Summary
세균성 병원균과 호스트 사이의 상호 작용을 조사하는 것은 생물학적 연구의 중요한 영역입니다. 여기서는 BLAM 기판을 사용하여 siRNA의 유전자 사일런 동안 Coxiella burnetii에 의해 이펙터 전위를 측정하기 위해 필요한 기술들을 설명한다.
Abstract
Coxiella burnetii의, Q 발열의 원인 물질은 복제 성 틈새를 확립 타입 IV 도트 / ICM 분비 시스템에 의존하여 세포 내 병원체이다. 이펙터의 코호트는 호스트 프로세스를 조작 및 복제에 대한 고유 리소좀 유래 액포의 확립을 허용하는 숙주 세포에 본 시스템을 통해 전좌된다. 특정 유전자의 siRNA를 이용하여 침묵과 β-lactamase의 활성에 의존하는 FRET 기반의 기판을 사용하여 이펙터 전위 측정 : 여기에 제시된 방법은 두 개의 잘 확립 된 기술의 조합을 포함한다. 이 두 접근 방법의 적용, 우리는 박테리아 분비 시스템 기능 및 이펙터 전위에서 호스트 인자의 역할을 이해하기 시작할 수있다. 이 연구에서 우리는 Rab5A과 Rab7A, 모두 세포 내 이입 인신 매매 경로의 중요한 규제 기관의 역할을 조사했다. 우리는 이펙터 translocatio의 감소 중 단백질 결과의 발현을 침묵 입증N 효율. 이러한 방법은 또한 쉽게 분비 시스템을 이용하는 다른 세포 및 세포 외 병원체를 조사하도록 변형 될 수있다. 이러한 방식으로, 세균 이펙터 전위에 관련된 호스트 요인 글로벌 영상이 드러날 수있다.
Introduction
Coxiella burnetii의는 인수 공통 인체 감염 Q 열병을 일으키는 독특한 세포 내 병원균이다. 이 질환은 증상이 혈청에서 종종 노출 한 후 심내막염 년으로 나타난다 생명을 위협하는 만성 감염 연장 임상 프레 젠 테이션의 광범위한 스펙트럼과 연결됩니다. 인간의 감염은 주로 반추 동물, 특히 젖소, 양, 염소 감염의 주요 저수지와 오염 된 에어로졸의 흡입을 통해 발생합니다. 이러한 동물 Coxiella 감염은 일반적으로 무증상이지만 감염 낙태를 트리거 할 수 있으며, 유체 출산 및 태반 내의 상당한 세균 부하는 한 로컬 환경을 오염시킬 수있다. 공중 보건과 농업 산업 모두 최근 네덜란드 2에서 발생한 Q 열병 발생이 관찰되었다에 엄청난 부담 등 오염의 예는 수 있습니다. 2007 년과 사이2010, Q 열병 4,000 통해 인간의 경우는 진단받은이 발발은 염소 농장 3의 중요한 오염에 연결되었다. 또한, Coxiella 인해 심각한 이환율과 사망률 (4)을 일으킬 수있는 박테리아와 필요한 낮은 전염성 선량의 환경 안정성에 미국 질병 통제 예방 센터에 의해 분류로, 잠재적 인 생물학적 무기입니다.
Coxiella은 두 단계에 존재하는 천연 소스에서 고립 된 단계 I 생물은 매우 악성이며, 단계 II 생물이 높은 생체 내에서 감쇠된다. 예를 들어, Coxiella burnetii 나인 마일 단계 I 생물의 여러 체외 통로 후, 단계 II 박테리아가 절단 된 리포 폴리 사카 라이드의 결과로 돌이킬 수없는 염색체 삭제를 포함하는 제조 하였다 (LPS) 5. 이 균주, C. burnetii NMII는 조직 배양 모델 I, 위상 표현형 유사하고 안전한 모드를 제공한다연구진은 실험실 5 Coxiella의 발병 기전을 연구하기위한 리터. 최근 몇 년 동안 몇 가지 혁신이 빠르게 Coxiella 유전학의 분야를 전진했다. 특히, 무균 매체의 개발 (시트르산 시스테인 매체 산성화 - ACCM-2)는 모두 액체 및 고체 배지에 6,7 Coxiella의 무 세포 성장을 허용했다. 이것은 유도 유전자 발현 시스템, 셔틀 벡터 및 랜덤 트랜스포존 시스템 8-11 포함 Coxiella 가능한 유전 도구 직접 개선 결과. 가장 최근에, 대상 유전자의 불 활성화에 대한 두 가지 방법이 특정 독성 유전자 후보 (12)를 조사하기위한 방법을 포장, 개발되었다.
폐포 대 식세포에 의해 내재화 이어 Coxiella는 막 결합 구획 내에 높은 번호에 복제는 액포 (CCV)을 함유 Coxiella- 불린다. CCV는 호스트 세포 내 이입 매매 일이 필요합니다거친 초기와 후기 엔도 좀이 리소좀 유래 세포 기관 (13)에 성숙 할 때까지. 이 과정을 통해 상기 CCV 중 하나가 일시적으로 나타나거나 포함 액포와 연관되지만 Rab5, Rab7, CD63 및 LAMP-1 13-15에 한정되지 유지 숙주 요인을 취득한다. 숙주 세포 내에서 Coxiella의 복제는 완전한 기능 도트 / ICM 형 IVB 분비 시스템 (T4SS) 8,16,17에 전적으로 의존한다. 이 분비 시스템 ancestrally 공액 시스템과 관련된 여러 단백질 구조 및 박테리아 단백질을 제공하기 위해 모두 세균과 액포 막에 걸쳐 호스트 세포질 18에, 이펙터 불린다. Coxiella T4SS는 기능적으로 레지오넬라 뉴모 필라 (19, 20)의 잘 특징 유형 IVB 점 / ICM 분비 시스템과 매우 유사합니다. Coxiella이 리소좀 유래 산성에 도달 할 때까지 흥미롭게 T4SS 이후 이펙터 전위의 활성화가 발생하지 않는다세포 기관, 약 8 시간 게시물 감염 17,21. 현재까지 130여 점 / ICM 이펙터는 9,17,22-24를 확인되었습니다. 이 이펙터의 대부분은 가능성이 숙주 세포 내에서 Coxiella의 복제시 중요한 역할을; 단, 약간의 이펙터 기능 25-29 특성화되었다.
