Abstract
המקרופאגים ותאים דנדריטיים (DCS) הם תאים חיסוניים מולדים נמצא ברקמות ואיברים הלימפה כי לשחק תפקיד מפתח בהגנה מפני פתוגנים. עם זאת, הם קשים לבודד בכמות מספקת כדי ללמוד אותם בפירוט, ולכן, במבחנת מודלים פותחו. בתרבויות במבחנה של מקרופאגים עצם שמקורם במח ותאי דנדריטיים הם ומבוססים ושיטות בעל ערך עבור מחקרים אימונולוגית. כאן, שיטת culturing וזיהוי הוא DCS ו מקרופאגים מתרבה אחת של תאים במח עצם עכבר העיקרי באמצעות גורם מגרת מושבת מקרופאג גרנולוציט ציטוקינים (GM-CSF) מתוארת. פרוטוקול זה מבוסס על ההליך הוקם ראשון שפותח על ידי ואח 'לוץ. בשנת 1999 עבור DCs עצם שמקורם במח. התרבות היא הטרוגנית, הכוללת MHCII ו hyaluronan fluoresceinated (FL-HA) משמשים כדי להבחין מקרופאגים DCs בשלה ובוגרת. GM-CSF אלה מתקבלים מקרופאגים פרוvide מקור נוח של מקרופאגים נגזר במבחנה כי הדומים מקרופאגים מכתשיים בשני הפנוטיפ ותפקוד.
Introduction
כמה בשיטות תרבות במבחנה תוארו ליצור מקרופאגים עצם שמקורם במח (BMDMs) ו DCs עצם שמקורם במח (BMDCs) באמצעות אחד או שילוב של גורמי גדילה. BMDMs יכול להיווצר על ידי culturing תאים במח העצם או באמצעות גורם מגרה המושבה מקרופאג (M-CSF) או GM-CSF 1,2. לקבלת BMDCs, תוספת של ליגנד FLT3 לתרבות מח עצם מוליד DCs קלאסית plasmacytoid לא חסיד (CD11c גבוה / גבוהה CD11c MHCII lo, B220 + בהתאמה) לאחר 9 ימים בתרבות 3,4. לעומת זאת, תאים שאינם חסידים שנוצרו לאחר 7 עד 10 ימים בתרבות עם GM-CSF לבד 5,6, GM-CSF ו- IL-4 7, או GM-CSF ו FLT3 ליגנד 8,9 ליצור BMDCs יותר מקרוב דומת DCs הדלקתית (גבוה CD11c, MHCII גבוהה CD11b +) 10. בעוד תרבויות חוץ גופית אלה משמשים ליצירת מקרופאגים אוDCS, לא ברור אם כל תרבות מולידה אוכלוסיות טהורות. לדוגמא, אם כי תאים חסידים בתרבויות-CSF GM מתוארים להיות מקרופאגים 5, התאים לא חסידים מאותה התרבות משמשים DCs 6,11-13, עם ההנחה כי הם הומוגנית וכל השתנות שנצפתה היא עקב שלבי ההתפתחות השונים 14,15. יתר על כן, מחקרים מצאו GM-CSF כדי להוות גורם צמיחה חיוני להתפתחות מקרופאג המכתשית in vivo 16,17, וניתן להשתמש במבחנה כדי לייצר מקרופאגים מכתשיים דמוי 16,17,18.
מלבד דבקות, הנהלים להפקה מאקרופאגים DCs ממח עצם מטופלים-CSF GM תרבויות דומים מאוד המצביע על ההטרוגניות יכול להתקיים בתוך תרבויות מח עצם GM-CSF. זה אכן נראה את המקרה כפי שני מסמכים לדווח על נוכחות של BMDMs בשבריר לא חסיד של תרבויות BMDC. במאמר אחד, הם identified אוכלוסייה של תאים כמו CD11c +, CD11b +, באמצע MHCII, MerTK +, ו CD115 +, אשר הביע חתימה ביטוי גנים שדמה יותר מכול מקרופאגים מכתשיים והיה לו יכולת מופחתת להפעיל תאי T 19. המאמר השני בשימוש MHCII ו FL-HA לזהות אוכלוסייה המכתשית מקרופאג דמוי (+ CD11c, MHCII אמצע / נמוך, FL-HA גבוהה) כי היה נבדל לא מפותחים (+ CD11c, MHCII באמצע, FL-HA נמוך) ובוגרת DCS (CD11c +, MHCII גבוהה), הן phenotypically והן מבחינה תפקודית 18. שני העיתונים הללו ממחישים כי GM-CSF תרבויות BMDC הן הטרוגניים, המכילים את שני מקרופאג ואוכלוסיות DC המציין טיפול שיש לנקוט כאשר לפרש נתונים מתרבויות BMDC.
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד מח עצם, תאי מח עצם התרבות GM-CSF, ולזהות את מכתשי מקרופאג דמויהאוכלוסייה מן DCs בשלה ובוגרת בתרבות מח העצם על ידי cytometry זרימה באמצעות FL-HA מחייב וביטוי MHCII. הליך זה מבוסס על הליך הוקמה של לוץ ואח 6 והוא מסוגל לייצר 5 -. 10 x 10 6 תאים לא חסיד ביום 7 של תרבות 10 מ"ל. התרבות היא שמיש מימים 7 עד 10 ומניבת אוכלוסייה הטרוגנית של מקרופאגים, DCS בשלה ובוגרת, כמו גם אבות חלקים ביום 7. זה מספק שיטה פשוטה לגדול ולבודד במבחנה המכתשית דמוי מקרופאגים בכמויות גדולות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עכברים היו מורדמים בהתאם המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בבעלי חיים למחקר בעלי חיים אתיים על ידי נהלים שאושרו על ידי אוניברסיטת ועדת טיפול בבעלי חיים קולומביה הבריטית.
