Summary
هنا نحن تصف الأساليب لتشريح أنسجة الجنين والأم من المشيمة المدى الإنسان، تليها العزلة وتوسيع الجذعية الوسيطة / الخلايا اللحمية (MSC) من هذه الأنسجة.
Introduction
الجذعية الوسيطة / الخلايا اللحمية (MSC) آخذة في الظهور كمرشح واعدة لاستخدامها في العلاجات القائمة على خلية 1. ويبدو أن معظم التطبيقات لاستهداف إصلاح الأنسجة بوساطة لجنة السلامة البحرية أو تنظيم جهاز المناعة 2. في العديد من هذه التطبيقات، قد يكون خيفي MSC فعالة كما MSC ذاتي 3. استخدام MSC خيفي لديه ميزة اقتصادية من كونها متوافقة مع تصنيع واسعة النطاق من جرعات خلية متعددة من الأنسجة مصدر واحد 4 لعلاج العديد من المرضى.
تاريخيا، وقد استخدمت الدراسات ما قبل السريرية والسريرية MSC المشتقة من نخاع العظام 4. يتم جمع نخاع العظام عموما من عرف الحرقفة من متبرع متطوع. هذه العملية هي الغازية، ويتم جمعها فقط كمية صغيرة من نخاع (~ 20 مل) من خلال ثقب واحد. توليد الأرقام ذات مغزى سريريا للجنة السلامة البحرية يتطلب واسعة النطاق في توسيع المختبر. انخفاض قوة خلية مع عدد مرور
المشيمة هي جهاز الدم الجنيني للأم التي تتكون من الجنين والأم الأنسجة 7 على حد سواء، وبالتالي MSC من أصل الجنين أو الأم يمكن أن يكون، من الناحية النظرية، ومعزولة. توفر المراجع التالية ديمعلومات الذيل على التنمية وعلم الأمراض، وكذلك الفحص المجهري والعيانية من المشيمة البشرية وadnexa 8،9. المشيمة السليم تتكون إلى حد كبير من الأوعية الدموية للجنين وإفرازية وخلايا دعم ودعا أرومة مغذية، ما يجعل منها الزغابات المشيمية التي frondosum المشيمه (لوحة) 8 تغطيتها. واستحم الزغابات المشيمية تشعبت في دم الأم تسليمها من شرايين الرحم دوامة، مما المواد الغذائية، والهرمونات وتبادل الغازات بين الجنين والأم. وترتكز المشيمة إلى بطانة الرحم عن طريق خلايا انسجة الساقطية الأمهات وأرومة مغذية extravillious الجنين تتناثر في المصفوفة خارج الخلية 8. الزغابات تلتقي على لوحة المشيمي الجنين حيث أنها تشكل الحبل السري 8.
وكان من نتائج ورشة العمل الدولية الأولى على خلايا جذعية مأخوذة من المشيمة (2008) تقديرا للحاجة إلى توحيد العزلة وتوصيفن من الخلايا من المشيمة المدى البشري 10. بسبب تشريح المشيمة، تشريح الأنسجة المختلفة، والعزلة للجنة السلامة البحرية والنتائج المتوقعة الثقافة يمكن ساحق للوافدين الجدد إلى هذا المجال. في هذا البروتوكول، والحصاد من الأنسجة المشيمية المشيمة، تليها العزلة MSC والتوسع هو مفصل بدقة. وتعتبر لجنة السلامة البحرية توصيف عبر التدفق الخلوي والتمايز في المختبر روتين 5،11-13، وبالتالي مفصلة فقط لفترة وجيزة هنا.
كما هو مبين في مراجعة الأدب منهجية حديثة 14، التي تم الحصول عليها لجنة السلامة البحرية من يفترض عموما الزغابات المشيمية المشيمة إلى الجنين يكون. وعلى الرغم من فحص 18٪ فقط من الدراسات أصل لجنة السلامة البحرية التي تم الحصول عليها، وتلك، أفاد نصف فقط من الدراسات MSC الجنين وأفاد النصف الآخر السكان MSC الأمهات أو مختلطة. كل واحد من مكونات النسيج الثلاثة المذكورة في هذه الوثيقة (الزغابات المشيمية، المشيمي لوحة والساقط القاعدي) هي شركاتosed أساسا من غشاء الجنين / الزغب، ونسبة صغيرة من الخلايا الأمهات المستمدة من الرحم، والتي لا تزال تعلق على المشيمة تسليمها. ونحن نقدم بيانات تدل على أن عزل MSC من جانب الأم من المشيمة، وليس الجانب الجنين من المشيمة، ونحن قد ذكرت سابقا 5،11، هو مادة انطلاق أكثر ملائمة إذا رغبت MSC الأمهات. يصف هذا البروتوكول أيضا استخدام XY FISH للتحقق من صحة مساهمة الجنين أو الأم إلى مزارع الخلايا. في حين أن هذا هو بروتوكول قياسي من الشركة المصنعة، غالبا ما تهمل هذا التحليل وأهميته الاستهانة 14.
Protocol
وافق البحوث اللجان الإنسان الأخلاق في الخدمات الصحية مطر، رويال بريسبان ومستشفى النساء، جامعة كوينزلاند للتكنولوجيا وجامعة كوينزلاند للأبحاث وجمع عينات من المشيمة البشرية المستخدمة في الدراسة. جميع البروتوكولات ينسجم مع المبادئ التوجيهية البحثية الوطنية. المرضى شريطة إبلاغ موافقة خطية لاستخدام الأنسجة لأغراض البحث.
تم الحصول عليها مشيمة الثلث الثالث من الأمهات صحية بعد ولادة قيصرية الروتينية (CS) في المدى من المستشفيات المذكورة أعلاه في بريسبان، أستراليا. واستخدمت الحمل المتنافرة الذكور للعينات المدى في هذه الدراسة للتمييز الجنين من خلايا الأمهات. وقد تم تحديد الجنين بين الجنسين عن طريق الموجات فوق الصوتية قبل الولادة و / أو الفحص البصري من الوليد عند الولادة من قبل الكادر الطبي. وقد استخدمت X و Y مضان كروموسوم في الموقع التهجين (FISH) لمزيد من التحقق من صحة نوع الجنس والأصل الجنين أو الأم للأنسجة المحفوظة منمشيمة الأصلية.
1. قبل الحصاد، إعداد ما يلي
ملاحظة: عندما تشكل حلول الانزيم، ينبغي اتباع متطلبات وتركيزات محددة المقدمة من قبل الشركة المصنعة لكل منتج. وغالبا ما تقدم الانزيمات بأنها مزيج النفط الخام من البروتينات، لذلك من المحتمل أن يكون مختلف الأنشطة / تركيزات الانزيمات مماثلة من شركات مختلفة. لهذا السبب ينبغي الاعتراف المشورة الشركة المصنعة وقد يكون إعداد حل لتعديلها وفقا لذلك.
- إعداد أو شراء 1،5-2 L مجموعه عقيمة هانك المتوازن محلول الملح (HBSS) لهذا البروتوكول.
- يعد حل كولاجيناز الأسهم أنا وزنها عن طريق نوع كولاجيناز الأول وحل 1 ملغ / مل في HBSS ودوامة بلطف لضمان حل كامل. تحديد حجم HBSS (التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم) المطلوبة لتحقيق حل كولاجيناز إلى 100 وحدة (U) / ميكرولتر (حل 1،000x الأسهم) ثم تصفية باستخدام 0.2 &# 181؛ م مرشح حقنة. قسامة 1 مل مجلدات إلى 1.5 مل أنابيب ومخزن في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
- إعداد dispase حل الأسهم عن طريق إذابة dispase غير معقمة في 10 ملغ / مل في Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) بدون الكالسيوم أو المغنسيوم. وعلاوة على ذلك تمييع مع DPBS بدون الكالسيوم أو المغنسيوم إلى تركيز النهائي من 2.4 U / مل. تصفية تعقيم من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرون. قسامة 1 مل مجلدات في أنابيب 1.5 مل ومخزن في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
- إعداد ديوكسي ريبونيوكلياز (الدناز) -I حل الأسهم عن طريق إذابة الدناز-I في 10 ملغ / مل في 0.15 م كلوريد الصوديوم. تصفية تعهدتا مرشح حقنة 0.2 ميكرون. قسامة 1 مل مجلدات في أنابيب 1.5 مل ومخزن في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
- إعداد الحل الهضم العمل من خلال الجمع بين 100 U / مل نوع كولاجيناز الأول، I.5 ميكروغرام / مل الدناز أنا و 2.4 U / مل dispase في DMEM المصل خالية. حديثا تذويب وتمييع الأسهم الإنزيم مباشرة قبل الاستعمال. تقريبا، نسبة 1: 1 من حل الهضمحجم لحجم الأنسجة مطلوب (مثلا 10 مل من الأنسجة، وتقاس في أنبوب 50 مل، ويتطلب 10 مل من محلول الهضم).
