هنا نحن تصف الأساليب لتشريح أنسجة الجنين والأم من المشيمة المدى الإنسان، تليها العزلة وتوسيع الجذعية الوسيطة / الخلايا اللحمية (MSC) من هذه الأنسجة.
Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.
الجذعية الوسيطة / الخلايا اللحمية (MSC) آخذة في الظهور كمرشح واعدة لاستخدامها في العلاجات القائمة على خلية 1. ويبدو أن معظم التطبيقات لاستهداف إصلاح الأنسجة بوساطة لجنة السلامة البحرية أو تنظيم جهاز المناعة 2. في العديد من هذه التطبيقات، قد يكون خيفي MSC فعالة كما MSC ذاتي 3. استخدام MSC خيفي لديه ميزة اقتصادية من كونها متوافقة مع تصنيع واسعة النطاق من جرعات خلية متعددة من الأنسجة مصدر واحد 4 لعلاج العديد من المرضى.
تاريخيا، وقد استخدمت الدراسات ما قبل السريرية والسريرية MSC المشتقة من نخاع العظام 4. يتم جمع نخاع العظام عموما من عرف الحرقفة من متبرع متطوع. هذه العملية هي الغازية، ويتم جمعها فقط كمية صغيرة من نخاع (~ 20 مل) من خلال ثقب واحد. توليد الأرقام ذات مغزى سريريا للجنة السلامة البحرية يتطلب واسعة النطاق في توسيع المختبر. انخفاض قوة خلية مع عدد مرور <suP> 3، وخلق مفارقة حيث يتم زيادة عدد النظري للخلايا اللازمة لفعالية سريرية أكثر يتم توسيع السكان الخلية. وعلى النقيض من aspirates نخاع العظام، والمشيمة المدى هي البداية الأنسجة كبيرة جسديا (عادة 500-750 ز 4)، والتي يمكن أن تحصد جو معقم و مطهر أثناء العملية القيصرية مع أي خطر على المانحة. MSC المستمدة من المشيمة يكون انتشار 5 و المناعية القدرات على المدى الطويل 6، متفوقة على العظام MSC المستمدة من النخاع العظمي. في دراسة سابقة، أثبتنا أن المشيمة عبارة واحدة تحتوي على MSC كافية لصنع ما يصل الى 7000 الجرعات السريرية 4. هذه الخصائص تجعل المشيمة والأنسجة مصدر مثالية لصناعة MSC خيفي.
المشيمة هي جهاز الدم الجنيني للأم التي تتكون من الجنين والأم الأنسجة 7 على حد سواء، وبالتالي MSC من أصل الجنين أو الأم يمكن أن يكون، من الناحية النظرية، ومعزولة. توفر المراجع التالية ديمعلومات الذيل على التنمية وعلم الأمراض، وكذلك الفحص المجهري والعيانية من المشيمة البشرية وadnexa 8،9. المشيمة السليم تتكون إلى حد كبير من الأوعية الدموية للجنين وإفرازية وخلايا دعم ودعا أرومة مغذية، ما يجعل منها الزغابات المشيمية التي frondosum المشيمه (لوحة) 8 تغطيتها. واستحم الزغابات المشيمية تشعبت في دم الأم تسليمها من شرايين الرحم دوامة، مما المواد الغذائية، والهرمونات وتبادل الغازات بين الجنين والأم. وترتكز المشيمة إلى بطانة الرحم عن طريق خلايا انسجة الساقطية الأمهات وأرومة مغذية extravillious الجنين تتناثر في المصفوفة خارج الخلية 8. الزغابات تلتقي على لوحة المشيمي الجنين حيث أنها تشكل الحبل السري 8.
وكان من نتائج ورشة العمل الدولية الأولى على خلايا جذعية مأخوذة من المشيمة (2008) تقديرا للحاجة إلى توحيد العزلة وتوصيفن من الخلايا من المشيمة المدى البشري 10. بسبب تشريح المشيمة، تشريح الأنسجة المختلفة، والعزلة للجنة السلامة البحرية والنتائج المتوقعة الثقافة يمكن ساحق للوافدين الجدد إلى هذا المجال. في هذا البروتوكول، والحصاد من الأنسجة المشيمية المشيمة، تليها العزلة MSC والتوسع هو مفصل بدقة. وتعتبر لجنة السلامة البحرية توصيف عبر التدفق الخلوي والتمايز في المختبر روتين 5،11-13، وبالتالي مفصلة فقط لفترة وجيزة هنا.
