة قبل بدء الإجراءات لتطهير الهواء مجلس الوزراء والسماح للاستقرار تدفق الهواء، ثم نظيفة / رش سطح BSC مع 70٪ من الإيثانول. إبقاء كل شيء معقمة قدر الإمكان لمجمل البروتوكول. لا قطع عظام في ظل ظروف غير معقمة.
- إعداد أدوات تشريح عن طريق نقع في 70٪ من الإيثانول (1 زوج من مقص تشريح، 2 أزواج من ملقط)، محلول ملح هانك المتوازن مع 5٪ مصل العجل الجنين (HBSS-FCS)، أطباق بتري معقمة (100 ملم × 15 ملم)، 1 المحاقن مل، 26½ الإبر قياس، أنابيب جمع المخروطية (15 مل أو 50 مل)، والمناشف الورقية في ش.
- الموت ببطء باستخدام الماوسالبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة أخلاقيات البحوث الحيوانية المؤسسة. تحقيق في BSC، وضع على رأس واحد أو اثنين من المناشف الورقية ورذاذ الفأر مع الايثانول 70٪.
- في BSC، فتح العقيمة طبق بتري جو معقم و مطهر، قسامة 10 مل من HBSS-FCS إلى قاعدة و1-2 مل إلى غطاء.
- ضع الماوس على بطنه مع الجزء الخلفي مواجهة ورفع الجلد حول أقسام الصدرية مع أصابع اليد غير المسيطرة. استخدام المقص لإجراء شق حيث يتم رفع الجلد.
- الابقاء على طرفي قطع، نهاية واحدة مع كل جهة، وبعناية مزق الجلد حول الماوس من الخلف إلى المعدة، ومواصلة سحب حتى اثنين من طرفي لقاء شق في المعدة.
- الوجه الماوس لالمعدة مواجهة، وبيد واحدة سحب النصف السفلي من الجلد أسفل نحو الساق، والحفاظ على الانسحاب الجلد حتى يتعرض الساقين.
- عقد سفح الماوس صعودا وقطع الأوتار أخيل فوق مفصل الكاحل والأربطة التي تربط العضلات على الاقدام في نهاية السفلى من الساق مع مقص. هذا يخفف من الأقدام من عظام الساق.
- في حين الضغط على الساق من القدم، وقطع العضلات والأربطة مع مقص في جميع أنحاء مفصل الركبة في نهاية السفلى من عظم الفخذ لقطع عضلات الفخذ من أسفل الساق. استخدام الملقط لسحب بلطف عضلات خففت بعيدا عن الشظية والسطوح الفخذ. الحرص على عدم قطع الشريان الفخذي لتجنب نزيف حاد.
- بيد واحدة على عقد في القدم، اضغط مقص مفتوحة إلى أسفل في نهاية العلوي من عظم الفخذ في مفصل الورك، وتناوب على ساق وسحب بلطف لفصل عظم الفخذ من مفصل الورك أثناء استخدام مقص لجعل خفض النهائي مجانا الساق من الجسم.
- من هذه النقطة فصاعدا، عقد فقط النسيج مع ملقط معقم. الابقاء على الساق في نهاية واحدة وسحب قبالة القدم من جهة أخرى.
ملاحظة: هذا لا ينبغي أن تتطلب الكثير من القوة، كما تم قطع الأربطة التي تربط في الخطوة1.9. بدلا من ذلك، وقطع الساق فقط فوق الكاحل حيث تنصهر العظام. - عقد الساق قبل نهاية البعيدة للعظم الفخذ مع مجموعة واحدة من الملقط والنهاية القريبة من الظنبوب والشظية مع آخر، ثني بعناية الظنبوب والشظية في الاتجاه المعاكس لمفصل الركبة للفصل بينهما من عظم الفخذ والرضفة.
- استخدام ملقط لهدم الأربطة والعضلات المتبقية لا تزال تعلق على عظام الساق السفلى. هنا، وإزالة الشظية جنبا إلى جنب مع أنسجة الضامة مع ملقط كما هو صغير جدا بحيث لا يمكن مسح لخلايا نخاع العظام. وضع الساق على تنظيف المقلوب طبق بتري غطاء.
- عقد نهاية السفلى من عظم الفخذ مع مجموعة واحدة من الملقط والرضفة مع آخر، ثني الرضفة والأنسجة المحيطة بها في الاتجاه المعاكس للمفصل لإزالة. ثم تنظيف قبالة الأنسجة الضامة من عظم الفخذ المتبقية. سحب منهم بعيدا مع ملقط، ووضعه على المقلوب طبق بتري غطاء. تجاهل الرضفة.
- كرر 1.7- 1.13 مع الساق الأخرى إذا لزم الأمر. نقل العظام إلى 1.6 مل أنابيب microcentrifuge تحتوي على 1 مل العقيمة HBSS-FCS لنقل إذا لزم الأمر.
