Heri beskriver vi metoder for disseksjon av foster eller mor vev fra menneskelig begrep placenta, etterfulgt av isolasjon og utvidelse av mesenchymale stamceller / stromale celler (MSC) fra disse vev.
Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.
Mesenchymale stamceller / stromale celler (MSC) er fremstår som en lovende kandidat for bruk i celle-baserte terapier 1. De fleste programmer ser ut til å målrette MSC-mediert vev reparasjon eller immunregulering to. I mange av disse programmene, kan allogen MSC være like effektivt som autolog MSC 3. Bruken av allogene MSC har den økonomiske fordel av å være kompatible med stor-skala produksjon av flere celle doser fra en enkelt kilde vev 4 til behandling av mange pasienter.
Historisk sett har prekliniske og kliniske studier benyttet MSC-avledet fra benmargen 4. Benmarg er vanligvis hentet fra hoftekammen hos en frivillig donor. Denne prosessen er invasiv, og bare et lite volum av marg (~ 20 ml) blir samlet opp gjennom en enkelt punktering. Generering av klinisk betydning antall MSC krever omfattende in vitro ekspansjon. Cell potens avtar med passering nummer <sup> 3, noe som skaper en paradoks der det teoretiske antall celler som er nødvendig for klinisk effektivitet økes, mer cellepopulasjonen er utvidet. I motsetning til benmarg aspirater, er betegnelsen placenta en fysisk stor start vev (typisk 500-750 g 4), som kan bli høstet aseptisk ved keisersnitt med noen risiko for donor. MSC avledet fra placenta har langsiktige spredning 5 og immunmodulerende kapasitet 6, overlegen benmargen-avledet MSC. I en tidligere studie demonstrerte vi at en enkelt term placenta inneholdt tilstrekkelig MSC for fremstilling av opptil 7000 kliniske doser 4. Disse egenskapene gjør placenta en ideell kilde vev for fremstilling av allogene MSC.
Morkaken er et fetomaternal organ bestående av både fosterets og morens vev 7, og dermed MSC for foster eller mors opprinnelse kan være teoretisk isolert. Følgende referanser gir detailed informasjon om utviklingen og patologi, samt makroskopisk og mikroskopisk undersøkelse av human placenta og adnexa 8,9. Morkaken skikkelig består i stor grad av fosterets blodårer og sekretorisk og støtte celler som kalles trophoblasts, som utgjør chorion villi omfattes av chorion frondosum (plate) 8. De forgrenede placenta villi er badet i mors blod levert fra livmorspiralarteriene, slik at næringsmidler, hormoner og gassutveksling mellom foster og mor. Morkaken er forankret til endometrium via mors Deciduale stromale celler og foster extravillious trophoblasts er ispedd i ekstracellulære matrise 8. De villi konvergerer mot foster chorionic plate hvor de danner navlestreng 8.
Et resultat av den første internasjonale Workshop på Placen-stamceller (2008) var en styrking av behovet for å standardisere isolasjon og characterization av celler fra human term placenta 10. På grunn av anatomien av morkaken, disseksjon av de ulike vev, isolering av MSC og forventede kultur utfall kan være overveldende for nykommere til feltet. I denne protokollen, høsting av placenta chorionic vev, etterfulgt av MSC isolasjon og utvidelse er grundig detaljert. MSC karakterisering via flowcytometri og in vitro differensiering anses som rutine 5,11-13, og derfor bare kort beskrevet her.
Som fremhevet i en fersk systematisk litteraturgjennomgang 14, MSC hentet fra placenta chorion villi er generelt antatt å være foster. Selv om bare 18% av studiene undersøkte opprinnelsen til MSC innhentet, og av dem, bare halvparten av studiene rapporterte foster MSC og den andre halvparten rapporterte mors eller blandede MSC bestander. Hver av de tre vevskomponenter beskrevet heri (chorion villi, chorionic plate og decidua basalis) er komposed hovedsakelig av fosterets membran / villi, og en liten andel av livmor-avledet mors celler, som forblir festet til den leverte morkaken. Vi gir data som viser at isolere MSC fra mors side av placenta, snarere enn foster side av placenta, som vi tidligere har rapportert 5,11, er en mer hensiktsmessig utgangsmateriale hvis moder MSC er ønsket. Denne protokollen beskriver også bruken av XY FISH å validere føtal eller mors bidrag til cellekulturer. Selv om dette er en standard protokoll fra produsenten, er denne analysen ofte neglisjert og dens betydning undervurdert 14.