1. רכישת השעית מח עצם תא בודד עכבר עצם הירך לבין השוקה
- הפעל ארון בטיחות ביולוגית (BSC) 15 דקות לפני תחילת ההליך לטהר אוויר ארון ולאפשר ייצוב זרימת אוויר, אז משטח BSC נקיים / הספרים עם אתנול 70%. הקפד שהטקסט יהיה סטרילי ככל האפשר עבור מכלול של הפרוטוקול. אין לחתוך את העצמות בתנאים לא סטריליים.
- הכינו כלי לנתיחה על ידי השריית באתנול 70% (1 זוג מספריים לנתיחה, 2 זוגות מלקחיים), תמיסת מלח מאוזן של האנק עם 5% נסיוב עגל עוברית (HBSS-FCS), צלחות פטרי סטרילי (100 מ"מ x 15 מ"מ), 1 מזרקים מ"ל, 26½ מחטים מד, צינורות אוסף חרוטי (15 מ"ל או 50 מ"ל), ומגבות נייר של BSC.
- להרדים את העכבר באמצעותפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת האתיקה במחקר בבעלי החיים של המוסד. תביא לתוך BSC, למקם על גבי מגבות נייר אחד או שתיים ולרסס את העכבר עם אתנול 70%.
- ב BSC, לפתוח בסביבה נקייה מחיידקים צלחת סטרילי פטרי, aliquot 10 מ"ל של HBSS-FCS לבסיס 1 - 2 מ"ל אל המכסה.
- מניחים את העכבר על הבטן שלה עם הגב כלפי מעלה להרים את העור סביב הסעיפים החזה עם האצבעות של היד הלא דומיננטית. השתמש במספריים לעשות חתך שבו העור יוסר.
- יחזיק בשני הקצוות של החתך, קצה אחד עם כל יד ובזהירות לפרק את העור סביב העכבר מהגב אל הבטן, להמשיך למשוך אותו עד שני קצוות נפגשים החתך ב בבטן.
- הפוך את העכבר על בטן פונה כלפי מעלה, ועם יד אחת למשוך את החצי התחתון של העור כלפי מטה לכיוון הרגל, לשמור שהפיל את העור עד שהרגליים נחשפות.
- החזיקו את כף הרגל של העכבר למעלה וחתך את גידי אכילס מעל מפרק הקרסולרצועות חיבור שרירי רגל בקצה התחתון של עצם השוק עם מספריים. זה מרפה את הרגל מעצמות הרגל.
- בעוד מחזיק את הרגל על ידי כף הרגל, לחתוך את השרירים והרצועות במספריים בכל רחבי מפרק הברך בקצה התחתון של עצם הירך לנתק את שרירי הירך מן הרגל התחתונה. שימוש במלקחיים כדי למשוך התירו שרירים בעדינות הרחק שׁוֹקִיתִי ומשטחי ירך. יש להיזהר שלא לנתק את עורק הירך כדי למנוע דימום כבד.
- ביד אחת נאחזה ברגל, לחץ כלפי מטה מספריים פתוחים בקצה העליון של עצם הירך במפרק הירך, לסובב את הרגל ומשוכים בעדינות כדי להפריד את הירך מן מפרק הירך תוך שימוש במספריים עוברים את הסינון הסופי חינם הרגל מהגוף.
- מנקודה זו ואילך, רק להחזיק את הרקמה עם מלקחיים סטרילית. תחזיק את הרגל בקצה אחד לשלוף את הרגל על אחרים.
הערה: זה לא צריך לדרוש כוח רב, כפי רצועות חיבור נחתכות בשלב1.9. לחלופין, לחתוך את השוקה בדיוק מעל הקרסול שם העצם הוא התמזג. - החזק את הרגל עד סוף דיסטלי של עצם הירך עם קבוצה אחת של מלקחי סוף הפרוקסימלי של הטיביה שוקית עם אחר, בזהירות לכופף, ועצמות השוק בכיוון ההפוך של מפרק הברך על מנת להפריד אותם מן הירך פיקת הברך.
- שימוש במלקחיים כדי לנתץ את הרצועות והשרירים הנותרים עדיין מחוברת עצמות הרגל התחתונה. הנה, להסיר את השוקית יחד עם רקמות החיבור עם מלקחיים כפי שהוא קטן מדי כדי להיות סמוק עבור תאים במח עצם. מניח את השוקה ניקתה על מכסת צלחת פטרי ההפוכה.
- החזק את הקצה התחתון של עצם הירך עם קבוצה אחת של מלקחיים פיקת הברך עם אחר, לכופף את פיקת הברך ואת הרקמות הסובבות בכיוון ההפוך של המפרק להסרה. לאחר מכן לנקות את הנותרים רקמות החיבור של הירך; משייך אותם עם מלקחיים, ומניח אותו על מכסת צלחת פטרי ההפוכה. מחק את פיקת הברך.