- وضع العظام على طبق بتري غطاء المقلوب، مع 1-2 مل من HBSS-FCS، استخدام ملقط لتنظيف أي نوع من الأنسجة المتبقية لا تزال تعلق على الساق وعظم الفخذ، ثم نقل العظام إلى قاعدة طبق بتري تحتوي على 10 مل من HBSS- FCS. بدلا من ذلك، تنظيف العظام وإزالة الأنسجة العضلية المرفقة باستخدام الايثانول 70٪ الأنسجة غارقة.
- قطع كل من العظام في نصف مع مقص. درع جزئيا طبق بيتري مع غطاء العقيمة في حين قطع لضمان عظام البقاء في الطبق. بدلا من ذلك، وقطع في نهاية كل العظام للسماح التنظيف في الخطوة التالية.
- إرفاق 26½ G الإبرة إلى حقنة 1 مل، ووضع 1 مل HBSS-FCS من طبق بيتري. إدراج غيض من الإبرة في نهاية قطعة عظم وطرد خلايا نخاع العظام (الأنسجة الناعمة الحمراء داخل العظام). ادخال الإبرة في الرأسمن العظام ونهاية مفتوحة، حتى يتم إزالة كافة نخاع اللون الأحمر. مراقبة عظام بيضاء اللون.
- تمرير أي كتل واضحة من نخاع العظام من خلال حقنة عدة مرات لتشكيل تعليق خلية واحدة.
- تجاهل العظام مسح. استخدام ماصة 10 مل إلى مزيج تعليق الخلية جيدا ونقل إلى أنبوب جمع. شطف طبق بيتري مرة واحدة مع 5 مل من HBSS-FCS لجمع الخلايا المتبقية في طبق. وضع الخلايا على الجليد.
ملاحظة: تعليق خلية نخاع العظام لا تزال قابلة للحياة إذا تخزينها ل2-3 ساعة عند 4 درجات مئوية.
2. طلاء والتثقيف من خلايا نخاع العظام (خلايا نخاع العظم)
- تحضير الكواشف واللوازم التالية.
- إعداد العازلة تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) عن طريق كلوريد الأمونيوم 0.84٪ في الحل النهائي من 2 ملي تريس درجة الحموضة 7.2، ثم تعقيم عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.2 ميكرون.
- إعداد وسائل الاعلام BMC بإضافة 10٪ FCS، 20 ملي HEPES، 1X الأحماض الأمينية غير الأساسية، 55 & #181، م 2 المركابتويثانول، 50 U / مل البنسلين والستربتومايسين، 1 ملم البيروفات الصوديوم، و 2 مم L-الجلوتامين لRPMI المتوسطة 1640.
- الحصول المتاحة تجاريا المؤتلف GM-CSF أو استخدام GM-CSF التي تحتوي على طاف من AG8.653 خلايا المايلوما transfected مع GM-CSF الجين 20. تحديد تركيز GM-CSF في طاف بواسطة ELISA وإضافة ما يعادل 20 نانوغرام / مل لوسائل الإعلام BMC.
- تدور باستمرار خلايا نخاع العظام في 314 x ج لمدة 5 دقائق. بيليه باللون الأحمر، نظرا لكرات الدم الحمراء. في BSC، ونضح طاف باستخدام معقم ماصة باستير الزجاج تعلق على فراغ شفط، تخفيف بيليه بواسطة التنصت، ثم إضافة 10 مل من العازلة تحلل كريات الدم الحمراء. دوامة resuspend الخلايا واحتضان العازلة في تحلل كريات الدم الحمراء في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- إضافة 10 مل من HBSS-FCS ثم تدور الخلايا في 314 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف. مراقبة بيليه الخلية كما اللون الأبيض. و resuspend الخلايا في حجم المطلوب من وسائل الإعلام BMC.
- عد دورة الفتشوبسبينديد الخلايا باستخدام عدادة الكريات بعد تلطيخ الخلايا الميتة مع 0.4٪ التريبان الأزرق.
ملاحظة: إذا تم استخدام نخاع العظام من ساق واحدة (الساق واحد وعظم الفخذ)، resuspend في 5 مل من وسائل الاعلام BMC، وتأخذ 10 ميكرولتر من التعليق الخلية وتمييع مع 70 ميكرولتر من 0.4٪ التريبان الأزرق، وتخلط جيدا ونقل 10 ميكرولتر من التخفيف 1/8 الخلية إلى غرفة عدادة الكريات. عد خلايا قابلة للحياة في أربعة أجزاء: متوسط التهم رباعي أربعة س عامل التخفيف × 10 4 = عدد الخلايا لكل مل. وهناك عظم الفخذ والساق من ساق واحدة تسفر عادة حوالي 2-4 × 10 7 الخلايا بعد RBC تحلل. - تقدير عدد 10 مل أطباق من الثقافات نخاع العظام اللازمة لإجراء التجارب النهائية بناء على عدد من مجموع الخلايا اللازمة لإجراء التجارب في نهاية الثقافة.
