Abstract
マクロファージや樹状細胞（DC）は、病原体に対する防御において重要な役割を果たしている組織やリンパ器官に見られる先天性免疫細胞です。しかし、それらは、それらを詳細に研究するために十分な数に分離することが困難であるため、 インビトロモデルが開発されている。骨髄由来マクロファージおよび樹状細胞のインビトロ培養物の免疫学的研究のための十分に確立され、有益な方法です。ここで、培養およびサイトカイン顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）を用いて、一次マウス骨髄細胞の単一培養物からのDCおよびマクロファージの両方を同定するための方法が記載されています。このプロトコルは、最初のルッツらによって開発された確立された手順に基づいています。骨髄由来DCの1999インチ文化は不均一であり、かつMHCIIおよび蛍光標識ヒアルロン酸（FL-HA）は、未成熟および成熟DCからマクロファージを区別するために使用されます。プロこれらのGM-CSF由来のマクロファージ密接に表現型および機能の両方に肺胞マクロファージに似ているインビトロ由来のマクロファージの便利な供給源を見よ。
Introduction
いくつかのin vitroでの培養方法は、骨髄由来マクロファージ（BMDMs）と1つの成長因子の組み合わせを使用して、骨髄由来DC（BMDCを）を生成することが記載されています。 BMDMsは、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、またはGM-CSF 1,2のいずれかを使用して骨髄細胞を培養することによって生成することができます。 BMDCのために、骨髄文化へのFLT3リガンドの添加は、培養3,4で9日後（ 高およびCD11c 見よ 、それぞれB220 + CD11cの高い / MHCII）非接着古典と形質DCに上昇を与えます。対照的に、GM-CSFと培養7〜10日後に生成された、非接着細胞単独5,6-、GM-CSFおよびIL-4 7、またはGM-CSFおよびFLT3リガンド8,9より密接炎症性DCを似たBMDCを生成（ 高いのCD11c、MHCII 高のCD11b +）10。これらのインビトロ培養は、マクロファージを生成するために使用されている間に各培養物は純粋な集団を生じさせる場合DCは、それは不明です。例えば、GM-CSF培養中の接着細胞は、それらが均質であり、任意の観察された変動がある推定でマクロファージ5、DCを6,11-13として使用されるのと同じ培養物からの非付着細胞であることが記載されているものの開発14,15の異なる段階に起因します。さらに、研究は、 インビボ 16,17 における肺胞マクロファージの発達のために必須の増殖因子であるGM-CSFを発見し、そして肺胞マクロファージ様16,17,18を生成するためにインビトロで使用することができます。
付着以外は、GM-CSF処理した骨髄培養物からのマクロファージ及び樹状細胞を生成するための手順は、GM-CSFの骨髄培養物内に存在し得る不均質性を示唆している非常に類似しています。これは、実際に2つの論文は、BMDC培養物の非付着画分におけるBMDMsの存在を報告としてケースのように思われます。 1論文で、彼らはidentifi最も密接に肺胞マクロファージに似ていたし、T細胞19を活性化する能力が低下していた遺伝子発現特性を発現したCD11c +、のCD11b +、MHCII 半ば 、MERTK +、およびCD115 +、などの細胞の集団を編。未熟（たCD11c +、MHCII 半ば 、 低 FL-HA）および成熟異なっていた肺胞マクロファージ様人口を識別するために、MHCIIとFL-HAを使用する第二の紙（たCD11c +、 ミッド/ロー MHCII、FL-HA 高 ）樹状細胞（のCD11cの+、 高 MHCII）、両方の表現型および機能的に18。これらの論文は、GM-CSF BMDC培養が不均一であることを示してBMDC培養物からのデータを解釈する際には注意すべきであることを示すマクロファージおよびDC集団の両方を含む両方。