- يعد حل بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني والتكيف مع درجة الحموضة 7.4 15. مخزن 25 مليلتر مأخوذة في -20 درجة مئوية لفترة طويلة أو عند 4 درجة مئوية لمدة 1 أسبوع.
- إعداد MSC مستنبت من DMEM منخفض الجلوكوز (DMEM-LG) تستكمل مع حل مضاد حيوي ومضاد فطري 1X و 10٪ غير الحرارة المعطل الجنين مصل بقري. FBS MSC-الصف يمكن شراؤها من العديد من الموردين FBS.
- الأوتوكلاف تعقيم المعدات تشريح مقدما وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. وتشمل هذه مقص، ملقط، المشارط، وعلبة تشريح معدنية كبيرة. جمع إضافية عقيمة بلستيكور زراعة الأنسجة والمواد الاستهلاكية (مثل شفرات المشرط، 50 مل و 15 مل أنابيب، 25 مل، 10 مل و 5 مل الماصات، و 75 أو 175 قوارير سم 2 ثقافة الخلية).
- استخدام معيار المعدات المختبرية ثقافة الخلية الأولية: من الدرجة الثانية بiosafety مجلس الوزراء مناسبة لعزل الخلية الأولية، وضعت خلية ثقافة حاضنة في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية، والروك في الحاضنة 37 درجة مئوية، وجهاز للطرد المركزي بسعة 50 مل أنابيب.
- استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة: معطف المختبر، 2 زوجا من القفازات (في جميع الأوقات)، ونظارات السلامة، والأحذية الأصابع قرب وفقا لتوجيهات المؤسسية.
- إعداد الحلول المناسبة لإزالة التلوث لعينات دم الإنسان وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية وحاويات النفايات البيولوجية السائلة مقدما.
2. عزل من المشيمة MSC
- إعداد المشيمة
- ارتداء معدات الوقاية الشخصية المطلوبة. اقامة مجلس الوزراء السلامة البيولوجية مع المواد المطلوبة والحلول وحاويات النفايات لتنفيذ الإجراء حتى الهضم الأنزيمي (القسم 2.5.6).
- الحصول على المشيمة مع الموافقة المسبقة والموافقة الأخلاقية. جمع المشيمة عبر ثانية القيصريةنشوئها في ظل ظروف الجراحية العقيم، وحزمة في كيس معقم أو دلو لنقلها إلى المختبر.
- أثناء النقل، وقبل التشريح، وتخزين المشيمة في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية.
ملاحظة: الأنسجة يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 6 ساعات دون التأثير على أداء ثقافة الخلية.- يحدد الوقت بين جمع المشيمة ومعالجة الأنسجة كلما كان ذلك ممكنا. تستند هذه التوصية على القضايا العملية. في بعض الحالات، ونحن قد تأخر عملية عزل الخلايا لمدة تصل إلى 6 ساعات بعد الولادة. في هذه الحالات ظلت مشيمة في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية (في المختبر أو في مركز جمع). وقد لوحظ عدم وجود فروق كشف، قبل الاختلاف المانحة العام، في لجنة السلامة البحرية التي تم الحصول عليها من مشيمة عندما تم تخزينها في 4 درجات مئوية أو في درجة حرارة الغرفة.
- وضع الحاوية مع المشيمة في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. فتح الحاوية ونقل المشيمة إلى علبة معقم.
- فتح من الأغشية الجنينية (السلوي كيس أو الجرداء-السلى المشيمي) 8. تصبح الموجه مع أجزاء من المشيمة. الجانب الجنين لديه الإدراج الحبل السري، وهو بشكل عام، وإدراجها مركزيا في المشيمة. الجانب الأمهات (واصطف مع القاعدي الساقط)، وهو عكس الجانب الجنين، لديها النبتات واضحة (أو الفصوص).
- للبدء في التشريح، وتوجيه المشيمة مع الحبل السري التي تواجه صعودا في علبة معقم.
ملاحظة: تم تصميم هذا البروتوكول لانتاج خلايا كافية لالبذور في واحدة قارورة T175 من كل نوع من أنواع الأنسجة الثلاث. كل هضم يبدأ مع ما يقرب من 10 غرام من الأنسجة. هذا هو رقم انطلاق مماثل من قوارير كما الثقافات MSC بدأت من نخاع نضح 20 مل العظام. وإذا رغبت المزيد من الخلايا، ثم المزيد من الأنسجة يمكن حصاده وبروتوكول يمكن تحجيمها خطيا. أحجام من الأنسجة إلى أن تحصد إرشادية فقط ما هو عملي مع أنسجة المشيمة. هناك عدد قليل من defininميزات ز في الزغابات المشيمية، والتي يمكن أن تستخدم كنقطة مرجعية. أبعاد أشار بمثابة تقدير ويستخدم الحبل السري كمعلم على سطح الجنين.
- تشريح (D) الأنسجة ساقطي
- الوجه المشيمة على ذلك السطح الأمهات (القاعدي الساقط) هو مواجهة. تأكد من أن الجانب الجنين مع نقطة الحبل السري الإدراج لأسفل.
- قطع قطعة من 0.5 سم سماكة من جانب الأم من المشيمة (التي تحتوي على الأنسجة الساقط القاعدي).
- ضع قطعة نسيج في طبق بتري تحتوي HBSS أثناء تشريح للحفاظ على قطعة نسيج رطب.
- نقل الأنسجة كافية لملء أنبوب يصل إلى العلامة 10 مل في أنبوب 50 مل (وهذا هو تقريبا 10 غرام من الأنسجة).
- تشريح للوحة المشيمي (CP) الأنسجة
- إزالة ميكانيكيا من الغشاء الذي يحيط بالجنين من على سطح الجنين المشيمة (لا الكيس الذي يحيط بالجنين)، وترك تشوfrondosum rionic (لوحة المشيمي) سليمة.
- تقطع ~ 1 سم من 0.5 سم عميقة من لوحة المشيمية. حصاد لوحة المشيمي من المنطقة الأقرب إلى الحبل السري، بعيدا عن حافة المشيمة.
- ضع قطعة نسيج في طبق بتري تحتوي HBSS أثناء تشريح للحفاظ على رطب.
- نقل الأنسجة كافية لملء أنبوب 50 مل يصل الى علامة 10 مل (~ 10 غرام من الأنسجة).
- تشريح Chorionic الزغب (CV) الأنسجة
- تشريح الأنسجة السيرة الذاتية ~ 1 سم 2 × 0.5-1 سم عميقة من أنسجة المشيمة حيث تم بالفعل إزالة CP. مرة أخرى، الحصاد السيرة الذاتية من المنطقة الأقرب إلى الحبل السري، بعيدا عن حافة المشيمة. في محاولة للبقاء 1 سم على الأقل من جانب الأم من المشيمة (التي تحتوي على الأنسجة الساقط القاعدي)؛ والهدف من ذلك هو حصاد الأنسجة من الداخل من أنسجة المشيمة الزغب.
- ضع قطعة نسيج في طبق بتري تحتوي HBSS خلال ديستصنيع الى الاحتفاظ بها رطبة.