ملاحظة: كل طبق يتطلب 2 × 10 6 خلايا نخاع العظام في بذر الأولي وعوائد 5-10 × 10 6 خلايا في يوم 7.- عليمثل عدد من الخلايا للتصفيح في أنبوب جديد، وتدور باستمرار في 314 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف، و resuspend الخلايا في 4 × 10 6 خلية / مل في وسائل الإعلام BMC.
- إعداد جديدة معقمة 100 ملم × 15 ملم طبق بتري مع 9.5 مل من وسائل الاعلام BMC تحتوي على 200 نانوغرام من GM-CSF (المؤتلف أو من GM-CSF التي تحتوي على طاف). إضافة 500 ميكرولتر من 4 × 10 6 خلية / خلايا نخاع العظام مل من وسط طبق بيتري لتركيز النهائي من 2 × 10 5 خلية / مل في 10 مل.
ملاحظة: من المهم استخدام طبق بتري معقمة ليس طبق زراعة الأنسجة. أيضا، عند إضافة الخلايا، وضمان بقاء الخلايا تتركز في الوسط وتقليل التأثير السلبي على الأطباق بعد البذر وخلال التغييرات وسائل الإعلام. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. هذا هو اليوم 0 في الثقافة. - في اليوم 3، إضافة 10 مل من وسائل الاعلام BMC الطازجة التي تحتوي على 200 نانوغرام من GM-CSF إلى كل طبق من الخلايا. الحرص على التقليل من اضطرابات سو الخلايا تتركز في تعليق. الحجم الكلي للثقافة الخلية هو الآن 20 مل.
- مراقبة الخلايا تحت المجهر في ضوء التكبير 100X. لاحظ العديد من الخلايا غير ملتصقة (الجولة) وعدد قليل من الخلايا الملتصقة (مسطحة). الخلايا في مجموعات من ثلاثة أو أربعة بتلات تشبه زهرة يمكن أن ينظر إليه، مشيرا إلى انتشار الأسلحة النووية.
- في يوم 6 إجراء تغيير وسائل الاعلام نصف. إزالة بعناية 10 مل من وسائل الاعلام في أنبوب 50 مل مخروطي العقيمة، وتدور باستمرار في 314 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح وتجاهل طاف.
- resuspend الكرية خلية في 10 مل من وسائل الاعلام BMC الطازجة التي تحتوي على 20 نانوغرام / مل من GM-CSF، بلطف دوامة وإضافة إلى الطبق ثقافة الخلية الأصلي لإجمالي حجم 20 مل. مراقبة الخلايا تحت المجهر.
وينبغي أن يكون يوم 7 الثقافة في 70٪ أو أكثر في confluency مع خلايا مسطحة ملتصقة والسحب الكثيفة من خلايا مستديرة غير ملتصقة: ملاحظة.
3. جمع وإعداد BMDC وBMDMs عن التدفق الخلوي
- <لى> حافظ على جميع المخازن في 4 درجات مئوية.
- حصاد الخلايا من يوم 7 إلى يوم 10. لحصاد الخلايا، الأول نقل 10 مل من طاف ثقافة إلى 50 مل أنبوب جمع مخروطي الشكل، ثم إمالة طبق عموديا قبل ما يقرب من 30 درجة وغسل الطبق قبل pipetting 10 مل المتبقية الثقافة من أعلى الطبق. كرر هذا يغسل 5 مرات، في كل مرة يدور الطبق بمقدار الثلث.
- نقل ما تبقى من 10 مل من الخلايا إلى أنبوب جمع نفسه والتخلص من لوحة والخلايا الملتصقة.
ملاحظة: سوف يغسل إزالة الخلايا غير ملتصقة وملتصقة فضفاضة. الخلايا الملتصقة مسطحة هي مقاومة للغسيل. عادة، ما بين 5 - من المتوقع 10 × 10 6 خلايا غير ملتصقة من لوحة واحدة في اليوم و 7 و2-5 × 10 6 خلايا في يوم 10، على الرغم من أن لوتز وآخرون. ذكرت 10 × 10 6 خلايا في يوم 10. لا تؤخذ عادة الخلايا الملتصقة. ومع ذلك، إذا كان يحتاج هذه الخلايا ليتم مقارنة مع الخلايا غير ملتصقة، ويمكن إزالتها على النحو التالي. إضافة 5 مل من 0.7 ملي EDTA في برنامج تلفزيوني 1X، ودرجة الحموضة 7.4 إلى الطبق بعد إزالة الخلايا غير ملتصقة، في احتضان 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ماصة صعودا وهبوطا لإزالة الخلايا الملتصقة وجمع في أنبوب منفصل. - تدور باستمرار الخلايا التي تم جمعها في 314 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف. resuspend في 5 مل سائل الإعلام BMC العقيمة عند 4 درجات مئوية، دوامة بلطف إلى المزيج، والعد باستخدام التريبان الأزرق وعدادة الكريات.