본 연구에서 우리는 숙주 세포의 세포질 내 β-lactamase의 활성을 통해 (이하 BLAM 기판이라 함) CCF2-AM FRET 기판 (도 1)의 절단에 의존하는 형광 기반 전위 분석을 이용한다. 관심의 유전자는 구성 적 발현을 제공하는 리포터 플라스미드에 β-lactamase를 (연기하는거야)-1 TEM 융합된다. BLAM 기판을 FRET 쌍을 형성하는 두 개의 형광 발색단 (쿠마린 및 플루오 레세 인)로 구성되어있다. 플루 오레 신 및 이펙터 전위의 부재하에 녹색 형광 발광의 FRET의 쿠마린의 여기 결과; 그러나, 만약 즐M 이펙터 융합 단백질은 호스트 세포질로 전좌하고, 얻어진 β-lactamase의 활성을 절단 여진 다음 청색 형광 방출을 생산 FRET 쌍을 분리 BLAM 기판의 β 락탐 고리. 이 전위 분석이 잘 C. 등 다양한 세포 내 및 세포 외 박테리아의 범위에서 이펙터 단백질을 식별하는 방식으로 입증되었다 burnetii, L. 뉴모 필라, L. longbeachae, 클라미디아 트라코마 티스, 장내 유해 E. 대장균, 살모넬라 균 및 브루셀라 17,30-35.
Coxiella 이펙터 전위 특정 숙주 인자의 역할을 결정하기 위해 우리는 특히 작은 간섭 RNA의 (siRNA의), RNA 간섭으로 알려진 유전자 침묵을위한 확립 된 방법을 이용한다. 원래 예쁜 꼬마 선충에서 발견, RNA 간섭은 타고난 defe에 사용되는 보존 내생 세포 과정바이러스에 대한 NSE뿐만 아니라 유전자 조절 (36, 37). 서열 - 특이 적 siRNA를 바인딩 한 후 mRNA를 분해 특정 유전자 침묵 또는 최저 38 결과 (RNA 유도 침묵 복합체) RISC 통해 발생한다. 이 연구에서의 siRNA가 세포 내 이입 경로의 중요한 레귤레이터 두 호스트 단백질 Rab5A 및 Rab7A를 대상으로 하였다. 이펙터 전위에 Rab5A 및 Rab7A 입을의 영향 C.을 사용하여 확인 하였다 burnetii pBlaM-CBU0077. 것은 이미 Coxiella 17 도트 / ICM 분비 시스템 전좌 것으로 나타났다 CBU0077로 선택 하였다.
siRNA의 유전자 사일런 여기 기재된 fluorescencebased 전위 분석 양쪽을 이용하여 우리는 Coxiella 이펙터 단백질의 전위에 숙주 인자의 역할을 설정하기 시작한다. 이 방법은 유사한 secretio 소유 모두 세포 내 및 세포 외 박테리아의 넓은 범위에 적용될 수있다이펙터 단백질의 전위에 대한 책임 N 시스템.
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Protocol
참고 : Coxiella burnetii RSA439 NMII의 성장 또는 조작과 관련된 모든 절차는 물리적 봉쇄 레벨 2 실험실 및 현지 가이드 라인을 준수 생물 안전 캐비닛 내에서 수행되어야한다. 후술 역 형질 감염 및 전위 분석 흐름의 개략도는도 2에 도시되어있다.
C. 1. 준비 burnetii 문화 β-lactamase를 위해 (pBlaM-CBU0077)를 CBU0077 융합을 표현 (DAY 1)
- 준비 1X ACCM-2 6 :
- 표 1에 나열된 구성 요소를 결합합니다. (오토 클레이브하지 않음) 6 M NaOH로 4.75에 pH 및 필터 소독을 조정합니다. ACCM-2는 4 ℃에서 보관 약 3 주 동안 안정하다.
- C. 생성 burnetii pBlaM-CBU0077 주식.
- C.와 헬라에게 229 세포를 감염 큰 vacuol 때까지 pBlaM-CBU0077과 통로를 들고 burnetii 변형ES 세포의 대부분에서 관찰된다.
- C. 성장 5 % CO 2, 2.5 %의 O 2에서 37 ℃에서 7 일간 통풍 모자와 75cm 두 조직 문화 플라스크에 20 ㎖ ACCM-2 포함 3 μg의 / ㎖ 클로람페니콜에 pBlaM-CBU0077를 들고 burnetii 변형.
- C.를 원심 분리기 실온에서 15 분 동안 15,000 × g에서 burnetii pBlaM-CBU0077 문화.
- 다시 일시 + 10 % 소 태아 혈청 (FCS) + 3 μg의 / ml의 클로람페니콜 (유지 배지) 20 ㎖의 DMEM에서 펠릿. 헬라 229 세포의 50 % 합류 75cm 2 플라스크에서 용지를 제거합니다. 추가는 다시 중단 C. 헬라 229 세포에 burnetii. 헬라 세포 (229)의 감염을 확립 할 수 있도록 5 % CO 2, 37 ℃에서 2 일 동안 인큐베이션.
- 175cm 두 조직 문화 플라스크에 세포를 분할합니다.
- 75 ㎠로 플라스크에서 용지를 제거하고 10 ml의 미리 예열 PBS로 두 번 단층을 씻는다.
- 1 ml의 O를 추가F 3 37 ° C + 5 % CO 2에서 0.05 % 트립신 EDTA 용액과 장소 세포 - 5 분 세포를 분리합니다.
- 유지 배지 10ml에 세포를 다시 일시. 유지 보수 미디어의 38 ml를 포함하는 175cm 2 플라스크에 재 부유 세포 2 ㎖를 추가합니다.
