Abstract
Makrofager og dendrittiske celler (DCS) er medfødte immunceller som finnes i vev og lymfoide organer som spiller en nøkkelrolle i forsvaret mot patogener. Men de er vanskelig å isolere i tilstrekkelig antall for å studere dem i detalj, derfor har in vitro-modeller er utviklet. In vitro kulturer av benmarg-avledede makrofager og dendrittiske celler er veletablerte og verdifulle metoder for immunologiske studier. Her er en fremgangsmåte for dyrking og identifisering av både DC og makrofager fra en enkelt kultur av musebenmargceller ved å bruke cytokin granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) er beskrevet. Denne protokollen er basert på etablert prosedyre som først ble utviklet av Lutz et al. i 1999 for benmargavledede DC. Kulturen er heterogen, og MHCII og fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) brukes for å skille makrofager fra umodne og modne DC. Disse GM-CSF avledet makrofager probringe en praktisk kilde til in vitro-avledet makrofager som tett ligner alveolære makrofager i både fenotype og funksjon.
Introduction
Flere in vitro kultur metoder har vært beskrevet for å generere benmarg-avledede makrofager (BMDMs) og benmarg-avledede DC (BMDCs) ved hjelp av en eller en kombinasjon av vekstfaktorer. BMDMs kan genereres ved dyrking av benmargceller enten ved hjelp av makrofag kolonistimulerende faktor (M-CSF) eller GM-CSF 1,2. For BMDCs, gir tilsetningen av FLT3 ligand til benmargen kulturen opphav til ikke-adherente klassiske og plasmacytoid DC (CD11c høy / MHCII høy og CD11c lo, B220 + henholdsvis) etter 9 dager i kultur 3,4. I motsetning til dette, ikke-adherente celler samlet etter 7 til 10 dager i kultur med GM-CSF alene 5,6, GM-CSF og IL-4-7, eller GM-CSF og FLT3-ligand 8,9 generere BMDCs nærmere ligner inflammatoriske DC (CD11c høy, MHCII høy CD11b +) 10. Selv om disse in vitro kulturer blir brukt til å generere eller makrofagerDC, er det uklart om hver kultur gir opphav til rene populasjoner. For eksempel, selv om adherente celler i GM-CSF-kulturer er beskrevet å være makrofager 5, de ikke-adherente celler fra samme kultur brukes som DCS 6,11-13, med den forutsetning at de er homogene og eventuelle observerte variasjon er på grunn av ulike stadier av utviklingen 14,15. Videre har studier funnet GM-CSF for å være en viktig vekstfaktor for alveolar macrophage utvikling in vivo 16,17, og kan anvendes in vitro for å generere alveolære makrofager lignende 16,17,18.
Annet enn tilslutning, fremgangsmåtene for generering av makrofager og DCS fra GM-CSF-behandlede benmargkulturer er svært like, noe som tyder på heterogenitet kan eksistere innenfor GM-CSF-benmargkulturer. Dette synes faktisk å være tilfelle da to artikler rapportere tilstedeværelsen av BMDMs i den ikke-adherente fraksjon av BMDC kulturer. I ett papir, identifikasjon deed en populasjon av celler som CD11c +, CD11b +, MHCII mid, MerTK + og CD115 +, som uttrykte en genuttrykk signatur som mest lignet alveolære makrofager og hadde en redusert evne til å aktivere T-celler 19. Den andre papiret som brukes MHCII og FL-HA for å identifisere en alveolar makrofag-lignende befolkningen (CD11c +, MHCII mid / low, FL-HA høy) som var forskjellig fra umoden (CD11c +, MHCII midten, FL-HA lav) og moden DC (CD11c +, MHCII høy), både fenotypisk og funksjonelt 18. Disse papirene både illustrerer at GM-CSF BMDC kulturer er heterogene, som inneholder både makrofag og DC populasjoner indikerer at forsiktighet bør tas når man tolker data fra BMDC kulturer.
Denne protokollen beskriver hvordan du isolere benmargen, kultur benmargceller i GM-CSF, og identifisere den alveolære makrobefolkningen fra de umodne og modne DC i benmargen kultur ved flowcytometri ved hjelp av FL-HA bindende og MHCII uttrykk. Denne prosedyren er basert på den etablerte fremgangsmåten i Lutz et al 6, og er i stand til å generere 5 -. 10 x 10 6 ikke-adherente celler på dag 7 i en 10 ml kultur. Kulturen er brukbart fra dager 7-10 og gir en heterogen populasjon av makrofager, umodne og modne DC, samt noen stamfedre på dag 7. Dette gir en enkel metode for å vokse og isolere in vitro alveolær-lignende makrofager i store mengder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus ble avlivet i samsvar med den kanadiske Rådet for dyrestell retningslinjer for etisk dyreforsøk ved prosedyrer godkjent av University of British Columbia Animal Care Committee.