Morkaken er en fysisk stor fetomaternal organ, som fetal eller mors MSC kan isoleres 22. Heri vi gitt en detaljert oversikt over morkake anatomi og instruksjon om hvordan du spesifikt dissekere decidua (maternal), chorion villi (foster), og chorionic plate (fetal) vev (trinn 2,2-2,4). Deretter skissert vi en robust protokoll som muliggjør MSC isolert fra hver av disse tre vevene (trinn 2.5 til 2.6). Placenta MSC utvidelse er effektiv og kulturer ligne på benmargavledede MSC kulturer (figur 3 og 4). Osteogene differensiering er pålitelig (figur 5B), mens adipogenic differensiering er generelt mindre effektiv (figur 5C) 5.
Mange nykommere til feltet vil anta at kulturer som stammer fra foster chorion villi eller chorionic plate vev vil bli beriket for foster MSC. Men i våre hender fetal celle berikelse er bare forbigående når standard MSC utvidelse medium som DMEM-LG + 10% FBS benyttes fem. Her gir vi representative resultater ved hjelp morkakevev stammer fra en mannlig baby. Ved hjelp av placenta vev fra en mannlig baby, føtale celler er lett identifiseres som å ha XY kromosomer, mens maternale celler kan identifiseres som å ha XX kromosomer. Figur 6 viser XY FISH resultater for et representativt kultur. Mens fetal MSC (XY) er anriket (opptil 80%) i de første kulturer avledet fra føtalt chorion villi eller chorionic plate vev, er de samme kulturene hurtig forbikjørt (~ 100%) av mors (XX) MSC i løpet av de to første passasjene . I standard medium, som består av DMEM-LG + 10% FBS, de få mors-avledet MSC som forurense fostervev utkonkurrere fosterets-deriverte celler i kultur.
Et kritisk punkt er skissert i denne protokollen er en styrking av morkake anatomi og fra hvor fosterog mors vev kan mest effektivt høstes. Som beskrevet i den representative resultater delen, betyr disseksjon av fostervevet gjør at forbigående berikelse for foster-avledet MSC. Forbedringer i ekspansjon medium formulering, gjennom konkrete eksogene vekstfaktor medium tilskudd bør tillate selektiv utvidelse av foster-avledet MSC populasjoner, og produserer en celle produkt som er beriket for foster snarere enn mors celler (vår gruppe er i ferd med å utvikle slike mellom formuleringer). Fremstillingen av føtale MSC populasjoner kan ha en rekke fordeler, som føtalt MSC er påstått å ha større angiogenese og immunsuppressive egenskaper enn tilsvarende maternale MSC populasjoner 37.
I hver av de beskrevne isoleringsmetoder, anvendte vi ca. 10 g vev. En hel placenta er typisk 500-750 g, og i tidligere arbeid vi vist at gjennom automatisert vev fordøye og en celle ekspansjon bioreaktor procsesser at det bør være mulig å produsere over 7000 kliniske celle doser fra en enkelt placenta 4. Disse tallene markere potensialet egnetheten av morkake-avledet MSC i allogene MSC terapi, og betydningen av denne metoden uavhengig av MSC opprinnelse (fetal eller mors). Fra et terapeutisk perspektiv, er det mest avgjørende at brukerne har full forståelse av cellen produktet og evnen til å pålitelig produsere denne cellen produktet. Vi håper at vår video vil hjelpe forskerne å forstå placenta anatomi, isolere MSC fra morkaken, og forutse sannsynlig fetal eller mors celle sammensetningen av sine kulturer.