このプロトコルは、骨髄、GM-CSFでの培養骨髄細胞を分離し、肺胞マクロファージ様を識別する方法について説明します結合およびMHCII発現FL-HAを使用して、フローサイトメトリーによる骨髄培養における未成熟および成熟DCから人口。 。この手順は、6ルッツらの確立された手順に基づいており、5生成することができるされている- 10ミリリットルの培養7日目に10×10 6非接着細胞を。文化は日から7〜10に使用可能であり、7日目これが成長し、大量にインビトロ肺胞のようなマクロファージを単離するための簡単な方法を提供するでマクロファージ、未成熟および成熟DC、だけでなく、いくつかの前駆細胞の不均一な集団を生成します。
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Protocol
マウスは、ブリティッシュコロンビア州の動物管理委員会の大学によって承認された手順によって、倫理的な動物実験のためのカナダ・カウンシル動物ケアに関するガイドラインに従って安楽死させました。
1.マウスの大腿骨および脛骨から単一細胞骨髄サスペンションを取得
- キャビネットの空気をパージし、空気の流れの安定化を可能にし、クリーン/ 70％エタノールでBSC表面を噴霧する手順を開始する前に生物学的安全キャビネットにスイッチ（BSC）15分。プロトコルの全体のために可能な限り無菌すべてを保管してください。非無菌条件下で骨を切断しないでください。
- 70％エタノールに浸漬することによって、解剖ツールを準備し、5％ウシ胎児血清（HBSS-FCS）、滅菌ペトリ皿（100ミリメートル×15 mm）で、1とハンクス液（解剖はさみ、鉗子の2ペアの1ペア） mlのシリンジ、26½ゲージ針、円錐形のコレクションチューブ（15ミリリットルまたは50ミリリットル）、およびBSCにおける紙タオル。
- 使用してマウスを安楽死させます機関の動物実験倫理委員会によって承認されたプロトコル。 、BSCに持参1または2ペーパータオルの上に置き、70％エタノールでマウスをスプレー。
- 蓋に2ミリリットル - BSCでは、無菌的にアリコートベースにHBSS-FCSの10ミリリットルと1を滅菌ペトリ皿を開きます。
- 上を向いて背中とのお腹の上でマウスを置き、非利き手の指で胸部セクションの周りの皮膚を持ち上げます。皮膚が持ち上げられる切開を作るためにハサミを使用してください。
- 胃での切開会うの両端まで引っ張り続け、胃に戻ってから、マウスの周りの皮膚を引き離す慎重にカットの両端は、それぞれの手で一方の端にしがみつくと。
- 上を向いて胃にマウスを裏返して、片手で足が露出するまで肌を引き戻す維持、ダウンレグに向けて皮膚の下半分を引っ張ります。
- マウスアップの足を持ち、足関節の上にアキレス腱を切断し、靭帯は、はさみで脛骨の下端に足に筋肉を接続します。これは、足の骨から足を緩めます。
- 足で足を持ち上げながら、下肢から大腿部の筋肉を切断するために、大腿骨の下端に、すべての膝関節の周りにハサミで筋肉や靭帯を切りました。静かに腓骨及び大腿骨表面から緩め筋肉を引っ張るために鉗子を使用してください。大量出血を避けるために、大腿動脈を切断しないように注意してください。
- 1手が足につかまっでは、股関節における大腿骨の上端部で記者ダウンオープンはさみは、脚を回転させ、自由への最終的なカットを作るためにハサミを使用しながら股関節から大腿骨を分離するために慎重に引き抜い本体から脚。
- これ以降、唯一の滅菌鉗子で組織を保持します。一方の端部での足にしがみつくと、他の上で足をやってのけます。
注：接続靭帯がステップで切断されているように、これは、多くの力を必要とすべきではありません1.9。また、ちょうど骨が融合されている足首の上に脛骨を切りました。 - 1鉗子のセットと別と脛骨と腓骨の近位端部と大腿骨の遠位端部により脚を持ち、慎重に大腿骨と膝蓋骨からそれらを分離するために、膝関節の反対方向に脛骨と腓骨を曲げます。
- まだ下腿骨に付着した残りの靭帯や筋肉をプルダウンするために鉗子を使用してください。骨髄細胞のためにフラッシュするには小さすぎるようにここでは、鉗子で結合組織と一緒に腓骨を削除します。反転ペトリ皿の蓋の上に洗浄脛骨を置きます。
- 1鉗子のセットと別と膝蓋骨と大腿骨の下端を持ち、除去のための共同の反対方向に膝蓋骨と周囲の組織を曲げます。その後、大腿骨から結合組織を残りきれい。鉗子でそれらを引き離し、反転シャーレのふたの上に置きます。膝蓋骨を捨てます。
- 1.7を繰り返します- 他の脚と1.13必要に応じて。必要に応じて輸送のための1ミリリットルの無菌HBSS-FCSを含む1.6ミリリットルのマイクロチューブに骨を移します。
