Heri beskriver vi metoder til dissektion af føtale og maternelle væv fra menneskelige sigt placenta, efterfulgt af isolation og udvidelse af mesenkymale stamceller / stromale celler (MSC) fra disse væv.
Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.
Mesenkymale stamceller / stromale celler (MSC) dukker op som en lovende kandidat til brug i cellebaserede behandlingsformer 1. De fleste programmer ser ud til at målrette MSC-medieret væv reparation eller immun regel 2. I mange af disse programmer, kan allogen MSC være så effektiv som autolog MSC 3. Brugen af allogen MSC har økonomisk fordel af at være kompatible med storstilet fremstilling af flere celledoser fra en enkelt kilde væv 4 til at behandle mange patienter.
Historisk set har prækliniske og kliniske studier udnyttes MSC-afledt fra knoglemarven 4. Knoglemarv er generelt indsamlet fra hoftebensrand en frivillig donor. Denne proces er invasiv, og kun et lille volumen af marv (~ 20 ml) opsamles gennem en enkelt punktering. Generering klinisk meningsfulde antal MSC kræver omfattende in vitro ekspansion. Celle potens aftager med passage nummer <sup> 3, hvilket skaber et paradoks, hvor det teoretiske antal celler, der kræves for klinisk effektivitet øges jo mere cellepopulationen er udvidet. I modsætning til knoglemarvsaspirater, term placenta er en fysisk stor start væv (typisk 500-750 g 4), der kan høstes aseptisk under kejsersnit uden risiko for donoren. MSC stammer fra placenta har langsigtede spredning 5 og immunmodulerende kapacitet 6, overlegen i forhold til knoglemarv-afledte MSC. I en tidligere undersøgelse påviste vi, at en enkelt term placenta indeholdt tilstrækkeligt MSC til fremstilling af op til 7.000 kliniske doser 4. Disse egenskaber gør placenta en ideel kilde væv til fremstilling af allogen MSC.
Moderkagen er et fetomaternal organ bestående af både føtal og maternel væv 7, og dermed MSC af føtal eller maternel oprindelse kan være teoretisk, isoleret. De følgende referencer giver detailed oplysninger om udviklingen og patologien, samt mikroskopisk og makroskopisk undersøgelse af den humane placenta og adnexa 8,9. Moderkagen egentlig består hovedsageligt af føtale blodkar og sekretorisk og understøttende celler kaldet trofoblaster, der udgør chorionvilli omfattet af chorion frondosum (plade) 8. De forgrenede placentale villi er badet i moderens blod leveret fra uterin spiral arterier, så næringsstof, hormon og udveksling gas mellem foster og moder. Moderkagen er forankret til endometrium via maternelle decidua stromale celler og føtale extravillious trophoblaster veksler i ekstracellulær matrix 8. De villi konvergere på fostrets chorion plade hvor de danner navlestrengen 8.
Et resultat af den første internationale workshop om Placentale-afledte stamceller (2008) var en vurdering af behovet for at standardisere isolation og characterization af celler fra human placenta 10. På grund af anatomien af moderkagen, dissektion af de forskellige væv, kan isolering af MSC og forventede kultur resultater være overvældende for nyankomne til området. I denne protokol, høsten af placenta chorion væv, efterfulgt af MSC isolation og ekspansion er grundigt detaljeret. MSC karakterisering via flowcytometri og in vitro differentiering anses rutine 5,11-13, og således kun kortvarigt detaljeret her.
Som fremhævet i en nylig systematisk litteraturgennemgang 14, MSC fremstillet af de placenta chorion villi generelt antages at være føtal. Selvom kun 18% af studierne undersøgte oprindelsen af MSC opnåede, og af dem, kun halvdelen af studierne rapporterede føtal MSC og den anden halvdel rapporterede maternelle eller blandede MSC populationer. Hver af de tre vævskomponenter beskrevet heri (chorionvilli, chorion plade og decidua basalis) er composed primært af den føtale membran / villi, og en lille del af uterine-afledte celler fra moderen, som forbliver knyttet til det leverede placenta. Vi giver data, som viser, at isolering af MSC fra moderens side af placenta, snarere end den føtale side af placenta, som vi tidligere har rapporteret 5,11, er en mere passende udgangsmateriale, hvis der ønskes maternal MSC. Denne protokol beskrives også anvendelsen af XY FISH at validere føtal eller maternel bidrag til cellekulturer. Mens dette er en standard-protokol fra producenten, er denne analyse ofte overset og dens betydning undervurderet 14.