- חזור על 1.7- 1.13 עם הרגל השנייה במידת הצורך. מעבירים את העצמות עד 1.6 מ"ל צינורות microcentrifuge המכילה 1 מ"ל HBSS-FCS סטרילי לתחבורה במידת הצורך.
- מניחים את העצמות על מכסה צלחת הפוכה פטרי, עם 1 - 2 מ"ל של HBSS-FCS, להשתמש במלקחיים כדי לנקות רקמות שיורית עדיין מחוברת הטיביה הירך, ולאחר מכן להעביר את עצמות לבסיס של צלחת פטרי המכילה 10 מ"ל של HBSS- FCS. לחלופין, לנקות את העצמות ולהסיר המצורפת רקמות שרירות באמצעות נייר רטוב אתנול 70%.
- חותכים כל העצמות בחצי במספריים. חלקית להגן על צלחת פטרי עם מכסה סטרילי תוך צמצום כדי להבטיח את העצמות להישאר בצלחת. לחלופין, לחתוך את הקצה של כל עצם לאפשר שטיפה בשלב הבא.
- צרף 26½ המחט G אל מזרק 1 מ"ל, ותנסחו 1 מ"ל HBSS-FCS מצלחת פטרי. הכנס את קצה המחט לתוך סוף פיסת עצם לשטוף את תאי מח עצם (רקמה אדומה רכה בתוך העצמות). הכנס את המחט לתוך הראששל העצם ואת הקצה הפתוח, עד שכל המח בצבע האדום מוסר. שים את העצמות כמו בצבע לבן.
- להעביר כל גושים גלויים של מח עצם באמצעות המזרק כמה פעמים כדי ליצור השעית תא בודדת.
- מחק את העצמות הסמוקות. השתמש פיפטה 10 מ"ל לערבב את ההשעיה תא היטב ולהעביר אל צינור איסוף. יש לשטוף את צלחת פטרי פעם אחת עם 5 מ"ל של HBSS-FCS לאיסוף תאים שיורית בצלחת. מניחים את התאים על הקרח.
הערה: מח עצם השעית התא עדיין קיימא אם מאוחסן במשך 2 - 3 שעות ב 4 ° C.
ציפוי 2. Culturing של תאים במח העצם (BMCs)
- כן ריאגנטים והאספקה הבאים.
- כן תאי דם אדום (RBC) חיץ תמוגה על ידי ביצוע אמוניום כלוריד 0.84% בתמיסה סופית של 2 מ"מ טריס pH 7.2, ואז לעקר ידי סינון דרך מסנן 0.2 מיקרון.
- כן תקשורת BMC על ידי הוספת 10% FCS, 20 HEPES מ"מ, חומצת אמינו חיוניות 1x, 55 & #181; M 2-mercaptoethanol, 50 U / ml פניצילין סטרפטומיצין, 1 מ"מ פירובט נתרן, ו -2 מ"מ L- גלוטמין עד בינוני RPMI 1640.
- השג זמין מסחרי רקומביננטי GM-CSF או להשתמש GM-CSF המכיל supernatant מן AG8.653 תאי מיאלומה טרנספקציה עם גן GM-CSF 20. קבע את הריכוז של GM-CSF ב supernatant ידי ELISA ומוסיפים את המקבילה של 20 ng / ml לתקשורת BMC.
- ספין למטה התאים במח העצם 314 XG במשך 5 דקות. הגלולה היא אדומה, בשל RBCs. ב BSC, לשאוב supernatant באמצעות פיפטה פסטר זכוכית סטרילית מצורף ואקום יניקה, לשחרר את הכדור על ידי הקשה, ולאחר מכן להוסיף 10 מ"ל של חיץ תמוגה RBC. וורטקס כדי resuspend את התאים דגירה במאגר תמוגה RBC בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
- הוסף 10 מ"ל של HBSS-FCS ואז ספין התאים ב 314 XG במשך 5 דקות ו לשאוב supernatant. שים את התא גלולה כמו צבע לבן. Resuspend תאים בנפח הרצוי של התקשורת BMC.
- ספירת resuspended-תאים באמצעות hemocytometer לאחר מכתים תאים מתים עם trypan כחול 0.4%.
הערה: אם מח עצם מאחד הרגל (יחיד הטיביה הירך) משמש, resuspend ב 5 מ"ל של התקשורת BMC, לקחת 10 μl של השעיה התא לדלל אותו עם 70 μl של 0.4% trypan כחול, ומערבבים היטב ולהעביר 10 μl של דילול תא 1/8 לתא hemocytometer. ספירת תאי קיימא ארבעה רביעים: הממוצע של ארבע הספירה ברבע x גורם לדילול x 10 4 = מספר תאים לכל מיליליטר. עצם הירך לבין השוקה מרגל אחת תניב בדרך כלל כ 2 - 4 x 10 7 תאים לאחר תמוגה RBC. - להעריך את המספר 10 מ"ל מנות של תרבויות מח עצם דרושי ניסויים המשך המבוססים על מספר התאים הכוללים דרוש לניסויים בסוף התרבות.
הערה: כל מנה דורשת 2 x 10 6 תאים במח עצם על זריעה ראשונית ותשואות 5 - 10 x 10 6 תאים ביום 7.- עליquot את המספר הכולל של תאים עבור ציפוי לתוך צינור חדש, ספין למטה ב 314 XG במשך 5 דקות, לשאוב supernatant, ו resuspend התאים ב 4 x 10 מ"ל 6 תאים / מדיה BMC.