- HBSS-の10ミリリットルを含むペトリ皿の底に骨を移すその後、まだ脛骨および大腿骨に取り付けられた任意の残留組織をきれいにするために鉗子を使用し、HBSS-FCSの2ミリリットル - 1で、反転したペトリ皿の蓋の上に骨を置きますFCS。また、骨をきれいにし、70％エタノールに浸した組織を用いて、添付の筋肉組織を取り除きます。
- ハサミで半分に骨のそれぞれをカット。皿の中の骨の滞在を確実にするために切断しながら、部分的に無菌の蓋付きペトリ皿を遮蔽します。あるいは、次のステップでフラッシングを可能にするために、各骨の端部を切断します。
- 1mlシリンジへの26½G針を取り付け、ペトリ皿から1ミリリットルHBSS-FCSを描きます。骨片の端部に針の先端を挿入し、骨髄細胞（骨内部の柔らかい赤組織）を洗い流します。頭の中に針を挿入骨と開放端の、すべての赤色骨髄が除去されるまで。色は白と骨を観察します。
- 単一細胞懸濁液を形成するために、数回の注射器を介して骨髄の目に見える塊を渡します。
- フラッシュ骨を捨てます。よく細胞懸濁液を混合し、コレクションチューブに転送するために10ミリリットルのピペットを使用してください。皿に残留する細胞を収集するためにHBSS-FCSの5ミリリットルで一回ペトリ皿をすすぎます。細胞を氷上に置きます。
注：2のために保存した場合の骨髄細胞懸濁液が依然として生存可能である- 4℃で3時間。
骨髄細胞の2めっきおよび培養（のBMC）
- 以下の試薬および消耗品を準備します。
- 2 mMトリスpH7.2の最終溶液を0.84％の塩化アンモニウムを行うことで、赤血球（RBC）溶解緩衝液を調製し、次いで0.2ミクロンフィルターを通して濾過することにより滅菌します。
- 10％FCS、20mMのHEPES、1×非必須アミノ酸、55＃を追加することによって、BMC媒体を準備181; RPMI培地1640 M 2-メルカプトエタノール、50 U / mlのペニシリンおよびストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム、および2mM L-グルタミン。
- 市販の組換えGM-CSFを入手するか、GM-CSF遺伝子20をトランスフェクトしAG8.653骨髄腫細胞からの上清を含むGM-CSFを使用します。 ELISAによる上清中のGM-CSFの濃度を決定し、BMCメディアに20 ng / mlでの同等のものを追加します。
- 5分間、314×gで骨髄細胞をスピンダウン。ペレットは、赤血球による赤です。 BSCでは、その後、RBC溶解緩衝液10mlを追加し、タップしてペレットを緩め、真空吸引に取り付けられた滅菌ガラスパスツールピペットを用いて上清を吸引除去します。渦は、細胞を再懸濁し、5分間室温でRBC溶解緩衝液中でインキュベートします。
- HBSS-FCSの10ミリリットルを追加し、その後5分間、314×gで細胞をスピンし、上清を吸引除去します。白い色として細胞ペレットを観察します。 BMCメディアの所望の体積で細胞を再懸濁します。
- RESUを数えます0.4％トリパンブルーで死細胞を染色した後、血球計数器を使用してspended細胞。
注：、片足（シングル脛骨および大腿骨）からの骨髄を使用する場合は、BMCメディアの5ミリリットル中に再懸濁し、10μlの細胞懸濁液を取り、青色の0.4％トリパン70μlのとそれを希釈し、よく混ぜおよび10μlのを転送血球計数器室に1/8細胞希釈。 4つの象限中の生存細胞の数：4象限のカウントの平均は、希釈係数×10 4 =ミリリットル当たりの細胞数をxは。 RBC溶解後に4×10 7細胞- 1の脚から大腿骨と脛骨は一般的に約2が得られます。 - 培養の終了時に実験に必要とされる総細胞数に基づいて、下流の実験に必要な骨髄培養10mlの料理の数を推定します。
注： - 10×10 7日目6細胞の各ディッシュは、最初の播種及び収率で2×10 6の骨髄細胞5が必要です。- アリ、5分間、314×gでスピンダウンし、新しいチューブにメッキのための細胞の総数をQUOT上清を吸引し、BMC培地中4×10 6細胞/ mlで細胞を再懸濁。
- GM-CSF（組換えまたは上清を含むGM-CSFから）200ngの含有BMC培地の9.5ミリリットルを持つ新しい滅菌100ミリメートルX 15ミリメートルペトリ皿を準備します。 10 mlの2×10 5細胞/ mlの最終濃度のために、ペトリ皿の中央に4×10 6細胞/ mlの骨髄細胞の500μLを加えます。