1. Anskaffelse av en enkelt celle Bone Marrow Suspensjon fra mus femur og Tibia
- Slå på et biologisk sikkerhetskabinett (BSC) 15 min før start av prosedyren for å rense skap luft og tillate luftstrøm stabilisering, deretter rense / spray BSC overflaten med 70% etanol. Hold alt så sterilt som mulig for helheten av protokollen. Ikke kutt bein under ikke-sterile forhold.
- Forbered disseksjon verktøy ved bløtlegging i 70% etanol (1 par disseksjon saks, 2 par av tang), Hank Balanced Salt Solution med 5% føtalt kalveserum (HBSS-FCS), sterile petriskåler (100 mm x 15 mm), 1 ml sprøyter, 26½ måle nåler, koniske samling rør (15 ml eller 50 ml), og papirhåndklær i BSC.
- Avlive mus ved hjelpprotokoller godkjent av institusjonens dyret forskningsetisk komité. Bringe inn i BSC, legg på toppen av en eller to tørkepapir og spray mus med 70% etanol.
- I BSC, åpner en steril petriskål aseptisk, alikvoter 10 ml HBSS-FCS til basen og 1 - 2 ml til lokket.
- Plasser musen på magen med baksiden vendt opp og løft huden rundt thorax seksjoner med fingrene på den ikke-dominante hånd. Bruk saks til å gjøre et snitt der huden er løftet.
- Hold på begge ender av kuttet, den ene enden med hver hånd, og trekk forsiktig fra hverandre huden rundt musen fra baksiden til magen, fortsetter å trekke til to ender av snittet møtes på magen.
- Flip musen til magen vendt oppover, og med en hånd trekke den nedre halvdel av huden ned mot benet, holde trekke tilbake huden inntil benene er utsatt.
- Hold foten av musen opp og kutte Achilles sener over ankelleddet ogsenene som forbinder musklene til foten ved den nedre ende av tibia med saks. Dette løsner foten fra leggbena.
- Mens holder foten opp ved foten, kuttet muskler og leddbånd med saks rundt kneleddet ved den nedre enden av lårbenet for å bryte lårmusklene fra leggen. Bruk pinsett til å dra forsiktig løsnet muskler unna fibular og femoral overflater. Pass på å ikke bryte lårarterie å unngå kraftig blødning.
- Med en hånd å holde på foten, trykk ned åpne saks på den øvre enden av femur ved hofteleddet, rotere benet og trekk forsiktig å skille femur fra hofteleddet mens du bruker saks til å foreta den endelige kuttet til gratis benet fra kroppen.
- Fra dette punktet og utover, bare holde vevet med steril pinsett. Hold på beinet i den ene enden og trekke av foten på den andre.
MERK: Dette bør ikke kreve mye kraft, som forbinder leddbånd er kuttet i trinn1,9. Alternativt kutte tibia like over ankelen der benet er smeltet. - Hold ben ved den distale ende av lårbenet med ett sett av tenger og proksimale ende av tibia og fibula med en annen, nøye bøy tibia og fibula i motsatt retning av kneleddet for å skille dem fra femur og patella.
- Bruk pinsett til å trekke ned de resterende sener og muskler fortsatt festet til leggen bein. Her, ta av fibula sammen med bindevev med tang som det er for lite til å bli spylt for benmargceller. Plasser renset tibia på invertert petriskål lokk.
- Holde den nedre ende av lårbenet med ett sett med pinsett og patella med en annen, bøyes patella og omkringliggende vev i den motsatte retning av den felles for fjerning. Rengjør deretter av de resterende bindevev fra femur; trekke dem bort med pinsett, og plassere den på invertert petriskål lokk. Kast patella.
- Gjenta 1.7- 1,13 med det andre benet hvis nødvendig. Overfør bein til 1,6 ml mikrosentrifugerør inneholder 1 ml sterilt HBSS-FCS for transport om nødvendig.
- Plasser bein på den omvendte petriskål lokk, med 1 - 2 ml HBSS-FCS Bruk pinsett til å rense eventuelle gjenværende vev fortsatt festet til tibia og femur, deretter overføre bein til bunnen av petriskål inneholder 10 ml HBSS- FCS. Alternativt rense bein og fjerne festet muskelvev ved hjelp av en 70% etanol gjennomvåt vev.