- 100 % 컨 플루 언시에 도달 할 때 큰 액포가 관찰 될 때까지 오일 - 또한 3 5 % CO 2에서 37 ℃에서 인큐베이션.
- 감염된 헬라 229 세포를 커버하고 감염된 세포를 용균 15 분 동안 배양 10 ml의 DH 2 O를 추가 175cm 2 플라스크에서 뜨는 수집합니다.
- 실온에서 15 분 동안 15,000 × g에서 뜨는 및 용해 세포 펠렛을 결합합니다.
- 다시 중단 10 ml의 DH 2 O의 펠렛을 반복적 10 ㎖ 주사기 적어도 20 배에 부착 된 바늘 (23G)를 통해 재 현탁액 전달하여 상기를 Lyse 셀. 5 분 동안 500 × g에서 펠렛 세포 파편을 제거합니다. <리> 제거하고 펠렛 뜨는 15,000 × g에서 C.를 수집 실온에서 15 분 동안 burnetii.
- C.와 헬라에게 229 세포를 감염 큰 vacuol 때까지 pBlaM-CBU0077과 통로를 들고 burnetii 변형ES 세포의 대부분에서 관찰된다.
- C.을 다시 중단 DMEM + 10 % FCS에 burnetii 및 4에 따라 박테리아의 수를 정량화. -80 ° C에서 DMEM + 10 % FCS + 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO), 분취 액 50 μL 축적량 미세 원심 분리 튜브에 저장을 사용하여 1 × 10 9 유전체 / ㎖로 희석한다.
2. 역의 siRNA의 형질과 헬라의 시드 229 세포 (DAY 4)
- 처음 실험의 siRNA를 사용하는 경우 준비siRNA를 다음과 같이 :
- 간단히 siRNA의 펠렛은 튜브의 바닥에서 수집되는 것을 보장하기 위해, 동결 건조 된 siRNA를 원심 분리기.
- 1X siRNA를 완충액 (표 2)의 적절한 부피를 피펫 팅하여 20 μM의 최종 농도 스톡 펠렛의 siRNA를 다시 일시.
- 용액을 피펫 3 아래 - 10 분 - 5 회 튜브 매 5 반전, RT에서 30 분 동안 궤도 믹서에 혼합 배치합니다.
- 간단히의 siRNA가 튜브의 바닥에 수집되도록하여 튜브를 원심 분리기.
- 요구 될 때까지 -20 ℃에서 미세 원심 분리 튜브 및 저장소 50 μL 분취 량으로 나누어지는 된 siRNA.
- 필요한 경우의 siRNA의 농도를 작업 1 μM를 생성하려면, 피펫 1X의 siRNA의 950 μl를 50 μl의 나누어지는 재고 (20 μM)로 버퍼. 참고 :이 1 μM 작업 농도는 반복 형질에 대해 여러 번 동결 해동 할 수 있습니다.
- , DMEM + 10 % FCS를 배치30 분 동안 37 ° C의 물을 욕조 (또는 동급)에서 0.05 % 트립신 EDTA와 PBS는 사용하기 전에 따뜻하게.
- 형질 성분의 제조 :
참고 : 다음 프로토콜은 검은 벽과 평평하고 투명한 바닥 96 웰 마이크로 플레이트에 헬라에 대한 229 세포를 최적화되었습니다. 형질 전환 시약의 양을 최적화는 세포의 siRNA 농도 파종 밀도가 상이한 세포주에 대한 필요가있다.- 각 웰, 0.1 ㎕를 형질 전환 시약을 사용하는 경우, 15.9 μL 감소 된 혈청 배지 1 μM의 siRNA (40 nm의 최종 siRNA의 농도의 결과로)의 4 μL (최소 필수 매체는 재료의 표를 참조 형질에 사용). OTP, PLK1, Rab5A 및 Rab7A에 대해 별도의 microfuge 튜브를 사용합니다. 세중의 각 분석 조건을 측정한다. 96- 웰 플레이트 레이아웃의 예는도 3에 도시되어있다.
주 : OTP와 PLK1 :이 프로토콜은 두 개의 제어의 사용을 포함한다. OTP는오프 - 타겟 효과를 감소시키기 위해 최적화되어있어 OTP가 음이 아닌 타겟팅 대조군으로 사용되는 네 풀링 된 siRNA로 구성. 스크램블 된 siRNA는 대조군으로서 사용될 수있다. 프로 - 세포 사멸 경로를 유도하므로 PLK1의 siRNA가 세포 사멸이 형질 전환 효율과 상관 형질 양성 대조군으로 사용하여 세포주의 여러 광범위한 세포 죽음에서 PLK1 식 결과 손실.- 각 실험의 siRNA 형질 감염의 경우, 개별적인 미세 원심 분리 튜브에 0.4 ㎕를 형질 전환 시약 및 63.6 ㎕의 혈청 감소 배지를 결합한다. 모든 미세 원심 분리 튜브 및 RT에서 5 분 동안 복잡한 부품을 소용돌이.
- 형질 복합체를 포함하는 대응의 microfuge 튜브 각 실험의 siRNA의 16μl를 추가합니다. 소용돌이 및 RT에서 20 분 동안 배양한다. 참고 :이 30 분을 초과하지 않는 것이 중요합니다, 형질 전환 효율이 감소하므로.
- 각 웰, 0.1 ㎕를 형질 전환 시약을 사용하는 경우, 15.9 μL 감소 된 혈청 배지 1 μM의 siRNA (40 nm의 최종 siRNA의 농도의 결과로)의 4 μL (최소 필수 매체는 재료의 표를 참조 형질에 사용). OTP, PLK1, Rab5A 및 Rab7A에 대해 별도의 microfuge 튜브를 사용합니다. 세중의 각 분석 조건을 측정한다. 96- 웰 플레이트 레이아웃의 예는도 3에 도시되어있다.
