Abstract
I macrofagi e le cellule dendritiche (DC) sono cellule immunitarie innate trovati nei tessuti e negli organi linfoidi che giocano un ruolo chiave nella difesa contro gli agenti patogeni. Tuttavia, essi sono difficili da isolare in numero sufficiente per studiarli in dettaglio, di conseguenza, sono stati sviluppati modelli in vitro. In vitro culture di osso macrofagi derivate dal midollo e cellule dendritiche sono metodi di valore ben consolidati e per gli studi immunologici. Qui, un metodo per la coltura e l'identificazione sia DC e macrofagi da una sola coltura di cellule del midollo osseo principale del mouse utilizzando il fattore stimolante le colonie di granulociti macrofagi citochina (GM-CSF) è descritto. Questo protocollo si basa sulla procedura stabilita prima sviluppato da Lutz et al. nel 1999 per l'osso DC derivate dal midollo. La cultura è eterogenea, e MHCII e acido ialuronico fluoresceinato (FL-HA) sono utilizzati per distinguere i macrofagi da DC immature e mature. Questi GM-CSF derivato macrofagi provide una comoda fonte di in vitro macrofagi derivati che ricordano da vicino macrofagi alveolari sia in fenotipo e la funzione.
Introduction
Diversi metodi in vitro di coltura sono stati descritti per generare osso macrofagi derivate dal midollo (BMDMs) e DC derivate dal midollo osseo (BMDCs) utilizzando uno o una combinazione di fattori di crescita. BMDMs può essere generato da coltura di cellule di midollo osseo utilizzando il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) o GM-CSF 1,2. Per BMDCs, l'aggiunta di FLT3 ligando alla cultura midollo osseo comporta non aderenti DC classici e plasmacitoidi (alta CD11c / MHCII alta e CD11c lo, B220 + rispettivamente) dopo 9 giorni di coltura 3,4. Al contrario, le cellule non aderenti generati dopo 7 a 10 giorni in coltura con solo GM-CSF 5,6, GM-CSF e IL-4 7, o GM-CSF e FLT3 ligando 8,9 generano BMDCs più da vicino assomiglia DC infiammatorie (alta CD11c, MHCII alta CD11b +) 10. Mentre queste colture in vitro sono utilizzati per generare macrofagi oDC, non è chiaro se ogni cultura dà luogo a popolazioni puri. Ad esempio, anche se le cellule aderenti nelle colture GM-CSF sono descritti come macrofagi 5, le cellule non aderenti dalla stessa cultura vengono utilizzati come DCS 6,11-13, con la presunzione che sono omogenei e ogni variabilità osservata è a causa di diversi stadi di sviluppo 14,15. Inoltre, gli studi hanno trovato GM-CSF di essere un fattore di crescita essenziale per lo sviluppo dei macrofagi alveolari in vivo 16,17, e può essere impiegato in vitro per generare macrofagi alveolari simile 16,17,18.
Oltre aderenza, le procedure per la generazione di macrofagi e cellule dendritiche da GM-CSF trattata colture di midollo osseo sono molto simili suggerendo eterogeneità possono esistere all'interno di GM-CSF colture di midollo osseo. Questo sembra davvero essere il caso come due documenti segnalare la presenza di BMDMs nella frazione non aderente di culture BMDC. In un articolo, che identified una popolazione di cellule come CD11c +, CD11b +, MHCII metà, MerTK + e CD115 +, che ha espresso una firma espressione genica che più assomigliava macrofagi alveolari e aveva una ridotta capacità di attivare le cellule T 19. La seconda carta utilizzata MHCII e FL-HA per identificare una popolazione macrofago-come alveolare (CD11c +, MHCII medio / basso, FL-HA alto), che è stato distinto da immaturi (CD11c +, MHCII metà, FL-HA basso) e maturo DC (CD11c +, MHCII alto), sia fenotipicamente e funzionalmente 18. Queste carte entrambe illustrano che le culture GM-CSF BMDC sono eterogenei, contenente sia macrofagi e le popolazioni DC che indicano che si deve prestare attenzione quando si interpretano i dati provenienti da culture BMDC.
Questo protocollo descrive come isolare il midollo osseo, cellule del midollo cultura ossee in GM-CSF, e identificare il alveolari macrofago-likepopolazione dalle DC immature e mature nella cultura midollo osseo di citometria a flusso utilizzando FL-HA vincolante e di espressione MHCII. Questa procedura è basata sulla procedura stabilita Lutz et al 6 ed è in grado di generare 5 -. 10 x 10 6 cellule non aderenti il giorno 7 di una cultura 10 ml. La cultura è utilizzabile da 7 a 10 giorni e produce una popolazione eterogenea di macrofagi, cellule dendritiche immature e mature, così come alcuni progenitori al giorno 7. Questo fornisce un metodo semplice per crescere e isolare in vitro macrofagi alveolari simili in grandi quantità.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I topi sono stati sacrificati in accordo con il Consiglio canadese sugli orientamenti cura degli animali per la ricerca animale etica da procedure approvate dalla University of Columbia Comitato Animal Care britannico.