- הכינו צלחת 100 מ"מ x 15 מ"מ פטרי סטרילית חדשה עם 9.5 מ"ל של התקשורת BMC המכיל 200 ng של GM-CSF (רקומביננטי או מ- GM-CSF המכיל supernatant). הוסף 500 μl של 4 x 10 6 תאים / תאים במח העצם מ"ל למרכז של צלחת פטרי עבור ריכוז סופי של 2 x 10 מ"ל 5 תאים / 10 מ"ל.
הערה: חשוב להשתמש בצלחת פטרי סטרילית לא צלחת בתרבית רקמה. כמו כן, בעת הוספת התאים, להבטיח תאים נשארים מתרכזות במרכז ולמזער הפרעה את הכלים אחרי הזריעה ובמהלך שינויי תקשורת. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. זהו יום 0 בתרבות. - ביום 3, להוסיף 10 מיליליטר של תקשורת הטריה BMC המכילה 200 ng של GM-CSF על כל מנה של תאי. תשמור על עצמך כדי למזער הפרעת of התאים המרוכזים השעיה. הנפח הכולל של תרבית תאים הוא כעת 20 מ"ל.
- שימו לב התאים תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה 100X. שים לב רבים שאינם חסידים תאים (עגולה) וכמה תאים חסידים (שטוחים). תאים בקבוצות של שלושה או ארבעה עלי כותרת הדומה של פרח ניתן לראות, המציין שגשוג.
- ביום 6 לבצע שינוי תקשורת וחצי. מוציאים בזהירות 10 מ"ל של מדיה לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל סטרילי, ספין למטה ב 314 XG במשך 5 דקות, לשאוב וזורקים supernatant.
- Resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל של התקשורת טריים BMC המכיל 20 ng / ml של GM-CSF, מערבולת בעדינות ומוסיפים לתבשיל תרבית תאים המקורי בנפח כולל של 20 מ"ל. שימו לב התאים תחת המיקרוסקופ.
הערה: תרבות יום 7 צריכה להיות ב 70% או יותר confluency עם תאים שטוחים חסיד ועננים צפופים של תאים עגולים לא חסידים.
3. איסוף הכנת BMDC ו BMDMs עבור cytometry זרימה
- <li> שמור את כל המאגרים ב 4 מעלות צלזיוס.
- קציר תאים מהיום 7 עד היום 10. כדי לקצור את התאים, ההעברה ראשונה 10 מיליליטר של supernatant תרבות צינור איסוף 50 מיליליטר חרוטים, ואז להטות את המנה אנכית בכ -30 מעלות לשטוף את המנה על ידי pipetting 10 מ"ל הנותרים תרבות מהחלק העליון של המנה. חזור על זה לשטוף 5 פעמים, בכל פעם סיבוב הצלחת על ידי שליש.
- מעביר את 10 מ"ל שאריות תאים לאותו צינור האיסוף וזורק את הצלחת תאים חסידים.
הערה: השטיפות תסרנה תאים שאינם חסידים חסיד רופף; את התאים החסידים השטוחים עמידים הכביסות. בדרך כלל, בין 5 - 10 x 10 6 תאים לא חסידים צפויים מצלחת אחד בכל יום 7 ו 2 - 5 x 10 6 תאים ביום 10, אם כי לוץ et al. דיווח 10 x 10 6 תאים ביום 10. התאים החסידים לא נלקחים בדרך כלל. עם זאת, אם תאים אלה צריכים להיות לעומת התאים שאינם החסידים, ניתן להסיר הם כדלקמן. הוסף 5 מ"ל של 0.7 mM EDTA ב 1x PBS, pH 7.4 כדי בצלחת לאחר שהתאים לא חסיד יוסרו, לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, פיפטה למעלה ולמטה כדי להסיר את התאים חסיד ולאסוף בצינור נפרד. - ספין למטה התאים שנאספו 314 XG במשך 5 דקות ו לשאוב supernatant. Resuspend ב 5 מ"ל מדיה סטרילי BMC ב 4 ° C, מערבולת בעדינות לתערובת, לספור באמצעות כחול hemocytometer trypan.
הערה: כל מנה תניב 5 - 10 x 10 6 לא חסידי תאים מתרבים יום 7. מעתה ואילך, לבצע את כל השלבים על 4 מעלות צלזיוס. - עבור ניתוח תזרים cytometric, העברה 2 x 10 5 תאים עבור כל דגימה לתוך 5 מיליליטר צינורות קלקר עגול תחתונים, להוסיף 300 μl של חיץ FACS על 4 מעלות צלזיוס (שנאגר פוספט 1x המלוח, 2 EDTA מ"מ ו 2% אלבומין בסרום שור) לכל לִטעוֹם.
- ספין תאים למטה 314 XG במשך 5 דקות ו לשאוב supernatant. שים לב גלולה לבנה, אטום גלויה בביתהחלק התחתון של הצינור.