- Skjær hver av bein i to med saks. Delvis skjerme petriskål med en steril lokk mens kutte for å sikre bein bo i fatet. Alternativt kan kutte enden av hvert ben for å tillate spyling i neste trinn.
- Fest 26½ G nål videre til en ml sprøyte, og utarbeide en ml HBSS-FCS fra petriskål. Sett tuppen av nålen inn i enden av et bein stykke og spyle ut benmargceller (myk rød vev inne bein). Sett nålen inn i hodetav benet og den åpne ende, til hele den rødfargede margen er fjernet. Observer bein som hvit i fargen.
- Pass noen synlige klumper av benmarg gjennom sprøyte et par ganger for å danne en enkelt celle suspensjon.
- Kast blussende bein. Bruke en 10 ml pipette for å blande cellesuspensjonen godt og overføres til oppsamlingsrøret. Skyll petriskål en gang med 5 ml HBSS-FCS å samle gjenværende cellene i fatet. Plassere cellene på is.
MERK: benmargscellesuspensjonen er fortsatt levedyktig dersom den oppbevares for 2-3 timer ved 4 ° C.
2. Plating og dyrking av benmargceller (BMCs)
- Forbered følgende reagenser og forbruksmateriell.
- Forbered røde blodceller (RBC) lyseringsbuffer ved at 0,84% ammoniumklorid i en sluttløsning på 2 mM Tris pH 7,2, og deretter sterilisere ved filtrering gjennom et 0,2 mikron filter.
- Forbered BMC media ved å tilsette 10% FCS, 20 mM HEPES, 1x unødvendig aminosyre, 55 & #181; M 2-merkaptoetanol, 50 U / ml penicillin og streptomycin, 1 mM natriumpyruvat, og 2 mM L-glutamin til RPMI medium 1640.
- Oppnå kommersielt tilgjengelig rekombinant GM-CSF, eller bruk GM-CSF inneholdende supernatant fra Ag8.653 myelom celler transfektert med GM-CSF-genet 20. Bestemme konsentrasjonen av GM-CSF i supernatanten ved hjelp av ELISA og tilsett tilsvarende 20 ng / ml til BMC media.
- Spinn ned benmarg ved 314 xg i 5 min. Pelleten er rød, på grunn av RBC. I BSC, aspirer supernatanten ved hjelp av en steril glass Pasteur pipette knyttet til vakuum sug, løsne pellet ved å trykke på, og deretter legge til 10 ml av RBC lysis buffer. Vortex for å resuspendere cellene og inkuberes i RBC lyseringsbuffer ved romtemperatur i 5 min.
- Tilsett 10 ml HBSS-FCS deretter spinne cellene ved 314 xg i 5 minutter og aspirer supernatanten. Observer cellepelleten som hvit farge. Resuspender cellene i ønskede volum av BMC media.
- Tell resuspended-celler ved hjelp av en hemocytometer etter farging døde celler med 0,4% trypanblått.
MERK: Hvis benmarg fra det ene benet (single tibia og femur) brukes, resuspender i 5 ml BMC media, ta 10 ul av cellesuspensjonen og fortynne den med 70 ul av 0,4% trypanblått, bland godt og overfør 10 pl 1/8 celle fortynning til hemocytometer kammeret. Telle levedyktige celler i fire kvadranter: gjennomsnittet av de fire kvadrant tellinger x fortynningsfaktor x 10 4 = antall celler pr ml. En femur og tibia en fra det ene benet vil vanligvis gi omtrent 2 - 4 x 10 7 celler etter RBC lysis. - Anslå antallet av 10 ml retter av benmargkulturer som trengs for nedstrøms eksperimenter basert på det totale antallet celler som trengs for forsøk på slutten av kulturen.
MERK: Hver tallerken krever 2 x 10 6 benmargceller ved første seeding og gir 5 - 10 x 10 6 celler på dag syv.- Aliquot det totale antall celler for plettering inn i et nytt rør, spinne ned ved 314 xg i 5 minutter, aspirer supernatanten og resuspender cellene ved 4 x 10 6 celler / ml i BMC media.
- Klargjør en ny steril 100 mm x 15 mm petriskål med 9,5 ml BMC medier som inneholder 200 ng av GM-CSF (rekombinant eller fra GM-CSF som inneholder supernatant). Legg 500 ul av de 4 x 10 6 celler / ml benmargsceller til midten av petriskålen for den endelige konsentrasjon på 2 x 10 5 celler / ml i 10 ml.
