Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Caracterizando Propriedades Multiscale mecânicas do tecido cerebral usando microscopia de força atômica, recuo de impacto, e Reologia

doi: 10.3791/54201 Published: September 6, 2016

Abstract

Para projetar e engenheiro de materiais inspirados nas propriedades do cérebro, seja para simuladores mecânicos ou para estudos de regeneração de tecidos, o próprio tecido cerebral deve ser bem caracterizada em várias escalas de comprimento e hora. Como muitos tecidos biológicos, tecido cerebral apresenta uma estrutura complexa, hierárquica. No entanto, em contraste com a maioria dos outros tecidos, o cérebro é de muito baixa rigidez mecânica, com elástico módulos E de novo na ordem de 100s de Pa. Esta baixa rigidez pode apresentar desafios para a caracterização experimental das propriedades mecânicas importantes. Aqui, demonstramos diversas técnicas de caracterização mecânicas que foram adaptados para medir as propriedades elásticas e viscoelásticas dos materiais hidratados, compatíveis biológicos, tais como tecido do cérebro, em diferentes escalas de comprimento e taxas de carregamento. Em microescala, realizamos creep-conformidade e força de relaxamento experimentos usando de força atômica recuo habilitado para microscópio. Nas mesoscale, realizamos experimentos de impacto de recuo usando um penetrador instrumentado à base de pêndulo. No macroescala, realizamos reometria de placas paralelas para quantificar o corte módulos elásticos dependente da freqüência. Nós também discutir os desafios e limitações associadas a cada método. Juntas, estas técnicas permitem uma caracterização mecânica em profundidade de tecido cerebral que pode ser usado para entender melhor a estrutura do cérebro e ao engenheiro de materiais bio-inspirados.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mais tecidos moles que compreendem órgãos biológicos são mecanicamente e estruturalmente complexa, de baixa rigidez em comparação com o osso mineralizado ou materiais de engenharia, e exibem deformação não-linear e dependente do tempo. Em comparação com outros tecidos do corpo, o tecido cerebral é extraordinariamente compatível, com módulos de elasticidade E na ordem de 100s de 1 Pa. O tecido cerebral apresenta heterogeneidade estrutural com regiões da substância branca, que também diferem funcionalmente distinta e cinza e interdigitados. Compreendendo mecânica de tecido cerebral irá ajudar na concepção de materiais e modelos computacionais para simular a resposta do cérebro durante a lesão, facilitar a previsão de dano mecânico, e permitir a engenharia de estratégias de protecção. Para além disso, tal informação pode ser utilizada para considerar alvos ideais para a regeneração de tecidos, e para melhor compreender as alterações estruturais no tecido cerebral que estão associados a doenças tais como esclerose múltipla e autismo. Here, descrevemos e demonstrar várias abordagens experimentais que estão disponíveis para caracterizar as propriedades viscoelásticas dos tecidos compatíveis mecanicamente incluindo tecido cerebral, na micro, meso e macro-escalas.

Em microescala, realizamos creep-conformidade e forçar experiências de relaxamento usando microscópio de força atômica (AFM) recuo habilitado. Tipicamente, a indentação permitiu-AFM é utilizado para estimar o módulo de elasticidade (rigidez ou instantânea) de uma amostra de 2-4. No entanto, o mesmo instrumento pode também ser utilizado para medir a viscoelasticidade microescala (tempo ou dependente da taxa de) propriedades 5-10. O princípio destas experiências, mostrado na Figura 1, é para recuar um AFM em cantilever sonda no tecido cerebral, manter uma magnitude especificada de força ou de profundidade de penetração, e medir as alterações correspondentes na profundidade de indentação e força, respectivamente, ao longo do tempo. Usando esses dados, podemos calcular o comp fluêncialiance J C e relaxamento módulo G R, respectivamente.

No mesoescala, realizamos experimentos de recuo de impacto em condições imersas de líquido que mantêm a estrutura do tecido e os níveis de hidratação, usando um nanoindenter instrumentado à base de pêndulo. A montagem experimental é ilustrada na Figura 2. Uma vez que o pêndulo oscila em contacto com o tecido, a sonda de deslocamento é registada como uma função do tempo até que o pêndulo oscilante vem a descansar dentro do tecido. A partir do movimento oscilatório amortecido harmónica, resultante da sonda, pode-se calcular a profundidade máxima de penetração X max, a capacidade de dissipação de energia de K, e o factor de qualidade Q de dissipação (que diz respeito à taxa de dissipação de energia) do tecido 11,12.

No macroescala, foi utilizado um reómetro de placas paralelas para quantificar o corte dependente módulos elásticos frequência,denominado o módulo de armazenamento G 'e o módulo de perda G ", do tecido. Neste tipo de reometria, aplica-se uma tensão angular harmónica (e tensão de cisalhamento correspondente) em amplitudes conhecidos e frequências e medir o binário reacional (e tensão de cisalhamento correspondente) , como mostrado na Figura 3. a partir da amplitude e da fase lag resultante do binário medido e variáveis ​​geométricas do sistema, pode-se calcular G 'e G "aplicados a frequências de interesse 13,14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Declaração de Ética: Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Pesquisa Animal do Hospital Infantil de Boston e cumprir com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Rato cérebro procedimentos de aquisição de tecido (para recuo permitiu-AFM e recuo de impacto)

  1. Prepara-se uma mistura de cetamina / xilazina para anestesiar os ratos. Combinar 5 ml de cetamina (500 mg / ml), 1 ml de xilazina (20 mg / ml) e 7 ml de solução salina 0,9%.
  2. Injectar rato (Raça: TSC1; Syn-Cre; PLP-eGFP; Idade: p21; Sexo: masculino ou feminino), com 7 ul por peso corporal gramas da solução de cetamina / xilazina.
  3. Uma vez que o rato está totalmente anestesiado, como demonstrado pela falta de resposta aos pés e cauda pitadas, eutanásia o mouse por decapitação usando grandes tesouras de dissecação.
  4. Remover o crânio, cortando ao meio usando menores tesouras de dissecação. Começando no cerebelo, REMpeças ove do crânio usando uma pinça curva. Após a remoção do crânio, extrair o cérebro, utilizando uma espátula plana para levantar o cérebro, começando no cerebelo, e colocar o cérebro em uma placa de Petri. Remover o cerebelo a partir do cérebro utilizando uma lâmina de barbear.
  5. Se estiver usando um cérebro inteiro para testes de recuo de impacto sobre o tecido fresco, transferência de cérebro em um tubo de fundo redondo com CO2 meio nutriente independente de para o tecido neural adulto no gelo e avançar para a secção 4. Caso contrário, vá para o passo 1.6 para cortar procedimentos.
  6. Ajustar as configurações vibratome a uma velocidade de 0,7 mm / seg, uma frequência de 70 Hz de vibração, e uma espessura de corte de 350 um. Cerque o prato vibratome com gelo. Coloque um pouco de supercola sobre a placa vibratome e montar cérebro para que cortes coronais podem ser cortadas, com o cérebro orientada para cortar o lado dorsal em primeiro lugar.
  7. Encher o prato vibratome com solução salina tamponada com fosfato suficiente de Dulbecco (DPBS) a apenas submergir o cérebro. Levantaro prato no vibratome de modo que a lâmina é apenas submerso no DPBS.
  8. Pressione start para começar a cortar seções cerebrais coronais 350 mm de espessura.
  9. Usando pincéis para evitar danos ao tecido, transferir as fatias de cérebro do banho de vibratome DPBS e para um tubo de fundo redondo com CO 2 independente de meio nutriente para tecido neural adulto em gelo e realizar medições em tecido fresco dentro de 48 h. Para começar experimentos recuo permitiu-AFM, avance para a secção 3.