The authors have nothing to disclose.
RP ble støttet av en National Health and Medical Research Council (NHMRC) Postdoktor Training Fellowship. VS ble støttet av en University of Queensland International Graduate Student stipend. MRD ble støttet av NHMRC og Indre Wheel Australia.
Vi takker klinisk og pleiepersonell for å bistå i pasient samtykke og prøvetaking. Vi takker professor Nickolas Fisk, Prof. Kerry Atkinson og Dr Rohan Lourie for innsiktsfulle diskusjoner i obstetrikk, feto placentaiskemi utvikling og morkaken anatomi.
Reagents | |||
HBSS | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Long name: Hanks Balanced Salt Solution |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
trypsin-substitute | Gibco/Invitrogen | 12563-029 | Long name: TrypLE Select |
DMEM-LG | Gibco/Invitrogen | 11885-092 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-Low Glucose |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
PBS (Mg+Ca+ free) | Gibco/Invitrogen | 14190-250 | Long name: Dulbecco's Phosphate buffered saline, magnesium and calcium free |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
paraformaldehyde powder or 4% solution | any | ||
Collagenase I | Invitrogen | 17100-017 | 2500U/ml |
Dnase I | Sigma | D5025 | 10 mg/mL in 0.15 M NaCl |
Dispase | Invitrogen | 17105-041 | 10 mg/ml in water (20,000 U/ml). |
Material | Company | Catalog Number | Comments |
Disposables: | |||
50 ml centrifuge tubes | Falcon or any brand | ||
petri dishes, sterile plactic (25 cm and 10 cm diameter) | Nunc | ||
Cell strainers (100 micron) | Becton Dickinson | 352340 | |
175 and 75 cm2 (T175 and T75) tissue culture flasks | Nunc | ||
5 ml, 10 ml, 25 ml sterile serolgical pipettes | any brand | ||
Material | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment: | |||
Centrifuge | |||
tissue culture incubator 37 degrees celcius, 5 % CO2 | |||
Biological safety cabinet | |||
Sterile scissors and tweezers | |||
Tube racks | |||
Pipette-boy or equivalent | |||
Gilson type pipetters and sterile tips 1000 µl, 200 µl, 20 µl. | |||
rocking or shaking incubator (37 degrees celcius) | |||
personal protective equipment | |||
cleaning solutions (suitable for blood) | |||
waste containers, correct disposal bins for tissue/blood | |||
Reagents for MSC characterization | |||
Antibody (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | Isotype |
CD73 (AD2) | Miltenyi Biotec | 130-095-183 | Mouse IgG1 |
CD105 (43A4E1) | Miltenyi Biotec | 130-094-941 | Mouse IgG1 |
CD90/Thy-1 (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-403 | Mouse IgG1 |
CD45 (5B1) | Miltenyi Biotec | 130-080-202 | Mouse IgG2a |
CD34 (AC136) | Miltenyi Biotec | 130-090-954 | Mouse IgG2a |
HLA-DR (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-298 | Mouse IgG2a |
CD31 (PECAM-1) | BD Pharmingen | 555446 | Mouse IgG1 |
CD146 (541-10B2) | Miltenyi Biotec | 130-092-849 | Mouse IgG1 |
CD44 (DB105) | Miltenyi Biotec | 130-095-180 | Mouse IgG1 |
Isotype Controls (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-214 | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-212 | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-091-837 | |
Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-098-849 | |
MACS Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Osteogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
β-Glycerol Phophate | Sigma | 50020 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | For calcium matrix staining |
Adipogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
insulin | Sigma | I2643 | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
Indomethacin | Sigma | I7378 | |
3-isobutyl-1-methyl xanthine | Sigma | I5879 | |
Oil Red O solution | Sigma | O1391-250ML | For lipid vacuole staining |
XY FISH kit to determine fetal or maternal origin of cells | |||
XY chomosome FISH kit | Vysis (Abbott Molecular) | 07J20-050 | Long name: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Direct Labeled Fluorescent DNA Probe Kit |