كما هو مبين في مراجعة الأدب منهجية حديثة 14، التي تم الحصول عليها لجنة السلامة البحرية من يفترض عموما الزغابات المشيمية المشيمة إلى الجنين يكون. وعلى الرغم من فحص 18٪ فقط من الدراسات أصل لجنة السلامة البحرية التي تم الحصول عليها، وتلك، أفاد نصف فقط من الدراسات MSC الجنين وأفاد النصف الآخر السكان MSC الأمهات أو مختلطة. كل واحد من مكونات النسيج الثلاثة المذكورة في هذه الوثيقة (الزغابات المشيمية، المشيمي لوحة والساقط القاعدي) هي شركاتosed أساسا من غشاء الجنين / الزغب، ونسبة صغيرة من الخلايا الأمهات المستمدة من الرحم، والتي لا تزال تعلق على المشيمة تسليمها. ونحن نقدم بيانات تدل على أن عزل MSC من جانب الأم من المشيمة، وليس الجانب الجنين من المشيمة، ونحن قد ذكرت سابقا 5،11، هو مادة انطلاق أكثر ملائمة إذا رغبت MSC الأمهات. يصف هذا البروتوكول أيضا استخدام XY FISH للتحقق من صحة مساهمة الجنين أو الأم إلى مزارع الخلايا. في حين أن هذا هو بروتوكول قياسي من الشركة المصنعة، غالبا ما تهمل هذا التحليل وأهميته الاستهانة 14.
المشيمة هي جهاز الدم الجنيني للأم كبير جسديا، والتي من MSC الجنين أو الأم يمكن عزل 22. هنا، قدمنا لمحة مفصلة عن التشريح المشيمة وتعليمات عن كيفية تشريح تحديدا الساقط (الأمهات)، الزغابات المشيمية (الجنين)، ولوحة المشيمية (الجنين) الأنسجة (الخطوة 2،2-2،4). وفي وقت لاحق، ونحن الخطوط العريضة لبروتوكول قوية تمكن MSC بمعزل عن كل هذه الأنسجة الثلاثة (الخطوة 2،5-2،6). التوسع المشيمة لجنة السلامة البحرية بكفاءة والثقافات تظهر مشابهة لالعظام المستمدة من نخاع الثقافات MSC (الشكلان 3 و 4). التمايز عظمي المنشأ هو موثوق بها (الشكل 5B)، في حين التمايز مكون الشحم عموما أقل كفاءة (الشكل 5C) 5.
وكثير من القادمين الجدد إلى الميدان يفترض أن الثقافات المستمدة من الزغابات المشيمية الجنين أو الأنسجة لوحة المشيمي سيتم المخصب لالجنين لجنة السلامة البحرية. ومع ذلك، في أيدينا الحديدتل تخصيب الخلية عابرة فقط عندما القياسي المتوسطة التوسع MSC مثل DMEM-LG + 10٪ يستخدم FBS 5. هنا نقدم نتائج ممثل باستخدام أنسجة المشيمة المستمدة من طفل ذكر. باستخدام أنسجة المشيمة من الطفل الذكر، والخلايا الجنينية هي بسهولة بحيث يمكن التعرف على أنها الصبغيات XY، في حين أن الخلايا الأم هي التي تعرف وجود كروموسومات XX. ويبين الشكل 6 النتائج FISH XY للثقافة التمثيلية. في حين MSC الجنين (XY) يتم إثراء (تصل إلى 80٪) في الثقافات الأولية المستمدة من الزغابات المشيمية الجنين أو الأنسجة لوحة المشيمي، هذه الثقافات نفس تتجاوزها بسرعة (~ 100٪) من الأمهات (XX) MSC على الممرات الأولين . في المتوسط القياسي، تتألف من DMEM-LG + 10٪ FBS، القليلة MSC الأمهات المشتقة التي تلوث أنسجة الجنين تكومبيتي الخلايا الجنينية المستمدة في الثقافة.
خطوة حاسمة الواردة في هذا البروتوكول هو تقدير للتشريح المشيمة والجنين من حيثوالأنسجة الأمهات يمكن أن تحصد أكثر فعالية. كما هو موضح في قسم النتائج تمثيلا، تشريح أنسجة الجنين لا يمكن تخصيب عابرة للجنة السلامة البحرية المستمدة من الجنين. تحسينات في توسيع صياغة المتوسطة، من خلال خارجي عامل النمو المتوسطة مكملات معينة ينبغي أن يسمح التوسع الانتقائي للسكان MSC الجنين المشتقة، وتصنيع منتج الخلية التي يتم تخصيبها للالجنين بدلا من الخلايا الأم (مجموعتنا حاليا على تطوير هذه الصيغ متوسطة). قد يكون صنع السكان MSC الجنين عددا من المزايا، كما يزعم MSC الجنين لديها أكبر الأوعية الدموية وخصائص مثبطة للمناعة من السكان أي ما يعادل MSC الأمهات 37.