MERK: Det er viktig å bruke en steril petriskål ikke en vev kultur parabolen. Også, når du legger til cellene, sikre celler forblir konsentrert i sentrum og minimere inngrepene i oppvasken etter såing og under medie endringer. Inkuber cellene ved 37 ° C og 5% CO2. Dette er dag 0 i kultur. - På dag tre, tilsett 10 ml fersk BMC medier som inneholder 200 ng av GM-CSF til hver rett av celler. Pass på å minimere forstyrrelser of cellene konsentrert i suspensjon. Totalt volum av cellekultur er nå 20 ml.
- Observere cellene under lysmikroskop ved 100 x forstørrelse. Observere mange ikke-adherente celler (runde) og noen adherente celler (flat). Celler i grupper på tre eller fire som likner blader på en blomst kan ses, noe som indikerer spredning.
- På dag 6 utføre en halv endring av medium. Fjern forsiktig 10 ml medier i en steril 50 ml konisk rør, spinn ned på 314 xg i 5 min, aspirer og kast supernatanten.
- Cellepelleten suspenderes i 10 ml friskt BMC medium inneholdende 20 ng / ml GM-CSF, forsiktig vortex og legge til den opprinnelige cellekulturskål for et totalvolum på 20 ml. Observer celler under mikroskop.
MERK: Dag 7 kultur bør være 70% eller mer i konfluens med heft flate celler og tette skyer av runde ikke-heftende celler.
3. Samle og Forbereder BMDC og BMDMs for flowcytometrisystemer
- <li> Hold alle buffere ved 4 ° C.
- Høste cellene fra dag 7 til dag 10. For å høste celler, første overføring 10 ml av kultursupernatanten til en 50 ml konisk oppsamlingsrøret, deretter vippe fatet vertikalt ved omtrent 30 grader og vaske skålen ved pipettering de resterende 10 ml av kultur fra toppen av fatet. Gjenta denne vaske 5 ganger, hver gang dreie fatet med en tredjedel.
- Overfør de gjenværende 10 ml celler til det samme oppsamlingsrøret og forkaste platen og adherente celler.
MERK: De vasker vil fjerne ikke-heftende og løst heftende celler; de flate adherente celler er motstandsdyktig mot vask. Vanligvis mellom 5 - Det forventes 10 x 10 6 ikke-heftende celler fra en plate på dag 7 og 2 - 5 x 10 6 celler på dag 10, selv om Lutz et al. rapporterte 10 x 10 6 celler på dag 10. festede celler ikke blir normalt tatt. Men hvis disse cellene trenger for å bli sammenlignet med de ikke-adherente celler, Kan de fjernes på følgende måte. Tilsett 5 ml 0,7 mM EDTA i 1 x PBS, pH 7,4 til skålen etter at de ikke-adherente celler blir fjernet, Inkuber ved 37 ° C i 5 minutter, pipette opp og ned for å fjerne adherente celler og oppsamles i et separat rør. - Spinne ned de oppsamlede cellene ved 314 xg i 5 minutter og aspirer supernatanten. Resuspender i 5 ml sterilt BMC media ved 4 ° C, vortex forsiktig for å blande, og telle ved hjelp av trypanblått og hemocytometer.
MERK: Hver tallerken vil gi 5 - 10 x 10 6 ikke-heftende celler fra en dag syv kultur. Fra nå utføre alle trinnene på 4 ° C. - For flowcytometrisk analyse, overføre 2 x 10 5 celler i hver prøve inn i rundbunnede rør 5 ml av polystyren, tilsett 300 ul FACS-buffer ved 4 ° C (1 x fosfatbufret saltvann, 2 mM EDTA og 2% bovint serumalbumin) til hvert prøve.
- Spinn-celler ned ved 314 xg i 5 minutter og aspirer supernatanten. Observere en synlig hvit, ugjennomsiktig pellet påbunnen av røret.
- Resuspender celler i 100 ul umerket Fc-reseptor-Ab å blokkere Fc-reseptor-binding (Bruk 1/10 supernatant fra 2.4G2 produserende myeloma-cellelinje) og inkuberes i 20 min ved 4 ° C. Deretter legger 300 ul FACS-buffer til hver prøve, forsiktig vortex, så spinne celler nedover ved 314 xg i 5 minutter og aspirer supernatanten.