2. Pig Cérebro procedimentos de aquisição de tecido (por reologia)

  1. Obter um suíno metade do cérebro sagital cortado dentro de ~ 1 hora de sacrifício de um talho local. Coloque a metade do cérebro de CO 2 independente de meio nutriente para o tecido neural adulta, e armazenar no gelo.
  2. Use uma lâmina de barbear ou bisturi para fazer uma ~ 5 mm de espessura fatia do cérebro coronal e armazenar em CO 2 independente de meio nutriente para o tecido neural adulta. Certifique-se de que o surfac fatiae é o mais plano possível. Use movimentos laterais cuidado com navalha / bisturi durante o corte.
  3. Loja tecido cerebral de suínos em CO 2 independente de meio nutriente para o tecido neural adulto no gelo e realizar reometria (seção 5) no tecido fresco dentro de 48 horas.

3. Microscópio de Força Atômica habilitado Indentation

  1. Preparar pratos 60 milímetros de diâmetro Petri (P60) com um bioadesiva derivada de mexilhões de acordo com as instruções do fabricante.
    1. Prepara-se uma solução de estoque de tampão neutro que consiste em bicarbonato de sódio 0,1 M em água esterilizada com um pH óptimo de 8,0. Filtrar a esterilizar (0,2 micron) o tampão de bicarbonato de sódio e armazenar a 4 ° C.
    2. Em uma câmara de fluxo laminar, mistura uma solução de 6,25% de bio-adesivo e 3,125% de NaOH derivado de mexilhão no tampão de bicarbonato de sódio.
    3. 100 ul pipeta da solução de bio-adesivo de 3.1.2 para um mm de diâmetro 60 dica Petri (P60) prato e a utilização da pipeta de espalhar solution em um círculo 3-5 cm de diâmetro.
    4. Deixar P60 pratos descobertos em capela de fluxo laminar e deixe a solução seca (~ 30 min). pratos Lavar 1x com PBS e 2x com água estéril. Deixe secar os pratos do ar na câmara de fluxo laminar e armazenar em um saco plástico selado a 4 ° C por até 1 mês.
  2. Calibrar o AFM e amostra cérebro set-up no AFM.
    NOTA: Siga as instruções de calibração AFM conforme o fabricante.
    1. Encher cuidadosamente uma sonda de AFM com uma constante da mola nominal de 0,03 N / m e uma mm de diâmetro borosilicato talão 20 no suporte da sonda.
    2. Calibrar a constante da mola e ópticos sensibilidade alavanca inverse (InvOLS) do cantilever AFM utilizando o método de sintonia térmica 15,16.
      NOTA: Uma vez que a constante da mola para uma sonda de AFM é calculado, ele deve permanecer constante com o uso repetido. No entanto, os InvOLS cantilever terá que ser novamente calibrado de cada vez que o laser é realinhados com o braço de suporte. Além disso, a calibraçãodeve ser realizada de encontro a um substrato de várias ordens de magnitude mais duro do que o raio de acção, tal como poliestireno.
    3. Ligar o aquecedor montado na fase e a temperatura ajustada para 37 ° C.
    4. Monte a fatia do cérebro para os pratos preparados P60 na secção 3.1.
      1. Suavemente para um de 350 um de espessura fatia cerebral, bem como o CO 2 independente de forma a partir do balão de fundo redondo em um prato P60 revestidos com o bioadesivo derivado de mexilhão.
      2. Ao inclinar ligeiramente o disco P60, posicionar a fatia do cérebro no centro do prato. Se necessário, pipetar lentamente meio de uma pipeta manual para desdobrar uma fatia do cérebro que dobrada sobre si mesma ou melhor posição a fatia do cérebro no centro do prato.
      3. Retirar cuidadosamente o excesso de mídia usando uma pipeta P1000 (não use o vácuo).
      4. Coloque a tampa no prato P60 e deixe a fatia do cérebro aderir durante 20 min.
    5. Retire a cabeça AFM, coloque a fatia do cérebro montado no P60prato no palco AFM, e adicionar ~ 2 ml de pré-aquecido CO 2 médio independente de.
    6. Adiciona-se cuidadosamente uma gota de meios para a sonda de AFM para o proteger de quebrar, devido à tensão superficial, quando é abaixado no meio circundante da fatia do cérebro.
    7. Reposicionar a cabeça AFM para o palco, e começar a baixar a cabeça até que ele seja submerso no media.
    8. Usando a câmera CCD-vista de cima, reposicionar o laser sobre o cantilever.
      NOTA: O alinhamento do laser sobre o braço de suporte terá mudado ligeiramente, devido à diferença no índice de refracção do ar e forma.
    9. Espere 5 minutos para o cantilever se ajustar a ser submerso em um líquido quente, em seguida, redefinir o alinhamento espelho para uma deflexão livre 0 V.
    10. Executar um espectro térmico na sonda de AFM de acordo com as instruções do fabricante 16. Usar o ajuste do primeiro pico térmico para recalcular InvOLS da sonda de AFM em meios.
    11. Utilizando o microscópio óptico,mover o estágio da amostra de tal forma que a região do cérebro de juro abaixo da sonda de AFM.
      NOTA: O corpo caloso aparece escuro, pois é mais opaca do que a massa cinzenta circundante. O córtex é superior à do corpo caloso.
    12. Redefinir o alinhamento espelho para uma deflexão livre 0 V.