في كل من البروتوكولات العزلة وصفها، وتستخدم ما يقرب من 10 غرام من الأنسجة. والمشيمة كلها عادة 500-750 غرام، وفي أعمال سابقة أثبتنا أنه من خلال النسيج الآلي هضم وتوسيع الخلية مفاعل حيوي بروكesses أنه ينبغي أن يكون من الممكن لتصنيع أكثر من 7،000 جرعات خلية السريرية من المشيمة واحدة (4). هذه الأرقام تبرز مدى ملاءمة المحتملة للجنة السلامة البحرية المستمدة من المشيمة في العلاجات MSC خيفي، وأهمية هذه الطريقة بغض النظر عن MSC المنشأ (الجنين أو الأم). من منظور علاجي، هو الأكثر أهمية أن المستخدمين لديهم فهم كامل من المنتج الخلية والقدرة على تصنيع هذا المنتج موثوق الخلية. نأمل أن لدينا شريط فيديو ستساعد الباحثين على فهم التشريح المشيمة، عزل MSC من المشيمة، وتوقع المرجح الجنين أو الأم تكوين خلية من ثقافاتهم.
The authors have nothing to disclose.
وأيد RP من قبل المجلس الوطني للصحة والأبحاث الطبية (NHMRC) ما بعد الدكتوراه تدريب الزمالة. وأيد VS من جامعة كوينزلاند الدولي طالب دراسات عليا منح دراسية. وأيد MRD من قبل NHMRC والداخلية العجلة أستراليا.
نشكر الكادر الطبي والتمريض للمساعدة في موافقة المريض وجمع العينات. نشكر الأستاذ Nickolas فيسك، البروفيسور كيري أتكينسون والدكتور روهان وري لإجراء مناقشات متعمقة في التوليد وتنمية فيتو المشيمة والتشريح المشيمة.
Reagents | |||
HBSS | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Long name: Hanks Balanced Salt Solution |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
trypsin-substitute | Gibco/Invitrogen | 12563-029 | Long name: TrypLE Select |
DMEM-LG | Gibco/Invitrogen | 11885-092 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-Low Glucose |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
PBS (Mg+Ca+ free) | Gibco/Invitrogen | 14190-250 | Long name: Dulbecco's Phosphate buffered saline, magnesium and calcium free |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
paraformaldehyde powder or 4% solution | any | ||
Collagenase I | Invitrogen | 17100-017 | 2500U/ml |
Dnase I | Sigma | D5025 | 10 mg/mL in 0.15 M NaCl |
Dispase | Invitrogen | 17105-041 | 10 mg/ml in water (20,000 U/ml). |
Material | Company | Catalog Number | Comments |
Disposables: | |||
50 ml centrifuge tubes | Falcon or any brand | ||
petri dishes, sterile plactic (25 cm and 10 cm diameter) | Nunc | ||
Cell strainers (100 micron) | Becton Dickinson | 352340 | |
175 and 75 cm2 (T175 and T75) tissue culture flasks | Nunc | ||
5 ml, 10 ml, 25 ml sterile serolgical pipettes | any brand | ||
Material | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment: | |||
Centrifuge | |||
tissue culture incubator 37 degrees celcius, 5 % CO2 | |||
Biological safety cabinet | |||
Sterile scissors and tweezers | |||
Tube racks | |||
Pipette-boy or equivalent | |||
Gilson type pipetters and sterile tips 1000 µl, 200 µl, 20 µl. | |||
rocking or shaking incubator (37 degrees celcius) | |||
personal protective equipment | |||
cleaning solutions (suitable for blood) | |||
waste containers, correct disposal bins for tissue/blood | |||
Reagents for MSC characterization | |||
Antibody (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | Isotype |
CD73 (AD2) | Miltenyi Biotec | 130-095-183 | Mouse IgG1 |
CD105 (43A4E1) | Miltenyi Biotec | 130-094-941 | Mouse IgG1 |
CD90/Thy-1 (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-403 | Mouse IgG1 |
CD45 (5B1) | Miltenyi Biotec | 130-080-202 | Mouse IgG2a |
CD34 (AC136) | Miltenyi Biotec | 130-090-954 | Mouse IgG2a |
HLA-DR (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-298 | Mouse IgG2a |
CD31 (PECAM-1) | BD Pharmingen | 555446 | Mouse IgG1 |
CD146 (541-10B2) | Miltenyi Biotec | 130-092-849 | Mouse IgG1 |
CD44 (DB105) | Miltenyi Biotec | 130-095-180 | Mouse IgG1 |
Isotype Controls (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-214 | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-212 | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-091-837 | |
Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-098-849 | |
MACS Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Osteogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
β-Glycerol Phophate | Sigma | 50020 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | For calcium matrix staining |
Adipogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
insulin | Sigma | I2643 | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
Indomethacin | Sigma | I7378 | |
3-isobutyl-1-methyl xanthine | Sigma | I5879 | |
Oil Red O solution | Sigma | O1391-250ML | For lipid vacuole staining |
XY FISH kit to determine fetal or maternal origin of cells | |||
XY chomosome FISH kit | Vysis (Abbott Molecular) | 07J20-050 | Long name: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Direct Labeled Fluorescent DNA Probe Kit |