1. L'acquisizione di una singola cella di midollo osseo Sospensione dal mouse femore e tibia
- Accendere una cappa di sicurezza biologica (BSC) 15 minuti prima dell'inizio della procedura per eliminare l'aria mobile e consentire la stabilizzazione del flusso d'aria, quindi pulire / spruzzo superficie BSC con il 70% di etanolo. Tenere tutto sterile come possibile per la totalità del protocollo. Non tagliare le ossa in condizioni non sterili.
- Preparare strumenti di dissezione da immersione in etanolo al 70% (1 paio di forbici dissezione, 2 paia di pinze), soluzione salina bilanciata di Hank con il 5% di siero fetale bovino (HBSS-FCS), piastre sterili (100 mm x 15 mm), 1 siringhe ml, 26½ aghi calibro, provette per la raccolta coniche (15 ml o 50 ml), e asciugamani di carta del BSC.
- Euthanize il mouse usandoprotocolli approvati dal comitato etico di ricerca animale dell'istituzione. Portare in BSC, posto in cima ad uno o due asciugamani di carta e spruzzare il mouse con il 70% di etanolo.
- Nel BSC, aprire una sterile Petri in modo asettico, un'aliquota di 10 ml di HBSS-FCS alla base e 1 - 2 ml al coperchio.
- Posizionare il mouse sul suo stomaco con il dorso rivolto verso l'alto e sollevare la pelle intorno alle sezioni del torace con le dita della mano non dominante. Usare le forbici per fare un'incisione in cui viene sollevato la pelle.
- Aggrappati a entrambe le estremità del taglio, una estremità con ogni mano e con attenzione separare la pelle intorno il mouse da dietro allo stomaco, continuare a tirare fino a due estremità dell'incisione incontrano alla stomaco.
- Capovolgere il mouse per lo stomaco rivolto verso l'alto, e con una mano tirare la metà inferiore della pelle verso la gamba, continuare a tirare indietro la pelle fino a quando le gambe sono esposte.
- Tenere il piede del mouse e tagliare i tendini di Achille sopra la caviglia ei legamenti che collegano i muscoli di fondo all'estremità inferiore della tibia con le forbici. Ciò allenta il piede dalle ossa delle gambe.
- Tenendo la gamba dal piede, tagliare i muscoli e legamenti con le forbici tutto il ginocchio all'estremità inferiore del femore per tagliare i muscoli della coscia dal braccio inferiore. Utilizzare pinze per estrarre delicatamente i muscoli allentati dal perone e le superfici femorale. Fare attenzione a non recidere l'arteria femorale per evitare gravi emorragie.
- Con una mano aggrappata al piede, premere forbici giù aperti all'estremità superiore del femore all'articolazione dell'anca, ruotare la gamba e tirare delicatamente per separare il femore dall'articolazione dell'anca mentre usando le forbici per fare il taglio finale alla libera la gamba dal corpo.
- Da questo punto in poi, contenere solo il tessuto con una pinza sterile. Tenere sulla gamba ad una estremità ed estrarre il piede sull'altro.
NOTA: Questo non dovrebbe richiedere molta forza, come i legamenti di collegamento sono tagliati in fase di1.9. In alternativa, tagliare la tibia appena sopra la caviglia dove si fonde l'osso. - Tenere la gamba dalla estremità distale del femore con una serie di pinze e dell'estremità prossimale della tibia e fibula con un altro, piegare accuratamente la tibia e perone nella direzione opposta del ginocchio per separarli dal femore e rotula.
- Utilizzare pinze per tirare giù i restanti legamenti e muscoli ancora attaccati alle ossa delle gambe inferiori. Qui, rimuovere il perone insieme con i tessuti connettivi con pinze in quanto è troppo piccolo per essere lavata per le cellule del midollo osseo. Posizionare la tibia pulita sul coperchio capovolto piastra di Petri.
- Tenere l'estremità inferiore del femore con una serie di pinze e rotula con un altro, piegare la rotula e tessuti circostanti nella direzione opposta del giunto per la rimozione. Poi pulire restante tessuto connettivo dal femore; tirando via con una pinza, e posizionarlo sul coperchio capovolto piastra di Petri. Eliminare la rotula.
- ripetere 1.7- 1.13 con l'altra gamba, se necessario. Trasferire le ossa a 1,6 ml provette da microcentrifuga contenente 1 ml sterile HBSS-FCS per il trasporto se necessario.