- תאים Resuspend ב 100 μl של Ab קולטן Fc ללא תווית לחסום קולטני Fc מחייב (supernatant השתמש 1/10 מ 2.4G2 לייצר קו תא מיאלומה) דגירה במשך 20 דקות ב 4 ° C. לאחר מכן להוסיף 300 μl של חיץ FACS לטעום כל, מערבולת בעדינות, ואז ספין למטה התאים ב 314 XG במשך 5 דקות ו לשאוב supernatant.
- תאים Resuspend ב 100 μl של CD11c-PeCy7 על 0.2 מיקרוגרם / מ"ל, כחול Gr1 פסיפיק ברמה של 0.25 מיקרוגרם / מ"ל, MHCII-APC ב 0.05 מיקרוגרם / מ"ל, ו FL-HA בכ 2 מיקרוגרם / מ"ל לזהות מקרופאגים DCs.
הערה: FL-HA הוכן בבית באמצעות והעמסה ומלח נתרן חומצה היאלורונית תרנגול מסרק כפי שתוארה לעיל 21. - דגירה במשך 20 דקות ב 4 ° C כדי לאפשר מחייב את פני התא. הוספת 300 μl של חיץ FACS לטעום כל, מערבולת בעדינות, ואז ספין למטה התאים ב 314 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C ו לשאוב supernatant הערה:. אם ביונוגדנים tinylated משמשים 3.8, לחזור 3.8 - 9 עם-streptavidin ניאון.
- שטפו תאים עם עוד 300 μl של חיץ FACS, מערבולת בעדינות לתערובת ספין למטה התאים ב 314 XG במשך 5 דקות. לשאוב supernatant ו resuspend התאים 200 μl של חיץ FACS המכיל 0.1 - 0.2 מיקרוגרם לכל מ"ל של יודיד propidium או DAPI לתייג תאים nonviable. תאים מוכנים כעת תזרים cytometric ניתוח 22.
הערה: ראה תוצאות ואיור 3 לפרטים של האוכלוסיות וכיצד התאים היו מגודרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תרשים זרימה המסכם את השלבים העיקריים של שיטה זו מוצגת באיור 1. הצפיפות והמורפולוגיה של תרבות מח עצם בזמנים שונים של התרבות מוצגות באיור 2. באותו יום 1, התאים הם קטנים ודלילים אבל ביום 3, יש יותר תאים, וחלקם גדולים יותר ועוד כמה החלו לדבוק. במשך היום 6 קיימים חסיד מובהק שברים שאינם חסידים (איור 2 א). התרבות ניתן לקצור מהיום 7 - 10 עם אחוז גבוה יותר של CD11c + תאים נוכחים ביום 10. האיור 2B מראה את התרבות 7 יום לפני הקציר, כמו גם שברי תא חסידים ולא חסיד המופרד. השבר החסיד מורכב של התאים לאחר שטיפות האור להסיר את השבריר לא חסיד. השבר לא חסיד הוא מועשר מאוד עבור תאים עם מורפולוגיה הדנדריטים, אשר ניתן לראות בצורה ברורה יותר של im מוגדל באופן דיגיטליגילים של הריבועים באיור 2B. לאחר השבר לא חסיד מוסר (יום 7 או 10 ימים), התאים מנותחים על ידי זרימת cytometry לאחר תיוג עם נוגדני ניאון כנגד סמנים פני תא מפתח, כמתואר לעיל. איור 3 מראה זרימת נציג cytometry מגרשים של לא חסיד חלק של התרבות ב יום 7 ויום 10.
לזיהוי הוא מאקרופאגים DCS, השער + CD11c ו Gr1 - תאים לאחר gating הראשון על גודל תאי חיים (איור 3 א 'וב'). ביום 7 התרבויות, CD11c + Gr1 - האוכלוסייה בשבריר של התאים הלא-חסיד הוא בדרך כלל 60 עד 70% של תאים חיים הכולל, וזה עלה ל 90% או יותר ביום 10 (איור 3 ב). CD11c + Gr1 - אוכלוסיית היום 7 ויום 10 ניתן לחלק לשלוש תת ראשית באמצעות MHCII ו FL-HA בינדיng: MHCII באמצע / הנמוך FL-HA מחייב מקרופאגים גבוה (P1), MHCII באמצע FL-HA המחייב נמוך (P2) תאים המכיל DCs הבוגר ובלתי FL-HA הגבוהה MHCII מחייב DCs נמוך בוגר (P3) (איור 3 ג ו אסמכתא 18 ). FL-HA הנמוכה, האוכלוסייה הנמוכה MHCII (P0) שנצפתה ביום 7 הוכח מכיל אבות עבור תאי P1-P3 18. אוכלוסייה זו אינה ניכרת ביום 10 רומז כי התבגרות נוספת של התרבות התרחשה. זו נתמכת גם על ידי האחוז הגבוה יותר של תאי CD11c בתרבות כמו גם באחוזים גבוהים במקצת של אוכלוסיות P2 ו P3 DC ביום 10. האיור 3D מציג MerTK, נחשב סמן מקרופאג, מבוטא בכמות גבוהה הוא מקרופאג בשלה DC אוכלוסיות (P1 ו- P2), אך מתבטאות במידה נמוכה על DCs הבוגרת (תאי P3). יש לציין, ניתוח של שבריר חסיד כדי לגלות את נוכחותם של P0, P1 ו-P2 אוכלוסיות, אבל לא אוכלוסיית P3 הבוגרת DC (מידע לא מוצג). לפיכך מקרופאגים נמצאים שברים חסיד לא חסיד אבל רק DCs בוגרת נוכחים בשבריר לא חסיד.