- نقل الأنسجة كافية لملء أنبوب 50 مل يصل الى علامة 10 مل (~ 10 غرام من الأنسجة).
- تنميق والأنزيمية الهضم من D، CP، والسيرة الذاتية المشيمة الأنسجة
- كما أن هناك ~ 10 غرام من D، CP أو السيرة الذاتية الأنسجة في ثلاثة مختلفة 50 مل أنابيب، وملء كل أنبوب مع ما يقرب من 40 مل من HBSS وعكس مرارا وتكرارا على أنبوب من أجل غسل الأنسجة (اكرر لل~ 10 ثانية).
- صب طاف وكرر هذه الخطوة غسل 2-3 مرات حتى الحل هو حر إلى حد كبير من الدم. استخدام ماصة 10 مل أو ملاقط طويلة لضمان عدم فقدان قطعة نسيج من الأنبوب (ق) عندما الصب طاف.
- إعادة القطع الأنسجة إلى 10 سم طبق بتري مع الحد الأدنى من نقل السائل. ختم / اللحم المفروم النسيج الى قطع صغيرة من حوالي 1-5 مم 3 مع مقص أو شفرة حلاقة.
- نقل الأنسجة المفروم مرة أخرى إلى وصفت بشكل مناسب (D، CP أو CV) 50 مل أنابيب.
- إضافة prepar حديثاإد الهضم وسائل الإعلام في لا يقل عن 1: 1 مع النسيج (مثلا 10 مل من الأنسجة بالإضافة إلى 10 مل من هضم وسائل الإعلام). استبدال الغطاء على كل أنبوب وعكس أنابيب عدة مرات لخلط.
- احتضان الأنسجة في الأنابيب مع الهضم وسائل الإعلام لمدة 1-2 ساعات عند 37 درجة مئوية. جو مرطب و 5٪ CO 2 ليست ضرورية لهذه الخطوة.
ملاحظة: مطلوب اهتزاز السريع من أجل فصل كفاءة الخلايا من الأنسجة، وتعظيم العائد لجنة السلامة البحرية. سوف العائد محدود يكون واضحا من قبل عدد قليل جدا من الخلايا التي تعلق على قارورة الثقافة في 48 ساعة والمرة الاولى مرور أطول من 1-2 أسابيع. فترة حضانة وأسلوب الهز يعتمد على 37 درجة مئوية الحاضنة المتوفرة في المختبر وقد تتطلب التحسين.- للحاضنة مع آلية الهز السريعة والسيطرة عليها، والأنسجة مكان وهضم المتوسط في أنبوب 50 مل أو دورق مخروطي العقيمة، ومكان في حاضنة ووضع اهتزاز السرعة إلى 250 دورة في الدقيقة. وهذا يؤدي إلى هضم كامل للالأنسجة في 1 ساعة.
- بدلا من ذلك، على سبيل حاضنة مع هزاز لطيف أو أي آلية هزاز، يدويا هز أنبوب بسرعة وبقوة باليد لمدة 10 ثانية كل 30 دقيقة لمدة 1،5-2 ساعة. فترة انزيم الحضانة هو الوقت المناسب للتخلص من النفايات، ومسح الوزراء للسلامة الأحيائية من العناصر غير الضرورية، تغيير معطف المختبر إذا المتسخة والتحضير للجزء القادم من هذا الإجراء.
- مجموعة من الخلايا وحيدة النواة وتصفيح في قوارير
ملاحظة: من الخطوة السابقة، وهناك ثلاثة 50 مل أنابيب (D، CP أو CV) مع هضم قطع الأنسجة. عندما تطور هضم حل الأنسجة مظهر غائم والأوعية الدموية البيضاء واضحة في الأنسجة، والهضم كاملة.- إضافة 30 مل من وسائل الاعلام MSC التي تحتوي على FBS إلى كل أنبوب لإبطال نشاط الإنزيمات الموجودة في حل الهضم.
- لفصل الخلايا وحيدة النواة من تحت الانقاض عسر الهضم كبير، نبض أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 50 مل. لفترة وجيزة، والسماحأجهزة الطرد المركزي لتصل إلى 340 س ز لمدة 5 ثوان، ثم توقف. وهذه القوة تحت الانقاض كبير لتكوير في أسفل الأنبوب، بينما يترك الخلايا وحيدة النواة في تعليق السائل.
ملاحظة: سوف تبقى الخلايا وحيدة النواة في الطور السائل إذا كان أنبوب لفترة وجيزة فقط (نابض) طرد. إذا تم تمديد الطرد المركزي، فإن الخلايا وحيدة النواة بيليه أيضا في الجزء السفلي من أنبوب مع قطع الأنسجة، مما أدى إلى فقدان الخلايا غير المرغوب فيها. - جمع طاف، التي تحتوي على الخلايا وحيدة النواة، ونقل ذلك في أنبوب 50 مل جديد مع ماصة.
- إضافة 30 مل من وسائل الاعلام أو HBSS إلى حطام الأنسجة المشيمة المتبقية ويهز بقوة. وسيؤدي هذا إلى ما تبقى الخلايا وحيدة النواة فصل في تعليق وتمكين الحصاد الثاني للجنة السلامة البحرية المفترضة من الأنسجة.
- نبض الطرد المركزي أنبوب مرة ثانية، ومرة أخرى نقل طاف لأنبوب 50 مل الجديد. كرر هذه الخطوة للمرة الثالثة لتعظيم كفاءة التحصيلالخلايا وحيدة النواة من كل مصدر الأنسجة.
- تجميع supernatants من كل نوع من أنواع الأنسجة الفردية في اثنين من 50 مل أنابيب. هذا وسوف تسفر عن 6 أنابيب الإجمالية (2 أنابيب من كل D، CP والسيرة الذاتية). أجهزة الطرد المركزي كل أنبوب لمدة 5 دقائق في 340 ز س. وهذه الخطوة بيليه الخلايا وحيدة النواة إلى الجزء السفلي من الأنابيب.
- بعناية صب أو ماصة قبالة طاف في النفايات. وليس من الضروري في محاولة للقضاء على كل قطرة من طاف.
ملاحظة: سوف بيليه خلية تكون هشة بسبب وجود عدد كبير من خلايا الدم الحمراء. يجب الحرص على عدم تجاهل بطريق الخطأ بيليه إذا كنت الصب مباشرة من الأنبوب 50 مل. - بعد إزالة معظم طاف، ونفض الغبار بلطف الأنبوب عدة مرات مع ساكنا لطرد بيليه الخلية. الجمع بين الكريات، وحتى لا يكون هناك أنبوب واحد لكل D، CP أو السيرة الذاتية الأنسجة و resuspend كل في 35 مل من وسائل الاعلام MSC.
- اختياري: تصفية جزء وحيدات النوى من خلال 100 ميكرون خلية شبكة مصفاة وضع شص في أنبوب 50 مل لإزالة كتل الخلايا أو المواد الليفية.
مطلوب العناية كما يمكن للمرشحات تسد بسهولة والإفراط في ملء: مذكرة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن فقاعات الهواء عرقلة المرشحات من استنزاف. إذا حدث هذا، رفع ببطء مرشح للخروج من أنبوب للسماح للهواء بالتدفق تحت التصفية، وغسل فلتر من خلال وسائل الاعلام مع ثقافة الخلية أو تبادل للفلتر جديد. باستثناء الخطوة التصفية لا تظهر لتغيير العائد أو نوعية الثقافات MSC اللاحقة.- اختياريا، يمكن أن يتم خلايا الدم الحمراء (RBC) تحلل أو التدرج الكثافة الطرد المركزي بها في هذه المرحلة 15. ومع ذلك، تجربتنا هي أن ربك لا تتداخل مع لجنة السلامة البحرية مرفق أو انتشار وبالتالي RBC تحلل ليس من الضروري. يمكن عد خلايا وحيدات النوى في هذه الخطوة إذا تم تنفيذ إزالة RBC من 15. وعلى الرغم من أن الغالبية العظمى من الخلايا في هذه المرحلة لا تكون لجنة السلامة البحرية، ولكن أن يكون أرومة مغذية الجنين الأصل، والخلايا البطانية والخلايا المكونة للدم، وكذلك أماهternal خلايا المنشأ الجنينية والخلايا اللحمية الساقطة.