- Posizionare ossa sul coperchio piatto Petri invertita, con 1 - 2 ml di HBSS-FCS, utilizzare pinze per pulire qualsiasi tessuto residuo ancora attaccato alla tibia e femore, quindi trasferire le ossa alla base della piastra Petri contenente 10 ml di HBSS- FCS. In alternativa, pulire le ossa e rimuovere il tessuto muscolare collegata con un fazzoletto di carta imbevuto di etanolo al 70%.
- Tagliare ciascuna delle ossa a metà con le forbici. Parzialmente schermare la piastra di Petri con un coperchio sterile durante il taglio per garantire le ossa rimangono nel piatto. In alternativa, tagliare l'estremità di ogni osso per consentire lavaggio nel passaggio successivo.
- Fissare il 26½ ago G alla siringa 1 ml, e redige 1 ml HBSS-FCS dalla piastra di Petri. Inserire la punta di un ago nella fine di un pezzo di osso e scovare le cellule del midollo osseo (tessuti molli rosso all'interno delle ossa). Inserire l'ago nella testadell'osso e l'estremità aperta, fino a quando tutto il midollo colore rosso viene rimosso. Osservare le ossa come di colore bianco.
- Passare eventuali grumi visibili di midollo osseo attraverso la siringa alcune volte per formare una sospensione di cellule singole.
- Eliminare le ossa arrossate. Utilizzare una pipetta 10 ml per mescolare la sospensione cellulare bene e trasferire al tubo di raccolta. Lavare la piastra di Petri una volta con 5 ml di HBSS-FCS per raccogliere le cellule residue nel piatto. Mettere le cellule in ghiaccio.
NOTA: La sospensione di cellule del midollo osseo è ancora valida se immagazzinato per 2 - 3 ore a 4 ° C.
2. placcatura e la coltura di cellule del midollo osseo (BMC)
- Preparare i seguenti reagenti e materiali di consumo.
- Preparare rosso tampone di lisi dei globuli (RBC) facendo cloruro di ammonio 0,84% in una soluzione finale di 2 mM Tris pH 7,2, poi sterilizzare per filtrazione attraverso un filtro da 0,2 micron.
- Preparare supporti BMC con l'aggiunta del 10% di FCS, 20 mM HEPES, aminoacido non essenziale 1x, 55 & #181, M 2-mercaptoetanolo, 50 U / ml di penicillina e streptomicina, 1 mM di sodio piruvato, e 2 mM L-glutammina a RPMI medio 1.640.
- Ottenere disponibile in commercio ricombinante GM-CSF o GM-CSF usare contenente surnatante da AG8.653 cellule di mieloma trasfettate con il gene GM-CSF 20. Determinare la concentrazione di GM-CSF nel supernatante mediante ELISA e aggiungere l'equivalente di 20 ng / ml ai media BMC.
- Centrifugare le cellule del midollo osseo a 314 xg per 5 min. Il pellet è di colore rosso, a causa di globuli rossi. Nel BSC, aspirare il surnatante con una pipetta di vetro sterile Pasteur collegato a vuoto di aspirazione, allentare il pellet toccando, quindi aggiungere 10 ml di tampone di lisi RBC. Vortex per risospendere le cellule e incubare in tampone di lisi RBC a temperatura ambiente per 5 min.
- Aggiungere 10 ml di HBSS-FCS poi girare cellule a 314 xg per 5 minuti e aspirare il surnatante. Osservare il pellet cellulare come colore bianco. Risospendere le cellule in volume desiderato di supporto BMC.
- Contare il Resu-cellule trascorsa utilizzando un emocitometro dopo colorazione cellule morte con il 0,4% trypan blu.
NOTA: Se si usa il midollo osseo da una gamba (tibia singolo e femore), risospendere in 5 ml di mezzi BMC, prendere 10 ml di sospensione cellulare e diluire con 70 ml di 0,4% trypan blu, mescolare bene e trasferire 10 ml di la diluizione 1/8 cella alla camera emocitometro. Contare le cellule vitali in quattro quadranti: la media dei quattro quadranti conteggi x fattore di diluizione x 10 4 = numero di cellule per ml. Un femore e tibia da una gamba generalmente produrrà circa 2 - 4 x 10 7 cellule dopo RBC lisi. - Stima il numero di 10 ml piatti di colture di midollo osseo necessari per gli esperimenti a valle in base al numero di cellule totali necessari per esperimenti alla fine della cultura.
NOTA: Ogni piatto richiede 2 x 10 6 cellule del midollo osseo a seeding iniziale e rendimenti 5 - 10 x 10 6 cellule a giorno 7.- Aliquot il numero totale di cellule per la placcatura in una nuova provetta, centrifugare a 314 xg per 5 minuti, aspirare il surnatante, e risospendere le cellule a 4 x 10 6 cellule / ml in mezzi BMC.