. איור 1: תרשים זרימה הוא מצביע על השלבים העיקריים של שיטת תאים ראשוני נקצרים ממח העצם, מצופה ומתוחזק בתרבות במשך 7 - 10 ימים כאשר הם נקצרים לשימוש בניסויים נוספים, מטוהרים או בניתוח FACS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: בדיקה מיקרוסקופית של GM-CSF שמקורם בתאי מח העצם. א) תרבות מח עצם ביום 1, 3, ו -6 המציגה את הגידול במספר תא, שינויים במורפולוגיה, ואת הופעתה של שברים חסידים ולא חסיד מובהקים. B) לוח שמאלי מציג את תרבות מח עצם יום 7 ואת צפיפות התאים הטיפוסית. הלוח המרכזי מציג את יום 7 תאים חסיד לאחר הקציר של השבר לא חסיד ואת הפאנל הימני מראה את החלק היחסי לא חסיד וקצרו ביום 7. ריבועי מוגדלים באופן דיגיטלי תמונות של תאים בשבריר זה עם מורפולוגיה הדנדריטים. סרגל הסולם הלבן מייצג 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: הפנוטיפ הנציג של GM-CSF התרבות ב יום 7 ויום 10. לא חסידתאי המתרבות מסומנים עם CD11c, Gr1, MHCII, FL-HA, ו MerTK ביום 7 או 10 ימים ונותחו עבור הפנוטיפ שלהם על ידי cytometry זרימה. א) תאים היו מגודרים ראשון על גודל אז לחיות תאים. B) מציגים העלילה של תאים מגודרת עם CD11c ו Gr1 (סמן נויטרופילים / מונוציטים) ומזהה את CD11c + Gr1 - האוכלוסייה המכיל את מקרופאג ותאים דנדריטיים. Gating על אוכלוסייה זו, C) מראה את עלילת cytometry הזרימה של MHCII ו FL-HA מחייב, אשר מציג את ההפרדה של מקרופאגים כמו-המכתשים (P1) מ DCs המפותח (P2) ובוגרת DCS (P3), כמתואר פון et al. 18. ד) היסטוגרמות השוואת ביטוי MerTK בין P1 (מקרופאגים), P2 (DCS בשלה), ואוכלוסיות P3 (בוגרת DCS) ביום 7 ויום 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של figu זהמִחָדָשׁ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בכתב היד הזה, אנו מספקים שיטה להפקת מקרופאגים GM-CSF נגזר DCs מתרבה מח עצם עכבר אחת כי הוא עיבוד לוץ et al. 6. ביטוי MHCII ו FL-HA מחייב מבחינה בין DCs בשלה מקרופאגים בתרבות זו (ראו איור 3 ג), אשר בעבר כבר קשה. זה, יחד עם דו"ח נוסף על ידי Helft et al. 19, הדגים הטרוגניות בתוך תרבויות BMDC מושרה GM-CSF שהיו בעבר חשבו להיות DCs בלבד. Helft et al. 19 השתמש תנאי תרבות שונים לגמרי כדי ליצור BMDCs אך גם מצא אוכלוסייה מקרופאג משמעותית. GM-CSF המושרה מקרופאגים להידמות מקרופאגים מכתשיים ו- GM-CSF המושרה DCs להידמות DCs דלקתיות, ואילו בתוספת ליגנד FLT3 תרבויות BMDC לייצר DCs קלאסית plasmacytoid 3,4. אוכלוסיות DC ו מקרופאג שונים הם נצפו גם in vivo unדער תנאים ההומיאוסטטית ודלקתיים, ויש דיונים רבים בתחום לגבי מה מגדיר DC ו מקרופאג 10. זה נכון במיוחד כשמדובר DCs דלקתית נגזר מונוציטים וזה גם רלוונטי BMC זה. מכיוון שכך, חשוב להשתמש כמה סמנים פנוטיפי, נתונים תפקודיים, וייתכן שאף נתוני ביטוי גנים לאפיין אוכלוסייה מסוימת. אפשר גם כי במבחנה אלה אוכלוסיות DC ו מקרופאג יכולות להיות רחוקות יותר מתחלק כיותר סמנים פונקציונליים פנוטיפי מתגלים.
בשיטה זו, CD11c סמנים, Gr1, MHCII, ו FL-HA משמשות כדי להבחין מקרופאגים ותאים דנדריטיים בשלה ובוגרת בשבריר לא חסיד של תרבות BMC. זה שונה Helft et al. 19, שהשתמשו סמנים CD11c, CD11b, CD115, CD135, MerTK, ו MHCII להבחין אוכלוסייה מקרופאג מ DCs בוגרת. רמות הביטוי MerTK יכול distinguisשעות בין מקרופאגים (P1) ובוגרת DCS (P3), אבל לא DCs מפותחים (P2) (איור 3D). לפיכך FL-HA ו MHCII הם סמנים שימושי להפלות מקרופאגים מאוכלוסיות בשלה ובוגרת הן DC. מקרופאגים אלו הם גם מבחינה תפקודית נבדלים DCs בתרבות BMC זה וזה בא לידי ביטוי ביתר פירוט במקום אחר 18. בקצרה, לאחר גירוי LPS מקרופאגים BMC לייצר ציטוקינים שונים מאשר DCs בוגרת ואינו להפעיל תאי T נאיביים 18. מקרופאגים אלו גם דומים מקרופאגים מכתשיים, הן phenotypically והן מהבחינה התפקודית הוא לאגד FL-HA ולהביע CD11c, MerTK, CD200R, CD206 ו F4 / 80 ואחרי תוצרת גירוי LPS-α TNF עדיין אינן מסוגלות להפעיל תאי T נאיביים 18. עם זאת, ישנם גם הבדלים: מקרופאגים BMC הם CD11b + ויש לי רמות נמוכות של Siglec F לעומת לשעבר vivo המכתשית מקרופאגים, דבר המצביע על תאים אלה דומים אך לא מזוההקאל מקרופאגים מכתשיים.