- نقل تعليق خلية لكل D، CP أو الأنسجة السيرة الذاتية في قارورة T175 واحدة والثقافة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- التوسع بعد عزل خلايا
- في 48 ساعة بعد العزلة الأولية، وإزالة المتوسطة من كل من قوارير (D، CP والسيرة الذاتية) واستبدالها مع 35 مل من وسائل الاعلام MSC جديدة. خلايا منفصلة المتوسطة المستهلك ويمكن التخلص منها، كما يفترض MSC المفترضة لضمها إلى زراعة الأنسجة قارورة 16. العودة القوارير إلى حاضنة لمدة 24 ساعة أخرى.
- بعد 24 ساعة إضافية من الثقافة، وغسل القوارير مرتين مع DPBS (25 مل) لإزالة الحطام وكرات الدم الحمراء. دوامة السائل حول الجزء السفلي من القارورة لإزاحة كرات الدم الحمراء. استخدام ماصة لإزالة السائل والحطام. إضافة 35 مل من وسائل الاعلام MSC إلى قوارير والعودة القوارير إلى حاضنة.
- استبدال وسائل الاعلام مرتين في الأسبوع، وفيالثقافات cubate حتى الطبقات الوحيدة الخلية هي 80- 90٪ متموجة. هذا التوسع الأولي يأخذ 4-14 أيام، وهذا يتوقف على نوعية النسيج، وكمية من بدء المادية والكفاءة والوقت من الحضانة مع حل هضم.
3. ثقافة فرعية من العسكرية والأمنية الخاصة
- عندما الثقافات 80-90٪ متموجة، ويغسل مرتين مع 20 مل 1X HBSS أو DPBS وتجاهل يغسل. إضافة التربسين- بديلا عن كل قارورة (أي استخدام 5 مل قارورة T175).
- احتضان قوارير لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية لتحرير MSC من سطح زراعة الأنسجة. اضغط على جانبي القارورة كل ~ 2 دقيقة لتسهيل انفصال.
- عندما يتم فصل الخلايا من السطح وفي تعليق خلية واحدة، وغسل الخلايا من قارورة مع وسائل الإعلام لجنة السلامة البحرية وجمع الخلايا في أنابيب. فإن وسائل الإعلام MSC تمييع وتعطيلها والتربسين- بديلا (استخدام ~ 15 مل من وسائل الاعلام MSC في قارورة T175).
- نقل محتويات كل قارورة زراعة الأنسجة ل50مل أنبوب.
- أنابيب الطرد المركزي في 340 x ج لمدة 5 دقائق لخلايا بيليه.
- تجاهل طاف و resuspend الكريات خلية في 1 مل من وسائل الاعلام MSC.
- تمييع 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في 10 ميكرولتر التريبان الأزرق. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وحساب العدد الكلي للخلايا (15).
- نقل الخلايا إلى قوارير جديدة في 1150 خلية / سم 2 في وسائل الإعلام لجنة السلامة البحرية الطازجة واحتضان في حاضنة زراعة الأنسجة. في هذه الكثافة بذر البذور، 200،000 MSC في كل قارورة T175 جديدة في 35 مل من وسائل الاعلام MSC. تغذية الخلايا مرتين في الأسبوع حتى 80-90٪ متموجة. البذور المقاطع اللاحقة في 1150 خلية / سم 2 أو 200،000 MSC في كل قارورة T175.
- عندما الممر 1 (P1) أو متموجة خلايا P2، cryopreserve غالبية الخلايا لاستخدامها في المستقبل، وRESEED واحد فقط قارورة T175 لمزيد من انتشار والتوصيف. الخلايا نشر يمكن استخدامها في P3 أو P4 لفحوصات أرومية متوسطة التمايز وتوصيف الخليوي عبر فلوريداآه الخلوي.
ملاحظة: في مقاطع في وقت مبكر، قد يكون هناك عدد قليل جدا من المستعمرات فصل قليلة، ولكن كثافة الخلايا المحلية داخل كل مستعمرة قد تكون مرتفعة جدا. هذه ليست مثالية، والتعبئة الكثيفة المحلية من الخلايا سوف يؤدي إلى تثبيط الاتصال، وتأخير النمو والحد من أداء الثقافة. ونحن نوصي عندما لوحظ مستعمرات كثيفة، يجب أن تحصد الخلايا وreseeded في قارورة جديدة. توفر هذه العملية إعادة توزيع الخلايا مع غرفة لتتكاثر، وسوف يتم تحسين الأداء الثقافة بشكل عام. - لcryopreserve MSC، وجمع ~ 1 × 10 6 الخلايا في 1 مل من 90٪ FCS و 10٪ dimethylsulphoxide ([دمس]) وتجميد باستخدام البروتوكولات القياسية.
ملاحظة: في قسم النتائج التمثيلي، وهناك أوصاف توصيف MSC باستخدام التدفق الخلوي، والتمايز أرومية متوسطة وتحليل FISH XY لتحديد جنس ثلاثة مختلفة (D، CP وCV) توسيع السكان الخلية. في دراستنا، وكانت مشيمة من الأطفال الذكور. وبالتالي كليمكن تمييز الخلايا الجنينية، وذكر (Y كروموسوم) ويمكن تمييزها عن الخلايا الأمهات الإناث (كروموسوم X فقط).
Representative Results
وتتلخص إجراءات MSC العزلة المشيمة في الشكل 1. يتم تسليط الضوء على المجالات الثلاثة للتشريح المشيمة التي كانت معزولة لجنة السلامة البحرية في الشكل 2. وهذه هي الساقط الأمهات، فضلا عن أنسجة الجنين إلى حد كبير من لوحة المشيمي والزغابات المشيمية. العديد من الكتب والمقالات والتفاصيل موارد الانترنت في التنمية ودور وظيفي من مختلف أنسجة المشيمة (الرجاء مراجعة المرجع 8).
مورفولوجية الثقافات 48 ساعة بعد عزل وإزالة الحطام الأنسجة.
وبعد 48 ساعة من الثقافة، وقد أولت اللجان الدائمة للالبلاستيك زراعة الأنسجة، في حين أن عدد كرات الدم الحمراء وغيرها من معظم الحطام الخلوي لن يكون قد تعلق. في هذا الوقت، يجب أن يتم استبدال المتوسطة مع 35 مل من مستنبت الطازجة. قبل هذا التبادل المتوسط، فإنه من الصعب إبداء ملاحظات دقيقة بسببأعداد كبيرة من كرات الدم الحمراء، والتي سوف تعرقل تقييم البصرية. ظهور طاف الثقافة قد تختلف بشكل كبير بين الجهات المانحة المشيمة. ويمكن رؤية هذا الاختلاف بصريا في مثال 1 و 2 (الشكل 3A). هذه العزلة MSC اثنين، والتي ظهرت لتكون مختلفة جدا، أجريت في وقت واحد من اثنين من مشيمة مختلفة. ومع ذلك، بمجرد غسلها، وبدا كل من ثقافات مماثلة (انظر غسلها سبيل المثال 3، الشكل 3A).
تحت المجهر، وبعد تبادل وسائل الإعلام 48 ساعة، وسوف تعلق سوى عدد قليل من الخلايا إلى قارورة (الشكل 3B)، والخلايا سوف تبدو مختلفة إلى حد كبير من اللجان الدائمة توسيع نطاق أوسع. وبعض الحطام وكرات الدم الحمراء تكون واضحة كما كتل عائمة أو المرفقة وهذه لن تتداخل مع نمو اللجان الدائمة. ومن المرجح أن تكون مزيجا من الخلايا بما في ذلك لجنة السلامة البحرية، المكونة للدم والخلايا يعد ليفية انضمت إلى أسفل القارورة،الأرومة الغاذية أو الخلايا البطانية. مرة أخرى، والخلايا غير MSC-لا تمس الثقافات جنة السلامة البحرية، كما أن هذه الخلايا لا يعيش عموما أكثر من 1-2 المقاطع في ظروف التربية MSC. وعلى الرغم من بعض الاختلاف في المظهر الأولي من الثقافات، ونتائج التوسع اللاحقة تتفق عموما.