- 20 분 동안 INCubation (2.3.1.2)는 20 형질 전환 시약 μL + 감소 된 혈청 배지를 추가 +의 siRNA는 멸균 블랙, 평면 분명 바닥 96 웰 트레이의 적절한 우물에 섞는다.
- 즉시 20 분 동안 배양 완료, 시드 / 웰의 세포를 3.92 × 229 × 103 세포의 밀도로 헬라 때문이다.
- 수확 헬라 예열 DMEM에 합류 또는 서브 합류 75cm 2 조직 배양 플라스크에서 229 세포 + 10 % FCS 및 표준 방법에 따라, 4.9 × 104 세포 / ml의 최종 농도로 세포를 재 - 보류. 효율이 손상되지 형질을 보장하기 위해, 20 분 잠복기 (2.3.1.2) 동안 세포를 준비합니다.
- 미리 예열 PBS 10 ㎖와 229 세포를 두 번 헬라의 단층을 씻으십시오.
- 5 분 세포를 분리 - 3가 37 ° C + 5 % CO 2에서 0.05 % 트립신 EDTA 용액과 장소 헬라 229 세포의 1 ML을 추가합니다.
- 예열 된 DMEM + 10 % FC 9 ml의 세포를 수집S.는 혈구 계를 사용하여 세포를 세어 DMEM + 10 % FCS를 사용하여 4.9 × 104 세포 / ml의 최종 농도로 세포를 준비한다.
- 형질 시약 + 감소 된 혈청 배지 + siRNA의 혼합을 포함 각 웰에 229 세포를 4.9 × 104 세포 / ml의 농도에서 헬라의 피펫 80 μL. 이것은 / 웰의 3.92 × 103 세포의 세포 농도에 해당한다.
참고 : 배경 빼기가 연기하는거야 기판이 필요합니다.- 세포 또는 siRNA를 추가하지 마십시오에 "빈"우물 (그림 3). 대신 중으로 설정이 우물에 DMEM + 10 % FCS의 80 μl를 추가합니다.
- 37 ° C + 5 % CO 2에서 24 시간 동안 품어.
- 수확 헬라 예열 DMEM에 합류 또는 서브 합류 75cm 2 조직 배양 플라스크에서 229 세포 + 10 % FCS 및 표준 방법에 따라, 4.9 × 104 세포 / ml의 최종 농도로 세포를 재 - 보류. 효율이 손상되지 형질을 보장하기 위해, 20 분 잠복기 (2.3.1.2) 동안 세포를 준비합니다.
3. 변경 미디어 (DAY 5)
- 24 시간 후, 다 채널 피펫 진공 원 또는 수동에 부착 된 다중 어댑터를 사용하여 매체를 제거하고 신선한 prewarm 100 ㎕로 대체에드 DMEM + 10 % FCS.
- 37 ° C + 5 % CO 2에서 추가로 48 시간 동안 품어.
- 이 시점에서, 시각적으로 표준 광학 현미경을 사용하여 세포의 생존을 확인합니다. 역 형질 감염이 성공 된 경우, 중요한 세포 죽음은 OTP의 siRNA에 비해 PLK1의 siRNA를 함유하는 웰에서 관찰된다.
qPCR에를 사용하여 정량 Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 스트레인 4. (DAY 7)
- 10 ml의 C. CO 2, 2.5 %의 O 2 (1.3), 원심 분리기 5 %에서 37 ° C에서 ACCM-2의 성장 7 일 후 실온에서 15 분 동안 15,000 × g에서 burnetii pBlaM-CBU0077 문화.
- 예열 된 DMEM + 10 % FCS 10ml에 세균 펠렛을 다시 일시. 1:10 1 준비 : DH 2 O를 사용하여 문화 (샘플) 100 희석
- qPCR에 필요한 구성 요소를 설정합니다.
참고 gDNA를 추출 미리 수행 -20 ° C UNT 저장 될 수있다위원장이 필요합니다.- 표준의 제조 :
- 칠일은 제조업체의 지침에 따라 같은 gDNA를 추출 키트를 사용하여 5 %의 CO 2, 2.5 %의 O 2에서 37 ° C에서 ACCM-2에서 재배 Coxiella burnetii RSA439 NMII 야생형 균주로부터 gDNA를 압축을 풉니 다.
- 260 나노 미터의 흡광도에서 Nanodrop (또는 동급)를 사용하여 gDNA를 농도 (g / μL)을 측정한다.
- 아래의 다음과 같은 공식을 사용하여 μL 당 게놈 사본의 수를 계산하고, 게놈 / ㎖의 숫자로 변환.
- DH O. 2를 사용하여 새로운 미세 원심 분리 튜브 (100 μL의 최종 부피) 109 / ml의 게놈 / ㎖의 수를 조정 이는 10 분 동안 끓여서 필요한 때까지 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
- 감염의 날, 109 게놈에서 게놈 105 / ㎖ 내지 10 8 유전체 / ㎖의 10 배 희석액을 생성S / ml의 재고.
- 피펫 DH 2 O 90 μL에 109 게놈 / ㎖의 10 μl를 10 8 유전체 / ㎖를 생성한다. 소용돌이는 혼합한다. 피펫 DH 2 O 90 μL에 108 게놈 / ㎖의 10 ㎕의 10 7 게놈 / ㎖를 생성한다. 10 5 게놈 / ㎖까지 소용돌이를 반복합니다.
- qPCR에 반응을 설정합니다. 25 우물은 어떤 피펫 오류를 설명하기위한 마스터 믹스를 만듭니다. 각각의 잘, 10 μl의 qPCR에 마스터 믹스를 사용; 로 ompA 프라이머 믹스 2 μL (4.3.2.2) 및 DH 2 O 3 μL
참고하는 OmpA는 C.의 외부 막 단백질 앞서 설명한 바와 같이 40 burnetii '39 고도로 보존 된 영역 내에서 82 염기쌍 부분은 프로브로 사용을 위해 선택되었다.- 각 표준 (DH 2 O, 105, 106, 107, 108, 109 게놈은 / ㎖) 및 샘플 (1을 설정합니다 :(10)과 1 : 100 희석)을 96 웰 PCR 각각 이중 또는 삼중으로) (비 치마를 입은 판을 얻어 찢어. 적절한 우물에 샘플 또는 표준의 5 μl를 추가합니다.