ملاحظة: كل طبق سوف تسفر 5-10 × 10 6 خلايا غير ملتصقة من ثقافة اليوم 7. من الآن فصاعدا، تنفيذ كافة الخطوات في 4 درجات مئوية. - لتحليل تدفق cytometric، ونقل 2 × 10 5 خلايا لكل عينة إلى 5 مل البوليسترين أنابيب أسفل الجولة، إضافة 300 ميكرولتر من FACS العازلة عند 4 درجات مئوية (1X الفوسفات مخزنة المالحة، 2 مم EDTA و 2٪ زلال المصل البقري) إلى كل عينة.
- تدور الخلايا في أسفل 314 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف. مراقبة بيضاء، بيليه مبهمة واضحة فيالجزء السفلي من الأنبوب.
- Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من الخالي من الملصقات التيسير مستقبلات أب لمنع التيسير مستقبلات ملزم (استخدام 1/10 طاف من 2.4G2 خط انتاج خلايا المايلوما) واحتضان لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. ثم إضافة 300 ميكرولتر من FACS العازلة لكل عينة، بلطف دوامة، ثم تدور الخلايا في أسفل 314 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف.
- Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من CD11c و-PeCy7 عند 0.2 ميكروغرام / مل، GR1 والمحيط الهادئ الأزرق عند 0.25 ميكروغرام / مل، MHCII-APC في 0.05 ميكروغرام / مل، وFL-HA في حوالي 2 ميكروغرام / مل لتحديد الضامة والبلدان النامية.
ملاحظة: تم إعداد FL-HA في المنزل باستخدام فلوريسئين والديك مشط حمض الهيالورونيك ملح الصوديوم كما هو موضح سابقا 21. - احتضان لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية للسماح ملزم لسطح الخلية. إضافة 300 ميكرولتر من FACS العازلة لكل عينة، بلطف دوامة، ثم تدور الخلايا في أسفل 314 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ونضح طاف ملاحظة: إذا الحيويوتستخدم الأجسام المضادة tinylated في 3.8، كرر 3،8-9 مع الفلورسنت streptavidin.
- غسل الخلايا مع 300 ميكرولتر آخر من FACS العازلة، بلطف دوامة لخلط وتدور باستمرار الخلايا في 314 x ج لمدة 5 دقائق. نضح في وطاف resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من FACS العازلة التي تحتوي على 0،1-0،2 ميكروغرام لكل مل من يوديد propidium أو دابي لتسمية الخلايا nonviable. الخلايا هي الآن جاهزة لتحليل تدفق cytometric 22.
ملاحظة: انظر نتائج والشكل (3) لمزيد من التفاصيل من السكان وكيفية بوابات الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد مخطط يلخص الخطوات الرئيسية لهذه الطريقة في الشكل 1. كثافة ومورفولوجية ثقافة نخاع العظام في أوقات مختلفة من الثقافة وهو مبين في الشكل (2). وفي يوم 1، وخلايا صغيرة ومتفرقة ولكن بعد يوم 3، هناك المزيد من الخلايا، وبعضها أكبر وبدأت عدد قليل من الالتزام. يوم 6 هناك تمسكا واضح وجزء غير ملتصقة (الشكل 2A). ثقافة يمكن أن تحصد من يوم 7-10 مع نسبة مئوية أعلى من الخلايا CD11c و+ الحاضرة في يوم 10. الشكل 2B يدل على ثقافة يوم 7 قبل الحصاد، فضلا عن فصل أجزاء الخلية ملتصقة وغير ملتصقة. ويتكون جزء ملتصقة الخلايا غادر بعد يغسل الخفيفة التي تعمل على إزالة جزء غير ملتصقة. تم تخصيب جزء غير ملتصقة إلى حد كبير للخلايا مع التشكل شجيري، وهو ما يمكن ملاحظته بشكل أكثر وضوحا في ايم تضخيم رقمياالأعمار في إدراجات في الشكل 2B. مرة واحدة يتم إزالة جزء غير ملتصقة (يوم 7 أو 10 يوما)، ويتم تحليل الخلايا عن طريق التدفق الخلوي بعد وضع العلامات مع الأجسام المضادة الفلورسنت ضد علامات سطح الخلية الرئيسية، كما هو موضح أعلاه. ويبين الشكل 3 تدفق التمثيلي الخلوي كيد غير ملتصقة جزء من الثقافة في يوم 7 ويوم 10.
