इस के साथ साथ हम मानव अवधि नाल से भ्रूण और मातृ ऊतकों के विच्छेदन के लिए विधियों, अलगाव और इन ऊतकों से mesenchymal स्टेम / stromal कोशिकाओं (एमएससी) के विस्तार के द्वारा पीछा वर्णन है।
Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.
Mesenchymal स्टेम / stromal कोशिकाओं (एमएससी) सेल आधारित चिकित्सा 1 में इस्तेमाल के लिए एक आशाजनक उम्मीदवार के रूप में उभर रहे हैं। अधिकांश आवेदन एमएससी की मध्यस्थता ऊतकों की मरम्मत या प्रतिरक्षा विनियमन 2 लक्ष्य दिखाई देते हैं। इन आवेदनों में से कई में, एलोजेनिक एमएससी ऑटोलॉगस एमएससी 3 के रूप में प्रभावी हो सकता है। एलोजेनिक एमएससी का उपयोग एक ही स्रोत ऊतक 4 से कई सेल खुराक का बड़े पैमाने पर निर्माण कई रोगियों का इलाज करने के साथ संगत होने का आर्थिक लाभ दिया है।
ऐतिहासिक दृष्टि से, पूर्व नैदानिक और नैदानिक अध्ययन का उपयोग किया है अस्थि मज्जा 4 से एमएससी-निकाली गई। अस्थि मज्जा आम तौर पर एक स्वयंसेवक दाता की श्रोणिफलक शिखा से एकत्र किया जाता है। इस प्रक्रिया को आक्रामक है, और केवल मज्जा (~ 20 एमएल) की एक छोटी मात्रा एक भी पंचर के माध्यम से एकत्र किया जाता है। एमएससी की चिकित्सकीय सार्थक संख्या पैदा करने के लिए इन विट्रो विस्तार में व्यापक आवश्यकता है। सेल शक्ति बीतने संख्या के साथ कम हो जाती है <sup> 3, एक विरोधाभास जहां नैदानिक प्रभावकारिता के लिए आवश्यक कोशिकाओं की सैद्धांतिक संख्या अधिक सेल की आबादी का विस्तार किया है बढ़ जाती है बनाने। अस्थि मज्जा रेस्पायरेट्रस के विपरीत, अवधि नाल एक शारीरिक रूप से बड़े शुरुआती ऊतक (आमतौर पर 500-750 जी 4), जो दाता के लिए कोई जोखिम के साथ सीजेरियन सेक्शन के दौरान aseptically काटा जा सकता है। एमएससी नाल से निकाली गई लंबी अवधि के प्रसार 5 और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी क्षमता 6, अस्थि मज्जा व्युत्पन्न एमएससी करने के लिए बेहतर है। पिछले एक अध्ययन में, हम दिखा दिया है कि एक ही पद नाल अप करने के लिए 7,000 नैदानिक खुराक 4 के निर्माण के लिए पर्याप्त एमएससी निहित। इन विशेषताओं एलोजेनिक एमएससी के निर्माण के लिए एक आदर्श स्रोत ऊतक नाल बनाते हैं।
अपरा एक fetomaternal दोनों भ्रूण और मातृ ऊतक 7 से मिलकर हो सकता है, सैद्धांतिक रूप से, पृथक भ्रूण या मातृ मूल के एमएससी अंग है, और इस प्रकार है। निम्न संदर्भ de प्रदानविकास और विकृति पर पूंछ जानकारी, साथ ही मानव नाल और adnexa 8,9 की सूक्ष्म और स्थूल परीक्षा। नाल उचित काफी हद तक भ्रूण रक्त वाहिकाओं और स्रावी और समर्थन कोशिकाओं trophoblasts बुलाया के शामिल है, जरायु frondosum (प्लेट) 8 द्वारा कवर कोरियोनिक विल्ली बना रही है। branched अपरा विल्ली गर्भाशय सर्पिल धमनियों से बचाया मातृ रक्त में स्नान कर रहे हैं, पोषक तत्व, हार्मोन और भ्रूण और मां के बीच गैस विनिमय सक्षम करने से। नाल मातृ decidual stromal कोशिकाओं और भ्रूण extravillious trophoblasts के माध्यम से अंतर्गर्भाशयकला के लिए लंगर डाले है बाह्य मैट्रिक्स 8 में interspersed हैं। विल्ली भ्रूण कोरियोनिक प्लेट जहां वे गर्भनाल 8 फार्म पर एकाग्र।