- (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') 및 역방향 프라이머로 ompA (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') 4 μM의 최종 농도로 ompA 정방향 프라이머 모두 희석 같은 미세 원심 분리 튜브에 결합 DH 2 O 사용.
주 :로 ompA 프라이머 믹스를 미리 준비하고, 필요한 때까지 -20 ℃에서 저장 될 수있다. - 250 ㎕의 qPCR에 마스터 믹스 50 μL로 ompA 프라이머 믹스 75 μL의 DH 2 O와 혼합하는 소용돌이를 결합합니다. 표준 또는 샘플 중 하나를 포함하는 우물이 마스터 믹스 15 μl를 추가합니다.
- 모든 것을 보장하기 위해 PCR 튜브는 튜브의 바닥에 수집 된 적절한 우물과 펄스 원심 분리기에 8 뚜껑 PCR 스트립 모자를 놓습니다.
- 정량적 PCR 엄마에 다음 프로그램을 설정산등성이 : 1 초 동안 95 ° C의 45주기와 20 초 (그림 4A) 60 ° C이어서 2 분, 10 분 동안 95 ° C, 50 ° C.
- qPCR에에서 코네티컷 (사이클 임계 값) 값을 분석 :
- 프로그램의 내보내기 기능을 사용하여 스프레드 시트에 코네티컷 값을 전송합니다.
- 9 ~ 10 게놈 / ㎖ (로그 값으로 표현)을 통해 기준 10 5 게놈 / ml의 산점도를 작성합니다. 세중 샘플 사이에 명백한 아웃 라이어를 폐기하십시오. 대수 추세선을 생성하고 그래프의 방정식을 결정합니다.
- 4.3.3.2에서 생성 된 방정식을 사용하여 샘플의 게놈 / ㎖의 총 수를 계산한다. 샘플 : (100 1:10 1) 초기 희석을 고려하는 것을 잊지 마십시오.
- 표준의 제조 :
5. 역의 감염 형질 감염된 세포 (DAY 7)
- C. 총 게놈 / ㎖를 계산 한 후, 가시netii pBlaM-CBU0077 배양 50 μL / 웰 데워진 사용 DMEM + 10 % FCS의 최종 부피 300 MOI로 감염 세포를 재현 탁 박테리아 배양을 조정 감염에 사용될 수있다.
참고 : 72 시간 후에 정상 배가 시간 시딩 헬라 세포 (229)의 예상 밀도 잘 3.136 × 104 세포 /이다. 300 MOI로 감염시킬 필요 박테리아의 양은 1.88 × 108 박테리아 / ㎖ 총점 50 μL에 9.408 × 106이다.- qPCR에 (게놈 / ㎖)에서 산출 된 값 (4.3.3.3)를 이용하여 역 형질 감염된 세포를 감염이 용액의 최종 부피 예열 DMEM + 10 % FCS를 사용하여 재현 탁 박테리아 희석.
- 빈에서 기존 용지를 제거하고 형질 감염된 세포를 역.
- 적절한 우물에 희석 박테리아 (1.88 × 10 8 박테리아 / ㎖)의 50 μl를 추가합니다. 빈과 유 모두 DMEM + 10 % FCS의 50 μl를 추가ninfected 우물.
- 37 ° C + 5 % CO 2에서 24 시간 동안 품어.
연기하는거야 기판 6. 추가가 전좌의 수준을 결정 (DAY 8)
- 연기하는거야 기판 6 배 로딩 솔루션의 솔루션을 준비합니다.
참고 : 용액 A, B 및 C는 연기하는거야 기판 키트 (재료의 표 참조) 내에서 제공된다. 용액 B는 RT에서 침전물을 형성 할 수있다. 이전에 사용하고 침전물을 용해한다 37 ° C에이 솔루션을 따뜻하게.- 처음 키트를 사용하는 경우,이어서, 건조 된 용액 A에합니다 (BLAM 기판 키트에 제공됨) DMSO 185 μL를 추가 -20 ° C에서 재 현탁 용액 A를 저장한다.
- 필요한 때까지 -20 ° C에서 1 ml의 분취 량에 미리 저장 0.1 M 프로 베니 시드 용액을 준비합니다.
- 0.4 M의 NaOH (100 ㎖ DH 2 O 1.6 g)을 준비합니다.
- 100 mM의 나트륨 인산염 완충액 pH 8 (1.56 g의의 NaH 2 PO 4 · 2H 준비
- 격렬한 교반 0.4 M NaOH를 22 ml의 프로 베니 시드 1.25 g을 녹여.
- (흐린집니다 용액)와 그 형태의 침전물을 용해 저어 100 mM의 나트륨 인산염 완충액 pH 8의 22 ML을 추가합니다.
- 1 M 수산화 나트륨 / 염산을 사용하여 pH를 8 개 (필요한 경우)를 조정.
- 적극적으로 저어 약간 열 (<50 ° C) 솔루션은 대부분 깨끗해질 때까지.
- 1 ml의 볼륨에 필터 (0.2 μm의 기공 크기)와 나누어지는. -20 ° C에서 보관 씩.
- 각 웰, 0.06 μL 솔루션 A, 0.54 μl를 해결 B, 7.9 ㎕를 해결 C 1.5 ㎕의 0.1 M 프로 베니 시드를 사용하십시오. 먼저 미세 원심 분리 튜브에 함께 용액 A의 1.8 μL 및 해결 B의 16.2 μl를 결합하여 30 웰에 대한 마스터 믹스를 만듭니다. 소용돌이를 사용하여 잘 섞는다. 해결 방법 C 237 ㎕의 0.1 M 프로 베니 시드의 45 μl를 추가합니다. 소용돌이는 모든 componen을 결합하는TS.