- Preparare una nuova sterile 100 millimetri x 15 mm piastra Petri con 9,5 ml di mezzi BMC contenente 200 ng di GM-CSF (ricombinante o da GM-CSF contenente surnatante). Aggiungere 500 ml di i / cellule del midollo osseo ml 4 x 10 6 cellule al centro del piatto Petri per la concentrazione finale di 2 x 10 5 cellule / ml in 10 ml.
NOTA: E 'importante utilizzare un non piastra di Petri sterile un piatto di coltura di tessuti. Inoltre, quando si aggiungono le cellule, affinché le cellule rimangono concentrate al centro e minimizzare il disturbo ai piatti dopo la semina e durante le modifiche di supporto. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2. Questo è il giorno 0 nella cultura. - Il giorno 3, aggiungere 10 ml di mezzi freschi BMC contenente 200 ng di GM-CSF per ogni piatto di cellule. Fare attenzione a minimizzare il disturbo of cellule concentrati in sospensione. Il volume totale di coltura cellulare è ora 20 ml.
- Osservare le cellule sotto il microscopio ottico a ingrandimento 100X. Osservare numerose cellule non aderenti (rotonde) e un paio di cellule aderenti (piatti). Le cellule in gruppi di tre o quattro petali che ricordano di un fiore può essere visto, indicando la proliferazione.
- Il giorno 6 eseguire un cambiamento mezzo dei media. Rimuovere con cautela 10 ml di media in un tubo da 50 ml conica sterile, spin down a 314 xg per 5 minuti, aspirare e scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 10 ml di media BMC freschi contenenti 20 ng / ml di GM-CSF, delicatamente vortice e aggiungere al piatto originale coltura cellulare per un volume totale di 20 ml. Osservare le cellule sotto il microscopio.
NOTA: Giorno 7 cultura dovrebbe essere al 70% o superiore in confluenza con cellule piatte aderenti e nuvole dense di cellule non aderenti rotonde.
3. Raccolta e preparazione BMDC e BMDMs per citometria a flusso
- <li> Mantenere tutti i buffer a 4 ° C.
- Raccogliere le cellule dal giorno 7 al giorno 10. Per raccogliere le cellule, primo trasferimento 10 ml del surnatante cultura ad un tubo da 50 ml conica di raccolta, quindi inclinare il piatto in verticale di circa 30 gradi e lavare il piatto pipettando i restanti 10 ml della cultura dalla parte superiore del piatto. Ripetere questo lavaggio 5 volte, ogni volta ruotare la piastra di un terzo.
- Trasferire i restanti 10 ml di cellule per lo stesso tubo di raccolta e scartare la piastra e cellule aderenti.
NOTA: I lavaggi saranno rimuovere le cellule non aderenti e vagamente aderenti; le cellule aderenti piatte sono resistenti ai lavaggi. Tipicamente, tra 5 - 10 x 10 6 cellule non aderenti sono attesi da una piastra al giorno 7 e 2 - 5 x 10 6 cellule a giorno 10, anche se Lutz et al. segnalati 10 x 10 6 cellule al giorno 10. Le cellule aderenti non vengono normalmente adottate. Tuttavia, se queste cellule devono essere confrontati con le cellule non aderenti, Possono essere rimossi come segue. Aggiungere 5 ml di 0,7 mM EDTA in 1x PBS, pH 7,4 al piatto dopo che le cellule non aderenti sono rimossi, incubare a 37 ° C per 5 min, pipetta su e giù per rimuovere le cellule aderenti e raccogliere in un tubo separato. - Spin giù le cellule raccolte a 314 xg per 5 minuti e aspirare il surnatante. Risospendere in 5 ml sterile supporto BMC a 4 ° C, vortice delicatamente per mescolare, e contare utilizzando trypan blu e emocitometro.
NOTA: Ogni piatto sarà resa 5 - 10 x 10 6 cellule non aderenti da una cultura giorno 7. D'ora in poi, eseguire tutti i passaggi a 4 ° C. - Per l'analisi citofluorimetrica, trasferimento 2 x 10 5 cellule per ciascun campione in 5 ml di polistirene provette con fondo arrotondato, aggiungere 300 ml di tampone FACS a 4 ° C (1x tampone fosfato, 2 mM EDTA e 2% di siero albumina bovina) a ciascun campione.
- Spin le cellule giù a 314 xg per 5 minuti e aspirare il surnatante. Osservare bianco, pellet opaca visibile alfondo della provetta.