अपरा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं पर पहला अंतर्राष्ट्रीय कार्यशाला का नतीजा (2008) अलगाव और characterizatio का मानकीकरण करने की जरूरत की सराहना की थीमानव अवधि नाल 10 से कोशिकाओं के एन। नाल की शरीर रचना के कारण, विभिन्न ऊतकों के विच्छेदन, एमएससी के अलगाव और प्रत्याशित संस्कृति परिणामों क्षेत्र के लिए नए लोगों के लिए भारी हो सकता है। इस प्रोटोकॉल में, अपरा कोरियोनिक ऊतकों की फसल, एमएससी अलगाव और विस्तार के द्वारा पीछा अच्छी तरह से विस्तृत है। से फ्लो के माध्यम से और इन विट्रो भेदभाव में एमएससी लक्षण वर्णन दिनचर्या 5,11-13 माना जाता है, और इस प्रकार केवल संक्षेप में यहां विस्तृत जानकारी दी।
जैसा कि हाल ही में एक व्यवस्थित साहित्य की समीक्षा 14 में प्रकाश डाला, एमएससी प्राप्त से अपरा कोरियोनिक विल्ली आम तौर पर भ्रूण माना जाता है। हालांकि, अध्ययन के केवल 18% एमएससी प्राप्त की उत्पत्ति की जांच की, और उन में से, पढ़ाई का केवल आधा भ्रूण एमएससी और दूसरे आधे मातृ या मिश्रित आबादी एमएससी सूचना दी। तीन ऊतक यहाँ बताया घटकों में से प्रत्येक (कोरियोनिक विल्ली, कोरियोनिक प्लेट और पत्या basalis) कंप्यूटर अनुप्रयोग हैंभ्रूण झिल्ली / विल्ली, और गर्भाशय व्युत्पन्न मातृ कोशिकाओं है, जो जन्म दिया नाल से जुड़े रहने के एक छोटे से अनुपात के मुख्य रूप से osed। हम डेटा का प्रदर्शन है कि, नाल के भ्रूण की ओर नाल की मातृ पक्ष, बजाय से एमएससी अलग-थलग करने के रूप में हम पहले से 5,11 सूचना दी है, एक और अधिक उचित मूल्य उस सामग्री है अगर मातृ एमएससी वांछित हैं प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल भी XY मछली का उपयोग सेल संस्कृतियों के लिए भ्रूण या मातृ योगदान को मान्य करने का वर्णन है। जबकि इस निर्माता से एक मानक प्रोटोकॉल है, इस विश्लेषण अक्सर उपेक्षित है और इसके महत्व को कम करके आंका 14।
अपरा एक शारीरिक रूप से बड़े fetomaternal अंग है, जिसमें से भ्रूण या मातृ एमएससी 22 अलग किया जा सकता है। इस के साथ साथ, हम कैसे विशेष रूप से पत्या (मातृ), कोरियोनिक विल्ली (भ्रूण), और कोरियोनिक प्लेट (भ्रूण) ऊतक (चरण 2.2-2.4) काटना करने पर अपरा शरीर रचना विज्ञान और शिक्षा का एक विस्तृत अवलोकन प्रदान की है। बाद में, हम एक मजबूत प्रोटोकॉल है कि इन तीन ऊतकों (चरण 2.5-2.6) में से प्रत्येक से एमएससी अलगाव में सक्षम बनाता है रेखांकित किया। अपरा एमएससी विस्तार कुशल है और संस्कृतियों अस्थि मज्जा व्युत्पन्न एमएससी संस्कृतियों (आंकड़े 3 और 4) के समान दिखाई देते हैं। जबकि adipogenic भेदभाव आम तौर पर कम कुशल (चित्रा 5C) 5 osteogenic भेदभाव, विश्वसनीय (चित्रा 5 ब) है।