- Resuspender celler i 100 ul CD11c-PeCy7 0.2 ug / ml, GR1-Pacific Blue på 0,25 ug / ml, MHCII-APC på 0,05 ug / ml, og FL-HA ved omtrent 2 ug / ml for å identifisere makrofager og DCS.
MERK: FL-HA ble utarbeidet i huset ved hjelp av fluorescein og hanekam hyaluronsyre natriumsaltet som tidligere beskrevet 21. - Inkuber i 20 minutter ved 4 ° C for å tillate binding til celleoverflaten. Tilsett 300 ul FACS-buffer til hver prøve, forsiktig vortex, så spinne celler nedover ved 314 xg i 5 minutter ved 4 ° C og aspirer supernatanten. MERK: Hvis biotinylated antistoffer brukes i 3.8, gjenta 3,8 til 9 med fluorescerende-streptavidin.
- Vask cellene med en annen 300 ul FACS-buffer, forsiktig vortex å blande og spinne ned cellene ved 314 xg i 5 minutter. Aspirer supernatanten og resuspender cellene i 200 pl FACS buffer inneholdende 0,1 til 0,2 ug pr ml propidiumjodid eller DAPI for å merke ikke-levedyktige celler. Cellene er nå klar for flowcytometrisk analyse 22.
MERK: Se resultater og figur 3 for detaljer om populasjoner og hvordan cellene ble inngjerdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et flytdiagram som oppsummerer de viktigste trinnene i denne fremgangsmåten er vist i figur 1. Tettheten og morfologi av benmargskulturen ved forskjellige tider av kultur er vist i figur 2. Ved dag 1, cellene er små og sparsom, men ved dag 3, det er flere celler, noen er større og noen har begynt å følge. Ved dag 6 er det en klar tilhenger og ikke-klebende fraksjon (figur 2A). Kulturen kan høstes fra dag 7-10 med en høyere prosentandel av CD11c + celler tilstede på dag 10. Figur 2B viser dag 7 kulturen før innhøsting, så vel som de separerte adherente og ikke-adherente cellefraksjoner. Den tilhenger brøkdel består av cellene igjen etter lyset vasker som fjerner den ikke-heftende fraksjon. Den ikke-adherente fraksjon er sterkt anriket på celler med en dendrittisk morfologi, som kan sees tydeligere i den digitalt forstørret imaldre i de innfellinger i figur 2B. Når den ikke-heftende fraksjon blir fjernet (dag 7 eller dag 10), blir cellene analysert ved flow-cytometri etter merking med fluoriserende antistoffer mot viktige celleoverflatemarkører, slik som beskrevet ovenfor. Figur 3 viser representative flowcytometri plott av den ikke-klebende fraksjon av kulturen ved dag 7 og dag 10.
For identifisering av både makrofager og DC, gate på CD11c + og GR1 - celler etter første gating på størrelse og levende celler (figur 3A og B). I dag 7 kulturer, den CD11c + GR1 - befolkningen i den ikke-heftende cellefraksjon er vanligvis 60 til 70% av totalt antall levende celler, og dette er økt til 90% eller mer på dag 10 (figur 3B). Den CD11c + GR1 - befolkning på dag 7 og dag 10 kan deles inn i tre hoved undergrupper ved hjelp MHCII og FL-HA binding: MHCII mid / low FL-HA bindende høye makrofager (P1), MHCII mid FL-HA bindende lav (P2) celler som inneholder umodne DC, og MHCII høy FL-HA bindende lave modne DC (P3) (Figur 3C og referere 18 ). FL-HA lav, MHCII lav befolkning (P0) observert på dag 7 har vist seg å inneholde stamfedre for P1-P3 celler 18. Denne populasjonen er ikke tydelig på dag 10 antyde at ytterligere modning av kulturen har oppstått. Dette understøttes også av den større andel av CD11c celler i kultur samt litt høyere prosenter av P2 og P3 DC-populasjonene på dag 10. Figur 3D viser MerTK, anses å være en makrofag markør, er sterkt uttrykt på både makrofag og umodne DC populasjoner (P1 og P2), men er uttrykt i en lavere grad på modne DC (P3 celler). Spesielt, analyse av adherente fraksjon avslører tilstedeværelsen av P0, P1 ogP2 populasjoner, men ikke P3 modne DC befolkningen (data ikke vist). Således makrofager er til stede i de adherente og ikke-adherente fraksjoner men bare modne DC er til stede i den ikke-heftende fraksjon.
