Descreve-se aqui métodos para a dissecação de tecidos fetais e maternas de placenta humana, seguido por isolamento e expansão de células estaminais mesenquimais / estroma (MSC) a partir desses tecidos.
Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.
-Tronco mesenquimais / células do estroma (MSC) estão emergindo como um candidato promissor para uso em terapias baseadas em células 1. A maioria das aplicações parecem ter como alvo a reparação de tecidos mediada por MSC ou regulação imune 2. Em muitas destas aplicações, alogênico MSC pode ser tão eficaz como MSC autólogo 3. O uso de MSC alogénico tem a vantagem económica de ser compatível com o fabrico em grande escala de múltiplas doses de células a partir de uma única fonte de tecido 4 para tratar muitos pacientes.
Historicamente, os estudos pré-clínicos e clínicos utilizaram-MSC derivadas da medula óssea 4. A medula óssea é geralmente recolhida a partir da crista ilíaca de um dador voluntário. Este processo é invasiva, e apenas um pequeno volume de medula (~ 20 ml) é recolhido através de um único punção. Gerar números clinicamente significativas de MSC exige ampla expansão in vitro. potência celular diminui com o número de passagens <sup> 3, criando um paradoxo que o número teórico de células necessárias para a eficácia clínica é aumentado mais a população de células é expandida. Em contraste com os aspirados de medula óssea, a placenta é um termo fisicamente grandes tecidos de partida (tipicamente 500-750 g 4), que pode ser colhido assepticamente durante cesariana sem risco para o dador. MSC derivadas de placenta têm proliferação 5 e imunomodulador capacidade a longo prazo 6, superior ao MSC derivadas de medula óssea. Num estudo anterior, demonstrou-se que um único termo placenta continha MSC suficiente para o fabrico de 7.000 até 4 doses clínicas. Estas características tornam placenta um tecido fonte ideal para o fabrico de MSC alogénica.
A placenta é um órgão feto-materna consiste em ambos fetal e materna tecido 7, e, assim, MSC de origem fetal ou materno pode ser, teoricamente, isolado. As seguintes referências fornecem deatado informações sobre o desenvolvimento e patologia, bem como exame microscópico e macroscópico da placenta humana e anexos 8,9. A placenta adequada é composta em grande parte dos vasos sanguíneos fetais e secretora e células de suporte chamadas trofoblastos, tornando-se as vilosidades coriônicas abrangidos pelo frondosum córion (placa) 8. As vilosidades da placenta ramificados são banhadas em sangue materno entregues a partir das artérias em espiral uterina, permitindo nutrientes, hormônios e as trocas gasosas entre o feto ea mãe. A placenta é ancorado ao endométrio através de células do estroma deciduais maternas e os trofoblastos fetais extravillious são intercaladas em oito matriz extracelular. As vilosidades convergem para a placa coriônica fetal onde formam o cordão umbilical 8.
Um resultado do primeiro Workshop Internacional sobre Células-tronco derivadas de placenta (2008) era uma apreciação da necessidade de padronizar o isolamento e characterization de células de placenta humana 10. Devido à anatomia da placenta, dissecção dos diferentes tecidos, isolamento de MSC e os resultados esperados cultura pode ser esmagadora para os recém-chegados ao campo. Neste protocolo, a colheita de tecidos coriônicas da placenta, seguido pelo isolamento MSC e expansão é completamente detalhado. MSC caracterização por meio de citometria de fluxo e na diferenciação in vitro são consideradas de rotina 5,11-13, e, assim, apenas brevemente detalhado aqui.
Conforme destacado em uma recente revisão sistemática da literatura 14, MSC obtidos a partir das vilosidades coriônicas da placenta são geralmente assumido ser fetal. Embora, apenas 18% dos estudos examinou a origem do MSC obtido, e desses, apenas metade dos estudos relataram MSC fetal ea outra metade relatou populações MSC maternos ou mistos. Cada um dos três componentes do tecido aqui descritos (vilo corial, placa e decídua basalis coriônica) são composed principalmente da membrana fetal / vilosidades, e uma pequena proporção de células maternas derivada-uterinas, que permanecem ligados à placenta entregue. Nós fornecer dados que demonstram que o isolamento MSC do lado materno da placenta, em vez do lado fetal da placenta, como já anteriormente relatado 5,11, é um material de partida mais adequado se MSC materno são desejados. Este protocolo descreve também o uso de XY peixe para validar contribuição fetal ou materno para culturas de células. Enquanto este é um protocolo padrão do fabricante, esta análise é muitas vezes negligenciada e sua importância subestimada 14.