Moderkagen er et fysisk stor fetomaternal orgel, hvorfra føtal eller maternel MSC kan isoleres 22. Heri, vi givet en detaljeret oversigt over placenta anatomi og instruktion om, hvordan man specifikt dissekere decidua (maternal), chorion villi (føtal), og chorion plade (føtalt) væv (Trin 2,2-2,4). Efterfølgende har vi skitseret en robust protokol, der muliggør MSC isolation fra hver af disse tre væv (Trin 2,5-2,6). Placental MSC ekspansion er effektiv og kulturer ligne knoglemarv-afledte MSC kulturer (figur 3 og 4). Osteogen differentiering er pålidelige (figur 5B), mens adipogenisk differentiering er generelt mindre effektiv (figur 5C) 5.
Mange tilflyttere til området vil antage, at kulturer afledt af føtal chorion villi eller chorion plade væv vil blive beriget for føtal MSC. Men i vores hænder fetal celle berigelse er kun forbigående, når standard MSC ekspansion medium såsom DMEM-LG + 10% FBS udnyttes 5. Her giver vi repræsentative resultater ved hjælp placentale væv hidrørende fra en mandlig baby. Ved at bruge placenta væv fra en mandlig baby, fostercellerne er let identificerbar som havende XY kromosomer, mens celler fra moderen kan identificeres som havende XX kromosomer. Figur 6 viser XY FISH resultater for en repræsentativ kultur. Mens føtal MSC (XY) er beriget (op til 80%) i de oprindelige kulturer afledt af føtalt chorionvilli eller chorion plade væv, er disse samme kulturer hurtigt overhalet (~ 100%) ved maternel (XX) MSC over de to første passager . I standardmedium, sammensat af DMEM-LG + 10% FBS, de få maternel-afledte MSC, der forurener føtale væv udkonkurrerer de føtale-afledte celler i kultur.
Et afgørende skridt er skitseret i denne protokol er en opskrivning af placenta anatomi og hvorfra føtalog moderens væv kan mest effektivt høstes. Som skitseret i afsnittet repræsentative resultater, er dissektion af fostervæv muliggøre forbigående berigelse for føtal-afledte MSC. Forbedringer i ekspansion medium formulering, gennem specifik eksogen vækstfaktor medium tilskud bør tillade selektiv udvidelse af føtale-afledte MSC befolkninger, og fremstille en celle produkt, der er beriget for føtal snarere end moderen celler (vores gruppe er ved at udvikle sådanne medium formuleringer). Fremstillingen af føtale MSC populationer kan have en række fordele, som føtal MSC er påstået at have større angiogenese og immunosuppressive egenskaber end tilsvarende maternelle MSC populationer 37.
I hver af de beskrevne isolation protokoller, vi brugte ca. 10 g væv. En hel placenta er typisk 500-750 g, og i tidligere arbejde, vi viste, at gennem automatiseret væv fordøje og en celle ekspansion bioreaktor proccesser, at det bør være muligt at fremstille over 7.000 kliniske celledoser fra en enkelt placenta 4. Disse tal understreger mulighederne egnethed placenta-afledt MSC i allogene MSC behandlingsformer, og betydningen af denne metode, uanset MSC oprindelse (føtal eller maternel). Fra et terapeutisk perspektiv er det mest afgørende, at brugerne har en fuld forståelse af cellen produktet og evnen til pålideligt at fremstille denne celle produkt. Vi håber, at vores video vil hjælpe forskere til at forstå placenta anatomi, isolere MSC fra placenta, og foregribe den sandsynlige føtal eller maternel celle sammensætning af deres kulturer.
