Nous décrivons ici des procédés pour la dissection de tissus foetaux et maternels à partir de placenta humain à terme, suivie par l'isolement et l'expansion des cellules souches / cellules stromales (MSC) à partir de ces tissus.
Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.
Cellules stromales souches / mésenchymateuses (MSC) sont en train de devenir un candidat prometteur pour une utilisation dans les thérapies à base de cellules 1. La plupart des applications semblent viser la réparation des tissus MSC médiée ou la régulation immunitaire 2. Dans beaucoup de ces applications, allogénique MSC peut être aussi efficace que MSC autologues 3. L'utilisation de MSC allogéniques a l'avantage économique d'être compatible avec la fabrication à grande échelle de doses multiples de cellules à partir d' un seul tissu source 4 pour traiter de nombreux patients.
Historiquement, les études pré-cliniques et cliniques ont utilisé MSC dérivées de la moelle osseuse 4. La moelle osseuse est généralement collectées à partir de la crête iliaque d'un donneur volontaire. Ce processus est invasif, et seulement un petit volume de moelle (~ 20 ml) sont recueillies au moyen d'une seule piqûre. Générer des nombres cliniquement significatives de MSC nécessite une dans l' expansion in vitro. Cellule puissance diminue avec le nombre de passage <sup> 3, ce qui crée un paradoxe , où le nombre théorique des cellules nécessaires pour une efficacité clinique augmente plus la population de cellules est agrandi. Contrairement à aspirats de moelle osseuse, placenta à terme est un physiquement grand tissu de départ (typiquement 500-750 g 4), qui peut être récolté aseptique pendant la césarienne sans risque pour le donneur. MSC dérivé de placenta ont prolifération 5 et immunomodulateur capacité à long terme 6, supérieure à MSC dérivées de moelle osseuse. Dans une étude précédente, nous avons montré qu'un seul placenta à terme contenait MSC suffisante pour la fabrication de jusqu'à 7000 4 doses cliniques. Ces caractéristiques en font un tissu de placenta source idéale pour la fabrication de MSC allogéniques.
Le placenta est un organe foeto – maternelle comprenant à la fois le tissu fœtal et maternel 7, et donc MSC d'origine foetale ou maternelle peut être, théoriquement, isolé. Les références suivantes fournissent deinformations à queue sur le développement et la pathologie, ainsi que l' examen microscopique et macroscopique du placenta humain et de ses annexes 8,9. Le placenta approprié est constitué en grande partie des vaisseaux sanguins du foetus et sécrétoires et les cellules de soutien appelées trophoblastes, qui constituent les villosités choriales couvertes par les frondosum chorionique (plaque) 8. Les villosités placentaires ramifiés sont baignées dans le sang maternel délivré des artères utérines en spirale, ce qui permet des éléments nutritifs, l'hormone et l'échange de gaz entre le fœtus et la mère. Le placenta est ancré sur l'endomètre par les cellules stromales déciduales maternelles et des trophoblastes foetaux sont entrecoupées extravillious dans une matrice extracellulaire 8. Les villosités convergent sur la plaque chorionique foetal où ils forment le cordon ombilical 8.
Un résultat du premier atelier international sur les cellules souches placentaires dérivées (2008) est une appréciation de la nécessité de normaliser l'isolement et characterization de cellules de placenta humain à terme 10. En raison de l'anatomie du placenta, la dissection des tissus différents, l'isolement du MSC et les résultats de culture prévus peut être écrasante pour les nouveaux arrivants sur le terrain. Dans ce protocole, la récolte des tissus placentaires choriales, suivie par MSC isolement et l'expansion est bien détaillée. MSC caractérisation par cytométrie en flux et dans la différenciation in vitro sont considérés comme routine 5,11-13, et donc que brièvement détaillé ici.