للتعرف على كل من الضامة والبلدان النامية، بوابة على CD11c و+ وGR1 - الخلايا بعد النابضة الأول على حجم والخلايا الحية (الشكل 3A وباء). في يوم 7 الثقافات، وCD11c و+ GR1 - السكان في جزء الخلية غير ملتصقة هو عادة 60 إلى 70٪ من مجموع الخلايا الحية، وهذا ما زاد إلى 90٪ أو أكثر في يوم 10 (الشكل 3B). وCD11c و+ GR1 - السكان في يوم 7 ويوم 10 يمكن تقسيمها إلى ثلاث مجموعات فرعية الرئيسية باستخدام MHCII وFL-HA بيندينانوغرام: MHCII منتصف / منخفضة FL-HA ملزمة الضامة عالية (P1)، MHCII منتصف FL-HA ملزمة منخفضة (P2) الخلايا التي تحتوي على البلدان النامية غير ناضجة، وMHCII FL-HA عالية ملزمة البلدان النامية المنخفضة ناضجة (P3) (الشكل 3C ومرجع 18 ). وقد تبين أن FL-HA منخفضة، MHCII السكان المنخفض (P0) لوحظ في اليوم 7 لاحتواء الأسلاف للخلايا P1-P3 18. هذه الفئة من السكان ليس واضحا في يوم 10 مما يعني أن مزيدا من النضج للثقافة حدث. ويؤيد ذلك أيضا نسبة أكبر من خلايا CD11c وفي الثقافة وكذلك نسبة أعلى قليلا من السكان P2 و P3 العاصمة في يوم يظهر 10. الشكل 3D MerTK، التي تعتبر علامة بلعم، وأعرب عن كبير على كل من البلاعم و وأعرب السكان غير ناضجة العاصمة (P1 و P2)، ولكن لأقل ما على ناضجة البلدان النامية (خلايا P3). والجدير بالذكر أن تحليل جزء ملتصقة يكشف وجود P0، P1 والسكان P2، ولكن ليس السكان P3 ناضجة العاصمة (لا تظهر البيانات). وهكذا الضامة موجودة في كسور ملتصقة وغير ملتصقة ولكن فقط البلدان النامية ناضجة موجودة في جزء غير ملتصقة.
ويتم حصاد ومخطط تدفق مبينا الخطوات الرئيسية لطريقة الابتدائي الخلايا من نخاع العظام، مطلي والمحافظة عليها في ثقافة لمدة 7 - 10 أيام عند حصادها لاستخدامها في تجارب أخرى، النقاء أو المستخدمة في تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية: الشكل 1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: فحص المجهري للGM-CSF مشتقة خلايا نخاع العظم. ا) ثقافة نخاع العظام في يوم 1 و 3 و 6 تظهر زيادة في عدد الخلايا، والتغيرات في التشكل، وظهور أجزاء ملتصقة وغير ملتصقة متميزة. ب) تظهر لوحة غادر يوم 7 الثقافة نخاع العظام وكثافة الخلايا العادية. تظهر لوحة الوسطى يوم 7 الخلايا الملتصقة بعد الحصاد للجزء غير ملتصقة واللوحة اليمنى يظهر جزء غير ملتصقة تحصد في يوم 7. إدراجات تم تكبيرها رقميا الصور من الخلايا في هذا الجزء مع التشكل شجيري. ويمثل حجم شريط أبيض 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): النمط الظاهري ممثل الثقافة GM-CSF في يوم 7 ويوم 10. غير ملتصقةوصفت الخلايا من الثقافة مع CD11c و، GR1، MHCII، FL-HA، وMerTK في يوم 7 أو 10 يوما وتحليلها لالنمط الظاهري من خلال التدفق الخلوي. أ) وبوابات الخلايا أولا على حجم ثم يعيش الخلايا. ب) يظهر ل مؤامرة من الخلايا المغلقة مع CD11c ووGR1 (العدلات / الوحيدات علامة) وتحدد CD11c و+ GR1 - السكان التي تحتوي على البلاعم والخلايا الجذعية. تبوب على هذه الفئة من السكان، C) ويبين مؤامرة التدفق الخلوي من MHCII وFL-HA ملزمة، مما يدل على انفصال الضامة مثل السنخية (P1) من البلدان النامية غير ناضجة (P2) وتستحق البلدان النامية (P3)، كما هو موضح في بون وآخرون. 