क्षेत्र के लिए कई नए चेहरे अनुमान होगा कि भ्रूण कोरियोनिक विल्ली या कोरियोनिक प्लेट ऊतकों से निकाली गई संस्कृतियों भ्रूण एमएससी के लिए समृद्ध होगा। हालांकि, हमारे हाथों में फेताल सेल संवर्धन केवल क्षणिक है जब इस तरह के DMEM-एलजी + मानक के रूप में एमएससी विस्तार मध्यम 10% FBS उपयोग किया जाता है 5। यहाँ हम एक पुरुष बच्चे से निकाली गई अपरा ऊतकों का उपयोग प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करते हैं। एक पुरुष बच्चे से अपरा ऊतक का उपयोग करके, भ्रूण कोशिकाओं जबकि मातृ कोशिकाओं XX गुणसूत्रों होने के रूप में पहचाने जाने योग्य हैं, आसानी से पहचान से XY गुणसूत्रों होने के रूप में कर रहे हैं। चित्रा 6 एक प्रतिनिधि संस्कृति के लिए चलता XY मछली का परिणाम है। जबकि भ्रूण एमएससी (XY) समृद्ध कर रहे हैं (अप करने के लिए 80%) भ्रूण कोरियोनिक विल्ली या कोरियोनिक प्लेट ऊतकों से निकाली गई प्रारंभिक संस्कृतियों में, ये वही संस्कृतियों तेजी से पहले दो मार्ग के ऊपर आगे निकल रहे हैं (~ 100%) मातृ द्वारा (XX) एमएससी । मानक माध्यम में, DMEM-एलजी + 10% FBS, कुछ मातृ व्युत्पन्न एमएससी कि दूषित भ्रूण ऊतकों संस्कृति में भ्रूण व्युत्पन्न कोशिकाओं outcompete की रचना की।
इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित एक महत्वपूर्ण कदम अपरा शरीर रचना विज्ञान के और जहां भ्रूण से एक प्रशंसा हैऔर मातृ ऊतक सबसे प्रभावी ढंग से काटा जा सकता है। के रूप में प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में उल्लिखित, भ्रूण ऊतक के विच्छेदन भ्रूण व्युत्पन्न एमएससी के लिए क्षणिक संवर्धन सक्षम करता है। विस्तार मध्यम तैयार करने में सुधार, विशिष्ट बहिर्जात वृद्धि कारक मध्यम पूरकता के माध्यम से भ्रूण व्युत्पन्न एमएससी आबादी के चुनिंदा विस्तार के लिए एक सेल उत्पाद है कि मातृ कोशिकाओं भ्रूण के बजाय के लिए समृद्ध है (हमारे समूह वर्तमान में इस तरह के माध्यम के योगों विकसित कर रहा है) के निर्माण की अनुमति चाहिए, और। के रूप में भ्रूण एमएससी अधिक से अधिक angiogenesis और बराबर मातृ एमएससी आबादी 37 से immunosuppressive गुण होते हैं कथित हैं भ्रूण एमएससी आबादी के निर्माण, लाभ के एक नंबर हो सकता है।
वर्णित अलगाव प्रोटोकॉल से प्रत्येक में, हम ऊतक के लगभग 10 ग्राम इस्तेमाल किया। एक पूरी नाल आम तौर पर 500-750 ग्राम है, और पिछले काम में हम दिखा दिया है कि स्वचालित ऊतक को पचाने और एक सेल विस्तार बायोरिएक्टर proc के माध्यम सेesses कि यह संभव होना चाहिए एक एकल नाल 4 से 7,000 से अधिक नैदानिक सेल खुराक निर्माण करने के लिए। ये संख्या एलोजेनिक एमएससी चिकित्सा में अपरा व्युत्पन्न एमएससी, और इस विधि के महत्व के संभावित उपयुक्तता एमएससी मूल (भ्रूण या मातृ) की परवाह किए बिना पर प्रकाश डाला। एक चिकित्सकीय दृष्टिकोण से, यह उपयोगकर्ताओं को सेल उत्पाद और क्षमता को मज़बूती से इस सेल उत्पाद का निर्माण करने की पूरी समझ है कि सबसे अधिक महत्वपूर्ण है। हमें उम्मीद है कि हमारे वीडियो शोधकर्ताओं की सहायता करेंगे नाल शरीर रचना विज्ञान को समझते हैं, नाल से एमएससी अलग, और उनकी संस्कृतियों की संभावना भ्रूण या मातृ कोशिका संरचना पूर्वानुमान करने के लिए।
The authors have nothing to disclose.