A placenta é um órgão feto-materna fisicamente grande, a partir do qual MSC fetal ou materno pode ser isolado 22. Aqui, nós fornecemos um panorama detalhado da anatomia da placenta e instruções sobre como dissecar especificamente decídua (materna), vilo corial (fetal), e placa coriônica (fetal) de tecido (Passo 2,2-2,4). Posteriormente, traçamos um protocolo robusto que permite o isolamento MSC de cada um destes três tecidos (Passo 2,5-2,6). Expansão da placenta MSC é eficiente e culturas aparecer semelhante ao osso derivadas de medula culturas MSC (Figuras 3 e 4). Diferenciação osteogénica é fiável (Figura 5B), enquanto que a diferenciação adipogênica é geralmente menos eficientes (Figura 5C) 5.
Muitos recém-chegados ao campo irá presumir que as culturas derivadas de vilo corial fetal ou tecidos placa coriônica será enriquecido por MSC fetal. No entanto, em nossas mãos feenriquecimento de células tal só é transitória quando o meio de expansão MSC padrão tal como DMEM-LG + 10% FBS é utilizado 5. Aqui nós fornecemos resultados representativos usando tecidos da placenta derivadas de um bebê do sexo masculino. Ao usar o tecido da placenta de um bebê do sexo masculino, as células fetais são facilmente identificáveis como tendo cromossomos XY, enquanto as células maternas são identificáveis como tendo cromossomas XX. A Figura 6 mostra XY resultados peixe para uma cultura representativa. Enquanto MSC fetal (XY) são enriquecidos (até 80%) nas culturas iniciais derivados de vilosidades coriónicas fetal ou tecidos placa coriónicas, estas mesmas culturas são rapidamente ultrapassada (~ 100%) por materna (XX) MSC sobre as duas primeiras passagens . Na forma padrão, composto por DMEM-LG + FBS a 10%, o MSC materno-derivados poucos que contaminam os tecidos fetais outcompete as células fetais derivadas em cultura.
Um passo crítico descrito neste protocolo é uma apreciação da anatomia da placenta e de onde fetale tecido materno pode ser mais eficazmente colhidas. Conforme descrito na seção de resultados representativos, dissecção de tecido fetal não permitir o enriquecimento transitória para MSC derivadas de fetal. Melhorias na formulação do meio de expansão, através da suplementação exógena específico médio do factor de crescimento deve permitir a expansão selectiva das populações MSC de derivação fetal, e fabricar um produto celular que é enriquecido por fetal, em vez de células maternas (o nosso grupo está actualmente a desenvolver tais formulações médias). O fabrico de populações MSC fetais pode ter um número de vantagens, como MSC fetal são supostas ter maior angiogénese e propriedades imunossupressoras do que equivalentes populações MSC 37 maternas.
Em cada um dos protocolos de isolamento descritos, utilizou-se cerca de 10 g de tecido. Toda uma placenta é tipicamente 500-750 g, e em trabalhos anteriores que demonstraram que através do tecido automatizada digestão e um biorreator proc expansão celularcessos que deveria ser possível fabricar mais de 7.000 doses de células clínicos de uma única placenta 4. Esses números destacam a adequação potencial de MSC derivadas da placenta em terapias MSC alogénicas, ea importância deste método, independentemente da origem MSC (fetal ou materna). Do ponto de vista terapêutico, é mais crítico que os usuários tenham um entendimento completo do produto celular e capacidade para fabricar de forma confiável este produto celular. Esperamos que o nosso vídeo vai ajudar os pesquisadores a entender a anatomia da placenta, isolar MSC a partir da placenta, e antecipar a composição celular fetal ou materna provável de suas culturas.