18. D) المدرج الإحصائي مقارنة التعبير MerTK بين P1 (الضامة)، P2 (البلدان النامية غير الناضجة)، والسكان P3 (تنضج البلدان النامية) في يوم 7 ويوم 10. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا فيقوإعادة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المخطوطة، ونحن نقدم طريقة لتوليد الضامة والبلدان النامية GM-CSF المستمدة من ثقافة نخاع العظام بالنسبة للفئران واحدة أن يتم تكييف من لوتز وآخرون. 6. MHCII التعبير وFL-HA يميز بين البلدان النامية غير ناضجة والضامة ملزم في هذه الثقافة (انظر الشكل 3C)، التي كانت في السابق صعبة. هذا، جنبا إلى جنب مع تقرير آخر عن طريق Helft وآخرون. 19، يدل على عدم التجانس داخل GM-CSF الناجم عن الثقافات BMDC التي كان يعتقد في السابق أن تكون الوحيدة البلدان النامية. Helft وآخرون. 19 استخدام الظروف ثقافة مختلفة تماما لتوليد BMDCs بعد وجدت أيضا عدد كبير من السكان البلاعم. GM-CSF الضامة التي يسببها تشبه البلاعم السنخية وGM-CSF البلدان النامية التي يسببها تشبه البلدان النامية التهابات، في حين FLT3 يجند تستكمل الثقافات BMDC تنتج البلدان النامية الكلاسيكية وبلازماوية 3،4. ويلاحظ مختلفة العاصمة وبلعم السكان أيضا في الامم المتحدة فيفودير الظروف التماثل الساكن والتهابات، وهناك الكثير من النقاش في هذا المجال إلى ما يعرف العاصمة والبلاعم 10. هذا صحيح بشكل خاص عندما يتعلق الأمر الوحيدات المستمدة البلدان النامية التهابات وهذا ما يفسر أيضا في هذا BMC. بالتالي فمن المهم استخدام العديد من علامات المظهرية، البيانات الوظيفية، وربما بيانات التعبير الجيني لتوصيف السكان معين. ومن الممكن أيضا أن هذه في المختبر العاصمة والبلاعم السكان قد تحتاج إلى مزيد من شبه مقسمة على النحو علامات أكثر وظيفية والمظهرية يتم اكتشافها.
في هذه الطريقة، يتم استخدام CD11c وعلامات، GR1، MHCII، وFL-HA للتمييز الضامة من الخلايا الجذعية غير الناضجة والناضجة في جزء غير ملتصقة الثقافة BMC. وهذا يختلف عن Helft وآخرون. 19، الذي استعمل CD11c وعلامات، CD11b، CD115، CD135، MerTK، وMHCII التمييز بين السكان بلعم من البلدان النامية ناضجة. مستويات التعبير MerTK يمكن distinguisح بين الضامة (P1) وتنضج البلدان النامية (P3)، ولكن ليس غير ناضجة البلدان النامية (P2) (الشكل 3D). وهكذا FL-HA و MHCII هي علامات مفيدة لتمييز الضامة من كلا الشعبين العاصمة غير ناضجة وناضجة. هذه البلاعم هي أيضا متميزة وظيفيا من البلدان النامية في هذه الثقافة BMC وهذا يتجلى في المزيد من التفاصيل في مكان آخر (18). لفترة وجيزة، بعد التحفيز LPS الضامة BMC إنتاج السيتوكينات مختلفة من البلدان النامية ناضجة ولا تنشط خلايا T ساذجة 18. هذه الضامة أيضا تشبه البلاعم السنخية، سواء ظاهريا وظيفيا على حد سواء ربط FL-HA والتعبير عن CD11c و، MerTK، CD200R، CD206 و F4 / 80 وبعد LPS تحفيز إنتاج-TNF ألفا وبعد قادر على تنشيط خلايا T ساذجة 18. ومع ذلك، هناك أيضا اختلافات: الضامة BMC هي CD11b + ولديهم مستويات أقل من Siglec F مقارنة السابقين فيفو السنخية الضامة، مما يشير إلى هذه الخلايا متشابهة ولكن ليس تحديد الهويةكال لالضامة السنخية.