The authors have nothing to disclose.
RP blev understøttet af en National Health og Medical Research Council (NHMRC) Postdoc Training Fellowship. VS blev understøttet af en University of Queensland International Postgraduate Student stipendium. MRD blev støttet af NHMRC og Inner Wheel Australien.
Vi takker klinisk og plejepersonale for at bistå i patient samtykke og prøvetagning. Vi takker Prof. Nickolas Fisk, Prof. Kerry Atkinson og Dr. Rohan Lourie for indsigtsfulde diskussioner i obstetrik, feto-placenta udvikling og placenta anatomi.
Reagents | |||
HBSS | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Long name: Hanks Balanced Salt Solution |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
trypsin-substitute | Gibco/Invitrogen | 12563-029 | Long name: TrypLE Select |
DMEM-LG | Gibco/Invitrogen | 11885-092 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-Low Glucose |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
PBS (Mg+Ca+ free) | Gibco/Invitrogen | 14190-250 | Long name: Dulbecco's Phosphate buffered saline, magnesium and calcium free |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
paraformaldehyde powder or 4% solution | any | ||
Collagenase I | Invitrogen | 17100-017 | 2500U/ml |
Dnase I | Sigma | D5025 | 10 mg/mL in 0.15 M NaCl |
Dispase | Invitrogen | 17105-041 | 10 mg/ml in water (20,000 U/ml). |
Material | Company | Catalog Number | Comments |
Disposables: | |||
50 ml centrifuge tubes | Falcon or any brand | ||
petri dishes, sterile plactic (25 cm and 10 cm diameter) | Nunc | ||
Cell strainers (100 micron) | Becton Dickinson | 352340 | |
175 and 75 cm2 (T175 and T75) tissue culture flasks | Nunc | ||
5 ml, 10 ml, 25 ml sterile serolgical pipettes | any brand | ||
Material | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment: | |||
Centrifuge | |||
tissue culture incubator 37 degrees celcius, 5 % CO2 | |||
Biological safety cabinet | |||
Sterile scissors and tweezers | |||
Tube racks | |||
Pipette-boy or equivalent | |||
Gilson type pipetters and sterile tips 1000 µl, 200 µl, 20 µl. | |||
rocking or shaking incubator (37 degrees celcius) | |||
personal protective equipment | |||
cleaning solutions (suitable for blood) | |||
waste containers, correct disposal bins for tissue/blood | |||
Reagents for MSC characterization | |||
Antibody (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | Isotype |
CD73 (AD2) | Miltenyi Biotec | 130-095-183 | Mouse IgG1 |
CD105 (43A4E1) | Miltenyi Biotec | 130-094-941 | Mouse IgG1 |
CD90/Thy-1 (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-403 | Mouse IgG1 |
CD45 (5B1) | Miltenyi Biotec | 130-080-202 | Mouse IgG2a |
CD34 (AC136) | Miltenyi Biotec | 130-090-954 | Mouse IgG2a |
HLA-DR (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-298 | Mouse IgG2a |
CD31 (PECAM-1) | BD Pharmingen | 555446 | Mouse IgG1 |
CD146 (541-10B2) | Miltenyi Biotec | 130-092-849 | Mouse IgG1 |
CD44 (DB105) | Miltenyi Biotec | 130-095-180 | Mouse IgG1 |
Isotype Controls (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-214 | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-212 | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-091-837 | |
Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-098-849 | |
MACS Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Osteogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
β-Glycerol Phophate | Sigma | 50020 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | For calcium matrix staining |
Adipogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
insulin | Sigma | I2643 | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
Indomethacin | Sigma | I7378 | |
3-isobutyl-1-methyl xanthine | Sigma | I5879 | |
Oil Red O solution | Sigma | O1391-250ML | For lipid vacuole staining |
XY FISH kit to determine fetal or maternal origin of cells | |||
XY chomosome FISH kit | Vysis (Abbott Molecular) | 07J20-050 | Long name: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Direct Labeled Fluorescent DNA Probe Kit |