    13. Na soma e deflexão do medidor no software AFM, clique em "Participar" para envolver a cabeça AFM.
    14. Usando o seletor de posição na cabeça AFM, baixar a cabeça até que o contato entre o cantilever ea amostra é feita.
  3. (Opcional) Se desejado, medir o módulo de elasticidade da amostra, como descrito anteriormente 4,17,18.
  4. Conduzir experimentos de conformidade de fluência.
    1. Construir uma função de força aplicada no editor de funções do software. A função de força consiste em uma rampa de 0,1 seg a um ponto de 5 nN set e segure por 20 segundos, seguido por um 1 segundo rampa até uma força aplicada de 0 nN.
      1. No recuo Master Panel, de acordo com o método de recuo, selecione "Load" para o modo Indenter; "N" para unidades; e "editor Function" para a função Indenter.
      2. No editor de função, no segmento de painéis Parms, criar um segmento função de força aplicada que começa em 0 nN, termina em 5 nN, com um tempo de 0,1 segundos. Clique em "Inserir ->".
      3. Para o próximo segmento, defina começar a 5 nN, de ponta a 5 nN, e tempo para 20 seg. Clique em "Inserir ->."
      4. Para o segmento final, de começo ajustado a 5 nN, de ponta a 0 nN, e tempo para 1 seg. Clique em "Empate" e feche a janela do editor de função.
    2. Na Tab Força do Painel-Mestre, marque "rampa penetrador depois do disparo" e definir a função de força aplicada para disparar depois de atingir um ponto de disparo de 0,1 V.
    3. Clique em "Force Single" na parte inferior do Tab Força do Painel-Mestre, que irá acionar a função de força construída aplicada pelo cumprimento fluência.
    4. Depois deúnico recuo força é terminado, levantar a cabeça AFM para que ele está fora de contato com a amostra e, em seguida, voltar a envolver a cabeça e voltar a deflexão zero livre.
    5. Reposicionar o estágio da amostra para localizar uma nova área de interesse, e baixar a cabeça AFM para fazer contato. NOTA: A cabeça AFM deve ser recolhida a partir da superfície da amostra quando o estágio da amostra é movido. Não fazer isso pode resultar em danos para o cantilever AFM delicado.
    6. Repita os passos 3.4.3-3.4.5 até que a quantidade desejada de dados foram coletados.
  5. Conduzir experimentos de relaxamento de força.
    1. Construir uma função de recuo aplicada no editor de funções do software. A função de recuo é constituído por uma rampa de 0,1 segundos para um ponto de 3 um conjunto e segurá-la durante 20 seg, seguido de uma rampa de 1 segundo até uma profundidade de penetração de 0 uM.
      1. No Painel Mestre de recuo, de acordo com o método de recuo, selecione "recuo" para o modo Indenter; "M" para as unidades; e "; Editor Function "para Indenter Função.
      2. No editor de função, no segmento de painéis Parms, criar um segmento de função força aplicada que começa em 0 ^ M, termina a 3 um, com um tempo de 0,1 segundos. Clique em "Inserir ->".
      3. Para o próximo segmento, defina começar a 3 um, de ponta a 3 mm, e tempo para 20 seg. Clique em "Inserir ->."
      4. Para o segmento final, de começo ajustado a 3 um, de ponta a 0 mm, e tempo para 1 seg. Clique em "Empate" e feche a janela do editor de função.
    2. Na Tab Força do Painel-Mestre, marque "rampa penetrador depois do disparo" e definir a função de força aplicada para disparar depois de atingir um ponto de disparo de 0,1 V.
    3. Clique em "Force Single" na parte inferior do Tab Força do Painel-Mestre, que irá acionar a função de recuo construído-aplicado para a força de relaxamento.
    4. Depois que o único recuo força é terminado, levantar a cabeça AFM para que sejafora de contato com a amostra e, em seguida, voltar a envolver a cabeça e re-deflexão zero.
    5. Reposicionar o palco para localizar uma nova área de interesse, e baixar a cabeça para fazer contato.
    6. Repita os passos de 5,3-5,5 até que a quantidade desejada de dados foram coletados.
  6. Concluímos experiências e clean-up.
    1. Depois de concluir experiências, levantar a cabeça AFM e removê-lo a partir da amostra.
    2. Use um tecido laboratório para remover cuidadosamente o excesso de líquido sem tocar o cantilever.
    3. Cuidadosamente limpar o porta cantilever a AFM utilizando uma pequena quantidade de etanol. Não exponha os componentes electrónicos delicados no suporte do cantilever ao etanol. Remova o cantilever AFM e coloque em um recipiente de armazenamento.
    4. Descarte a amostra de tecido do cérebro, seguindo protocolos de biossegurança adequadas.
  7. Usando MATLAB, calcular o cumprimento fluência e forçar relaxamento módulos usando a geometria penetrador, de acordo com a solução derivada por Lee e Radok de 1960 19.
    1. Calcular a força F e profundidade de recuo equação 1 a partir de dados sobre a posição cantilever z, deflexão d, e constante da mola, k c