هناك عدة خطوات هامة لضمان نجاح هذا البروتوكول. فمن المهم للحفاظ على عقم من فضح نخاع العظام فصاعدا. عندما يدخلون ويخرجون من BSC، رش يد القفاز والكائنات مع 70٪ من الإيثانول. على الرغم من أنه من المفيد لشطف الأدوات في الايثانول 70٪ لتعقيم، والإيثانول هو سامة لخلايا نخاع العظم، لذلك الهواء الجاف الأدوات وضمان الايثانول قد تبخرت قبل ان يصل العظام أو الخلايا على اتصال معهم. وبالإضافة إلى ذلك، وتجنب الاتصال الأنسجة الماوس أو الخلايا التي تحتوي على معدات غير معقمة أو اليدين أثناء موسم الحصاد نخاع العظام. على الرغم من أن يتم توفير البنسلين والستربتومايسين مكملات في وسائل الإعلام، الإهمال في التعامل مع الخلايا قد تؤدي إلى الخميرة أو التلوث بالفطريات. وبالإضافة إلى ذلك، منذ يتم إنشاء الخلايا المناعية مع نشاط البلعمة في هذه الثقافة، قد لا يتم الكشف عن تلوث طفيف ببساطة عن طريق مراقبة ثقافة الخلية مجهريا، وبالتالي من المهم أن تعرف ريوقع من التلوث. على سبيل المثال، قد يتم تخفيض أعداد الخلايا ويمكن زيادة التعبير عن علامات تنشيط الخلايا مثل CD40 و CD86 عند تحليلها من قبل التدفق الخلوي. اللون وسائل الاعلام قد تتحول أيضا الأصفر يعكس تغير درجة الحموضة بسبب التلوث. عندما يحدث التلوث، وثقافة BMC هي غير صالحة للاستعمال. للحفاظ على التناسق تجريبي، فمن المهم لتوليد تعليق خلية واحدة من نخاع العظام من قبل vortexing والحصول على عدد خلايا دقيقة لإعداد الثقافات BMC. أيضا، إن وجدت النسيج الضام من العظام ينتهي في تعليق خلية واحدة، من خلال تصفية العقيمة تصفية 70 ميكرون لحذفها. غلة خلية نموذجية لوحة واحدة من جزء غير ملتصقة في يوم 7 ما بين 5-10 × 10 6 خلايا. أرقام الهواتف المحمولة وعادة ما تكون مؤشرا جيدا أن البروتوكول يعمل بشكل جيد. مع هذا الإجراء ونحن عادة الحصول على ما بين 2-5 × 10 6 خلايا في يوم 10، في حين أن لوتز تقارير 10 × 10 6 خلايا. ونحن أداء RBC تحلل على الالبريد خلايا نخاع العظام الأولي في حين أن البروتوكول من قبل لوتز وآخرون. لا وحتى هذه الخطوة قد تكون اختيارية. الاختلافات في المئة من الخلايا CD11c وفضلا عن أعداد ونسب الضامة والبلدان النامية يمكن أن تنشأ من مصادر مختلفة أو دفعات من FCS ولذا فمن الأهمية بمكان لاختبار دفعات جديدة من FCS على الثقافات BMC عن النتائج التجريبية متسقة. قد تختلف تركيز GM-CSF من 5 نانوغرام / مل إلى 40 نانوغرام / مل وهذا لم يؤثر بشكل كبير من العائد الخلية. كثافة الخلية قد تؤثر أيضا على نضوج الثقافة. على سبيل المثال، Helft وآخرون. المصنف 1 × 10 7 خلايا في 4 مل سائل الإعلام التي أنتجت في المئة أكبر من الخلايا مع ارتفاع MHCII التعبير 19. في نقطة زمنية عندما يتم حصاد الخلايا يمكن أن تؤثر أيضا على نسبة من السكان موجودة في جزء غير ملتصقة. وعادة ما يتم جمع الخلايا بين أيام 7-10 25-27 ولكن بعض الدراسات جمع خلايا نخاع العظم في يوم 6 19،23،24. إذا كانت هناك حاجة أكثر من الخلايا والثقافة خلايا نخاع العظمفي جو من 150 مم × 15 مم أطباق بتري في 40 مل في نفس كثافة. في هذه الحالة يتم تغيير وسائل الاعلام نصف الحجم على كل يوم 3 ويوم 6 (أي 20 مل من وسائل الاعلام إزالتها، خلايا نسج أسفل واستبدالها جديدة 20 مل سائل الإعلام تستكمل مع 20 نانوغرام / مل RGM-CSF). هذه اللوحات عادة ما تولد 3-6 × 10 7 خلايا في طبق في اليوم 7. FL-HA هو كاشف المهم، جنبا إلى جنب مع MHCII، للتمييز الضامة من البلدان النامية غير الناضجة والناضجة في الثقافة BMC. وهكذا مرة واحدة ويتم ذلك، يعاير FL-HA للاستخدام على الخلايا المعروفة لربط جوهري HA مثل الضامة السنخية 18 أو خلايا BW5147 T وتأكيد خصوصيته سواء باستخدام CD44 الأجسام المضادة حجب HA (KM-81، وهي متاحة تجاريا)، HA الخالي من الملصقات أو خلية نقص CD44. CD11c و- GR1 + الخلايا في الثقافة يمكن أن تكون بمثابة الرقابة الداخلية للخلايا غير ملزمة HA، ومضان ناقص عنصر تحكم واحد (FMO) أو CD44 الثقافات BMC ناقصة للغاية وأوصت لsettin دقيقةغرام من بوابة ملزمة FL-HA.