. Figur 1: En Flow diagram som viser de viktigste trinnene i Metode Primær celler er høstet fra benmargen, belagt og holdt i kultur i 7 - 10 dager når de høstes for bruk i videre forsøk, renset eller brukt i FACS analyse. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: mikroskopisk undersøkelse av GM-CSF Avledet benmargceller. EN) benmargen kultur på dag 1, 3 og 6 viser økningen i celletall, forandringer i morfologi, og fremveksten av distinkte adherente og ikke-adherente fraksjoner. B) Venstre panel viser dag 7 benmargen kultur og den typiske celletetthet. Den midtre panelet viser dag 7 adherente celler etter innhøsting av de ikke-adherente fraksjon og den høyre panel viser den ikke-adherente fraksjon høstet på dag 7. innfellinger er digitalt forstørret bilder av cellene i denne fraksjonen med dendrittisk morfologi. Den hvite skala bar representerer 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representant Phenotype av GM-CSF kultur på dag 7 og dag 10. Non-tilhengerceller fra kulturen er merket med CD11c, GR1, MHCII, FL-HA, og MerTK på dag 7 eller dag 10 og analysert med henblikk på deres fenotype ved strømningscytometri. A) Celler ble først separert på størrelse så lever-celler. b) viser en tomt på gated celler med CD11c og GR1 (nøytrofile / monocytt markør) og identifiserer CD11c + GR1 - befolkningen som inneholder makrofag og dendrittiske celler. Gating på denne populasjonen, C) viser flowcytometri handlingen i MHCII og FL-HA-binding, som viser separasjonen av alveolære lignende makrofager (P1) fra umodne DC (P2) og modne DC (P3), som beskrevet i Poon et al. 18. D) Histograms sammenligne MerTK uttrykk mellom P1 (makrofager), P2 (umodne DC), og P3 populasjoner (modne DC) på dag 7 og dag 10. klikk her for å se en større versjon av denne Figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskriptet, gir vi en fremgangsmåte for generering av GM-CSF avledet makrofager og DC fra en enkelt mus benmargskultur som er tilpasset fra Lutz et al. 6. MHCII ekspresjon og FL-HA-binding skiller mellom umodne DC og makrofager i denne kultur (se figur 3C), som tidligere har vært vanskelig. Dette, sammen med en annen rapport fra Helft et al. 19, viser heterogenitet innen GM-CSF-indusert BMDC kulturer som tidligere ble antatt å være bare DC. Helft et al. 19 brukes helt andre kulturbetingelser for å generere BMDCs ennå fant også en signifikant makrofag befolkning. GM-CSF-induserte makrofager ligne alveolære makrofager og GM-CSF-indusert DC ligne inflammatoriske DC, mens FLT3 ligand supplert BMDC kulturer produsere klassisk og plasmacytoid DC 3,4. Ulike DC og macrophage populasjoner er også observert in vivo unDer homeostatiske og inflammatoriske tilstander, og det er mye diskusjon på feltet om hva som definerer en DC og en makrofag 10. Dette er spesielt sant når det kommer til stammer fra monocytter inflammatoriske DC, og dette er også relevant i denne BMC. Det er således viktig å bruke flere fenotypiske markører, funksjonelle data, og muligens genuttrykk data for å karakterisere en bestemt populasjon. Det er også mulig at disse in vitro-DC og makrofag populasjoner kan være ytterligere sub-oppdelt i flere funksjonelle og fenotypiske markører blir oppdaget.
I denne fremgangsmåten blir den markører CD11c, GR1, MHCII, og FL-HA brukes for å skille makrofager fra umodne og modne dendrittiske celler i den ikke-adherente fraksjon av BMC kulturen. Dette er annerledes enn Helft et al. 19, som brukte markører CD11c, CD11b, CD115, CD135, MerTK, og MHCII å skille en makrofag befolkning fra modne DC. MerTK uttrykk nivåer kan distinguish mellom makrofager (P1) og modne DC (P3), men ikke umodne DC (P2) (figur 3D). Dermed FL-HA og MHCII er nyttige markører for å diskriminere makrofager fra både umodne og modne DC populasjoner. Disse makrofager er også funksjonsmessig forskjellig fra DC i denne BMC kulturen, og dette blir demonstrert i mer detalj et annet sted 18. Kort fortalt, etter LPS stimulering BMC makrofager produserer ulike cytokiner enn modne DC og aktiverer ikke naive T-celler 18. Disse makrofager også likne alveolære makrofager, både fenotypisk og funksjonelt både bind FL-HA og uttrykke CD11c, MerTK, CD200R, CD206 og F4 / 80 og etter LPS stimulering produsere TNF-α ennå ikke er i stand til å aktivere naive T-celler 18. Det er imidlertid også forskjeller: BMC makrofager er CD11b + og har lavere nivåer av Siglec F sammenlignet med eks-vivo-alveolar makrofager, noe som tyder på disse cellene er like, men ikke identifisertcal å alveolære makrofager.