      equação 1 e equação 1 .
    2. Localizar o ponto de contacto ao longo da curva de indentação utilizando o algoritmo descrito em Lin et ai. 20.
    3. Definir uma janela de interesse para análise de dados. A janela de interesse é a região em que qualquer força (em conformidade fluência) ou profundidade de penetração (para a força de relaxamento) é mantida a um valor nominal (isto é, Região 3, como mostrado na Figura 1C, D).
    4. Para as experiências de conformidade de fluência, calcular o módulo de fluência conformidade experimental, J-C (T), em resposta a uma carga etapan 1 "src =" / files / ftp_upload / 54201 / 54201eq4.jpg "/>:
      equação 1 ,
      em que h (t) é a função de passo Heavyside e R é o raio da sonda esférica.
    5. Para as experiências de força de relaxamento, calcular o módulo da força de relaxamento experimental, G R (t), em resposta a uma profundidade de passo de recuo equação 1 :
      equação 1 .

4. Recuo Impacto

  1. Calibrar o nanoindenter instrumentado e ajustar as configurações padrão para permitir experimentos impacto dinâmico no tecidos cerebrais hidratados de acordo com as instruções do fabricante.
    1. Montar uma sonda esférica, deslizando-a para o pêndulo, usando uma pinça.
    2. Cole uma amostra de quartzo fundido para o poste de amostra, o qual é aparafusado no translacionaletapa.
    3. Vá para o menu Calibração e selecione "Cell líquido." Siga as instruções do software para fazer contato com a amostra de quartzo fundido.
    4. Selecione "Normal" para o tipo de Indenter e usar o valor padrão de 0,05 mN para a carga Indenter. Clique em "Continuar" para realizar a calibração para a configuração normal penetrador.
    5. Mova o estágio da amostra de volta, pelo menos, 5 mm. Montar o braço de alavanca, o que permite que a sonda a ser baixada para dentro da célula de líquido, e repetir a calibração da célula de líquido na nova configuração, seleccionando "Cell líquido" para o tipo Indenter. Clique em "Continuar" para obter o líquido Fator de Calibração celular.
    6. Ative a opção de software celular líquido, indo para o menu Experiment e selecionando "Opções especiais." Use o valor de calibração mais recente.
    7. Aumentar o espaçamento entre as placas do capacitor como isso vai levar a uma maior profundidade máxima mensurável, o que é necessário quando se testa higmateriais hly conformes.
      1. No menu Sistema, selecione "Configurações não Protegidas" e "Parâmetros da máquina" para alterar a taxa de teste do pêndulo de carga, taxa de carga zero, e rampa de espera compensar a 0,5 mN / seg, 0,1 mN / sec e 3 V, respectivamente.
      2. Com uma chave, vire as três porcas que controlam o horário espaçamento entre as placas do capacitor em pequenos incrementos.
      3. Depois de cada volta no sentido horário completo, selecione "Ajuste Ponte Box" no menu Manutenção e obter um bom teste do pêndulo, o que exigirá movendo o peso de contrapeso longe do pêndulo.
      4. Repita os passos até que a calibração 4.1.7.2-4.1.7.3 profundidade aproximada lê um valor de 70.000 nm / V ou superior.
    8. Posicionar um novo limite de parada, na parte inferior do pêndulo que pode ser ligado e desligado através de uma fonte de alimentação. Retraia o batente inicial sentado atrás do pêndulo para remover uma obstrução potencial do movimento pendular e permitem maiorvelocidades de impacto, bem como profundidades de penetração mais elevadas em amostras conformes.
    9. Permitir que o gabinete para atingir o equilíbrio térmico (demora cerca de 1 hora).
    10. Enquanto o gabinete equilibra, voltar para o menu Sistema e selecione "Configurações não protegidos" e "Máquina de Parâmetros". Defina a profundidade da velocidade de calibração (DCAL) de contacto a 1 mm / s, a velocidade de contacto recuo primário para 3 mm / s, e os ultra baixa velocidade contacto carga a 1 mm / seg.
    11. Sob o menu de calibração, execute uma calibração profundidade padrão nessa nova configuração.
    12. Ligue o fornecimento de energia para o solenóide e configurá-lo para 10 V. Vá para o menu Experiment e selecione "Impacto" e "Ajuste Impulse deslocamento". Siga as instruções do software (prompts automáticos) para calibrar a distância balanço do pêndulo.
  2. Montar o tecido cerebral do rato na célula líquido.
    1. Após a colheita todo o cérebro de step 1.5, armazená-lo imediatamente em CO 2 independente de meio nutriente para meios de tecido neural adulto no gelo.
    2. Quando a configuração da reentrância impacto é totalmente completa, transferir cuidadosamente o cérebro para uma placa de Petri, juntamente com o CO 2 independente de forma. Cortar o cérebro em 6 mm de espessura com superfícies planas em ambos os lados.
    3. Aderir o tecido cortado para o posto de amostra de alumínio com uma camada fina de adesivo de cianoacrilato.
    4. Deslize a pilha líquido sobre o segundo anel de vedação sobre o post da amostra, e preencher a célula líquido com 5 ml de CO 2 médio independente de imergir completamente o tecido. Este post amostra é então cuidadosamente montado para o palco de translação dentro da nanoindenter instrumentado.
  3. Medir a resposta impacto do tecido cerebral.
    1. Se necessário, retire a sonda esférica e substituí-lo com a sonda de interesse, sem retirar o braço de alavanca.
    2. No menu Sistema, selecione "Não protegidoConfigurações "e" Máquina de parâmetros. "Alterar a velocidade de contacto impacto primário para 5 mm / seg.
    3. Com o banho de amostra baixo (direcção -z) e longe do pêndulo (+ x), mover-se na direcção -x, até a ponta sobre o braço de alavanca está adequadamente localizado acima do banho. Mover-se na direcção + z até que a ponta está completamente submerso no banho e em frente da amostra.
    4. Usando a janela controle do estágio da amostra, fazer contato com cuidado e, em seguida, voltar ao palco de distância da superfície da amostra em cerca de 30 mm.
    5. Sob o menu Experiment, clique em "Impacto" para configurar um experimento impacto. Escolha uma carga impulso específico que se relacionam diretamente com a velocidade de impacto resultante com base na calibração do balanço distância. Executar o experimento programado.
    6. Quando o pêndulo oscila para trás e para a superfície da amostra continua a mover-se ao plano de medição, ligue o interruptor de fim de curso inferior off.
    7. Observe como o pêndulo balança FORWard para impactar a amostra. O deslocamento da sonda como uma função de tempo será registado pelo software.
    8. Quando a janela do palco xyz aparecer, ligue o interruptor de fim de curso de volta.
    9. Repita os passos de 3,4-3,8 para testar o maior número de cargas e locais diferentes, conforme necessário.
  4. Analisar o deslocamento adquiriu vs. tempo de resposta do pêndulo usando scripts MATLAB personalizadas para determinar a profundidade máxima de penetração x max, capacidade de dissipação de energia K, e dissipação fator de qualidade Q. 11
    1. Vá para o menu Análise e exportar os dados em um arquivo de texto.
    2. Aqui a derivada temporal do perfil de deslocamento para obter a velocidade em função do tempo. Ajuste de zero deslocamento como o ponto de contato x o1.
      NOTA: Impacto na velocidade v é a velocidade máxima imediatamente antes do contacto X max corresponde à deformação em que a sonda.primeira velocidade diminui para zero. x O2, que é equivalente a X R, é a posição necessária para reiniciar o contacto com a amostra deformada no próximo ciclo. Velocidade Rebound v fora é a velocidade no deslocamento x r.
    3. Definir K (sem unidade) como a energia dissipada pela amostra normalizado pela soma das energias de amostra recuperados e dissipou-se durante o primeiro ciclo de impacto. Calcular K com base nas propriedades intrínsecas do pêndulo 21 (tal como rigidez e coeficiente de amortecimento de rotação), O1 x, x max, x r, v, e v a.
      NOTA: Para mais informações, pode consultar o trabalho de Kalcioglu et al, 2011..
    4. Desde o deslocamento pode ser descrito como um movimento oscilatório harmônico amortecido, encaixar uma função de decaimento exponencial aos valores máximos das discolocação vs a curva do tempo.
    5. Calcular Q (sem unidade) como π multiplicado pelo número de ciclos necessários para a amplitude de oscilação para diminuir por um factor de e. Um valor Q maior significa uma taxa de dissipação de energia mais baixo.