The authors have nothing to disclose.
RP foi apoiado por um Conselho Nacional de Saúde e de Investigação Médica (NHMRC) Pós-Doutorado Training Fellowship. VS foi apoiado por uma bolsa de estudos da Universidade de Queensland International Postgraduate Student. MRD foi apoiado pela NHMRC e Inner Roda Austrália.
Agradecemos pessoal clínico e de enfermagem para auxiliar o consentimento do paciente e coleta de amostras. Agradecemos Prof. Nickolas Fisk, Prof. Kerry Atkinson eo Dr. Rohan Lourie para discussões criteriosas em obstetrícia, o desenvolvimento feto-placentária e anatomia placenta.
Reagents | |||
HBSS | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Long name: Hanks Balanced Salt Solution |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
trypsin-substitute | Gibco/Invitrogen | 12563-029 | Long name: TrypLE Select |
DMEM-LG | Gibco/Invitrogen | 11885-092 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-Low Glucose |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
PBS (Mg+Ca+ free) | Gibco/Invitrogen | 14190-250 | Long name: Dulbecco's Phosphate buffered saline, magnesium and calcium free |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
paraformaldehyde powder or 4% solution | any | ||
Collagenase I | Invitrogen | 17100-017 | 2500U/ml |
Dnase I | Sigma | D5025 | 10 mg/mL in 0.15 M NaCl |
Dispase | Invitrogen | 17105-041 | 10 mg/ml in water (20,000 U/ml). |
Material | Company | Catalog Number | Comments |
Disposables: | |||
50 ml centrifuge tubes | Falcon or any brand | ||
petri dishes, sterile plactic (25 cm and 10 cm diameter) | Nunc | ||
Cell strainers (100 micron) | Becton Dickinson | 352340 | |
175 and 75 cm2 (T175 and T75) tissue culture flasks | Nunc | ||
5 ml, 10 ml, 25 ml sterile serolgical pipettes | any brand | ||
Material | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment: | |||
Centrifuge | |||
tissue culture incubator 37 degrees celcius, 5 % CO2 | |||
Biological safety cabinet | |||
Sterile scissors and tweezers | |||
Tube racks | |||
Pipette-boy or equivalent | |||
Gilson type pipetters and sterile tips 1000 µl, 200 µl, 20 µl. | |||
rocking or shaking incubator (37 degrees celcius) | |||
personal protective equipment | |||
cleaning solutions (suitable for blood) | |||
waste containers, correct disposal bins for tissue/blood | |||
Reagents for MSC characterization | |||
Antibody (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | Isotype |
CD73 (AD2) | Miltenyi Biotec | 130-095-183 | Mouse IgG1 |
CD105 (43A4E1) | Miltenyi Biotec | 130-094-941 | Mouse IgG1 |
CD90/Thy-1 (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-403 | Mouse IgG1 |
CD45 (5B1) | Miltenyi Biotec | 130-080-202 | Mouse IgG2a |
CD34 (AC136) | Miltenyi Biotec | 130-090-954 | Mouse IgG2a |
HLA-DR (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-298 | Mouse IgG2a |
CD31 (PECAM-1) | BD Pharmingen | 555446 | Mouse IgG1 |
CD146 (541-10B2) | Miltenyi Biotec | 130-092-849 | Mouse IgG1 |
CD44 (DB105) | Miltenyi Biotec | 130-095-180 | Mouse IgG1 |
Isotype Controls (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-214 | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-212 | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-091-837 | |
Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-098-849 | |
MACS Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Osteogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
β-Glycerol Phophate | Sigma | 50020 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | For calcium matrix staining |
Adipogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
insulin | Sigma | I2643 | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
Indomethacin | Sigma | I7378 | |
3-isobutyl-1-methyl xanthine | Sigma | I5879 | |
Oil Red O solution | Sigma | O1391-250ML | For lipid vacuole staining |
XY FISH kit to determine fetal or maternal origin of cells | |||
XY chomosome FISH kit | Vysis (Abbott Molecular) | 07J20-050 | Long name: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Direct Labeled Fluorescent DNA Probe Kit |