- Risospendere le cellule in 100 ml di non marcata recettore Fc Ab per bloccare il recettore Fc vincolante (Usa 1/10 surnatante da 2.4G2 producendo linea cellulare di mieloma) e incubare per 20 minuti a 4 ° C. Quindi aggiungere 300 ml di tampone FACS per ogni campione, delicatamente vortice, poi girare le cellule giù a 314 xg per 5 minuti e aspirare il surnatante.
- Risospendere le cellule in 100 ml di CD11c-PeCy7 a 0.2 mg / ml, Gr1-Pacific Blue a 0.25 mg / ml, MHCII-APC a 0,05 mg / ml, e FL-HA a circa 2 mg / ml per identificare i macrofagi e le cellule dendritiche.
NOTA: FL-HA è stata preparata in casa con fluoresceina e gallo pettine sale sodico dell'acido ialuronico come descritto in precedenza 21. - Incubare per 20 minuti a 4 ° C per consentire il legame alla superficie cellulare. Aggiungere 300 pl di tampone FACS per ogni campione, delicatamente vortice, poi girare celle in basso a 314 xg per 5 minuti a 4 ° C e aspirare il surnatante. NOTA: Se bioGli anticorpi tinylated sono utilizzati in 3.8, ripetere 3,8-9 fluorescente-streptavidina.
- Lavare le cellule con altri 300 ml di tampone FACS, delicatamente vortice di mescolare e centrifugare le cellule a 314 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 200 ml di tampone FACS contenente 0.1 - 0.2 mg per ml di ioduro di propidio o DAPI per etichettare le cellule non vitali. Le cellule sono ora pronti per l'analisi di citometria di flusso 22.
NOTA: vedere i risultati e la Figura 3 per i dettagli delle popolazioni e di come le cellule sono state gated.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un diagramma di flusso che sintetizza le fasi principali di questo metodo è illustrato in Figura 1. La densità e la morfologia della cultura midollo osseo in diversi momenti della coltura sono mostrati in Figura 2. Al giorno 1, le cellule sono piccole e sparse, ma al giorno 3, ci sono più celle, alcuni sono più grandi e alcuni hanno cominciato ad aderire. Di giorno 6 c'è un aderente definito e frazione non aderente (Figura 2A). La coltura può essere raccolto dal Giorno 7 - 10 con una maggiore percentuale di cellule CD11c + presenti al giorno 10. La figura 2B mostra la coltura giorno 7 prima della raccolta, nonché le frazioni cellulari aderenti e non aderenti separati. La frazione aderenti è costituito da cellule a sinistra dopo il lavaggi leggeri che rimuovono la frazione non aderente. La frazione non aderenti si arricchisce di cellule con morfologia dendritica, che può essere visto più chiaramente nel im ingrandita digitalmenteetà nel inserti in figura 2B. Una volta che la frazione non aderente viene rimosso (giorno 7 o giorno 10), le cellule vengono analizzate mediante citometria a flusso dopo marcatura con anticorpi fluorescenti contro marcatori di superficie cellulare chiave, come descritto sopra. La Figura 3 mostra il flusso rappresentante citometria trame del non aderente frazione di cultura al giorno 7 e il giorno 10.
Per l'identificazione di entrambi i macrofagi e cellule dendritiche, cancello CD11c + e Gr1 - cellule dopo la prima gating sulle dimensioni e cellule vive (Figura 3A e B). Nel giorno 7 culture, il CD11c + Gr1 - popolazione della frazione di cellule non-aderenti è in genere dal 60 al 70% del totale delle cellule vive, e questo è aumentato al 90% o più al giorno 10 (Figura 3B). Il CD11c + Gr1 - popolazione al giorno 7 e il giorno 10 possono essere suddivisi in tre sottogruppi principali che utilizzano MHCII e FL-HA binding: MHCII medio / basso FL-HA vincolante alti macrofagi (P1), MHCII metà FL-HA vincolanti cellule (P2) a basso contenente DC immature, e MHCII alta FL-HA basso legame DC mature (P3) (Figura 3C e riferimento 18 ). Il FL-HA basso, MHCII scarsa popolazione (P0) osservato al giorno 7 ha dimostrato di contenere progenitori per le cellule P1-P3 18. Questa popolazione non è evidente al giorno 10 implica che si è verificato ulteriore maturazione della cultura. Ciò è supportato anche dalla maggiore percentuale di cellule CD11c nella cultura e leggermente superiori percentuali delle popolazioni P2 e P3 DC al giorno 10. La figura 3D mostra MerTK, considerato un marcatore macrofagi, è altamente espressa sia macrofagi e popolazioni immaturo DC (P1 e P2), ma si esprime in misura inferiore maturo DC (cellule P3). In particolare, l'analisi della frazione aderenti rivela la presenza del P0, P1 epopolazioni P2, ma non la popolazione P3 DC mature (dati non riportati). Così macrofagi sono presenti nelle frazioni aderenti e non aderenti ma solo dendritiche mature sono presenti nella frazione non aderente.