5. Reologia

  1. Defina-se e calibrar o reómetro de acordo com as instruções do fabricante.
    1. Inicializar o reômetro abrindo o painel do dispositivo / controle. No separador do painel de controle, clique em "inicializar".
    2. Montar a placa 25 mm de diâmetro de medição (PP25) e o sistema térmico.
    3. (Opcional) Para reduzir o deslizamento entre as placas e o reómetro de tecido, cortar fatias de lixa adesivas que correspondem à forma da placa de topo reómetro e aderem a lixa para a placa superior e inferior.
    4. Faça contato entre a placa superior e inferior, clicando em "definir a zero gap" no painel de controle.
    5. Zerar o transdutor normal de força por parte clicking "reset força normal."
    6. Realizar um teste de inércia, abrindo o guia de serviço no painel de controle, clicando em "sistema de medição", e depois clicar em "teste de inércia". Grave o velho eo novo inércia. Verificar que a inércia está dentro do limite permitido para a sonda, como listado pelo fabricante.
  2. amostra de carga em reômetro.
    1. Após a colheita do tecido e cortar um segmento coronal do cérebro de porco à espessura ~ 5 mm, armazená-lo no gelo em CO 2 médio independente de.
    2. Colocar o cérebro entre as duas placas. Remover grandes gotas de água a partir da superfície superior e inferior da amostra para evitar o deslizamento, mas não secar a amostra.
    3. Lentamente baixar a placa de medição até que a placa é completamente em contacto com a superfície superior do tecido e a força normal medido é consistente em 0.01 mN após um período de relaxação de 5-10 min.
      1. No painel de controle, digite alturas sucessivamente mais baixas in caixa e posição de medição clique em "posição de medição" para reduzir lentamente a placa de medição.
      2. Quando no interior de um milímetro de contacto com o tecido, baixar a placa de medição, em incrementos de 0,1 mm até que o prato está completamente em contacto com a superfície superior do tecido. Certifique-se que a força medida normal é consistentemente em 0.01 mN depois de um período de relaxamento 5-10 min.
      3. Grave a força normal de medição inicial. medições repetidas devem ser tomados ao mesmo compressão de tensões / deformações.
    4. Aparar a amostra com uma lâmina de plástico, se a amostra for superior ao diâmetro da placa. Pipetar um pequeno volume (~ 1-2 mL) dos meios sobre as arestas da amostra para hidratar o tecido.
    5. (Opcional) Abaixe a capa térmica. No painel de controle, defina a temperatura para 37 ° C e clique em "set".
  3. Executar uma varredura de amplitude para estabelecer a gama viscoelástica linear do material (ou seja, o cisalhamentoestirpes em que G 'e G' 'são constantes) a frequências de interesse (por exemplo, 1 rad / seg).
    1. Selecione "File / New". Sob a guia gel selecione "varredura Amplitude: LVE-range". Selecione a janela e clique em "Medição 1: Varredura de Amplitude." Dê um duplo clique na caixa de oscilação. Introduza a estirpe inicial e final (por exemplo, 0,01-105), a frequência (por exemplo, 1 rad / seg) e o número de pontos por década (por exemplo, 6 pontos / dec). Selecione "ok" e clique em start ".
    2. Repita este procedimento para várias fatias com ensaios repetidos para garantir a consistência da faixa elástica linear. A compressão axial da amostra deve permanecer constante entre as amostras.
  4. Realizar um varrimento da frequência de tecido a uma tensão na gama viscoelástica linear do tecido (por exemplo, 1% de deformação) 22, e a uma gama de interesse (por exemplo, 0,1-100 rad / s) frequência.
    1. Clique "File / New" e sob o separador gel selecionar "Varredura de freqüência." Clique na janela / medição 1: Varredura de freqüência. Dê um duplo clique na caixa de oscilação. Entre a gama de frequências (por exemplo, 0,1 a 100 rad / s), a estirpe (por exemplo, 1% de deformação) e o número de pontos por década (por exemplo, 6 pontos / dec). Selecione "ok" e clique em "Iniciar" para iniciar a varredura de freqüência.
  5. sweep Repita frequência (passo 5.4) em duplicado ou triplicado.
  6. Reveja os dados que são calculados automaticamente e exportado pela rheometer: G 'e G "em função da frequência (varredura de freqüência) ou tensão de cisalhamento (varredura de amplitude). NOTA: G' e G '' são calculados a partir da amostra (máxima ) T 'reacional binário amplitude 0, e ângulo de deslocamento de rotação (ou ângulo de deflexão) equação 1 E atraso de faseEquação 1 "src =" / files / ftp_upload / 54201 / 54201eq9.jpg "/>, da resposta da amostra com a estirpe oscilatório aplicada (Figura 3):
    equação 1
    equação 1
    em que R e h são o raio e altura da amostra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

A Figura 4 mostra recuo representativa e força versus respostas de tempo (Figura 4B, E) para o cumprimento de fluência e forçar experiências de relaxação, dada uma força aplicada ou profundidade de indentação (Figura 4A, D), respectivamente. Utilizando estes dados e a geometria do sistema, o cumprimento fluência J c (t) e do relaxamento da força módulos G R (T) pode ser calculada para diferentes regiões do cérebro (Figura 4C, F). Enquanto os estudos anteriores mostraram uma diferença entre o módulo de elasticidade de diferentes áreas do cérebro 23, as propriedades viscoelásticas medido desta maneira para fatias de tecido de cérebro de ratinho não mostram variação inter dentro de uma dada fatia de tecido.

indentação impacto mede as propriedades mecânicas do tecido a elevadas taxas de espacialmente e temporalmente Concentrated carregamento. Os resultados destas experiências fornecem informação sobre a forma como o tecido dissipa a energia em resposta a uma lesão traumática ou deformação intencional associado com a cirurgia. O movimento oscilatório amortecido da sonda recuo impacto (Figura 2B) fornece informação para calcular a profundidade máxima de penetração X max (Figura 5A), a capacidade de dissipação de energia K (Figura 5B) e taxa de dissipação de energia Q (Figura 5C) do tecido. profundidade de penetração mede a resistência à deformação, que se correlaciona fortemente com o módulo de elasticidade do tecido: tecidos mais duras apresentam profundidades de penetração menores para uma dada velocidade de impacto e energia de impacto. capacidade de dissipação de energia é uma medida sem unidades de a medida em que o tecido se dissipa a energia de impacto durante o primeiro ciclo de impacto. medidas fator de qualidade dissipação de quantos ciclos ocorrer antes das oscilações de icompactas são amortecidas de forma significativa - isto se relaciona directamente com a taxa de dissipação de energia, embora isto não é expressa em unidades de tempo. Estes parâmetros de resposta de três impacto pode ser quantificada em diferentes velocidades de impacto, que fornece um meio para estudar as propriedades dependentes da taxa do tecido.

A Figura 6 mostra macroescala G 'e G "de frequências que variam de 0,1 rad / seg a 50 rad / seg. O módulo de armazenamento é quase uma ordem de grandeza maior do que o módulo de perda em baixas frequências. No entanto, a relação entre módulos de armazenamento e perda diminui à medida que a frequência aumenta. Isto indica que as propriedades elásticas dominar o comportamento do tecido cerebral, uma vez que o módulo de armazenamento descreve as propriedades elásticas e o módulo de perda descreve as perdas viscosas do material. Com uma frequência de carga suficientemente alta, os módulos de armazenamento e perda irá igualar, que indica o ponto no qualo material começa a fluir (isto é, propriedades viscosas dominam o comportamento da amostra). Para o caso de tecido cerebral medida como aqui ilustrado, as limitações físicas do instrumentação não permitem medir as propriedades dos materiais a frequências mais elevadas.