ישנם מספר צעדים חשובים כדי להבטיח את הצלחת של פרוטוקול זה. חשוב לשמור על סטריליות מלחשוף במח העצם ואילך. כאשר נע פנימה והחוצה של BSC, לרסס בידיים עטויות כפפות וחפצים עם 70% אתנול. למרות זאת הוא מועיל לשטוף כלים באתנול 70% לעקר, אתנול הוא רעיל לתאים במח עצם, כך שאוויר-לייבש את הכלים להבטיח את אתנול התאדה לפני הבאת עצמות או תאים במגע איתם. בנוסף, להימנע פנייה רקמות העכבר או תאים עם ציוד שאינו סטרילי או ידיים במהלך תרומת מוח עצם. למרות פניצילין תוספת סטרפטומיצין מסופק בתקשורת, טיפול רשלני של התאים עשוי להוביל שמרים או זיהום פטרייתי. בנוסף, מאז תאים חיסוניים עם פעילות phagocytic נוצרים בתרבות זו, זיהום קטין לא יכול להיות מזוהה פשוט על ידי התבוננות תרבית התא מיקרוסקופית, ובכך הוא חשוב לזהות tהוא החותם של זיהום. לדוגמא, מספרים סלולריים עשויים להיות מופחתים לבין הביטוי של סמני הפעלת תא כגון CD40 ו CD86 עשוי להתארך כאשר נותחו על ידי cytometry זרימה. צבע מדיה עלול גם להפוך צהוב המשקף שינוי pH עקב זיהום. כאשר זיהום מתרחש, תרבות BMC היא שמישה. כדי לשמור על עקביות ניסיון, חשוב ליצור השעית תא בודדת ממח העצם על ידי vortexing ו להשיג ספירת תאי מדויקת להגדיר את תרבויות BMC. כמו כן, אם כל רקמת חיבור של העצם בסופו של השעית התא הבודדה, לסנן דרך פילטר 70 מיקרון סטרילי כדי להסיר אותו. תשואות תא אופייניות עבור צלחת אחת של השבר לא חסיד ביום 7 הן בין 5 - 10 x 10 6 תאים. מספרים סלולריים הם בדרך כלל אינדיקציה טובה כי הפרוטוקול הוא עובד טוב. עם הליך זה אנחנו בדרך כלל להשיג בין 2 - 5 x 10 6 תאים ביום 10, ואילו לוץ מדווח 10 x 10 6 תאים. אנו מבצעים תמוגה RBC על הדואר תאי מח עצם ראשוני ואילו הפרוטוקול ע"י לוץ et al. לא וכן הלאה שלב זה עשוי להיות אופציונאלי. וריאציות באחוז תאי CD11c כמו גם מספרים ואת הפרופורציות של מאקרופאגים DCs יכולות לנבוע ממקורות שונים או קבוצות של FCS ולכן זה קריטי לבדוק קבוצות חדשות של FCS על תרבויות BMC עבור תוצאות ניסוי עקביות. GM-CSF הריכוז היה נע בין 5 ng / ml ל -40 ng / ml וזה לא השפיע על תשואות התא באופן משמעותי. צפיפות תאים יכולה להשפיע גם על ההתבגרות של התרבות. לדוגמה, Helft et al. זורעי 1 x 10 7 תאים 4 מיליליטר תקשורת שפיקה אחוז יותר של תאים עם ביטוי MHCII הגבוה 19. נקודת הזמן כאשר תאים נקצרים יכולה להשפיע גם על אחוז אוכלוסיות נוכח השבר לא חסיד. תאים בדרך כלל נאספים בין ימים 7 - 10 25-27, אך כמה מחקרים לאסוף BMCs ביום 6 19,23,24. אם תאים יותר יש צורך, תרבות BMCsגדולות ב 150 מ"מ x 15 מ"מ צלחות פטרי ב 40 מ"ל באותו הצפיפות. במקרה זה שינוי תקשורת חצי נפח נעשה בשני יום 3 ויום 6 (כלומר, 20 מיליליטר של תקשורת סיר, תאים סובבים ויוחלף 20 טרי מיליליטר תקשורת השלימה עם 20 ng / RGM-CSF מיליליטר). הצלחות אלה בדרך כלל ליצור 3 - 6 x 10 7 תאים לכל צלחת ביום 7. FL-HA הוא מגיב חשוב, יחד עם MHCII, להבדיל מקרופאגים DCs בשלה ובוגרת בתרבות BMC. לכן ברגע שהוא עשה, לכיל FL-HA לשימוש על תאים המכונים להיקשר HA constitutively כגון מקרופאגים מכתשיים 18 או תאים BW5147 T ולאשר הספציפיות שלו או באמצעות נוגדן CD44 HA-חוסם (KM-81, זמינים מסחרית), HA ללא תווית או תא CD44 לקוי. CD11c - Gr1 + תאים בתרבות יכולים לתפקד בתור בקרה פנימית על תאי HA-מחייבים עישון, ואת קרינת מינוס בקרה אחת (FMO) או CD44 תרבויות לקוי BMC, מומלצים settin המדויקגרם של השער מחייב FL-HA.