على الرغم من أن التجارب لا يمكن أن يؤديها باستخدام ثقافة متجانسة، فإنه من المستحسن لإثراء للالعاصمة أو السكان بلعم باستخدام مضان تنشيط فرز الخلايا أو الأجسام المضادة المغلفة الخرز المغناطيسي 18 على أساس التعبير عن CD11c و، GR1، MHCII، وHA ملزمة. وتشمل التجارب الممكنة التحفيز مع تول مثل منبهات مستقبلات مثل LPS لقياس تفعيل وخلوى الإنتاج، T المقايسات تنشيط الخلايا، أو توصيف إضافي عن طريق التدفق الخلوي. على سبيل المثال، بعد 8 أو 24 ساعة من التحفيز، والتدفق الخلوي يمكن استخدامها لقياس تلطيخ الخلايا لالسيتوكينات و / أو العلامات سطح الجزيئات شارك في تنشيطية مثل CD40 و CD86، كما هو موضح في 18. تتطلب إجراءات وضع العلامات خلوى داخل الخلايا المعالجة من الخلايا مع Brefeldin A، والذي يمنع إفراز ويسمح للخلوى لبناء داخل الخلية. لتي المقايسات تنشيط الخلايا التي تنطوي على مبناهادينغ من مستضد مثل الببتيد OVA من قبل خلية مستضد، الضامة النقاء على أساس MHCII وHA ملزمة لن تنشيط خلايا T في حين غير ناضجة وناضجة البلدان النامية سوف 18. وتجدر الإشارة إلى أن هذا الإجراء الفرز وحدها قد ينشط الخلايا الجذعية إلى حد ما، مما يجعل من المهم أن تشمل ضوابط السلبية في جميع التجارب.
كما هو الحال مع أي طريقة في المختبر، وهناك مزايا وعيوب مقارنة مع استخدام في الجسم الحي أو الحي السابقين الخلايا. العيب هو أن في الخلايا المختبر المستمدة قد لا في الجسم الحي خلايا تقليد بالضبط ولكن لديهم ميزة أنها يمكن أن تتولد بأعداد كافية للسماح التحليل الوظيفي والكيمياء الحيوية، الأمر الذي غالبا ما تكون غير مجدية مع خلايا الجسم الحي السابقين. وهذا الأسلوب من البلاعم وتحديد العاصمة يسمح بحث في المستقبل للحصول على السكان الخلية أكثر تجانسا من ثقافة مع مغاير بالتقدير السابقgeneity. كما الضامة تنقيته من هذه الثقافة GM-CSF تشبه البلاعم السنخية من الرئة 18، ويوفر مصدرا مريحا الضامة مثل السنخية لفي المختبر تحليل. على سبيل المثال، يمكن أن تستخدم هذه الضامة ملزمة HA للكشف عن المخدرات التي تعدل وظيفة البلاعم السنخية والتحقيق في آليات عدوى السل المتفطرة والمقاومة. وبالنظر إلى الاكتشاف الأخير الذي GM-CSF و M-CSF العظام المستمدة من زرع نخاع البلاعم يمكن أن يخفف البروتيني الرئوي في الفئران 28،29، وهذه الطريقة لتحديد الضامة من الثقافات GM-CSF قد تساعد على زيادة فعالية هذا العلاج المقترحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR) (MOP-جرانت 119503) والعلوم والهندسة مجلس الطبيعية في كندا (NSERC). NSERC كما دعمت دراسية الصيف ليارد ومعتمد من AA YD من جامعة كولومبيا البريطانية (UBC) مع منح زمالة لمدة 4 سنوات، ويدعم AA من قبل CIHR مع جائزة طالب دراسات عليا ماجستير (كلية الدراسات العليا-M). نشكر كالفين Roskelley للحصول على المساعدة مع الاداة المستخدمة لتوليد الصور في الشكل (2). نحن نعترف أيضا بدعم من جامعة كولومبيا البريطانية الحيوان والتدفق الخلوي المرافق.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
| Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
| Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Sterile 100 mm x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
| Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37 °C before using. |
| Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |
References
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).
- Lari, R., et al. Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis--complexity in the control by GM-CSF and. Bone. 40 (2), 323-336 (2007).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).
- Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes. J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).
- Brasel, K., et al. Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice. Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).
- Segura, E., Amigorena, S. Inflammatory dendritic cells in mice and humans. Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Goodridge, H. S., et al. Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a 'phagocytic synapse. Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).
- Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation. Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).
- Vander Lugt, B., et al. Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation. Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).
- Shibata, Y., et al. GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1. Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models. J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Poon, G. F., et al. Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures. J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. cells solicit their own help from T cells. J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).
- de Belder, A. N., Wik, K. O. Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate. Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , Wiley, J., & Sons, Inc. Champter 6, Unit 6.2 (2001).
- Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells. Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).
- Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: 'Exhausted' or Alert and Waiting. J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).
- Contreras, I., et al. Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions. PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).
- Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid. J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).
- Grauer, O., et al. Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique. Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).
- Suzuki, T., et al.
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), (2014).