figura 1
Figura 1. Ilustração do cumprimento fluência AFM-habilitado e forçar experiências de relaxamento. (A) recuo permitiu-AFM é conduzida usando um cantilever flexível com um talão esférica de nano de raio microescala anexado ao livre-end. (B) Durante o recuo, cantilever deflexão é medida usando um laser reflectido para fora da extremidade do braço de suporte e para um fotodíodo. (C) experimentos do relaxamento da força são conduzidos pelo recuo do braço de suporte a uma profundidade aplicada constante, enquanto que a degradação da força com respecto de tempo é medido. Medidas (D) Creep de conformidade a profundidade de recuo mudança do cantilever com uma força aplicada constante. (C) e (D) foram divididas em cinco regiões (texto verde): (1) Abordagem da sonda AFM à superfície da amostra, (2) Fale com a amostra e rampa até a um ponto de ajuste de recuo / force, (3) manutenção do valor nominal recuo / force, (4) uma desaceleração e, (5) retração da sonda de AFM da superfície da amostra. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Ilustração de experimentos de recuo de impacto. (A) Esquema de recuo impacto, ilustrando a capacidade de realizar experimentos em condições totalmente hidratados. (B) Repres perfil sonda de deslocamento tante como uma função de tempo recolhidos a partir de uma fatia de cérebro de ratinho e o perfil de velocidade correspondente. Deslocamento medido chave e parâmetros de velocidade calculados utilizados para quantificar dissipação de energia são indicados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Ilustração de experimentos placa de reómetro paralelas. (A) esquemática do experimento reômetro de placas paralelas e definições relacionadas com aplicada a tensão de cisalhamento oscilatório. (B) representativas aplicada tensão e stress resultante como uma função de tempo. Armazenamento módulo de cisalhamento G 'e perda de módulo de cisalhamento G "são calculados através da amplitude de tensão54201 / 54201eq12.jpg "/>, amplitude de binário T '0, atraso de fase equação 1 , Sonda e raio de amostra R, e altura da amostra h. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Os dados representativos do cumprimento fluência e forçá experiências de relaxamento. (A, B) A partir dos dados brutos na Figura 1, uma região de interesse é definido pelo cumprimento fluência como o tempo em que a força aplicada permanece constante (A), enquanto que a profundidade de recuo é medida (B). A inserção em (A) mostra os dados de uma experiência em que o piezo vencida AFM era incapazpara manter a força aplicada e a inserção em (B) mostra a resposta de recuo correspondente, o qual é qualitativamente semelhante para os dados de uma experiência de sucesso mostrado em (B). (C) com os dados da força aplicada, recuo medido e conhecimento da geometria da sonda, o cumprimento fluência J c (t) é computada. (D, E) No relaxamento da força, profundidade de penetração é mantida constante (D), enquanto que a força em função do tempo é medida (E). (F) Usando estes dados, do relaxamento da força módulo G R (T) pode ser calculado. cumprimento de deslizamento e forçam as experiências de relaxação podem ser realizados em regiões anatómicas distintas do cérebro, tais como o corpo caloso (vermelho) e do córtex (azul). Os dados em (C, F) são uma média de medições a partir de n = 5 ratinhos. Por favor click aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Os dados representativos obtidos em experiências de recuo impacto. Profundidade máxima de penetração x max, capacidade de dissipação de energia K, e qualidade de dissipação factor Q do tecido do cérebro do rato são calculados a partir de perfis de deslocamento brutos obtidos em diferentes velocidades de impacto. Os dados estão representados ± como desvio padrão (n = 18 medições repetidas por ponto). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. Os dados representativos de experimentos reometria. Armazenamento G 'eperda G '' módulos de de cortes coronais de cérebro de porco. O tanδ quantidade é calculada como a proporção da perda de módulo de armazenamento. Os dados estão representados ± como desvio padrão (n = 4 medições repetidas por ponto). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cada técnica apresentada neste artigo mede diferentes facetas de propriedades mecânicas do tecido cerebral. cumprimento fluência e relaxação de tensão módulos são uma medida das propriedades mecânicas dependentes do tempo. Os módulos de armazenamento e de perda representam propriedades mecânicas dependentes de taxa. Impacto recuo também mede propriedades mecânicas dependentes da taxa, mas no contexto de dissipação de energia. Ao caracterizar as propriedades mecânicas dos tecidos, tanto recuo permitiu-AFM e reologia são métodos comumente usados. Indentação permitiu-AFM é particularmente útil porque, além de proporcionar as propriedades do material dependentes do tempo, diferentes parâmetros experimentais podem ser usadas para medir as células e tecidos módulo de elasticidade de 4 e mesmo de frequência propriedades dependentes 24, como descrito anteriormente. No entanto, a interpretação precisa dos dados e design de experimentos pode ser um desafio para, tecidos hidratados conformes. Embora as medidas de reometria granel adequadalaços de tecido, recuo permitiu-AFM sondas volumes microescala relevantes para microambiente das células. indentação impacto proporciona um meio para quantificar especificamente como um material deforma-se no contexto de uma carga de impacto dinâmico concentrado, o que é útil em aplicações como o estudo da lesão cerebral traumática provocada por impacto focal. Embora os resultados de cada uma das técnicas não são directamente comparáveis, as características de dissipação de energia medidos através de recuo impacto seguem as mesmas tendências que o módulo de perda de cisalhamento medido através de reologia, tal como discutido abaixo.

No recuo permitiu-AFM do tecido cerebral aqui ilustrado, medimos as propriedades viscoelásticas utilizando o cumprimento fluência e forçar relaxamento. Devido à pequena dimensão da sonda de AFM, esta técnica pode medir as propriedades mecânicas de áreas anatómicas distintas do cérebro, tais como as regiões de matéria branca e cinzenta do corpo caloso e o córtex, respectivamente (Fig. 4

Verificou-se que o comportamento visco-elástico do tecido cerebral medida desta forma é qualitativamente semelhante ao relatado anteriormente os resultados por Elkin & Morrison 26. Embora a magnitude dos valores medidos para o módulo de relaxação não concordar, esta é provavelmente devida à diferença nas condições experimentais. Elkin & Morrison usar um soco plana de 250 mm de diâmetro, em comparação com nossa esfera de 20 mm de diâmetro. Além disso, Elkin & Morrison realizar medições em tecidos do cérebro de ratos, enquanto que as medições realizadas no tecido cerebral obtido a partir de murganhos. Apesar destas diferenças, ambas as técnicas measured propriedades mecânicas heterogéneos no tecido do cérebro, ou mais especificamente, de que a substância branca do corpo caloso exibe um módulo de relaxação mais baixa do que a matéria cinzenta do córtex no plano coronal.

É importante notar que, enquanto foi calculado o cumprimento fluência e forçar módulos de relaxamento em resposta a uma carga passo solicitado ou passo de recuo, respectivamente, a carga aplicada experimentalmente e recuo não são ideais (instantâneo) funções degrau. Cargas e entalhes são aplicados ao longo prazos curtos (<1 seg), e essas histórias de carregamento pode afetar a fluência medidas e respostas de relaxamento 7,25. Especificamente, assumindo aplicou um resultado de recuo passo em ligeira subestimação do módulo de relaxamento, enquanto assumindo um passo aplicadas de carga resulta em ligeira sobre-estimação do módulo de conformidade fluência. As discrepâncias entre os módulos elásticos reais e calculados irá diminuir à medida que as taxas de rampadas cargas aplicadas e aumento recuo.

Um passo fundamental na condução de carga relaxamento é escolher a magnitude da força adequada mantida (isto é, o ponto de ajuste que corresponde à tensão de fotodíodo que está directamente relacionada com a força aplicada). A força de valor nominal para o cumprimento deformação deve ser escolhido de modo que: (1) a resposta é suficientemente grande para produzir alterações facilmente mensuráveis ​​em profundidade de penetração; e (2) suficientemente pequeno para que a profundidade de penetração necessária para manter a força de valor nominal não se torna tão grande que deriva do lado de fora do alcance do actuador piezoeléctrico AFM que modula a posição vertical do braço de suporte da base AFM. No protocolo apresentado, sugerimos uma força de valor nominal de 5 nN, que funcionou bem para a nossa configuração experimental. No entanto, se o piezo AFM é incapaz de manter a força de que, devido à sua gama limitada de movimento (ver Fig. 4A, inserção), o valor pode ser reduzido. Esta edição experimental não é encountrado com experimentos força de relaxamento que mantêm uma profundidade de recuo constante, calculada através de um ciclo de feedback.