注 ：滅菌ペトリ皿ではない組織培養皿を使用することが重要です。セルを追加するときは、細胞が中央に集中し、播種後、メディアの変更中皿に乱れを最小限に残っていることを確認します。 37℃で、5％CO 2で細胞をインキュベートします。これは、培養中0日です。 - 3日目に、細胞の各ディッシュにGM-CSFの200 ngのを含有する新鮮なBMC培地の10ミリリットルを追加します。外乱Oを最小限に抑えるように注意してください懸濁液中の細胞を濃縮し、F。細胞培養物の総容量は、現在20 mlです。
- 100Xの倍率で光学顕微鏡下で細胞を観察します。多数の非接着細胞（丸）といくつかの接着細胞（フラット）を確認します。花の3つまたは4つの似た花弁の群における細胞は、増殖を示し、見ることができます。
- 6日目に半分の培地交換を行います。慎重に、滅菌50mlコニカルチューブにメディアの10ミリリットルを削除し、5分間314×gでスピンダウンし、吸引して上清を捨てます。
- GM-CSFの20 ngの/ mlを含有する新鮮なBMC培地10ml中に細胞ペレットを再懸濁し、穏やかにボルテックスし、20mLの総容積の元の細胞培養皿に加えます。顕微鏡下で細胞を観察します。
注：7日目文化が付着平らな細胞と丸い非付着細胞の密な雲と密集度が70％以上である必要があります。
3.収集し、フローサイトメトリーのためにBMDCとBMDMsの準備
- <LI> 4℃ですべてのバッファを保管してください。
- 培養上清の10ミリリットルは、約30度、垂直皿を傾け、残りの10ミリリットルをピペットで皿を洗った後、50ミリリットルコニカルコレクションチューブに細胞を採取するために10日目に7日目から細胞を採取、最初の転送皿の上から文化の。この洗浄を5回、三分の一の皿を回転するたびに繰り返します。
- 同じコレクションチューブに細胞の残りの10ミリリットルを移し、プレートと付着細胞を廃棄します。
注：洗浄は非接着および緩く接着細胞を除去します。フラット接着細胞を洗浄に耐性です。一般的に、5〜 -ルッツらが、10日目6細胞5×10 - 6、非接着細胞を7日目に一枚の板から期待されている10×10と2。 10日目で報告された10×10 6個の細胞を付着細胞を正常に取得されません。しかしながら、これらの細胞は、非接着性細胞と比較する必要がある場合次のように、それらを除去することができます。接着細胞を除去し、別のチューブに収集するために、非接着細胞を除去した後、皿に1×PBS、pH7.4中0.7 mMのEDTAの5ミリリットルを加え37℃で5分間インキュベートし、上下にピペット。 - 5分間、314×gで採取した細胞をスピンダウンし、上清を吸引除去します。 4℃で5ミリリットルの滅菌BMC培地で再懸濁は、渦は穏やかに混合し、トリパンブルーと血球計数器を使用してカウントします。
注：各料理は5得られます- 7日目培養物から10×10 6非接着細胞を。今から、4℃で、すべての手順を実行します。 - フローサイトメトリー分析5mlのポリスチレン丸底チューブに2×10 5細胞を各試料の移送のために、それぞれに4°C（1× リン酸緩衝生理食塩水、2mMのEDTAおよび2％ウシ血清アルブミン）でFACS緩衝液300μLを加えますサンプル。
- 5分間、314×gで細胞をスピンダウンし、上清を吸引除去します。見える白、不透明なペレットを守ってチューブの底。
- 非標識のFc受容体抗体の100μl中に再懸濁細胞（骨髄腫細胞株を作製する2.4G2から使用1/10上清）をFc受容体結合をブロックし、4℃で20分間インキュベートします。そして、静かにボルテックス、各サンプルに300μlのFACS緩衝液を追加し、5分間314×gで細胞をスピンダウンし、上清を吸引除去します。
- 0.2μgの/ mlでのCD11c-PeCy7100μl中に細胞を再懸濁、0.25μgの/ mlの群Gr1、パシフィックブルー、0.05μgの/ mlのMHCII-APC、およびFL-HAは、約2μg/ mlのは、マクロファージや樹状細胞を識別します。
注：以前に21を説明したようにFL-HAは、フルオレセイン及び雄鶏櫛ヒアルロン酸ナトリウム塩を使用して社内で調製しました。 - 細胞表面への結合を可能にするために4℃で20分間インキュベートします。その後、4℃で5分間314×gで細胞をスピンダウンし、上清を吸引、優しく渦、各サンプルに300μlのFACS緩衝液を追加します。注：バイオ場合蛍光ストレプトアビジンで9 - tinylated抗体が3.8を繰り返し、3.8で使用されています。