مورفولوجية الثقافات MSC مع مرور الوقت.
في هذا المثال تمثيلا، بعد سبعة أيام من العزلة، كانت صغيرة المستعمرات MSC ليفية واضحة، على الرغم من أن خلايا غير MSC ويمكن أيضا أن ينظر إليها على أنها مستديرة أو خلايا فضفاضة يعلق الشكل (4A). الخلايا المرفقة هي ما كان يطلق عليه في الأصل "وحدة مستعمرة تشكيل -fibroblast "(كفو-F) 17 و في وقت لاحق وصف MSC 18. بعد العزلة، كانت ثلاثة عشر يوما مستعمرات MSC ليفية كبيرة (الشكل 4B). عموما، سوف أحادي الطبقة يكون 80-90٪ متكدسة في هذه النقطة، والخلايا ينبغي أن يكون باشا GED. من مرور 2 فصاعدا، فإن لجنة السلامة البحرية أحادي الطبقة المشيمية تطوير مثل دوامة التشكل مميزة في ملتقى (الشكل 4C). إلا و passaged الخلايا في كثافة منخفضة، وسوف لم يعد من الممكن لاحظ تشكيل كفو-F. في كثافة منخفضة، MSC المشتقة من المشيمة لديها، ومظهر أصغر squarer من العظام الكبار المشتقة من نخاع MSC 1. في حين MSC المشتقة من المشيمة والعظام المستمدة من نخاع MSC يحمل معدلات انتشار مماثلة، والخلايا المشتقة من المشيمة هي أقل عرضة للالشيخوخة السريعة 5.
توصيف للجنة السلامة البحرية المشيمة في المختبر.
يجب أن يتسم كل السكان الخلية موسع للتأكد من أنه يتوافق مع معايير السلامة البحرية القياسية 16، بما في ذلك (1) الالتزام البلاستيك (2) وجود علامات سطح الوسيطة وعدم وجود علامات سطح المكونة للدم، و (3) القدرة على الخضوع لأرومية متوسطة التمايز.
كما هو مبين في الشكل (4)، واللجان الدائمة في الثقافة هي البلاستيكية تمسكا ولها شكل يشبه الأرومة الليفية. هذا ما يؤكد أن الخلايا تفي بالمعايير الأولى التي تحدد MSC 16.
المشيمة عرض MSC علامات سطح الوسيطة.
والثانية صفة مميزة لجنة السلامة البحرية هي وجود علامات سطح الوسيطة وعدم وجود علامات سطح المكونة للدم (16). كما ليس هناك علامة واحدة قادرة على تحديد قاطع لجنة السلامة البحرية، وتستخدم الألواح من علامات عموما بالتزامن مع تحليل التدفق الخلوي لتحديد الخلايا التي هي الوسيطة، ولكن ليس للدم. في مجموعة البيانات التمثيلية المقدمة هنا (الشكل 5A)، قمنا بتقييم التعبير خلية من علامات الوسيطة CD73، CD105، CD90، CD146، وCD44، CD45 علامات المكونة للدم وCD34، و HLA-DR، وأهلا وسهلال باسم CD31 علامة البطانية. يتم سرد كافة الأجسام المضادة المستخدمة في هذه العملية توصيف MSC المشيمة في جدول المواد / المعدات. تم تنفيذ تلطيخ وفقا للتعليمات بتصنيع وطرائق التحليل هو موضح هنا 19.
وكانت الخلايا إيجابية للعلامات الوسيطة CD73، CD105، CD44، والسلبية للعلامات سطح الخلية CD45، CD34، HLA-DR و CD31، كما هو متوقع 5،20. تقريبا، كانت 37٪ و 57٪ من الخلايا في لدينا مجموعة بيانات تمثيلية إيجابية لCD90 وCD146 21، على التوالي. وتستخدم على حد سواء CD90 وCD146 عادة MSC علامات 21. قد يكون MSC ملامح علامة سطح الخلية مختلفة اعتمادا على مصدر MSC الأنسجة وتكوين المتوسطة، أو مرور عدد 22. في لدينا العديد من سنوات الخبرة، ونحن لم وحظ تلوث طويل الأجل المستمدة من المشيمة MSC مع الخلايا غير الوسيطة التالية 1-2 صassages 5،11.
المشيمة عرض MSC إمكانية الوسيطة تمايز
بحكم التعريف، يجب أن لجنة السلامة البحرية تمتلك في المختبر أرومية متوسطة القدرة التمايز 5،13. ويتم تقييم إمكانية أرومية متوسطة التمايز عادة إما عن طريق ثلاثي أو ثنائي النسب المقايسات التمايز. المقايسات ثنائية نسب تقييم عموما المكونة للعظم والقدرة على التمايز مكون الشحم، في حين المقايسات ثلاثي النسب بالإضافة إلى تقييم قدرة التمايز المولدة للغضروف. في نتائج تمثيلية المعروضة هنا، وتبين لنا أن السكان MSC موسعة تشكل كل من الودائع الكالسيوم، مما يدل على التمايز عظمي المنشأ، وفجوات الدهون، مما يدل على تكون الشحم (الشكل 5B).
لتوصيف السكان MSC ذكرت هنا، نحن المصنفة الخلايا في 24 بئرا الثقافة في 6 × 10 4 الخلايا في 1 مل من المتوسط التعريفي. وكومبو المتوسطوترد nents في جدول المواد / المعدات. في حين الصيغ المتوسطة التعريفي شائعة في الأدب، هناك تفاوتا كبيرا في الصياغات التي تم نشرها. لهذا السبب نحن قائمة لفترة وجيزة لدينا الحث المتوسطة التركيبات والنهج تلطيخ هنا. عظمي المنشأ المتوسطة تحريض يتضمن DMEM-HG، و 10٪ FBS، 1X حل مضاد فطري للمضادات الحيوية، و 10 ملي β-الجلسرين phophate، 100 ديكساميثازون نانومتر، و 50 ميكرومتر حمض الأسكوربيك L-2-الفوسفات. مكون الشحم المتوسطة تحريض يتضمن DMEM-HG، و 10٪ FBS، 1X حل مضاد فطري للمضادات الحيوية، و 10 ميكروغرام / مل الانسولين، و 100 نانومتر ديكساميثازون، و 200 ميكرومتر الاندوميتاسين، و 500 ميكرومتر الكزانتين 3-إيسوبوتيل-1-ميثيل. هنا، والحفاظ على الثقافات في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة وتربيتها لمدة 14 يوما. وجرى تبادل المتوسطة التعريفي مرتين في الأسبوع خلال الفترة الثقافة. وبعد 14 يوما من الاستقراء، وتميزت الثقافات إما تشبه العظام مصفوفة (تكون العظم) أو فجوات الدهون (تكون الشحم) كما في السابق لدينانشر] [إيووس] 5. وقد تحقق التحليل ترسب الكالسيوم مصفوفة عظمي المنشأ بواسطة الشفط أولا قبالة المتوسطة، وتحديد الثقافات مع بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 20 دقيقة، وغسل أحادي الطبقة مع DPBS، ثم تلطيخ مع الصبغ الأحمر الأحمر S وفقا لتصنع التعليمات. تم تقييم تحريض مكون الشحم بواسطة الشفط قبالة المتوسطة، وتحديد الثقافات مع بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 20 دقيقة، وغسل أحادي الطبقة، وتلطيخ مع النفط الأحمر يا الحل وفقا لالمصنوعات التعليمات. وبعد ذلك تصور ودائع الكالسيوم الملون وفجوات النفط مع المجهر الضوئي والصور حفظها للرجوع إليها في المستقبل.