참고 : 6 배 로딩 솔루션은 4 시간까지 (어둠 속에서) 안정적이지만 사용하기 전에 가능한 한 가깝게 준비를해야합니다. - 기존의 미디어를 제거하지 않고 직접 모든 빈과 형질 리버스 우물에 6 배 로딩 용액 10 μl를 추가합니다.
- 어둠 속에서 2 시간 동안 실온에서 접시를 품어.
- 전위의 레벨을 결정하기 위해 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 형광의 양을 정량화.
참고 : 다음 절차는 ClarioSTAR의 마이크로 플레이트 리더에 따라 다릅니다. 등가 마이크로 플레이트 리더도 이용 될 수있다.- 판독 모드로 포인트를 사용하여 새로운 형광 강도 프로토콜을 생성한다.
- 다음과 같이 기본 매개 변수를 조정합니다 :
- 96 웰 마이크로 플레이트를 선택합니다.
- 광학 설정에서 다음과 같은 사용자 정의 설정이 multichromatics를 선택 (1) 입력 410-10 nm의 여기 및 520-10 nm의 방출을. (2) 입력 410-10 nm의 여기 및 450-10 nm의 방출. 잘 MULT 확인ichromatics이 선택됩니다.
- 3mm의 직경 궤도 평균을 선택합니다.
- 광학에서 바닥 광학을 선택합니다.
- 속도와 정밀도에서 정확한 선택합니다. 이것은 물론 당 8 개의 영역에 해당한다.
- 샘플로서 적합한 웰 플레이트를 선택하여 레이아웃을 조정한다.
- 시작 측정.
- 뚜껑을 제거하고 플레이트 리더로 트레이를 배치합니다. 최대 형광 값에 도달하지 않도록하기 위해, 게인 값이되도록 조정된다. 이렇게하려면 역 OTP siRNA를 형질 전환 된 감염 우물 중 하나에 이득 조정을 수행합니다. 이것은 가장 높은 예상 전위에 상당한다.
- 시작 측정은 각각 450 nm의 파란색과 녹색 형광 520 nm의 모두의 410 나노 미터의 여기 및 방출에 바닥 형광을 사용하여 모든 적절한 우물을 측정합니다.
결과 7. 분석 :
- 비율을 계산모든 샘플 520 nm의 (녹색 청색)에 450 나노 미터의 빈 감소를 다음과 감염되지 않은 OTP 샘플에 대해 표현한다.
주 : 다음 분석 단계가 단순 스프레드 시트 프로그램에 제공된다.- 마이크로 플레이트 리더에 익스포트 기능을 사용하여, 520 nm의 스프레드 시트로 450 nm의 방출 파장 (6.5) 모두에 대해 얻어진 원료 형광 값을 전송.
- 원시 520 nm의 형광 값이 첨가 웰의 숫자로 분할하여 520 nm 파장에 대해 "빈"판독 (배지만없이 세포)의 평균을 계산한다 (3). 블랭크 450 nm 파장의 값을 사용하여 반복한다. 이러한 값 의한 96- 웰 플레이트 미디어 백그라운드 형광을 나타낸다.
- 배경 형광을 뺍니다. 7.1.2에서 얻은 값을 사용하여 모든 샘플을 520 nm의 형광 값에서 빈 520 nm 파장의 평균을 뺀다. 450 nm 파장의 값을 반복합니다.
- 520 nm의 비율 빈 보정 값을 사용 (7.1.3) : 450가 구하십시오. 그것의 520 nm의 값에 대응하여 각 시료 450 nm의 형광 값을 나눈다.
- (7.1.4부터) 520 nm의 비율 값과 웰 (3)의 개수로 나눈 다음 450을 추가하여 비감염 OTP 비의 평균값을 계산한다.
- 7.1.5에서 산출 비감염 OTP 비율 값의 평균값으로 계산 7.1.4 520 nm의 비율 : 450 나누어 비감염 OTP에 대해 시료의 비율을 계산한다.
핵 얼룩 8. 추가가 전좌 분석 한 후 세포 수를 계산하기 (DAY 8)
- 형광의 정량화이어서, 모든 웰 사용하거나 멀티 채널 피펫 진공 원 또는 수동에 부착 된 멀티 - 채널 어댑터에서 6X 로딩 용액을 함유 매체를 제거한다.
- 4 % PFA (파라 포름 알데히드) 용액 50 μL를 추가PBS에서 모든 적절한 우물에 세포를 고정합니다. 실온에서 20 분 동안 인큐베이션.
- (8.1에 따라) 4 % PFA PBS 용액을 제거하고 PBS의 75 μL로 두 번 세포를 씻으십시오.
- 각 웰에, 예를 들어, DAPI (4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌)에 대해, 세포 투과성 핵 얼룩의 50 μl를 추가합니다. 형광 현미경 이미지를 수집 및 ImageJ에 41와 같은 적절한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 siRNA를 잘 처리 후의 각각 본 핵의 수를 정량화.
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Representative Results
이 연구를 들면, C. CBU0077 이전 Coxiella 도트 / ICM 분비 시스템 (17)의 전좌 이펙터로 도시 된 바와 같이 burnetii pBlaM-CBU0077 균주를 선택 하였다. 앞서 감염, 칠일 C.의 게놈 / ㎖의 총 개수 burnetii pBlaM-CBU0077 배양 물을 사용 qPCR에 열거 하였다. (4)는 순환 액의 예를 보여주는 도표 (TR) 값은 다음의 두 qPCR에 표준 샘플 예상. 4.3.3에 설명 된대로 (증폭 플롯 (그림 4B)과 수치 (그림 4C)에 그래픽으로 표시) 중부 표준시 값은 수출 및 분석 하였다. 도시 대표 데이터에 기초하여, 10 mL로 재현 탁 세균 배양 (도 4d)에서 2.31 × 108 게놈 / ㎖가 있었다. 해당 박테리아 희석을 생성하려면 (1.88 × 10 8 유전체 / ㎖ 전n은 2 ㎖)에 재현 탁 박테리아 1.63 ml의 신선한 예열 DMEM + 10 % FCS 370 μl를 첨가 하였다. siRNA를 형질 역방향이어서, 세포에 감염되었다 C. 24 시간 동안 (300)의 MOI에서 burnetii pBlaM-CBU0077.