- 混合し、5分間、314×gで細胞をスピンダウンするFACS緩衝液の別の300μlを、穏やかにボルテックスで細胞を洗浄。上清を吸引し、0.1を含むFACS緩衝液200μl中に細胞を再懸濁 - 非生存細胞を標識するためにヨウ化プロピジウムまたはDAPIの1mlあたり0.2μgのを。細胞は、今、フローサイトメトリー分析の22の準備ができています。
注：集団の詳細についての結果と図3を参照して 、どのように細胞をゲートしました。
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Representative Results
この方法の主要なステップを要約するフローチャートを図1に示されている。培養の異なる時点での骨髄培養物の密度および形態を、図2に示されている。1日目に、細胞は、小さなスパースしかし3日目によるものですより多くの細胞が存在し、いくつかは大きく、数が付着し始めています。 6日目までに一定の接着性および非接着性画分（ 図2A）があります。収穫前7日目文化を示しているだけでなく、分離接着性および非接着細胞画分10日目図2Bに存在したCD11c +細胞のより高い割合で10 -文化は7日目から収穫することができます。接着性画分は、非接着性画分を除去する光の洗浄後に残った細胞からなります。非接着画分を大幅にデジタル拡大イムでより明確に見ることができる樹状形態、を有する細胞について濃縮されます図2Bの挿入図で年齢。非接着性画分を除去された後（7日目または10日目）上述のように、細胞は、重要な細胞表面マーカーに対する蛍光抗体で標識後、フローサイトメトリーにより分析する。 図3は、非接着性のプロットサイトメトリーの代表的な流れを示しています7日目と10日目文化の一部分。
サイズと生細胞（ 図3A およびB）上の第1のゲート後の細胞-の両方のマクロファージや樹状細胞、のCD11c +および群Gr1上のゲートの同定のため。 7日目の培養物では、のCD11c +群Gr1 -集団非接着細胞画分における総生存細胞の典型的には60〜70％であり、これは10日目（ 図3B）の90％以上に増加させます。 CD11c +群Gr1 - 7日目と10日目の人口はMHCIIとFL-HAビンディを使用して、3つの主要な部分集合に分割することができますNG：MHCII ミッド/ロー FL-HA結合高マクロファージ（P1）、未成熟DCを含む低 （P2）のセルを結合MHCII 半ば FL-HA、およびMHCII 高 FL-HAが低い成熟DC（P3）に結合する（ 図3Cおよび18を参照します ）。 FL-HA 低く 、MHCII 低い集団（P0）7日目に観察されたP1-P3セル18用前駆体を含むことが示されています。この集団は、培養のさらなる成熟が発生したことを意味する10日目に明らかではありません。これはまた、培養中のCD11c細胞の割合は大きくなるだけでなく、10日目図3Dは MERTKを示しでP2とP3 DC集団のわずかに高い割合でサポートされている、マクロファージマーカーであると考えられ、非常に両方のマクロファージ上に発現され、未成熟DC集団（P1およびP2）が、成熟DC（P3細胞）上の低い程度に発現しています。特に、接着画分の分析は、P0、P1の存在を明らかにしP2集団ではなく、P3、成熟DC集団（データは示さず）。したがって、マクロファージは、接着性および非接着性画分に存在するだけで、成熟DCは、非接着性画分に存在します。
。図1： -彼らは精製またはFACS分析に使用される、さらなる実験に使用するために収穫される10日間の方法の主要なステップを示すフロー・チャート初代細胞は、7用に平板培養し、培養物中で維持、骨髄から採取されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：GM-CSF 由来の骨髄細胞の顕微鏡検査。 A） 細胞数、形態の変化、および異なる接着性および非接着性画分の出現の増加を示した1日目、3及び6での骨髄培養物。 B）左のパネルは、7日目の骨髄文化と典型的な細胞密度を示しています。中央のパネルは非接着画分の収穫、右側のパネル7日後に付着細胞を示し7.インセットがデジタル樹状形態で、この画分中の細胞の画像を拡大している日に採取した非接着部分を示しています。