Comme l'a souligné dans une revue systématique de la littérature récente 14, MSC obtenu à partir des villosités choriales placentaires sont généralement supposés être fœtal. Bien que, seulement 18% des études ont examiné l'origine du MSC obtenu, et de ceux, seulement la moitié des études a rapporté MSC foetal et l'autre moitié ont déclaré les populations de MSC maternels ou mixtes. Chacun des trois composants de tissus décrits ici (villosités choriales, plaque et decidua basalis choriales) sont compOSED principalement du fœtus membrane / villosités, et une petite proportion de cellules maternelles utérines dérivées, qui restent attachées au placenta livré. Nous fournissons des données démontrant que l' isolement MSC du côté maternel du placenta, plutôt que du côté foetal du placenta, comme nous l' avons signalé précédemment 5,11, est un matériau de départ plus approprié si MSC maternelle sont souhaités. Ce protocole décrit également l'utilisation de XY FISH pour valider la contribution foetale ou maternelle à des cultures cellulaires. Bien que ce soit un protocole standard du fabricant, cette analyse est souvent négligée et son importance sous – estimée 14.
Le placenta est un organe physiquement grand foeto – maternelle, à partir de laquelle MSC foetale ou maternelle peut être isolé 22. Ici, nous avons fourni un aperçu détaillé de l'anatomie du placenta et des instructions sur la façon de disséquer spécifiquement decidua (maternelle), villosités choriales (de fœtus), et la plaque chorionique (foetal) tissu (étape 2,2-2,4). Par la suite, nous avons décrit un protocole robuste qui permet MSC l'isolement de chacun de ces trois tissus (étape 2,5-2,6). L' expansion placentaire MSC est efficace et les cultures semblent similaires à la moelle osseuse dérivés MSC cultures (figures 3 et 4). Une différenciation ostéogénique est fiable (figure 5B), tandis que la différenciation adipocytaire est généralement moins efficace (figure 5C) 5.
Beaucoup de nouveaux arrivants sur le terrain vont présumer que les cultures dérivées de villosités choriales foetal ou des tissus de la plaque choriales seront enrichies en MSC foetal. Cependant, dans nos mains fel' enrichissement cellulaire tal est seulement transitoire lorsque le milieu d'expansion de MSC standard tel que DMEM-LG + 10% de FBS est utilisée 5. Ici, nous fournissons des résultats représentatifs à l'aide de tissus placentaires provenant d'un bébé de sexe masculin. En utilisant le tissu placentaire d'un bébé de sexe masculin, les cellules foetales sont facilement identifiable comme ayant des chromosomes XY, tandis que les cellules maternelles sont identifiables comme ayant des chromosomes XX. La figure 6 montre les résultats de FISH XY pour une culture représentative. Alors que le MSC fœtal (XY) sont enrichis (jusqu'à 80%) dans les cultures initiales dérivées de villosités choriales du foetus ou de tissus de la plaque choriales, les mêmes cultures sont rapidement rattrapés (~ 100%) par la mère (XX) du MSC au cours des deux premiers passages . Dans un milieu standard, composé de DMEM-LG + 10% de FBS, le MSC maternel dérivé rares qui contaminent les tissus foetaux outcompete les cellules foetales dérivées de la culture.
Une étape critique décrite dans ce protocole est une appréciation de l'anatomie du placenta et d'où foetalet le tissu maternel peut être le plus efficacement récolté. Comme il est indiqué dans la section des résultats représentatifs, la dissection du tissu fœtal ne permet l'enrichissement transitoire pour MSC fœtaux dérivés. L'amélioration de la croissance à moyen formulation, par le biais exogène facteur de croissance moyen de suppléments spécifiques devraient permettre une expansion sélective des populations de MSC fœtaux dérivés, et la production d'un produit cellulaire qui est enrichi pour foetal plutôt que des cellules maternelles (notre groupe est en train de développer de telles formulations moyennes). La fabrication des populations de MSC foetales peut avoir un certain nombre d'avantages, comme MSC foetal sont censés avoir une plus grande angiogenèse et des propriétés immunosuppressives que les populations de MSC maternels équivalents 37.
Dans chacun des protocoles d'isolement décrits, on a utilisé environ 10 grammes de tissu. Tout un placenta est typiquement 500-750 g, et dans le travail précédent, nous avons démontré que, grâce à un tissu automatisé condensé et un bioréacteur proc d'expansion cellulaireesses qu'il devrait être possible de fabriquer plus de 7000 doses de cellules cliniques d'un seul placenta 4. Ces chiffres mettent en évidence la pertinence potentielle de MSC placentaire dérivés dans les thérapies de MSC allogéniques, et l'importance de cette méthode sans distinction d'origine MSC (foetale ou maternelle). Du point de vue thérapeutique, il est plus important que les utilisateurs ont une compréhension complète du produit cellulaire et la capacité de fabriquer de manière fiable ce produit cellulaire. Nous espérons que notre vidéo aidera les chercheurs à comprendre l'anatomie du placenta, isoler MSC à partir du placenta, et anticiper la composition cellulaire foetale ou maternelle probable de leurs cultures.