في المنشورات السابقة، فقد تميزت إمكانية التفريق بين MSC المستمدة من المشيمة أكثر على نطاق واسع 4،5. المشتقة من المشيمة MSC تكون العظم يشبه العظام MSC المستمدة من النخاع، في حين تكون الشحم عموما أقل كفاءة في المستمدة من المشيمة MSC 5 </ سوب>. نحن لا تحمل بشكل روتيني التمايز المولدة للغضروف لعدة أسباب، على الرغم من أن هذا قد ذكرت في وقت سابق من قبلنا لالمشيمة-MSC 5. أولا، في حين أن القدرة أرومية متوسطة التمايز هو السمة المميزة للجنة السلامة البحرية، فمن المرجح ذات أهمية ثانوية 23-25، وخاصة حيث من المرجح أن تكون مستمدة من لجنة السلامة البحرية إفرازات نظير الصماوي 26 والفوائد العلاجية. ثانيا، على الرغم من دومينيتشي آخرون المقترحة الحد الأدنى من المعايير لإنتاج السريري من الكبار العظام البشرية المستمدة من نخاع MSC 16، لمزيد من الدراسات الأخيرة تشير إلى MSC من منافذ مختلفة لها خصائص كامنة مختلفة وقدرات التمايز 5،13،27-32. في الواقع، Parolini آخرون اقترح أن لجنة السلامة البحرية المستمدة من المشيمة يجب أن تفرق في الأنساب "أرومية متوسطة واحدة أو أكثر" بدلا من كل الأنساب ثلاثة 10. وأخيرا، شاملة العديد من الدراسات MSC التمايز المولدة للغضروف كما يحدث من خلال ما شابه الخلايا مسار الإشارات كما تكون العظم (TGFβ مسار العائلة) 33-35.
المشيمة هي MSC الأمهات في الأصل تستخدم هذه الطريقة للثقافة، على الرغم من الموقع التشريحي للمواد البداية.
تفترض العديد من المنشورات التي خلايا معزولة من الجنين العائد المشيمه MSC الجنين على الثقافة 14. ومع ذلك، ونحن قد ذكرت سابقا 5، جميع الثقافات المستمدة من المشيمه الجنين، وذلك باستخدام هذا البروتوكول، وبسرعة أصبح المخصب لجنة السلامة البحرية الأمهات أن حدسي المتوقعة للثقافات MSC الساقطية الأمهات. في هذه النتائج تمثيلية كنا أنسجة المشيمة من الأطفال الذكور حتى أنه كان من الممكن أن تحدد بسهولة مساهمة خلية الجنين والأم في السكان الخلية الموسعة. لهذه الدراسات استخدمنا عدة FISH XY المدرجة في جدول المواد / المعدات، واتباع إرشادات المصنعين.
الآثار البيئية-together.within الصفحات = "1"> في بيانات تمثيلية المقدمة هنا، والثقافات المستمدة من الساقط الأمهات كانوا ~ 90٪ الخلايا الأم (XX) و~ 10٪ خلايا الجنين (XY) في مرور 0 (الشكل 6) . قبل مرور 2، كان السكان الخلية المستمدة من الأنسجة الأمهات ~ خلايا الأمهات 100٪ (XX)، وكانت الخلايا الجنينية (XY) لا يمكن الكشف عنها. هذا يشير إلى أن تشريح المادي للنسيج الأمهات أدى إلى إثراء خلايا الأمهات في الثقافات اللاحقة. ومع ذلك، من المهم جدا للنظر في نتائج ثقافة من الزغابات المشيمية الجنين والثقافات المستمدة من لوحة المشيمية. في مرور 0، وكانت كل من الجنين الزغابات المشيمية والمشيمي لوحة المستمدة الثقافات ~ 85٪ XY، أو من أصل الجنين، مشيرا إلى أن تشريح المستهدف إثراء للخلايا الجنينية (الشكل 6). في مرور 0، تضمنت كلا الثقافتين ~ الخلية الأم 15٪ (XX) تلوث. والمثير للدهشة، في مرور 2، ويسكنها الثقافتين الجنين مع ~ 100٪ الخلايا الأم (XX)، وخلايا الجنين (XY)لم تعد قابلة للكشف. ويكشف تحليل FISH XY أن الخلايا الأم (الكروموسومات XX) بسرعة وباستمرار سيطرة ثقافات مستمدة من الأنسجة المشيمية الجنين. هذا هو المراقبة ثقافة الحرجة التي غالبا ما يتم تجاهله 5. يتم تضمين تفاصيل هذا التحليل في هذا البروتوكول لأنه يدل على ملاحظة مهمة جدا أن الخلايا الأمهات ملء بسرعة في جميع الثقافات عندما تستكمل DMEM مع FBS 10٪ يستخدم دون عوامل إضافية تهدف إلى دعم السكان الجنين المشتقة.
الشكل 1: ملخص المشيمة إجراء MSC العزلة (الخطوة 1) توجيه نفسك مع علم التشريح المشيمة. (الخطوة 2) تشريح يدويا 10 غرام من نسيج إما الساقط، الزغابات المشيمية أو لوحة المشيمية باستخدام مقص. (الخطوة 3) اللحم المفروم ر انه تشريح أجزاء من الساقط، الزغابات المشيمية أو الأنسجة لوحة المشيمي الى قطع صغيرة مع مقص أو مشرط.
(الخطوة 4) حرروا الخلايا من القطع الجميلة عن طريق الهضم 1-2 ساعة في dispase وكولاجيناز أولا
(الخطوة 5) فصل الخلايا من الأنسجة الليفية عن طريق الطرد المركزي نبض و / أو غسلها من خلال مصفاة الخلية. جمع و resuspend الخلايا في مستنبت ووضعها في قوارير الثقافة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وسيتم اختيار الخلايا اللحمية الوسيطة (MSC) بناء على ميلها لتمسك البلاستيك والقدرة على البقاء والتكاثر في مستنبت. وأخيرا، في قسم النتائج، لجنة السلامة البحرية موسع يمكن وصف وتخزينها لاستخدامها في التجارب المستقبلية.