आरपी एक राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (NHMRC) postdoctoral प्रशिक्षण फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया। वी.एस. एक विश्वविद्यालय क्वींसलैंड अंतर्राष्ट्रीय स्नातकोत्तर छात्र की छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित किया गया। MRD NHMRC और इनर व्हील ऑस्ट्रेलिया द्वारा समर्थित किया गया।
हम रोगी सहमति और नमूना संग्रह में सहायता के लिए नैदानिक और नर्सिंग स्टाफ को धन्यवाद। हम प्रसूति में व्यावहारिक विचार विमर्श, Feto-अपरा विकास और नाल शरीर रचना के लिए प्रो Nickolas फिस्क, प्रो केरी एटकिंसन और डॉ रोहन Lourie धन्यवाद।
Reagents | |||
HBSS | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Long name: Hanks Balanced Salt Solution |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
trypsin-substitute | Gibco/Invitrogen | 12563-029 | Long name: TrypLE Select |
DMEM-LG | Gibco/Invitrogen | 11885-092 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-Low Glucose |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
PBS (Mg+Ca+ free) | Gibco/Invitrogen | 14190-250 | Long name: Dulbecco's Phosphate buffered saline, magnesium and calcium free |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
paraformaldehyde powder or 4% solution | any | ||
Collagenase I | Invitrogen | 17100-017 | 2500U/ml |
Dnase I | Sigma | D5025 | 10 mg/mL in 0.15 M NaCl |
Dispase | Invitrogen | 17105-041 | 10 mg/ml in water (20,000 U/ml). |
Material | Company | Catalog Number | Comments |
Disposables: | |||
50 ml centrifuge tubes | Falcon or any brand | ||
petri dishes, sterile plactic (25 cm and 10 cm diameter) | Nunc | ||
Cell strainers (100 micron) | Becton Dickinson | 352340 | |
175 and 75 cm2 (T175 and T75) tissue culture flasks | Nunc | ||
5 ml, 10 ml, 25 ml sterile serolgical pipettes | any brand | ||
Material | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment: | |||
Centrifuge | |||
tissue culture incubator 37 degrees celcius, 5 % CO2 | |||
Biological safety cabinet | |||
Sterile scissors and tweezers | |||
Tube racks | |||
Pipette-boy or equivalent | |||
Gilson type pipetters and sterile tips 1000 µl, 200 µl, 20 µl. | |||
rocking or shaking incubator (37 degrees celcius) | |||
personal protective equipment | |||
cleaning solutions (suitable for blood) | |||
waste containers, correct disposal bins for tissue/blood | |||
Reagents for MSC characterization | |||
Antibody (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | Isotype |
CD73 (AD2) | Miltenyi Biotec | 130-095-183 | Mouse IgG1 |
CD105 (43A4E1) | Miltenyi Biotec | 130-094-941 | Mouse IgG1 |
CD90/Thy-1 (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-403 | Mouse IgG1 |
CD45 (5B1) | Miltenyi Biotec | 130-080-202 | Mouse IgG2a |
CD34 (AC136) | Miltenyi Biotec | 130-090-954 | Mouse IgG2a |
HLA-DR (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-298 | Mouse IgG2a |
CD31 (PECAM-1) | BD Pharmingen | 555446 | Mouse IgG1 |
CD146 (541-10B2) | Miltenyi Biotec | 130-092-849 | Mouse IgG1 |
CD44 (DB105) | Miltenyi Biotec | 130-095-180 | Mouse IgG1 |
Isotype Controls (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-214 | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-212 | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-091-837 | |
Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-098-849 | |
MACS Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Osteogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
β-Glycerol Phophate | Sigma | 50020 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | For calcium matrix staining |
Adipogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
insulin | Sigma | I2643 | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
Indomethacin | Sigma | I7378 | |
3-isobutyl-1-methyl xanthine | Sigma | I5879 | |
Oil Red O solution | Sigma | O1391-250ML | For lipid vacuole staining |
XY FISH kit to determine fetal or maternal origin of cells | |||
XY chomosome FISH kit | Vysis (Abbott Molecular) | 07J20-050 | Long name: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Direct Labeled Fluorescent DNA Probe Kit |