The authors have nothing to disclose.
RP a été soutenu par un Conseil national de la santé et de la recherche médicale (NHMRC) formation postdoctorale Fellowship. VS a été soutenue par l'Université du Queensland international Postgraduate Student bourse. MRD a été soutenu par le NHMRC et Inner Wheel Australie.
Nous remercions le personnel clinique et les soins infirmiers pour aider à le consentement du patient et de la collecte de l'échantillon. Nous remercions Prof. Nickolas Fisk, le professeur Kerry Atkinson et Dr Rohan Lourie pour des discussions pertinentes en obstétrique, le développement foeto-placentaire et de l'anatomie du placenta.
Reagents | |||
HBSS | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Long name: Hanks Balanced Salt Solution |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
trypsin-substitute | Gibco/Invitrogen | 12563-029 | Long name: TrypLE Select |
DMEM-LG | Gibco/Invitrogen | 11885-092 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-Low Glucose |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
PBS (Mg+Ca+ free) | Gibco/Invitrogen | 14190-250 | Long name: Dulbecco's Phosphate buffered saline, magnesium and calcium free |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
paraformaldehyde powder or 4% solution | any | ||
Collagenase I | Invitrogen | 17100-017 | 2500U/ml |
Dnase I | Sigma | D5025 | 10 mg/mL in 0.15 M NaCl |
Dispase | Invitrogen | 17105-041 | 10 mg/ml in water (20,000 U/ml). |
Material | Company | Catalog Number | Comments |
Disposables: | |||
50 ml centrifuge tubes | Falcon or any brand | ||
petri dishes, sterile plactic (25 cm and 10 cm diameter) | Nunc | ||
Cell strainers (100 micron) | Becton Dickinson | 352340 | |
175 and 75 cm2 (T175 and T75) tissue culture flasks | Nunc | ||
5 ml, 10 ml, 25 ml sterile serolgical pipettes | any brand | ||
Material | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment: | |||
Centrifuge | |||
tissue culture incubator 37 degrees celcius, 5 % CO2 | |||
Biological safety cabinet | |||
Sterile scissors and tweezers | |||
Tube racks | |||
Pipette-boy or equivalent | |||
Gilson type pipetters and sterile tips 1000 µl, 200 µl, 20 µl. | |||
rocking or shaking incubator (37 degrees celcius) | |||
personal protective equipment | |||
cleaning solutions (suitable for blood) | |||
waste containers, correct disposal bins for tissue/blood | |||
Reagents for MSC characterization | |||
Antibody (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | Isotype |
CD73 (AD2) | Miltenyi Biotec | 130-095-183 | Mouse IgG1 |
CD105 (43A4E1) | Miltenyi Biotec | 130-094-941 | Mouse IgG1 |
CD90/Thy-1 (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-403 | Mouse IgG1 |
CD45 (5B1) | Miltenyi Biotec | 130-080-202 | Mouse IgG2a |
CD34 (AC136) | Miltenyi Biotec | 130-090-954 | Mouse IgG2a |
HLA-DR (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-298 | Mouse IgG2a |
CD31 (PECAM-1) | BD Pharmingen | 555446 | Mouse IgG1 |
CD146 (541-10B2) | Miltenyi Biotec | 130-092-849 | Mouse IgG1 |
CD44 (DB105) | Miltenyi Biotec | 130-095-180 | Mouse IgG1 |
Isotype Controls (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-214 | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-212 | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-091-837 | |
Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-098-849 | |
MACS Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Osteogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
β-Glycerol Phophate | Sigma | 50020 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | For calcium matrix staining |
Adipogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
insulin | Sigma | I2643 | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
Indomethacin | Sigma | I7378 | |
3-isobutyl-1-methyl xanthine | Sigma | I5879 | |
Oil Red O solution | Sigma | O1391-250ML | For lipid vacuole staining |
XY FISH kit to determine fetal or maternal origin of cells | |||
XY chomosome FISH kit | Vysis (Abbott Molecular) | 07J20-050 | Long name: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Direct Labeled Fluorescent DNA Probe Kit |