למרות ניסויים יכולים להתבצע באמצעות תרבות הטרוגנית, רצוי להעשיר עבור DC או אוכלוסייה מקרופאג או באמצעות מיון תא מופעל קרינה או חרוזים מגנטיים מצופה נוגדן 18 מבוסס על הביטוי של CD11c, Gr1, MHCII, ו HA מחייבים. ניסויים אפשריים כוללים גירוי עם אגוניסטים לקולטן דמוי אגרה כגון LPS למדוד ייצור הפעלה ציטוקינים, מבחני הפעלת תא T, או אפיון נוסף על ידי cytometry הזרימה. לדוגמה, לאחר 8 או 24 שעות של גירוי, cytometry זרימה ניתן להשתמש כדי למדוד מכתים תאיים ציטוקינים ו / או תיוג פני השטח של מולקולות שיתוף גירוי כגון CD40 ו CD86, כמתואר 18. נהלי תיוג ציטוקינים תאיים דורשים טיפול מקדים של תאים עם Brefeldin A, אשר מונע הפרשה ומאפשר ציטוקינים לבנות בתוך התא. עבור מבחני הפעלת תא T לערב את לואהדינג של אנטיגן כמו הפפטיד OVA ידי תא מציגי אנטיגן, מקרופאגים מטוהרים מבוסס על MHCII ו HA מחייב לא יפעיל תאי T תוך בשלה ובוגרת DCs יהיה 18. יצוין כי הליך המיון לבד יוכל להפעיל את התאים הדנדריטים במידה מסוימת, מה שהופך אותו חשוב לכלול בקרות שליליות בכל הניסויים.
כמו בכל שיטה חוץ גופית, יש יתרונות וחסרונות בהשוואה לשימוש בתאי vivo או-vivo לשעבר. החיסרון הוא כי תאים שמקורם במבחנה לא בדיוק לחקות in vivo תאים אבל יש להם את היתרון שהם יכולים להיווצר בכמות מספקת על מנת לאפשר אנליזה פונקציונלית ביוכימיים, משהו שהוא בדרך כלל לא ריאלי עם תאים לשעבר vivo. שיטה זו של מקרופאג והזדהות DC תאפשר למחקר עתידי להשיג אוכלוסיות תאים הומוגנית יותר מתרבות עם הטרו מעריך בעברgeneity. כמו מקרופאגים מטוהרים מן תרבות GM-CSF זה דומה מקרופאגים מכתשיים מן הריאה 18, הוא מספק מקור נוח של מקרופאגים דמוי המכתשית לניתוח במבחנה. לדוגמה, מקרופאגים HA מחייב אלה יכולים לשמש מסך עבור תרופות שמשנות פונקציה מקרופאג המכתשית ולחקור מנגנוני זיהום שחפת Mycobacterium והתנגדות. בהתחשב התגלית האחרונה כי GM-CSF והשתלות מקרופאג M-CSF עצם שמקורם במח יכולים להקל proteinosis ריאתי בעכברים 28,29, בשיטה זו כדי לזהות מקרופאגים מתרבויות-CSF GM עשויה לסייע להגביר את היעילות של טיפול מוצע זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) (גרנט MOP-119,503) ואת למדעי הטבע וההנדסה המועצה של קנדה (NSERC). NSERC גם נתמך studentships הקיץ י"ד ו- AA י"ד נתמך על ידי אוניברסיטת קולומביה הבריטית (UBC) עם פרס המילגה 4 שנים, AA נתמך על ידי CIHR עם פרס שני סטודנט לתואר שני (CGS-M). אנו מודים קלווין Roskelley לסיוע עם מיקרוסקופ השתמשו כדי ליצור את התמונות באיור 2. כמו כן, אנו מכירים תמיכה מן מתחם Cytometry Animal ושפל UBC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
| Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
| Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Sterile 100 mm x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
| Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37 °C before using. |
| Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |
References
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).
- Lari, R., et al. Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis--complexity in the control by GM-CSF and. Bone. 40 (2), 323-336 (2007).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).
- Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes. J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).
- Brasel, K., et al. Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice. Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).
- Segura, E., Amigorena, S. Inflammatory dendritic cells in mice and humans. Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Goodridge, H. S., et al. Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a 'phagocytic synapse. Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).
- Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation. Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).
- Vander Lugt, B., et al. Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation. Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).
- Shibata, Y., et al. GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1. Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models. J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Poon, G. F., et al. Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures. J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. cells solicit their own help from T cells. J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).
- de Belder, A. N., Wik, K. O. Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate. Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , Wiley, J., & Sons, Inc. Champter 6, Unit 6.2 (2001).
- Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells. Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).
- Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: 'Exhausted' or Alert and Waiting. J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).
- Contreras, I., et al. Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions. PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).
- Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid. J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).
- Grauer, O., et al. Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique. Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).
- Suzuki, T., et al.
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), (2014).