. Figura 1: un diagramma di flusso Indicando i passaggi chiave del metodo principale cellule sono raccolte dal midollo osseo, placcati e mantenuti in coltura per 7 - 10 giorni quando sono raccolte per l'uso in ulteriori esperimenti, purificati o utilizzati in analisi FACS. clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: esame microscopico di GM-CSF Derivato cellule del midollo osseo. UN) cultura midollo osseo al giorno 1, 3, e 6 che mostra l'aumento del numero di cellule, cambiamenti morfologici e comparsa di frazioni aderenti e non aderenti distinti. B) del pannello di sinistra mostra la cultura midollo osseo giorno 7 e la tipica densità cellulare. Il pannello centrale mostra il giorno 7 cellule aderenti dopo la raccolta della frazione non aderente e il pannello di destra mostra la frazione non aderente raccolte al giorno 7. Insets sono ingrandite digitalmente le immagini di cellule in questa frazione con morfologia dendritica. La barra di scala bianca rappresenta il 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Fenotipo rappresentativi della cultura GM-CSF al giorno 7 e il giorno 10. non aderentele cellule della cultura sono etichettati con CD11c, Gr1, MHCII, FL-HA, e MerTK al giorno 7 o giorno 10 e analizzati per la loro fenotipo mediante citometria di flusso. A) Le cellule sono state prima gated sulla dimensione poi vivere le cellule. B) mostra una lotto delle cellule gated con CD11c e Gr1 (neutrofili / monociti marcatore) e identifica il CD11c + Gr1 - popolazione che contiene il macrofagi e le cellule dendritiche. Gating su questa popolazione, C) mostra l'andamento citometria di flusso di MHCII e FL-HA vincolante, che mostra la separazione dei macrofagi alveolari-like (P1) da DC immature (P2) e maturo DC (P3), come descritto in Poon et al. 18. D) istogrammi di confronto espressione MerTK tra il P1 (macrofagi), P2 (DC immature), e le popolazioni P3 (maturare DC) al giorno 7 e il giorno 10. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figuri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In questo manoscritto, forniamo un metodo per generare macrofagi e cellule dendritiche GM-CSF derivati da una singola coltura di midollo osseo di topo che è adattato da Lutz et al. 6. Espressione MHCII e FL-HA distingue tra DC immature e macrofagi vincolante in questa cultura (vedi Figura 3C), che in precedenza è stato difficile. Questo, insieme con un altro rapporto da Helft et al. 19, dimostra l'eterogeneità all'interno di GM-CSF culture BMDC indotte che in precedenza erano ritenuti essere solo DC. Helft et al. 19 utilizzato molto diverse condizioni di coltura per generare BMDCs ma anche trovato una significativa popolazione di macrofagi. GM-CSF macrofagi indotti assomigliano macrofagi alveolari e GM-CSF DC indotte assomigliano DC infiammatorie, mentre FLT3 ligando integrato culture BMDC producono cellule dendritiche plasmacitoidi classici e 3,4. Diverse popolazioni DC e macrofagi si osservano anche in vivo under condizioni omeostatiche e infiammatorie, e si discute molto nel campo da ciò che definisce una CC e un macrofago 10. Questo è particolarmente vero quando si tratta di monociti derivati DC infiammatorie e questo è anche rilevante in questo BMC. È quindi importante utilizzare diversi marcatori fenotipici, dati funzionali, e possibilmente dati di espressione genica per caratterizzare una particolare popolazione. È anche possibile che questi in vitro DC e macrofagi popolazioni possono essere ulteriormente suddivise come marcatori più funzionali e fenotipiche vengono scoperti.
In questo metodo, il marcatori CD11c, Gr1, MHCII, e FL-HA sono utilizzati per distinguere i macrofagi da cellule dendritiche immature e mature nella frazione non aderente della cultura BMC. Questo è diverso da Helft et al. 19, che ha usato il CD11c marcatori, CD11b, CD115, CD135, MerTK, e MHCII distinguere una popolazione di macrofagi da DC mature. livelli di espressione MerTK potrebbero distinguish tra macrofagi (P1) e maturare DC (P3), ma non immaturi DC (P2) (Figura 3D). Così FL-HA e MHCII sono marcatori utili per discriminare i macrofagi da entrambe le popolazioni DC immature e mature. Questi macrofagi sono anche funzionalmente distinta da DC in questa cultura BMC e questo è dimostrato più in dettaglio altrove 18. In breve, dopo la stimolazione LPS macrofagi BMC producono citochine diverse rispetto DC mature e non attivano le cellule T naive 18. Questi macrofagi anche molto simili macrofagi alveolari, sia fenotipicamente e funzionalmente sia come bind FL-HA ed esprimono CD11c, MerTK, CD200R, CD206 e F4 / 80 e dopo LPS stimolazione producono TNF-α ancora sono in grado di attivare le cellule T naive 18. Tuttavia, vi sono anche differenze: i macrofagi BMC sono CD11b + e hanno livelli inferiori di Siglec F rispetto a ex-vivo alveolari macrofagi, suggerendo queste cellule sono simili ma non identiCAL per macrofagi alveolari.