白いスケールバーは50μmで表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：7日目と10日目でのGM-CSF文化の代表的な表現型非付着培養物からの細胞は、その後、細胞を生きている。A）細胞を最初にサイズでゲートした7日目または10日目でのCD11c、群Gr1、MHCII、FL-HA、およびMERTKで標識し、フローサイトメトリーによってそれらの表現型を分析する。B）A表示CD11cおよび群Gr1とゲート細胞（好中球/単球マーカー）のプロットおよびCD11c +群Gr1を識別-マクロファージや樹状細胞を含む集団。この集団でのゲーティング、C）は MHCIIのフローサイトメトリープロットを示し、FL-HAは、結合、未成熟DC（P2）から肺胞のようなマクロファージ（P1）の分離を示しているとプーンで説明したように、DC（P3）を成熟しますら 18。D-P1間MERTK発現を比較）ヒストグラム（マクロファージ）、P2（未成熟DC）、およびP3集団（DCを成熟）7日目と10日目でこのfiguの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。再。
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Discussion
本稿では、我々はルッツら 6から採用された単一のマウス骨髄培養からGM-CSF由来のマクロファージや樹状細胞を生成する方法を提供します。この培養中の未成熟DCおよびマクロファージを区別する結合MHCII発現およびFL-HAは、以前は困難であった、（ 図3Cを参照します）。これは、一緒にHelft ら 19による別のレポートで、以前はDCのみであると考えられていたGM-CSF誘導されたBMDC培養内の不均一性を示しています。 Helft ら 19はまだも大幅なマクロファージ集団を発見したBMDCを生成するために、全く異なる培養条件を使用していました。 GM-CSF誘導されたマクロファージは肺胞マクロファージに似ており、FLT3リガンド補足BMDC培養は、古典的と形質のDC 3,4を生成するのに対し、GM-CSF誘導DCは、炎症性樹状細胞に似ています。種々のDCおよびマクロファージの集団はまた、 インビボ未において観察され恒常性および炎症状態をDER、およびDCおよびマクロファージ10を定義するものに、フィールド内の多くの議論があります。それは、単球由来の炎症性DCに来て、これはまた、このBMCで関連している場合に特に当てはまります。特定の集団を特徴づけるためにいくつかの表現型マーカー、機能データ、および場合によっては、遺伝子発現データを使用することが重要です。より多くの機能および表現型マーカーが発見され、これらのインビトロ DCおよびマクロファージの集団は、さらに細分することができる可能性もあります。
この方法では、マーカーのCD11c、群Gr1、MHCII、およびFL-HAは、BMCの培養物の非接着画分に未成熟および成熟樹状細胞からマクロファージを区別するために使用されます。これは、成熟DCからのマクロファージ集団を区別するためにマーカーのCD11cを使用Helft ら 19、、のCD11b、CD115、CD135、MERTK、およびMHCIIに異なっています。 MERTK発現レベルでしdistinguisマクロファージ間の時間（P1）および未成熟DC（P2）（ 図3D）のDC（P3）を成熟ではなく。したがって、FL-HAおよびMHCIIは未熟および成熟DC集団の両方からマクロファージを区別するための有用なマーカーです。これらのマクロファージは、このBMC培養でもDCをより機能的に区別され、これは他の場所で18、より詳細に示されています。簡単に言えば、LPS刺激後BMCのマクロファージは、成熟DCとは異なるサイトカインを産生し、ナイーブT細胞18を活性化しません 。これらのマクロファージはまた、密接に両方の表現型および機能的にバインドFL-HAの両方として、肺胞マクロファージに似およびCD11cを発現し、MERTK、CD200R、CD206及びF4 / 80およびLPS刺激プロデュースのTNF-αの後にまだナイーブT細胞18を活性化することができません。しかし、も違いがあります：BMCのマクロファージがのCD11b +であり、これらの細胞を示唆し、ex vivoでの肺胞マクロファージに比べシグレックFのレベルが低い類似しているが同定されません肺胞マクロファージにCAL。