Det er flere viktige tiltak for å sikre suksess for denne protokollen. Det er viktig å opprettholde sterilitet fra eksponere benmargen og utover. Når du flytter inn og ut av BSC, spray hansker og objekter med 70% etanol. Selv om det er nyttig å skylle verktøy i 70% etanol for å sterilisere, er etanol giftig for benmargceller, så luft-tørke verktøy og sikre etanolen er fordampet før bringe bein eller cellene i kontakt med dem. I tillegg unngå kontakt mus vev eller celler med ikke-sterilt utstyr eller hender under benmargen innhøsting. Selv om penicillin og streptomycin tilskudd er gitt i media, kan uforsiktig håndtering av cellene føre til gjær eller soppsporer. I tillegg, siden immune celler med fagocytisk aktivitet er generert i denne kulturen, er mindre kontaminering kan ikke detekteres ved ganske enkelt å observere den cellekultur mikroskopisk, er derfor viktig å identifisere than signerer for forurensning. For eksempel kan celletall reduseres og ekspresjonen av celleaktiveringsmarkører slik som CD40 og CD86 kan økes når de analyseres ved hjelp av strømningscytometri. Media farge kan også gulne reflekterer en pH-forandring på grunn av forurensning. Når forurensning oppstår, er det BMC kulturen ubrukelig. For å opprettholde eksperimentelt konsistens, er det viktig å generere en enkeltcelle-suspensjon fra benmargen ved virvling og få en nøyaktig legemer for å sette opp de BMC kulturer. Også, hvis noen bindevev fra benet ender opp i enkeltcellesuspensjon, filtreres gjennom et sterilt 70 pm filter for å fjerne det. Typisk celleutbytte for en plate av den ikke-adherente fraksjon på dag 7 er mellom 5 - 10 x 10 6 celler. Celle tall er vanligvis en god indikasjon på at protokollen fungerer godt. Med denne fremgangsmåten vi vanligvis får mellom 2-5 x 10 6 celler på dag 10, mens Lutz rapporterer 10 x 10 6 celler. Vi utfører RBC lysis på the innledende benmargceller, mens protokollen av Lutz et al. ikke og så dette trinnet kan være valgfritt. Variasjoner i prosent av CD11c celler samt tall og proporsjonene av makrofager og DC kan oppstå fra forskjellige kilder eller grupper av FCS og så er det viktig å teste nye grupper av FCS på BMC kulturer for konsistente eksperimentelle resultater. GM-CSF-konsentrasjonen ble variert fra 5 ng / ml til 40 ng / ml, og dette gjorde ikke påvirke celle yield. Celletettheten kan også påvirke modningen av kulturen. For eksempel Helft et al. utsådd 1 x 10 7 celler i 4 ml media som produserte en større prosent av celler med høy ekspresjon MHCII 19. Det tidspunkt da cellene er høstet kan også påvirke den prosentandel av befolkningsgrupper som er tilstede i den ikke-heftende fraksjon. Cellene er vanligvis samlet mellom dager 7 - 10 25-27, men noen studier samle BMCs på dag 6 19,23,24. Dersom flere celler er nødvendig, kultur BMCsi større 150 mm x 15 mm Petri-skåler i 40 ml ved samme tetthet. I dette tilfellet er et halv-volumendring media gjøres på både dag 3 og dag 6 (dvs. 20 ml av mediet fjernet, cellene spunnet ned og erstattes med friske 20 ml media supplert med 20 ng / ml RGM-CSF). Disse platene typisk generere 3 - 6 x 10 7 celler per tallerken på dag 7. FL-HA er en viktig reagent, sammen med MHCII, å skille makrofager fra umodne og modne DC i BMC kultur. Således når det er gjort, titrere FL-HA for bruk på celler som er kjent for å konstitutivt binde HA eksempel alveolære makrofager 18 eller BW5147-T-celler og bekrefte dets spesifisitet ved anvendelse av enten et HA-blokkerende CD44-antistoff (KM-81, kommersielt tilgjengelig), umerket HA eller en CD44 mangel celle. CD11c - GR1 + celler i kultur kan fungere som en intern kontroll for ikke HA-bindende celler, og en fluorescens minus én kontroll (FMO) eller CD44 mangel BMC kulturer er sterkt anbefalt for nøyaktig stilling av FL-HA-bindende gate.