Ci sono diversi passi importanti per garantire il successo di questo protocollo. È importante mantenere la sterilità di esporre il midollo osseo in poi. Quando si sposta dentro e fuori del BSC, spruzzare le mani e gli oggetti con il 70% di etanolo guantate. Anche se è utile lavare utensili in 70% di etanolo per sterilizzare, l'etanolo è tossico per le cellule del midollo osseo, così aria asciugare gli strumenti e garantire l'etanolo evaporato prima di portare ossa o cellule in contatto con loro. Inoltre, evitare il contatto tessuti di topo o cellule con apparecchiature o le mani non sterili durante il prelievo di midollo osseo. Anche se la penicillina e la streptomicina supplementazione è fornito dai media, manipolazione incurante delle cellule può portare a lievito o contaminazione fungina. Inoltre, poiché le cellule immunitarie con attività fagocitica vengono generati in questa cultura, contaminazione minore può non essere rilevato semplicemente osservando la coltura cellulare microscopicamente, pertanto è importante identificare tha segni di contaminazione. Ad esempio, il numero di cellule possono essere ridotti e l'espressione di marcatori di attivazione delle cellule, come CD40 e CD86 possono essere aumentati se analizzati mediante citometria di flusso. colore del supporto può anche diventare giallo che riflette un cambiamento di pH a causa di contaminazione. Quando si verifica la contaminazione, la cultura BMC è inutilizzabile. Per mantenere la coerenza sperimentale, è importante per generare una sospensione singola cella dal midollo osseo nel vortex e ottenere una conta cellulare accurate per impostare le culture BMC. Inoltre, se qualsiasi tessuto connettivo dall'osso finisce nella sospensione singola cella, filtrata attraverso un filtro 70 micron sterile per rimuoverlo. Le rese di cellule tipiche per un piatto della frazione non aderente al giorno 7 sono tra i 5 - 10 x 10 6 cellule. il numero di cellule sono di solito una buona indicazione che il protocollo sta funzionando bene. Con questa procedura si ottiene di solito tra 2-5 x 10 6 cellule il giorno 10, mentre Lutz riporta 10 x 10 6 cellule. Eseguiamo RBC lisi su Thcellule del midollo osseo iniziale e considerando che il protocollo da Lutz et al. non e quindi questo passaggio può essere opzionale. Le variazioni nella percentuale di cellule CD11c, nonché i numeri e le proporzioni di macrofagi e cellule dendritiche possono derivare da diverse fonti o lotti di FCS e quindi è fondamentale per testare nuovi lotti di FCS sulle culture BMC per risultati sperimentali coerenti. concentrazione GM-CSF è stata variata da 5 ng / ml a 40 ng / ml e questo non ha influenzato significativamente la resa cellule. densità cellulare può anche influenzare la maturazione della cultura. Ad esempio, Helft et al. testa di serie 1 x 10 7 cellule in 4 ml di mezzi che hanno prodotto una maggiore percentuale di cellule con l'espressione alta MHCII 19. Il punto di tempo in cui vengono raccolte le cellule può anche influenzare la percentuale di popolazioni presenti nella frazione non aderente. Le cellule vengono in genere raccolti tra i giorni 7 - 25-27 ottobre, ma alcuni studi raccolgono BMC al giorno 6 19,23,24. Se sono necessarie più celle, la cultura BMCin grandi x 15 mm piatti 150 mm Petri in 40 ml alla stessa densità. In questo caso un cambiamento supporti mezzo volume avviene sia giorno 3 e il giorno 6 (cioè, 20 ml di mezzi rimosso, le cellule centrifugare e sostituiti con freschi 20 ml multimediale integrato con 20 ng / ml RGM-CSF). Questi piatti tipicamente generano 3 - 6 x 10 7 cellule per piatto al giorno 7. FL-HA è un reagente importante, insieme con MHCII, per distinguere i macrofagi da DC immature e mature nella cultura BMC. Così una volta che è fatto, titolare la FL-HA per l'uso su cellule conosciute per legare costitutivamente HA quali macrofagi alveolari 18 o cellule BW5147 T e confermare la sua specificità utilizzando un anticorpo CD44 HA-bloccante (KM-81, disponibile in commercio), senza etichetta HA o una cellula carente CD44. CD11c - cellule GR1 + nella cultura può funzionare come controllo interno per le cellule non HA vincolanti, e una fluorescenza meno uno di controllo (FMO) o CD44 carenti culture BMC sono altamente raccomandati per settin accuratag del cancello vincolante FL-HA.