このプロトコルの成功を確保するために、いくつかの重要なステップがあります。それ以降は、骨髄を露出するから無菌性を維持することが重要です。 BSCの内外に移動する場合、70％エタノールで手袋をはめた手やオブジェクトをスプレー。それは滅菌するために70％エタノールでツールを洗うために有用であるが、エタノールは、骨髄細胞への毒性があるので、ツールを空気乾燥し、エタノールが彼らと接触して骨や細胞を持ち込む前に蒸発したことを確認します。また、骨髄採取の際に非滅菌装置や手でマウス組織または細胞を接触させることを避けます。ペニシリンおよびストレプトマイシン補充がメディアで提供されていますが、細胞の不注意な取扱いは、酵母または真菌汚染につながる可能性があります。また、食作用活性を有する免疫細胞はこの培養物中で生成されるため、軽微な汚染は単に顕微鏡で細胞培養物を観察することによって検出されない場合があり、したがって、Tを特定することが重要です彼は、汚染の兆候。例えば、細胞数を減少させることができるし、フローサイトメトリーにより分析したとき、このようなCD40およびCD86のような細胞活性化マーカーの発現を増大させることができます。メディア色も汚染によるpH変化を反映して黄色くなることがあります。汚染が発生した場合、BMCの文化は使用できません。実験的な一貫性を維持するためには、ボルテックスすることにより、骨髄からの単一細胞懸濁液を生成し、BMC培養を設定するには、正確な細胞数を得ることが重要です。骨から任意の結合組織は、単一の細胞懸濁液で終わる場合も、それを削除するには、無菌の70ミクロンのフィルターでろ過します。 10×10 6細胞- 7日目での非接着画分の1のプレートのための典型的な細胞収量は5の間です。細胞数は、通常、プロトコルがうまく機能していることは良い兆候です。ルッツは、10×10 6個の細胞を報告し、一方、10日目に6×10 5細胞-この手順で、私たちは通常、2間を得ます。私たちは、目の上のRBC溶解を行いますルッツらによるプロトコルのに対し、電子初期骨髄細胞。ていないので、このステップは任意でよいん。 CD11cの細胞ならびに数字およびマクロファージや樹状細胞の割合の割合の変化は、異なるソースやFCSのバッチから生じる可能性があるので、一貫性のある実験結果のためのBMC培養にFCSの新しいバッチをテストすることが重要です。 GM-CSF濃度は40 ngの/ mlの5 ngの/から変化させた、これは大幅に細胞収率に影響を及ぼしませんでした。細胞密度はまた、培養の成熟に影響を及ぼし得ます。例えば、Helft ら 。高MHCII発現の19を有する細胞の大きいパーセントを生産4ミリリットル培地に1×10 7個の細胞を播種しました。細胞を採取した時点で、非接着性画分に存在する集団の割合に影響を与えることができます。細胞は、典型的には、日7との間に収集されている- 10 25-27が、いくつかの研究では、6日目19,23,24でのBMCを収集します。より多くの細胞が必要とされている場合は、文化のBMC同じ密度で40ミリリットルの方が大きい150ミリメートルX 15ミリメートルペトリ皿インチこの場合、ハーフボリュームメディアの変化がで行われ、両方の3日目と6日目（ すなわち、培地を除去し、細胞をスピンダウンし、20 ngの/ mlのRGM-CSFを補充した新鮮な20ミリリットル培地と交換の20ミリリットル）。 FL-HAは、BMC培養における未成熟および成熟DCからマクロファージを区別するために、一緒にMHCIIで、重要な試薬であり、7日目皿当たり6×10 7細胞-これらのプレートは、典型的には、3を生成します。それが行われるこのよう一旦、そのような肺胞マクロファージ18またはBW5147 T細胞として構成HAに結合することが知られている細胞での使用のためにFL-HAを滴定し、HA-ブロッキングCD44抗体のいずれかを使用して、その特異性を確認する（KM-81、商業的に入手可能）、非標識HAまたはCD44欠損細胞。 CD11c -群Gr1 +培養中の細胞は、非HA結合細胞のための内部統制、および蛍光マイナス1の制御（FMO）として機能することができ、またはCD44欠損BMC培養物を、高精度な設のために推奨されていますFL-HA結合ゲートのグラム。