Selv om forsøk kan utføres ved anvendelse av en heterogen kultur, er det tilrådelig å anrike for DC eller makrofag-populasjonen ved anvendelse av enten fluorescens-aktivert cellesortering eller antistoff-belagte magnetiske kuler 18 basert på ekspresjon av CD11c, GR1, MHCII, og HA-binding. Mulige eksperimenter inkluderer stimulering med Toll-lignende reseptor-agonister så som LPS for å måle aktivering og cytokinproduksjon, T-celle-aktiveringsanalyser, eller med ytterligere karakterisering ved strømningscytometri. For eksempel, etter 8 eller 24 timer for stimulering, strømningscytometri kan brukes til å måle intracellulær farging for cytokiner og / eller overflatemerking av kostimulerende molekyler så som CD40 og CD86, som beskrevet i 18. Intracellulære cytokin merkingsprosedyrer krever forbehandling av cellene med Brefeldin A, som forhindrer sekresjon og gjør det mulig for cytokin til å bygge seg opp inne i cellen. For T-celleaktivering analyser som involverer den loading av et antigen som OVA peptid av en antigenpresenterende celle, rensede makrofager basert på MHCII og HA bindende vil ikke aktivere T-celler, mens umodne og modne DC vil 18. Det skal bemerkes at sorteringsprosedyren alene kan aktivere dendrittiske celler til en viss grad, slik at det er viktig å inkludere negative kontroller i alle forsøk.
Som med en hvilken som helst in vitro-metode, det er fordeler og ulemper i forhold til ved bruk av in vivo eller ex-vivo-celler. Ulempen er at in vitro avledede celler kan ikke nøyaktig etterligner in vivo-celler, men de har den fordel at de kan frembringes i tilstrekkelig antall til å tillate funksjonell og biokjemisk analyse, noe som ofte ikke er mulig med eks-vivo-celler. Denne metoden for makrofag og DC identifikasjon vil tillate fremtidig forskning for å få mer homogene cellepopulasjoner fra en kultur med tidligere underappreciated heterogeneity. Som rensede makrofager fra denne GM-CSF kultur likne alveolære makrofager fra lungene 18, gir det en praktisk kilde til alveolære lignende makrofager for in vitro analyse. For eksempel, kan disse HA-bindende makrofager brukes til å screene for midler som modifiserer alveolar makrofagfunksjonen, og for å undersøke mekanismer for Mycobacterium tuberculosis-infeksjon og motstand. Gitt den nylige oppdagelsen av at GM-CSF og M-CSF benmarg-avledede makrofag-transplantasjon kan lindre pulmonal proteinosis i mus 28,29, kan denne fremgangsmåten for å identifisere makrofager fra GM-CSF-kulturer bidra til å øke effektiviteten av denne foreslåtte behandlingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av den kanadiske Institutes of Health Research (CIHR) (Grant MOP-119503) og Natural Sciences og Engineering Council of Canada (NSERC). NSERC støttes også sommerStipend til YD og AA YD er støttet av University of British Columbia (UBC) med en 4-årig fellesskap prisen, er AA støttet av CIHR med en graduate student master award (CGS-M). Vi takker Calvin Roskelley for å få hjelp med mikroskop brukes til å generere bildene i figur 2. Vi erkjenner også støtte fra UBC Animal og flowcytometri fasiliteter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
| Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
| Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Sterile 100 mm x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
| Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37 °C before using. |
| Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |
References
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).
- Lari, R., et al. Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis--complexity in the control by GM-CSF and. Bone. 40 (2), 323-336 (2007).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).
- Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes. J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).
- Brasel, K., et al. Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice. Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).
- Segura, E., Amigorena, S. Inflammatory dendritic cells in mice and humans. Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Goodridge, H. S., et al. Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a 'phagocytic synapse. Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).
- Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation. Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).
- Vander Lugt, B., et al. Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation. Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).
- Shibata, Y., et al. GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1. Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models. J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Poon, G. F., et al. Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures. J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. cells solicit their own help from T cells. J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).
- de Belder, A. N., Wik, K. O. Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate. Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , Wiley, J., & Sons, Inc. Champter 6, Unit 6.2 (2001).
- Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells. Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).
- Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: 'Exhausted' or Alert and Waiting. J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).
- Contreras, I., et al. Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions. PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).
- Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid. J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).
- Grauer, O., et al. Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique. Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).
- Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), (2014).