Em contraste com o recuo permitiu-AFM quasi-estática em nanonewton (nn) dimensionar as forças e profundidades escala uM, indentação impacto aplica uma carga dinâmica concentrada de forças MN-escala e mede a resposta deformação do espécime a uma profundidade que se aproximam da escala milimétrica. Nós já usou recuo impacto para quantificar o comportamento do coração e do fígado 9,11,12, e observaram uma dependência semelhante de resposta de dissipação de energia na taxa de carregamento para os tecidos desses órgãos.

indentação impacto pode acomodar raios de sondas que vão desde um a mm. Além disso, experiências de impacto de entalhe pode ser realizado em ambientes completamente imersa, o que permite a caracterização mecânica dos tecidos hidratados 21. Ao testar amostras altamente compatíveis, tais como tecido cerebral, important considerações devem ser tidas em conta. Em primeiro lugar, a profundidade máxima mensurável dentro do material é aproximadamente 1 mm, uma limitação definida pelas escalas de comprimento do próprio instrumento; qualquer deslocamento adicional pêndulo vai ser fisicamente interrompida pela colisão entre a bobina electromagnética localizado na parte superior do pêndulo e o prato magnético estacionário. Para o tecido do cérebro, o que limita a velocidade de impacto mais alto que pode ser aplicado com sucesso a aproximadamente 5 mm / seg. Note-se que, enquanto as velocidades de impacto são da ordem mm / s, as densidades de energia de deformação correspondentes são da ordem de kJ / m 3, que se aproxima das condições de balística, devido às pequenas dimensões do raio da sonda 11. Em segundo lugar, pode potencialmente tornar-se difícil para o instrumento para detectar o contacto entre a sonda e a superfície de tecido. Como o estágio da amostra viaja em direção a sonda, o contato é detectado quando o pêndulo é empurrado para trás pela amostra em movimento. No entanto, para altamente COMPLIANt amostras, o pêndulo não pode ser desviado de forma detectável enquanto que a sonda penetra no interior da amostra.

Para resolver este problema, pode-se aumentar a velocidade na qual a fase de amostra move-se de tal modo que haverá um maior impulso durante o contacto para conduzir o pêndulo de volta. A amostra também deve ser o mais plano possível, para minimizar ainda mais os erros na detecção do ponto de contacto adequado. Por fim, notar que a carga de impacto não é um verdadeiro impulso de carga, em que a corrente electromagnética na parte superior do pêndulo continua a fornecer uma força de condução para a penetração após o primeiro evento de impacto. Como resultado, a deformação pode ocorrer especialmente nas condições de carga mais elevados, o que complica a análise das características de dissipação de energia. Mais trabalho nesta técnica pode envolver desacoplamento da resposta de fluência do impacto de resposta, a introdução de controlo de temperatura para permitir estudos à temperatura do corpo, e incluindo a visualização da superfície da amostra de tecido por meio de um microscope compatível com a célula de líquido.

Reometria mede as propriedades mecânicas dependentes de frequência de sólidos viscoelásticos no nível macroescala. Os componentes modulares de cisalhamento, de armazenamento G 'e de perda G ", pode ser medida em intervalos de frequência tipicamente abrangendo 0,001-0,1 rad / seg a 10-100 rad / seg, dependendo do instrumento, geometria de ponta de prova, e a amostra 13. Para uma medição precisa , um varrimento de amplitude deve ser realizado antes de um varrimento de frequência para determinar a gama linear elástico do material, o que é a gama de tensão para o qual o G 'e G' 'permanecer constante 14,27 a deformação de corte escolhido para a frequência. varredura deve ser tão alto quanto possível dentro do limite viscoelástica linear (tipicamente 1-2% de deformação de corte), de modo que o torque suficiente é conseguida durante a medição. o binário durante as medições deve estar sempre na gama permitida fornecida pelo fabricante como para assegurarsinal ufficient-ruído.

Além disso, a sonda de reometria utilizado deve ser tão grande quanto possível para maximizar o binário, mas deve sobrepor completamente com a amostra 13. Na preparação da amostra, o tecido deve ser cortado o mais plano possível para minimizar gradientes de tensão quando o contato é feito entre as placas. Quando o contato é feito com a amostra, o tecido não deve ter quaisquer gotas de água nela para minimizar deslizamento naquela interface. No entanto, o tecido também não deve ser seco antes ou durante a medição como este irá degradar a estrutura do tecido 13. O tecido deve ser totalmente hidratado com a mídia após o contato entre as duas placas. Adesiva, lixa à prova d'água também pode ser anexado às placas para minimizar deslizamento 28. Além disso, a compressão axial tenha sido mostrado para alterar a magnitude de G 'de tecido cerebral 29. Uma vez que as amostras de reologia são tipicamente fina (~ 5 mM), as pequenas alterações na altura (~ 500mm) podem produzir grandes tensões de compressão (por exemplo, ~ 10%), e, por conseguinte, as alterações significativas no módulo de cisalhamento. Além disso, como a amostra é viscoelástico, o material irá sofrer relaxação de tensão devido à compressão axial 28, o que pode afectar as medições. Assim, medições repetidas devem ser realizados em estirpes axiais de funcionamento semelhantes, e a amostra deve ser permitido relaxar (por exemplo, 5-10 minutos) antes da medição. Erro associado a estes fenómenos é uma limitação da técnica. Outras limitações de reometria incluem o pressuposto de que o material é homogéneo e isotrópico, que muitas vezes não é verdade em amostras de tecido 13. Além disso, a temperatura deve ser mantida em condições fisiológicas, uma vez que afectará G 'e G "22. No tecido cerebral especificamente, o aumento da temperatura tem sido demonstrado para diminuir ambos os G' e G '' modestamente sem alterar a lei de potência behavior com frequência, seguindo assim o tempo-temperatura superposição principais 22,30. Nossos dados estão de acordo com estudos anteriores 22,27 no cérebro suíno, que observados magnitudes semelhantes de G 'e G' ', bem como uma dependência fraca frequência de lei de potência em ambos os G' e G ".

A relação tanδ calculado = G "/ G '(Fig. 6), prevê uma base de comparação entre reometria e recuo impacto. Em recuo impacto, descobrimos que a capacidade de dissipação de energia do tecido cerebral aumentou com o aumento das taxas de carregamento. Usando reometria, descobrimos que como a frequência aumentada, tanδ também aumentou. Em outras palavras, o material era mais dissipadora em frequências mais altas. Além disso, enquanto as medidas de recuo impacto não quantificam um módulo de elasticidade diretamente, a profundidades de penetração x diminuição max diretamente com increasing módulo de elasticidade.