역방향의 배양 후 이펙터 전좌 BLAM 기판 정량화로 형질 감염된 세포를 형광 플레이트 판독기를 사용하여 결정될 수있다. 7에 기재된 분석에 따라, 비감염 된 OTP로 정규화 된 모든 비율 값 감염된 OTP로 정규화 될 수있다. 숙주 유전자의 침묵 후 이펙터 전위 레벨은 감염된 OTP 제어에 비해 후 3 결과들로 그룹화 될 수있다 : (1) 변화 없음; (2) 이펙터 전위를 증가; (3) 이펙터 전위를 감소. 이후 통계적 분석, 예를 들면 학생의 t 테스트를 위해, 모든 관찰 차분 t의 중요성을 결정하기 위해 사용될 수있다O OTP 제어 감염. 3 개의 독립적 인 실험에서 이펙터 전위에 Rab5A 또는 Rab7A를 침묵의 결과는도 5a에 도시되어있다. 연기하는거야 - CBU0077 전위의 수준에서 유의 한 감소는 OTP 제어 (p 값 = 0.0088 (Rab5A)과 p 값 = 0.0059 (Rab7A), 쌍, 학생 t 테스트)에 비해 Rab5A 및 Rab7A 모두의 침묵하는 동안 오류가 발생했습니다. 세포 생존 능력에 대한 siRNA의 처리에의 영향은 또한 설립되었다. 전좌 분석 후, 세포를 고정 하였다 핵 얼룩 염색 및 이후 정량. OTP 제어 (12 % 및 31 %, 각각)에 비하여 세포 생존율의 감소 Rab5A 또는 Rab7A 결과 중 치료가이 감소 PLK1 (97 %), 공지 된 유전자만큼 심각하지 않지만,도 5c에 도시 된 바와 같이 세포 사멸 원인 (p- 값 = 0.0102 (Rab5A를) p- 값 = 0.0081 (Rab7A), p- 값 <0.0001 (PLK1), 쌍, 학생 t 테스트). GE의 호스트의 입을 어떻게 이러한 결과는 보여된 siRNA를 이용 NES 부정적인 세균 이펙터 전위의 레벨을 변경할 수있다.
그림 1. 감염하는 동안 연기하는거야 기판의 행동의 메커니즘. C. burnetii는 숙주 세포에 의해 내재화 및 리소좀 유래 공포가 Coxiella 함유 공포로 명명 형성한다. 24 시간 후 감염, 세포는 β-lactamase를 즉, 연기하는거야 - CBU0077 이펙터없이 전위, 쿠마린의 여기에서이없는 경우. FRET 쌍 (A)를 형성하는 두 형광을 보유하고 막 투과성 연기하는거야 기판과로드 녹색 형광 신호 (520 ㎚) (B)로서 관찰 형광에 FRET 410 nm의 결과. 기능적 도트 / ICM 분비 시스템의 경우에서, BLAM-CBU0077 융합 단백질은 숙주 세포에 전좌되며 카스티 것두 염료의 분리를 야기하고 FRET 중단하고 410 nm의 (C)에서 여진 후 푸른 형광 신호 (450 ㎚)의 결과, β-lactamase의 활성을 통해 상기 BLAM 기판 처마. 모두 녹색 및 청색 형광 신호가 될 수있다 형광 플레이트 리더를 이용하여 검출. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
. 그림 2. 역 형질과 전좌 분석 워크 플로우의 도식 개요 주 1 : C. 준비 burnetii pBlaM-CBU0077 문화 4 일 :. 96 웰 트레이에 / 웰 3.92 × 10 3 세포의 최종 밀도로 40 nM의 siRNA의 종자 헬라 229 세포를 이용하여 역 트랜 5 일 :. 장플랜지 미디어 7 일 :. C의 전체 게놈 / ㎖를 정량화 burnetii pBlaM-CBU0077 문화 qPCR에를 사용하여 이후 300 일 (8)의 MOI와 역 형질 전환 세포를 감염 :., 6 배 로딩 염료를 추가 형광을 측정하고 세포 수를 정량화 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 역 형질과 헬라 229 세포의 시드를 설정하는 데 사용되는 96 웰 플레이트 레이아웃. (빨간색으로 표시)은 "빈"우물 미디어 만 포함하고 siRNA의 또는 헬라 229 세포 중 하나를 추가 할 필요가 없습니다. 이에 최적화 된 이후 OTP의 siRNA (감염되지 않은 우물과 감염된 우물 어두운 청색 빛 파란색으로 표시)을, 비 대상 제어로 사용적은 오프 대상 효과가있다. 적갈색과 녹색 우물은 각각 Rab5A 및 Rab7A의 siRNA를 나타냅니다. PLK1 표현의 손실이 세포주의 대부분의 프로 - 세포 사멸 경로 및 광범위한 세포 사멸을 유도 할 수있는 (노란색으로 표시) PLK1의 siRNA가 형질 전환 효율의 척도로 사용된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 대표 qPCR에 코네티컷 값은 C에서 게놈 / ㎖의 총 수를 정량하는 데 사용 burnetii pBlaM-CBU0077 문화. (A) Coxiella 배양 게놈 / ㎖의 번호를 열거 할 qPCR에에 사용되는 사이클 조건. 표준 및 샘플들 모두 가능한, CT 값은 그래프 (B)와 숫자 (C)로 표현되는형식. (D) 표준 코네티컷 값, 평균 그래프와 로그 추세선이 계산되었다. 식 샘플의 평균을 사용 코네티컷 C.의 게놈 / ㎖의 총 개수 값 burnetii pBlaM-CBU0077 문화 × 10 8 2.31로 측정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
siRNA를 Rab5A의 음소거 및 Rab7A. 헬라 229 셀 동안 도트 / ICM 이펙터 연기하는거야 - CBU0077 그림 5. 전좌는 역 Rab5A 고유의 siRNA (적갈색 바), Rab7A (녹색 막대), OTP (파란색 막대) 또는 PLK1로 형질 감염시켰다 (노란색 막대가)와 C. 감염 전에 72 시간 동안 배양 24 시간 동안 (300)의 MOI에서 burnetii pBlaM-CBU0077 변형. t 후그 BLAM 기판의 첨가는 형광 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 측정 하였다 (A)을 테이블 450과 함께 하나의 실험에서 얻은 원료 형광 값 보여. 블랭크 값을 공제 한 후 비감염 OTP 제어에 520 nm의 비율 상대 (미디어 단지, 아니 셀). 전위 (B)와 세포 생존율 (C)의 레벨이 백분율로 표현되는 세 개의 독립적 인 실험에서 OTP 역 형질 감염된 세포 ± 표준 편차 상대적인 의미한다. * p- 값 <0.05; ** p 값이 <0.01; **** p 값이 <0.0001 (쌍, 학생 t의 -test). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 구성 요소 | 집중 |
| 구연산 | 13.4 밀리미터 |
| 구연산 나트륨 | 16.1 밀리미터 |
| 인산 칼륨 | 3.67 밀리미터 |
| 마그네슘 클로라이드 | 1 ㎜ |
| 염화칼슘 | 0.02 밀리미터 |
| 황산 철 | 0.01 밀리미터 |
| 염화나트륨 | 125.4 밀리미터 |
| L 시스테인 | 1.5 밀리미터 |
| neopeptone | 0.1 g / L |
| 카사 미노산 | 2.5 g / L |
| 메틸 베타 사이클로 덱스트린 | 1g / L |
| RPMI | 125 ㎖ / L |
표 1. 구성 요소 필수 1 배 ACCM-2를 확인합니다.
| 목표 농도 | ||||
| 1μM | 5 μM | 10μM | 20 ㎛ | |
| 두더지 시작 | ||||
| 1 nmol의 | 1 ml의 | 200 μL | 100 μL | 50 μL |
| 2 nmol의 | 2 ml의 | 400 μL | 200 μL | 100 μL |
| 5 nmol의 | 5 ml의 | 1 ml의 | 500 μL | 250 μL |
| 10 nmol의 | 10 ml의 | 2 ml의 | 1 ml의 | 500 μL |
| 20 nmol의 | 20 ㎖ | 4 ml의 | 2 ml의 | 1 ml의 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Citric acid | Sigma | C0759 | ACCM-2 medium component |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | ACCM-2 medium component |