ther.within الصفحات = "1"> 
الشكل 2: تشريح المشيمة المدى الإنسان والأنسجة المعزولة في هذا الإجراء الأنسجة الأولى التي تحصد هو الساقط الأمهات. الساقط هو الأنسجة التي لا تزال كطبقة رقيقة على سطح المشيمة بعد إلقاء ذلك من جدار الرحم (يتم تحديد الساقط من علامات خضراء). الأنسجة الثانية التي سيتم حصادها من داخل المشيمة هي الزغابات المشيمية الجنين (علامات زرقاء). الأنسجة الثالثة إلى أن تحصد هي لوحة الجنين المشيمية (علامات حمراء) (مقتبس من مرجع 36). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مورفولوجيا الثقافات 48 ساعة بعد عزل وإعادةتحريك الحطام الأنسجة. (A) مظهر من طاف الثقافة قد تتفاوت تفاوتا كبيرا بين الجهات المانحة المشيمة قبل غسله تحت الانقاض. الثقافات سبيل المثال 1 و 2 تبين هذا الاختلاف. وقد أجريت هذه العزلة اثنين في وقت واحد، ولكن اثنين من مشيمة مختلفة. مرة واحدة الثقافات غسلها سوف تكون واضحة من عدد كرات الدم الحمراء والحطام الأنسجة كما هو موضح في المثال 3. النتائج توسع لاحقة تتفق عموما. (ب) وبعد تبادل وسائل الإعلام 48 ساعة، وسوف تعلق سوى عدد قليل من الخلايا إلى قارورة. مقياس شريط = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4: مورفولوجية الثقافات MSC على مر الزمن (A) سبعة أيام بعد العزلة، و الصغيرةالمستعمرات MSC ibroblastic واضحة على الرغم من خلايا غير MSC سوف تكون موجودة بشكل دائري أو خلايا فضفاضة يعلق أيضا. (ب) بعد 13 يوما من العزلة، مستعمرات لجنة السلامة البحرية ليفية كبيرة وغالبا ما يكون أحادي الطبقة من MSC هو متكدسة وجاهزة للمرور. (ج) من مرور 2 فصاعدا، سوف أحادي الطبقة MSC تطوير مثل دوامة التشكل مميزة في التقاء. مقياس شريط = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: MSC توصيف التدفق الخلوي والتمايز أرومية متوسطة (A) والمشيمية MSC المستمدة من الزغابات المشيمية عرض لمحة MSC علامة كلاسيكية من تحليل التدفق الخلوي، على الرغم من أن لهذه العلامات سطح الخلية، مورينداتاهيتيانونيسيون مشابه لجميع أنواع MSC الإنسان. ويظهر الرسم البياني كل شدة إشارة (محور س) مقابل عدد خلايا طبيعية على المحور الصادي (٪ ماكس). في هذه البيانات التمثيلية المنصوص كانت خلايا إيجابية لCD73، CD105 وCD44، والسلبية للعلامات المكونة للدم CD45 و CD34 و HLA-DR. (ب) المشيمة MSC الخضوع عموما التمايز مولدة للعظم قوي، ولكن (C) التمايز مكون الشحم يمكن أن يكون أقل كفاءة من مع العظام MSC المستمدة من النخاع العظمي. واتخذت صورة في تعليق B و C في 40X التكبير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: MSC المشيمة والأمهات في الأصل تستخدم هذه الطريقة للثقافة، على الرغم من الموقع التشريحي للمواد البداية.تظهر المؤامرات الكمي من الجنين (ذكر، XY) والأم (أنثى، XX) تكوين خلية من الثقافات MSC المشيمة معزولة عن ساقطي، الزغابات المشيمية والأنسجة لوحة المشيمي في كل مرور الثاني. الخلايا الأم (XX) بسرعة وبتكاثر تولي الثقافات المستمدة من الأنسجة المشيمية الجنين. الجنين = = الذكور كروموسوم XY في الكشف عن خلية فردية، الأم = الإناث = XX الكروموسومات في الكشف عن خلية فردية. وكانت البيانات المقدمة هنا من N = 3 مشيمة المانحة مستقلة من الأطفال الذكور، مع ما لا يقل عن 100 خلية الملون لXY الأسماك وتحسب لكل نقطة بيانات. الحانات تمثل المتوسطات، وأشرطة الخطأ تعكس انحراف معياري واحد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
المشيمة هي جهاز الدم الجنيني للأم كبير جسديا، والتي من MSC الجنين أو الأم يمكن عزل 22. هنا، قدمنا لمحة مفصلة عن التشريح المشيمة وتعليمات عن كيفية تشريح تحديدا الساقط (الأمهات)، الزغابات المشيمية (الجنين)، ولوحة المشيمية (الجنين) الأنسجة (الخطوة 2،2-2،4). وفي وقت لاحق، ونحن الخطوط العريضة لبروتوكول قوية تمكن MSC بمعزل عن كل هذه الأنسجة الثلاثة (الخطوة 2،5-2،6). التوسع المشيمة لجنة السلامة البحرية بكفاءة والثقافات تظهر مشابهة لالعظام المستمدة من نخاع الثقافات MSC (الشكلان 3 و 4). التمايز عظمي المنشأ هو موثوق بها (الشكل 5B)، في حين التمايز مكون الشحم عموما أقل كفاءة (الشكل 5C) 5.
وكثير من القادمين الجدد إلى الميدان يفترض أن الثقافات المستمدة من الزغابات المشيمية الجنين أو الأنسجة لوحة المشيمي سيتم المخصب لالجنين لجنة السلامة البحرية. ومع ذلك، في أيدينا الحديدتل تخصيب الخلية عابرة فقط عندما القياسي المتوسطة التوسع MSC مثل DMEM-LG + 10٪ يستخدم FBS 5. هنا نقدم نتائج ممثل باستخدام أنسجة المشيمة المستمدة من طفل ذكر. باستخدام أنسجة المشيمة من الطفل الذكر، والخلايا الجنينية هي بسهولة بحيث يمكن التعرف على أنها الصبغيات XY، في حين أن الخلايا الأم هي التي تعرف وجود كروموسومات XX. ويبين الشكل 6 النتائج FISH XY للثقافة التمثيلية. في حين MSC الجنين (XY) يتم إثراء (تصل إلى 80٪) في الثقافات الأولية المستمدة من الزغابات المشيمية الجنين أو الأنسجة لوحة المشيمي، هذه الثقافات نفس تتجاوزها بسرعة (~ 100٪) من الأمهات (XX) MSC على الممرات الأولين . في المتوسط القياسي، تتألف من DMEM-LG + 10٪ FBS، القليلة MSC الأمهات المشتقة التي تلوث أنسجة الجنين تكومبيتي الخلايا الجنينية المستمدة في الثقافة.
خطوة حاسمة الواردة في هذا البروتوكول هو تقدير للتشريح المشيمة والجنين من حيثوالأنسجة الأمهات يمكن أن تحصد أكثر فعالية. كما هو موضح في قسم النتائج تمثيلا، تشريح أنسجة الجنين لا يمكن تخصيب عابرة للجنة السلامة البحرية المستمدة من الجنين. تحسينات في توسيع صياغة المتوسطة، من خلال خارجي عامل النمو المتوسطة مكملات معينة ينبغي أن يسمح التوسع الانتقائي للسكان MSC الجنين المشتقة، وتصنيع منتج الخلية التي يتم تخصيبها للالجنين بدلا من الخلايا الأم (مجموعتنا حاليا على تطوير هذه الصيغ متوسطة). قد يكون صنع السكان MSC الجنين عددا من المزايا، كما يزعم MSC الجنين لديها أكبر الأوعية الدموية وخصائص مثبطة للمناعة من السكان أي ما يعادل MSC الأمهات 37.
في كل من البروتوكولات العزلة وصفها، وتستخدم ما يقرب من 10 غرام من الأنسجة. والمشيمة كلها عادة 500-750 غرام، وفي أعمال سابقة أثبتنا أنه من خلال النسيج الآلي هضم وتوسيع الخلية مفاعل حيوي بروكesses أنه ينبغي أن يكون من الممكن لتصنيع أكثر من 7،000 جرعات خلية السريرية من المشيمة واحدة (4). هذه الأرقام تبرز مدى ملاءمة المحتملة للجنة السلامة البحرية المستمدة من المشيمة في العلاجات MSC خيفي، وأهمية هذه الطريقة بغض النظر عن MSC المنشأ (الجنين أو الأم). من منظور علاجي، هو الأكثر أهمية أن المستخدمين لديهم فهم كامل من المنتج الخلية والقدرة على تصنيع هذا المنتج موثوق الخلية. نأمل أن لدينا شريط فيديو ستساعد الباحثين على فهم التشريح المشيمة، عزل MSC من المشيمة، وتوقع المرجح الجنين أو الأم تكوين خلية من ثقافاتهم.
Acknowledgments
وأيد RP من قبل المجلس الوطني للصحة والأبحاث الطبية (NHMRC) ما بعد الدكتوراه تدريب الزمالة. وأيد VS من جامعة كوينزلاند الدولي طالب دراسات عليا منح دراسية. وأيد MRD من قبل NHMRC والداخلية العجلة أستراليا.