実験は、異種の文化を使用して行うことができますが、のCD11c、群Gr1、MHCII、およびHA結合の発現に基づいて磁気ビーズ18を被覆した蛍光活性化細胞選別または抗体のいずれかを使用して、DCまたはマクロファージ集団を濃縮することをお勧めします。可能な実験は、フローサイトメトリーによって活性化し、サイトカイン産生、T細胞活性化アッセイ、または付加的な特徴づけを測定するために、そのようなLPSなどのToll様受容体アゴニストでの刺激が挙げられます。例えば、刺激の8または24時間後、フローサイトメトリー18で説明したように、サイトカインおよび/ またはCD40およびCD86などの共刺激分子の表面標識のための細胞内染色を測定することができます。細胞内サイトカイン標識法は、分泌を防ぎ、サイトカインは細胞内に構築することを可能にするブレフェルジンA、と細胞の前処理を必要とします。 LOAを含むT細胞活性化アッセイのための抗原提示細胞によるこのようなOVAペプチドのような抗原の鼎、MHCIIおよびHAはバインディングに基づいて精製されたマクロファージは未熟ながら、T細胞を活性化し、DCを成熟していないだろうします18。それだけでは、ソート手順は、それが重要な全ての実験において陰性対照を含むようになって、ある程度の樹状細胞を活性化することができることに留意すべきです。
任意のインビトロ方法と同様に、in vivoまたはex vivoで細胞 に使用する場合に比べ利点と欠点があります。欠点は、 インビトロ由来の細胞に正確に模倣するin vivoでの細胞はしかし、彼らは機能的および生化学的解析を可能にするのに十分な数で生成することができるという利点、多くの場合、ex vivoでの細胞ではない可能である何かを持っていないことです。マクロファージおよびDC同定するこの方法は、以前に過小評価テロと今後の研究は、培養物からより均質な細胞集団を得ることができるようになりますgeneity。このGM-CSF培養物から精製されたマクロファージが密接に肺18から肺胞マクロファージに似ているように、in vitroでの解析のために肺胞のようなマクロファージの便利な供給源を提供します。例えば、これらのHA結合マクロファージは肺胞マクロファージの機能を変更する薬剤をスクリーニングするため、および結核菌の感染および耐性のメカニズムを調べるために使用することができます。 GM-CSFおよびM-CSFの骨髄由来マクロファージ移植マウス28,29における肺タンパクを軽減することができる最近の発見を考慮すると、GM-CSF培養物からマクロファージを同定するためのこの方法は、この提案された治療の有効性を高めることができます。
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Acknowledgments
この作品は、ヘルスリサーチ（CIHR）（グラントMOP-119503）とカナダの自然科学・工学評議会（NSERC）のカナダの研究所によって資金を供給されました。 NSERCもYDする夏のstudentshipsをサポートし、AA YDは、4年間のフェローシップ賞とブリティッシュコロンビア大学（UBC）によってサポートされ、AAは、大学院生の修士賞（CGS-M）とCIHRでサポートされています。我々は、 図2の画像を生成するために使用される顕微鏡の支援のためにカルバンRoskelleyに感謝します。我々はまた、UBC動物とフローサイトメトリー施設からの支援を認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
| Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
| Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Sterile 100 mm x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
| Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37 °C before using. |
| Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |
References
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