Anche se gli esperimenti possono essere eseguiti utilizzando una cultura eterogenea, si consiglia di arricchire la DC o la popolazione di macrofagi utilizzando la fluorescenza attivato l'ordinamento delle cellule o sfere magnetiche legate agli anticorpi 18 in base alla espressione di CD11c, vincolante Gr1, MHCII, e HA. Le possibili esperimenti comprendono la stimolazione con Toll-like agonisti del recettore LPS, come per misurare l'attivazione e la produzione di citochine, saggi di attivazione delle cellule T, o la caratterizzazione ulteriore mediante citometria di flusso. Ad esempio, dopo 8 o 24 ore di stimolazione, citometria a flusso può essere utilizzato per misurare la colorazione intracellulare citochine e / o etichettatura superficie molecole co-stimolatorie come CD40 e CD86, come descritto in 18. Intracellulari procedure di etichettatura citochine richiedono pretrattamento delle cellule con brefeldina a, che impedisce la secrezione e permette la citochina ad accumularsi all'interno della cellula. Per i saggi attivazione delle cellule T che coinvolgono il loading di un antigene, come il peptide OVA da una cellula che presenta l'antigene, i macrofagi purificati basano su MHCII e HA vincolante non attivare le cellule T, mentre immaturo e maturo DCS 18. Va notato che la procedura di ordinamento da solo può attivare le cellule dendritiche in una certa misura, il che rende importante includere controlli negativi in tutti gli esperimenti.
Come con qualsiasi metodo in vitro, ci sono vantaggi e svantaggi rispetto all'utilizzo in cellule in vivo o ex vivo. Lo svantaggio è che in cellule in vitro derivate possono non vivo cellule esattamente mimici ma hanno il vantaggio che possono essere generati in numero sufficiente per permettere analisi funzionale e biochimico, qualcosa che spesso non è fattibile con cellule ex-vivo. Questo metodo di macrofagi e di identificazione CC permetterà la ricerca futura di ottenere popolazioni di cellule più omogenee da una cultura con etero precedentemente sottovalutatogeneità. Come macrofagi purificati da questa coltura GM-CSF sono molto simili macrofagi alveolari del polmone 18, fornisce una comoda fonte di macrofagi alveolari simile per l'analisi in vitro. Ad esempio, queste HA macrofagi vincolanti potrebbero essere utilizzati per lo screening per farmaci che modificano la funzione dei macrofagi alveolari e di indagare meccanismi di infezione Mycobacterium tuberculosis e resistenza. Data la recente scoperta che GM-CSF e il trapianto di macrofagi derivate dal midollo osseo M-CSF possono alleviare proteinosi polmonari nei topi 28,29, questo metodo per identificare i macrofagi da culture GM-CSF può contribuire ad aumentare l'efficacia di questa terapia proposta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (Grant MOP-119503) e le scienze e ingegneria Consiglio Naturale del Canada (NSERC). NSERC supportato anche borse di studio estive per YD e AA YD è sostenuto dalla University of British Columbia (UBC), con un premio borsa di studio di 4 anni, AA è supportato da CIHR con il premio di Master studente laureato (CGS-M). Ringraziamo Calvin Roskelley per l'assistenza con il microscopio utilizzato per generare le immagini nella Figura 2. Riconosciamo inoltre sostegno da parte dei UBC animali e citometria a flusso strutture.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
| Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
| Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Sterile 100 mm x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
| Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37 °C before using. |
| Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |
References
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).
- Lari, R., et al. Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis--complexity in the control by GM-CSF and. Bone. 40 (2), 323-336 (2007).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).
- Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes. J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).
- Brasel, K., et al. Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice. Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).
- Segura, E., Amigorena, S. Inflammatory dendritic cells in mice and humans. Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Goodridge, H. S., et al. Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a 'phagocytic synapse. Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).
- Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation. Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).
- Vander Lugt, B., et al. Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation. Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).
- Shibata, Y., et al. GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1. Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models. J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Poon, G. F., et al. Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures. J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. cells solicit their own help from T cells. J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).
- de Belder, A. N., Wik, K. O. Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate. Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , Wiley, J., & Sons, Inc. Champter 6, Unit 6.2 (2001).
- Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells. Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).
- Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: 'Exhausted' or Alert and Waiting. J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).
- Contreras, I., et al. Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions. PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).
- Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid. J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).
- Grauer, O., et al. Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique. Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).
- Suzuki, T., et al.
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), (2014).