نشكر الكادر الطبي والتمريض للمساعدة في موافقة المريض وجمع العينات. نشكر الأستاذ Nickolas فيسك، البروفيسور كيري أتكينسون والدكتور روهان وري لإجراء مناقشات متعمقة في التوليد وتنمية فيتو المشيمة والتشريح المشيمة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| HBSS | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Long name: Hanks Balanced Salt Solution |
| FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
| trypsin-substitute | Gibco/Invitrogen | 12563-029 | Long name: TrypLE Select |
| DMEM-LG | Gibco/Invitrogen | 11885-092 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-Low Glucose |
| DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
| PBS (Mg+Ca+ free) | Gibco/Invitrogen | 14190-250 | Long name: Dulbecco's Phosphate buffered saline, magnesium and calcium free |
| Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
| paraformaldehyde powder or 4% solution | any | ||
| Collagenase I | Invitrogen | 17100-017 | 2,500 U/ml |
| Dnase I | Sigma | D5025 | 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | 10 mg/ml in water (20,000 U/ml). |
| Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables: | |||
| 50 ml centrifuge tubes | Falcon or any brand | ||
| petri dishes, sterile plactic (25 cm and 10 cm diameter) | Nunc | ||
| Cell strainers (100 μm) | Becton Dickinson | 352340 | |
| 175 and 75 cm2 (T175 and T75) tissue culture flasks | Nunc | ||
| 5 ml, 10 ml, 25 ml sterile serolgical pipettes | any brand | ||
| Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | |||
| tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Sterile scissors and tweezers | |||
| Tube racks | |||
| Pipette-boy or equivalent | |||
| Gilson type pipetters and sterile tips 1,000 µl, 200 µl, 20 µl. | |||
| rocking or shaking incubator (37 °C) | |||
| personal protective equipment | |||
| cleaning solutions (suitable for blood) | |||
| waste containers, correct disposal bins for tissue/blood | |||
| Reagents for MSC characterization | |||
| Antibody (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | Isotype |
| CD73 (AD2) | Miltenyi Biotec | 130-095-183 | Mouse IgG1 |
| CD105 (43A4E1) | Miltenyi Biotec | 130-094-941 | Mouse IgG1 |
| CD90/Thy-1 (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-403 | Mouse IgG1 |
| CD45 (5B1) | Miltenyi Biotec | 130-080-202 | Mouse IgG2a |
| CD34 (AC136) | Miltenyi Biotec | 130-090-954 | Mouse IgG2a |
| HLA-DR (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-298 | Mouse IgG2a |
| CD31 (PECAM-1) | BD Pharmingen | 555446 | Mouse IgG1 |
| CD146 (541-10B2) | Miltenyi Biotec | 130-092-849 | Mouse IgG1 |
| CD44 (DB105) | Miltenyi Biotec | 130-095-180 | Mouse IgG1 |
| Isotype Controls (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | |
| Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-214 | |
| Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-212 | |
| Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
| Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-091-837 | |
| Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-098-849 | |
| MACS Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Osteogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
| DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
| FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
| Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| β-Glycerol Phophate | Sigma | 50020 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | For calcium matrix staining |
| Adipogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
| DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
| FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
| Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
| insulin | Sigma | I2643 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378 | |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine | Sigma | I5879 | |
| Oil Red O solution | Sigma | O1391-250ML | For lipid vacuole staining |
| XY FISH kit to determine fetal or maternal origin of cells | |||
| XY chomosome FISH kit | Vysis (Abbott Molecular) | 07J20-050 | Long name: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Direct Labeled Fluorescent DNA Probe Kit |
References
- Brooke, G., et al. Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells. Semin Cell dev Biol. 18, 846-858 (2007).
- Wei, X., et al. Mesenchymal stem cells: a new trend for cell therapy. Acta Phamacol Sin. 34, 747-754 (2013).
- Ma, S., et al.
- Timmins, N. E., et al. Closed system isolation and scalable expansion of human placental mesenchymal stem cells. Biotechnol Bioeng. 109, 1817-1826 (2012).
- Barlow, S., et al. Comparison of human placenta- and bone marrow-derived multipotent mesenchymal stem cells. Stem Cell Dev. 17, 1095-1107 (2008).
- Jones, B. J., Brooke, G., Atkinson, K., McTaggart, S. J. Immunosuppression by placental indoleamine 2,3-dioxygenase: a role for mesenchymal stem cells. Placenta. 28, 1174-1181 (2007).
- Parolini, O., et al. Toward cell therapy using placenta-derived cells: disease mechanisms, cell biology, preclinical studies, and regulatory aspects at the round table. Stem Cell Dev. 19, 143-154 (2010).
- Benirschke, K., Burton, G. J., Baergen, R. N. Pathology of the Human Placenta. , 6 edn (2012).
- Moore, K., Persaud, T., Torchia, M. The developing human: clinically oriented embryology. , Elsevier/ Saunders. (2013).
- Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem cells. 26, 300-311 (2008).
- Brooke, G., et al. Manufacturing of human placenta-derived mesenchymal stem cells for clinical trials. Brit J Haematol. 144, 571-579 (2009).
- Pelekanos, R. A., et al. Intracellular trafficking and endocytosis of CXCR4 in fetal mesenchymal stem/stromal cells. BMC cell biology. 15, 15 (2014).
- Chen, Y. S., et al. Small molecule mesengenic induction of human induced pluripotent stem cells to generate mesenchymal stem/stromal cells. Stem Cells Transl Med. 1, 83-95 (2012).
- Heazlewood, C. F., et al. High incidence of contaminating maternal cell overgrowth in human placental mesenchymal stem/stromal cell cultures: a systematic review. Stem Cells Transl Med. 3, 1305-1311 (2014).
- Horn, P., Bork, S., Wagner, W. Standardized isolation of human mesenchymal stromal cells with red blood cell lysis. Methods Mol Biol. 698, 23-35 (2011).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol. 2, 83-92 (1974).
- Caplan, A. I.
- Futrega, K., et al. The microwell-mesh: A novel device and protocol for the high throughput manufacturing of cartilage microtissues. Biomaterials. 62, 1-12 (2015).
- Liu, Y., Goldberg, A. J., Dennis, J. E., Gronowicz, G. A., Kuhn, L. T. One-step derivation of mesenchymal stem cell (MSC)-like cells from human pluripotent stem cells on a fibrillar collagen coating. PloS one. 7, 33225 (2012).
- Maleki, M., Ghanbarvand, F., Reza Behvarz, M., Ejtemaei, M., Ghadirkhomi, E. Comparison of mesenchymal stem cell markers in multiple human adult stem cells. Int J Stem Cell. 7, 118-126 (2014).
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).
- Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal stem cells: revisiting history, concepts, and assays. Cell stem cell. 2, 313-319 (2008).
- Bianco, P., et al. The meaning, the sense and the significance: translating the science of mesenchymal stem cells into medicine. Nature med. 19, 35-42 (2013).
- Da Silva Meirelles, L., Caplan, A. I., Nardi, N. B. In search of the in vivo identity of mesenchymal stem cells. Stem cells. 26, 2287-2299 (2008).
- Caplan, A. I., Correa, D. The MSC: an injury drugstore. Cell Stem Cell. 9, 11-15 (2011).
- Wegmeyer, H., et al. Mesenchymal Stromal Cell Characteristics Vary Depending on Their Origin. Stem Cell Dev. , (2013).
- Guillot, P. V., Gotherstrom, C., Chan, J., Kurata, H., Fisk, N. M. Human first-trimester fetal MSC express pluripotency markers and grow faster and have longer telomeres than adult MSC. Stem cells. 25, 646-654 (2007).
- Covas, D. T., et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hemol. 36, 642-654 (2008).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem cell res. 8, 58-73 (2012).
- da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P. C., Nardi, N. B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119, 2204-2213 (2006).
- James, A. W. Review of Signaling Pathways Governing MSC Osteogenic and Adipogenic Differentiation. Scientifica (Cairo). 2013, 684736 (2013).
- Xu, C., et al. Cross-Talking between PPAR and WNT Signaling and Its Regulation in Mesenchymal Stem Cell Differentiation. Curr Stem Cell Res Ther. , (2015).
- Zhuang, H., et al. Molecular Mechanisms of PPAR-gamma Governing MSC Osteogenic and Adipogenic Differentiation. Curr Stem Cell Res Ther. , (2015).
- Moore, K., Persaud, T., Torchia, M. Before We Are Born: Essentials of Embryology and Birth Defects. , Elsevier Health Sciences. 8 edn (2011).
- Zhu, Y., et al. Placental mesenchymal stem cells of fetal and maternal origins demonstrate different therapeutic potentials. Stem Cell Res Ther. 5, 48 (2014).