| Potassium phosphate | Sigma | 60218 | ACCM-2 medium component |
| Magnesium chloride | Calbiochem | 442611 | ACCM-2 medium component |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | ACCM-2 medium component |
| Iron sulfate | Fisher | S93248 | ACCM-2 medium component |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | ACCM-2 medium component |
| L-cysteine | Sigma | C6852 | ACCM-2 medium component |
| Bacto-neopeptone | BD | 211681 | ACCM-2 medium component |
| Casamino acids | Fisher | BP1424 | ACCM-2 medium component |
| Methyl beta cyclodextrin | Sigma | C4555 | ACCM-2 medium component |
| RPMI + Glutamax | ThermoFisher Scientific | 61870-036 | ACCM-2 medium component |
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | For bacterial culture |
| ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP) | Dharmacon | D-001810-10-05 | Non-targeting control |
| siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool | Dharmacon | M-003290-01-005 | Causes cell death; measure of transfection efficiency |
| siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool | Dharmacon | M-004009-00-0005 | |
| siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool | Dharmacon | M-010388-00-0005 | |
| 5x siRNA buffer | Dharmacon | B-002000-UB-100 | Use sterile RNase-free water to dilute 5x siRNA buffer to 1x siRNA buffer |
| DharmaFECT-1 Transfection Reagent | Dharmacon | T-2001-01 | For transfection |
| Opti-MEM + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | Reduced-serum medium used for transfection |
| DMEM + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 10567-014 | For cell culture and infection |
| Heat-inactivated fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Can use alternate equivalent product |
| DMSO | Sigma | D8418 | For storage of Coxiella strain |
| PBS | For cell culture | ||
| 0.05% Trypsin + EDTA | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | For cell culture |
| dH2O | For dilution of samples and standards for qPCR | ||
| Quick-gDNA Mini Prep | ZYMO Research | D3007 | Can use alternate equivalent product to extract gDNA |
| SensiFAST SYBR No-ROX Kit | Bioline | BIO-98020 | Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM | Invitrogen | K1032 | For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO) |
| Sodium hydroxide | Merck | 106469 | Probenicid solution component |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | 71505 | Probenicid solution component |
| di-Sodium hydrogen orthophosphate | Merck | 106586 | Probenicid solution component |
| Probenicid | Sigma | P8761 | Probenicid solution component |
| DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62251 | Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS. |
| 4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS | Sigma | P6148 | Fixing solution for HeLa 229 cells |
| 25 cm2 tissue culture flask with vented cap | Corning | 430639 | For growth of bacterial strain |
| 96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 3603 | |
| 75 cm2 tissue culture flask with vented cap | Corning | 430641 | For growth of HeLa 229 cells |
| 175 cm2 tissue culture flask with vented cap | Corning | 431080 | For growth of HeLa 229 cells |
| Haemocytometer | For quantification of HeLa 229 cells | ||
| Tear-A-Way 96 Well PCR plates | 4titude | 4ti-0750/TA | For qPCR reaction |
| 8-Lid chain, flat | Sarstedt | 65.989.002 | For qPCR reaction |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bench top microfuge | |||
| Bench top vortex | |||
| Orbital mixer | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | For pelleting bacterial culture |
| Nanodrop | For gDNA quantification | ||
| Mx3005P QPCR machine | Aligent Technologies | 401456 | For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture |
| ClarioSTAR microplate reader | BMG LabTech | For measurement of fluorescence |
References
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