Juntos, os métodos descritos no presente documento permitem a caracterização mecânica do tecido cerebral no micro, meso e macro-escalas de comprimento, e a diferentes taxas de carregamento. Os métodos aqui apresentados podem ser utilizados num certo número de materiais compatíveis, incluindo ambos os tecidos biológicos e hidrogéis de engenharia. Com uma compreensão profunda das propriedades viscoelásticas multiescala de tecido cerebral, podemos melhorar materiais de design de engenharia para imitar a resposta mecânica do cérebro. Estes materiais simuladores de tecido pode facilitar a previsão de danos mecânicos e de engenharia de estratégias de proteção. Além disso, as propriedades do material do cérebro pode ser usada para projetar para materiais bioinspirados in vitro e estudos in vivo para entender melhor o crescimento e a conectividade de células no sistema nervoso central, particularmente no contexto das doenças neurológicas, tais como esclerose múltipla e autismo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylazine Lloyd Laboratoried perscription drug
Ketamine AnaSed Injections perscription drug
Vibratome (Vibrating blade microtome) Leica VT1200
Hibernate-A Medium Gibco A1247501 CO2-independent neural medium for adult tissue
Atomic Force Microscope, MFP-3D-BIO Asylum Research -
Petri Dish Heater Asylum Research -
AFM Probe, 0.03 N/m, 10 µm radius borosilicate sphere Novascan PT.GS
Cell-Tak Corning 354240 mussel-derived bioadhesive
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 alternate suppliers can be used
Sodium Hydroxide, 1 N Sigma-Aldrich 59223C alternate suppliers can be used
Instrumented Indenter, NanoTest Vantage Micro Materials Ltd. - probe tip needs to be machined (steel flat punch, 1 mm diameter, 4-5 mm length)
NanoTest Liquid Cell Micro Materials Ltd. -
Parallel Plate Rheometer MCR501 Anton-Parr -
PP25  Anton-Parr - 25 mm diameter flat measurement plate
Adhesive Sandpaper McMaster-Carr 4184A48 alternate suppliers can be used
Loctite 4013 Instant Adhesive Henkel 20268 alternate suppliers can be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Dommelen, J. A. W., Hrapko, M., Peters, G. W. M. Mechanical Properties of Brain Tissue: Characterisation and Constitutive Modelling. Mechanosensitivity of the Nervous System. 249-281 (2009).
  2. Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (54), e2911 (2011).
  3. Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).
  4. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
  5. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. dM., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21, 445101 (2010).
  6. Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. Creep function of a single living cell. Biophysical Journal. 88, (3), 2224-2233 (2005).
  7. Lu, H., Wang, B., Ma, J., Huang, G., Viswanathan, H. Measurement of creep compliance of solid polymers by nanoindentation. Mechanics Time-Dependent Materials. 7, (3/4), 189-207 (2003).
  8. Cheng, L., Xia, X., Scriven, L. E., Gerberich, W. W. Spherical-tip indentation of viscoelastic material. Mechanics of Materials. 37, 213-226 (2005).
  9. Kalcioglu, Z., Qu, M., Van Vliet, Multiscale characterization of relaxation times of tissue surrogate gels and soft tissues. 7th Army Science Conference Proceedings. (2010).
  10. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. D., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation microscopy: Imaging local stress in cells. Journal of Biomechanics. 43, (2), 349-354 (2010).
  11. Kalcioglu, Z. I., Qu, M., et al. Dynamic impact indentation of hydrated biological tissues and tissue surrogate gels. Philosophical Magazine. 91, (7-9), 1339-1355 (2011).
  12. Kalcioglu, Z. I., Ra Mrozek, R. a, Mahmoodian, R., VanLandingham, M. R., Lenhart, J. L., Van Vliet, K. J. Tunable mechanical behavior of synthetic organogels as biofidelic tissue simulants. Journal of Biomechanics. 46, (9), 1583-1591 (2013).
  13. Janmey, P. A., Georges, P. C., Hvidt, S. Basic rheology for biologists. Methods in Cell Biology. 83, 3-27 (2007).
  14. Miller, K., Kurtcuoglu, V. Biomechanics of the Brain. Springer Science & Business Media. (2011).
  15. Lévy, R., Maaloum, M. Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods. Nanotechnology. 13, (1), 33-37 (2002).
  16. Fuierer, R. Basic Operation Procedures for the Asylum Research MFP-3D Atomic Force Microscope. MFP-3D Procedureal Operation "Manualette". Asylum Research. (2006).
  17. Elkin, B. S., Ilankovan, A., Morrison, B. Age-dependent regional mechanical properties of the rat hippocampus and cortex. Journal of Biomechanical Engineering. 132, 011010 (2010).
  18. Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. Journal of Neurotrauma. 24, (5), 812-822 (2007).
  19. Lee, E. H., Radok, J. R. M. The Contact Problem for Visooelastic Bodies. Journal of Applied Mechanics. 27, (3), 438-444 (1960).
  20. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129, (3), 430-440 (2007).
  21. Constantinides, G., Kalcioglu, Z. I., McFarland, M., Smith, J. F., Van Vliet, K. J. Probing mechanical properties of fully hydrated gels and biological tissues. Journal of Biomechanics. 41, (15), 3285-3289 (2008).
  22. Shen, F., Tay, T. E., et al. Modified Bilston Nonlinear Viscoelastic Model for Finite Element Head Injury Studies. Journal of Biomechanical Engineering -- Transactions of the ASME. 128, (5), 797-801 (2006).
  23. van Dommelen, J. aW., vander Sande, T. P. J., Hrapko, M., Peters, G. W. M. Mechanical properties of brain tissue by indentation: Interregional variation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 3, (2), 158-166 (2010).
  24. Rother, J., Nöding, H., Mey, I., Janshoff, A. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open biology. 4, (5), 140046 (2014).
  25. Du, P., Lu, H., Zhang, X. Measuring the Young's Relaxation Modulus of PDMS Using Stress Relaxation Nanoindentation. Symposium DD - Microelectromechanical Systems - Materials and Devices III. 1222, (c), (2009).
  26. Elkin, B. S., Morrison, B. Viscoelastic properties of the P17 and adult rat brain from indentation in the coronal plane. Journal of Biomechanical Engineering. 135, 114507 (2013).
  27. Brands, D. W., Bovendeerd, P. H., Peters, G. W., Wismans, J. S., Paas, M. H., van Bree, J. L. Comparison of the dynamic behavior of brain tissue and two model materials. 43rd Stapp Car Crash Conference Proceedings. 313-320 (1999).
  28. Hrapko, M., van Dommelen, J. A. W., Peters, G. W. M., Wismans, J. S. H. M. Characterisation of the mechanical behaviour of brain tissue in compression and shear. Biorheology. 45, (6), 663-676 (2008).
  29. Pogoda, K., Chin, L., et al. Compression stiffening of brain and its effect on mechanosensing by glioma cells. New Journal of Physics. 16, (7), 075002 (2014).
  30. Peters, G. W. M., Meulman, J. H., Sauren, A. A. H. J. The applicability of the time/temperature superposition principle to brain tissue. Biorheology. 34, (2), 127-138 (1997).
Caracterizando Propriedades Multiscale mecânicas do tecido cerebral usando microscopia de força atômica, recuo de impacto, e Reologia
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Canovic, E. P., Qing, B., Mijailovic, A. S., Jagielska, A., Whitfield, M. J., Kelly, E., Turner, D., Sahin, M., Van Vliet, K. J. Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry. J. Vis. Exp. (115), e54201, doi:10.3791/54201 (2016).More

Canovic, E. P., Qing, B., Mijailovic, A. S., Jagielska, A., Whitfield, M. J., Kelly, E., Turner, D., Sahin, M., Van Vliet, K. J. Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry. J. Vis. Exp. (115), e54201, doi:10.3791/54201 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter