Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Применение флуоресцентного резонанса переноса энергии (FRET) для изучения Эффектор транслокации эффективности путем Published: July 6, 2016 doi: 10.3791/54210
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, University of Melbourne

Summary

Исследование взаимодействия между бактериальными патогенами и их хозяев является важной областью биологических исследований. Здесь мы опишем необходимые методы для измерения эффекторной транслокацию по Coxiella burnetii во время миРНК молчанием генов с использованием Бламу субстрата.

Abstract

Coxiella burnetii, возбудитель лихорадки Ку, является внутриклеточным патогеном , который зависит от типа IV Dot / Icm секреция системы , чтобы создать репликативной нишу. Когорта эффекторов транслоцируются через эту систему в клетку-хозяина, чтобы управлять процессами хоста и позволяют создание уникального лизосом происхождения вакуоли для репликации. Метод, представленный здесь, включает в себя комбинацию двух хорошо известных методов: специфического молчанием генов с использованием миРНК и измерения эффекторной транслокации с использованием FRET на основе подложки, которая опирается на β-лактамазы активности. Применение этих двух подходов, мы можем начать понимать роль факторов хозяина в бактериальной функции системы секреции и эффекторной транслокации. В данном исследовании мы рассмотрели роль Rab5A и Rab7A, как важных регуляторов эндоцитотического пути торговли. Показано, что глушение экспрессию либо белка приводит к снижению эффекторной translocatioп эффективность. Эти методы могут быть легко изменены, чтобы исследовать другие внутриклеточные и внеклеточные патогенные микроорганизмы, которые также используют системы секреции. Таким образом, глобальная картина факторов хозяина, участвующих в бактериальной транслокации эффектора могут быть выявлены.

Introduction

Coxiella burnetii является уникальным внутриклеточным патогеном , который вызывает зоонозных инфицирования человека вирусом лихорадки Ку. Это заболевание связано с широким спектром клинических проявлений , простирающихся от бессимптомной сероконверсией к угрожающей жизни хронической инфекции , которая часто проявляется как эндокардит лет после облучения 1. Человек заражение происходит в основном за счет вдыхания загрязненных аэрозолей с жвачных Главным резервуаром инфекции, в частности, молочных коров, овец и коз. Хотя Coxiella инфекция у этих животных , как правило , субклинический, инфекция может вызвать аборт , и значительная бактериальной нагрузки в родильном жидкости и плаценты может сильно повредить окружающей среде 1. Примером огромное бремя такого загрязнения может иметь на недавно наблюдался как общественного здравоохранения и промышленности сельского хозяйства в Q лихорадки вспышки, произошедшей в Нидерландах 2. Между 2007 и2010, более 4000 случаев заболевания людей лихорадкой Ку был поставлен диагноз , и эта вспышка была связана со значительным загрязнением козьих ферм 3. Кроме того, Coxiella является потенциальным биологическим оружием, по классификации Центров США по контролю и профилактике заболеваний, в связи с экологической устойчивости бактерий и низкой инфекционной дозы , необходимой для возникновения серьезных заболеваемости и смертности 4.

Coxiella существует в двух фазах: Фаза I организмы, выделенные из природных источников, являются чрезвычайно вирулентных и фазовые организмы II являются сильно ослаблена в естественных условиях. Например, после того, как несколько в пробирке пассажей Coxiella burnetii Девять Миля этап I организмов, бактерии II фазы были получены , которые содержат необратимые хромосомные делеции что приводит к укороченной липополисахарида (LPS) 5. Этот штамм, C. burnetii NMII, фенотипически подобна фазе I в моделях тканевой культуры и обеспечивает более безопасный режимл для исследователей для изучения Coxiella патогенеза в лабораториях 5. В последние годы некоторые прорывы быстро продвигались поле Coxiella генетики. В частности, развитие аксенными сред (подкисленной цитрат цистеина среда - ACCM-2) позволил рост клеток , свободных от Coxiella как в жидком , так и на твердых средах 6,7. Это привело к улучшению прямых генетических инструментов , доступных для Coxiella включая индуцибельной системы экспрессии генов, челночных векторов и случайных систем транспозонов 8-11. Совсем недавно, два способа целевой инактивации генов были также разработаны, проложив путь для изучения кандидатов 12 генов вирулентности конкретных.

После интернализации альвеолярными макрофагами, Coxiella размножается до высоких цифр в мембраносвязанного отсек называется Coxiella- содержащий вакуоли (CCV). ККТ требует незаконного оборота хост эндоцитических-йгрубые ранние и поздние эндосомы , пока она не созревает в лизосом происхождения органелл 13. На протяжении всего этого процесса, ККТ приобретает факторы хозяина , которые либо появляются скоротечно или остаются связанными с вакуоль, в том числе, но не ограничиваясь ими, Rab5, Rab7, CD63 и LAMP-1 13-15. Репликация Coxiella внутри клеток - хозяев полностью зависит от полностью функциональной Dot / Icm Тип системы IVB секрецией (T4SS) 8,16,17. Эта система секреции является многослойной структуры белка праязыка , связанные с системами конъюгации и охватывает как бактериальные и вакуолярной мембраны для доставки бактериальные белки, называемые эффекторы, в цитоплазме хозяина 18. Coxiella T4SS функционально очень похож на хорошо охарактеризован тип IVB Dot / Icm секрецией системы легионелл 19,20. Интересно отметить , что активация эффекторной транслокации T4SS и последующее не происходит до тех пор , пока не достигнет Coxiella кислой лизосомы , производныйорганеллы, приблизительно 8 ч после инфицирования 17,21. На сегодняшний день более 130 Dot / ИВМ эффекторы были идентифицированы 9,17,22-24. Многие из этих эффекторов , вероятно , играют важную роль в процессе репликации Coxiella внутри клеток - хозяев; Тем не менее, лишь немногие эффекторы были функционально характеризуется 25-29.

В данном исследовании мы используем анализ транслокации флуоресценции на основе , которая опирается на расщепления субстрата CCF2-AM FRET (далее в качестве субстрата Бламу) через β-лактамазы активности в цитоплазме клетки - хозяина (рис 1). Интересующий ген слит с TEM-1 бета-лактамазы (Бламу) на репортерной плазмидой, которая обеспечивает конститутивную экспрессию. Субстрат Бламу состоит из двух флуорофоров (кумарин и флуоресцеин), которые образуют пару разъедать. Возбуждение результатов кумарина в ладу флуоресцеина и зеленого флуоресцентного излучения в отсутствие эффекторных транслокации; Тем не менее, если Дву-M-эффектор слитый белок транслоцируется в цитоплазме хозяина, в результате β-лактамазы расщепляет деятельности по β-лактам кольцо подложки Бламу, отделяя пары FRET по производству синего флуоресцентное излучение при возбуждении. Этот анализ транслокация было хорошо зарекомендовала себя как подход к идентификации эффекторных белков из ряда различных внутриклеточных и внеклеточных бактерий, в том числе С. burnetii, Л. pneumophila, Л. longbeachae, хламидиоза, энтеропатогенные Е. палочка, сальмонелла и Brucella 17,30-35.

Для определения роли конкретных факторов хозяина на Coxiella эффекторной транслокации мы используем устоявшийся метод молчанием генов , известного как РНК - интерференции, в частности малых интерферирующих РНК (миРНК). Первоначально определены в Caenorhabditis Элеганс, РНК - интерференция является сохраняющимся эндогенный клеточный процесс , используемый для врожденной оборNSE от вирусов, а также регуляции генов 36,37. После связывания последовательности конкретных миРНК, деградация мРНК происходит через RISC (РНК-индуцированного глушителей комплекса) приводит к определенному молчанием генов или бросовой 38. В этом исследовании миРНК был использован для целевой двух белков хозяина, Rab5A и Rab7A, которые являются важными регуляторами эндоцитотического пути. Влияние глушителей Rab5A и Rab7A на эффекторной транслокации было установлено с помощью С. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 был выбран , как это было показано ранее , транслоцироваться системой секреции Дот / Icm из Coxiella 17.

Используя оба миРНК глушителей гена и fluorescencebased анализа транслокации , описанный здесь, мы начинаем установить роль факторов хозяина в транслокации эффекторных белков с помощью Coxiella. Такой подход может быть применен к широкому кругу обеих внутриклеточной и внеклеточной бактерий, которые обладают сходными secretioN системы, отвечающие за транслокацию эффекторных белков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Все процедуры , связанные с ростом или манипулирования Coxiella burnetii RSA439 NMII должны быть выполнены в физическом уровне Контеймент 2 Лаборатория и в кабинете биологической безопасности в соответствии с местными правилами. Принципиальная схема обратной трансфекции и транслокации анализа рабочего процесса , описанного ниже, показан на рисунке 2.

1. Приготовление C. burnetii Культура Выражая CBU0077 слитую с бета-лактамазы (pBlaM-CBU0077) (1 день)

  1. Подготовка 1X ACCM-2 6:
    1. Смешайте компоненты , перечисленные в таблице 1. Отрегулируйте рН до 4,75 с 6 М NaOH и фильтр стерилизовать (не автоклав). ACCM-2 стабилен в течение приблизительно трех недель хранили при 4 ° С.
  2. Сформировать C. запасы burnetii pBlaM-CBU0077.
    1. Заражайте HeLa 229 клеток с C. burnetii штамм переноски pBlaM-CBU0077 и проход до большого vacuolЕ. С. наблюдаются в большинстве клеток.
      1. Растут C. burnetii штамм , несущий pBlaM-CBU0077 в 20 мл ACCM-2 , содержащей 3 мкг / мл хлорамфеникола в 75 см 2 для тканевой культуры колбы с вентилируемой крышкой в течение 7 дней при температуре 37 ° С в 5% CO 2, 2,5% O 2.
      2. Центрифуга C. burnetii pBlaM-CBU0077 культуры при 15000 х г в течение 15 мин при комнатной температуре.
      3. Повторно приостанавливать осадок в 20 мл DMEM + 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), + 3 мкг / мл хлорамфеникола (техническое обслуживание средств массовой информации). Удалить носитель из 50% сливающийся 75 см 2 колбы клеток HeLa 229. Добавить ресуспендировали C. burnetii в клетках HeLa 229. Инкубировать в течение 2 -х дней при температуре 37 ° С в 5% CO 2 , чтобы позволить инфекции клеток HeLa , 229 , чтобы установить.
      4. Сплит клеток в 175 см 2 колбу с тканевой культурой.
        1. Удалите носитель из колбы 75 см 2 и промывают монослой дважды 10 мл подогретого PBS.
        2. Добавить 1 мл оF 0,05% трипсин-ЭДТА и место клетки при 37 ° C + 5% CO 2 в течение 3 - 5 мин , чтобы отделить клетки.
        3. Повторное приостановить клеток в 10 мл поддерживающей сред. Добавьте 2 мл взвешенное клеток в 175 см 2 колбу , содержащую 38 мл поддерживающей сред.
        4. Инкубируют при 37 ° С в 5% CO 2 в течение 3 - 5 дней до 100% конфлуэнтности пока не будет достигнуто и наблюдаются большие вакуоли.
    2. Собрать супернатанта от 2 см колбу 175, добавляют 10 мл дН 2 O , чтобы покрыть инфицированные клетки HeLa 229 и инкубировать в течение 15 мин для лизиса инфицированных клеток.
    3. Объединить супернатанта и подвергали лизису клеток и осадок при 15000 х г в течение 15 мин при комнатной температуре.
    4. Повторное приостановить осадок в 10 мл дН 2 O. Клетки Lyse далее неоднократно проходя ресуспензию через 23G иглы, прикрепленной к шприц объемом 10 мл, по меньшей мере в 20 раз. Гранула при 500 х г в течение 5 мин для удаления остатков клеток.
      5. <Li> Удалить и осадок супернатант при 15000 & bull ; g в течение 15 мин при комнатной температуре , чтобы собрать C. burnetii.
    5. Повторное приостановить C. burnetii в DMEM + 10% FCS и количественного определения количества бактерий в соответствии с 4. Разбавить до 1 × 10 9 геномов / мл с использованием DMEM + 10% FCS + 10% диметилсульфоксид (ДМСО), аликвоты 50 акций мкл в микроцентрифужных пробирках и хранят при -80 ° С.
  3. Привить 10 мл подогретого ACCM-2 , содержащей 3 мкг / мл хлорамфеникола с 20 мкл C. burnetii pBlaM-CBU0077 штамм 17 (из запасов , образующихся в 1,2 хранили при -80 ° С) в 25 см 2 тканевой культуры колбы с вентилируемой крышкой. Grow бактериальной культуры в течение 7 дней при температуре 37 ° С в 5% CO 2, 2,5% O 2.

2. Обратный Трансфекция киРНК и обсеменения HeLa 229 клеток (День 4)

  1. При использовании экспериментальной Серна впервые приготовитькиРНК следующим образом:
    1. Кратко центрифугировать лиофилизированный миРНК, чтобы гарантировать, что миРНК осадок собирают в нижней части трубы.
    2. Повторное приостановить Осажденный миРНК до конечной концентрации акций 20 мкМ пипеткой соответствующий объем 1x миРНК буфера (таблица 2).
    3. Пипетировать раствор вверх и вниз 3 - 5 раз перемешать и место на орбитальном смесителе в течение 30 мин при комнатной температуре, переворачивая пробирку каждые 5 - 10 мин.
    4. Кратко отцентрифугировать пробирку для того чтобы обеспечить миРНК собирается в нижней части трубы.
    5. Алиготе миРНК в 50 мкл аликвоты в микроцентрифужных труб и хранить при температуре -20 ° С, пока не требуется.
    6. Для создания 1 мкМ рабочих концентрацию миРНК, пипетка 950 мкл 1X буфера миРНК в 50 мкл аликвоты запаса (20 мкМ) в случае необходимости. Примечание: Эта 1 мкМ рабочая концентрация может быть сублимацией оттаивали несколько раз для повторных трансфекциях.
  2. Поместите DMEM + 10% FCS,; 0,05% трипсин-ЭДТА и PBS, в С водяной бане при 37 ° (или эквивалент) в течение 30 мин, чтобы нагреть перед использованием.
  3. Получение компонентов трансфекции:
    Примечание: Следующий протокол был оптимизирован для HeLa 229 клеток в 96-луночного микропланшета с черными стенами и плоской, прозрачным дном. Оптимизация количества реагента для трансфекции, концентрация миРНК и высева плотность клеток могут быть необходимы для различных клеточных линий.
    1. Для каждой лунки, используют 0,1 мкл реагента для трансфекции, 15,9 мкл уменьшенного сыворотки среда (минимальной основной среде , используемой для трансфекциях, обратитесь к таблице материалов) и 4 мкл 1 мкМ миРНК ( что приводит к конечной концентрации киРНК 40 нМ). Используйте отдельные микроцентрифуге трубки для OTP, PLK1, Rab5A и Rab7A. Измерьте каждое условие анализа в трех экземплярах. Пример компоновки пластины 96-луночного показана на рисунке 3.
      Примечание: Этот протокол включает в себя использование двух элементов управления: OTP и PLK1. ОТРсостоит из четырех объединенных миРНК, которые были оптимизированы для уменьшения вне цели эффектов и, таким образом, ОТР используют в качестве отрицательного, ненацеливании контроля. Зашифрованный миРНК также могут быть использованы в качестве отрицательного контроля. Потеря результатов экспрессии PLK1 в обширной гибели клеток в ряде клеточных линий путем индукции проапоптотического путей и, следовательно, PLK1 миРНК используется в качестве положительного контроля для трансфекции, где гибель клеток коррелирует эффективность трансфекции.
      1. Для каждой экспериментальной миРНК трансфекции, объединить 0,4 мкл реагента для трансфекции и 63,6 мкл с пониженным содержанием сыворотки среды в отдельной пробирке. Мешалке все микроцентрифуге трубки и позволяют компоненты комплекса в течение 5 мин при комнатной температуре.
      2. Добавить 16μl каждой экспериментальной миРНК к соответствующим микроцентрифужных пробирки, содержащие комплекс трансфекцию. Vortex и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре. Примечание: Важно, чтобы не превышать 30 мин, так как эффективность трансфекции будет уменьшаться.
  4. В течение 20 мин вклubation (2.3.1.2) добавляют 20 мкл реагента для трансфекции + уменьшенного сыворотки среды + миРНК смесь в соответствующие лунки стерильный черный, плоский прозрачным дном лотка 96-луночного.
  5. Как только 20 мин инкубационный период завершается, семена HeLa 229 клеток при плотности 3,92 × 10 3 клеток / лунку.
    1. Урожай HeLa 229 клеток из сливного или суб-сливающийся 75 см 2 для тканевой культуры колбы в предварительно нагретый DMEM + 10% FCS , и повторно приостанавливать клеток до конечной плотности 4,9 × 10 4 клеток / мл в соответствии со стандартными методами. Для того, чтобы обеспечить трансфекцию эффективность не скомпрометированы, подготовить клетки в течение 20 - минутного периода инкубации (2.3.1.2).
      1. Промыть монослой HeLa 229 клеток дважды 10 мл подогретого PBS.
      2. Добавьте 1 мл 0,05% раствора трипсина-ЭДТА и место HeLa 229 клеток при 37 ° С + 5% CO 2 в течение 3 - 5 мин , чтобы отделить клетки.
      3. Сбор клеток в 9 мл подогретого DMEM + 10% FCС. Граф клеток с использованием гемоцитометра и подготовить клетки к конечной плотности 4,9 × 10 4 клеток / мл с использованием DMEM + 10% FCS.
    2. Пипеток 80 мкл HeLa 229 клеток при плотности 4,9 × 10 4 клеток / мл в каждую лунку , которая содержит трансфекцию реагент + уменьшенного сыворотки среда + миРНК смесь. Это соответствует плотности клеток 3,92 × 10 3 клеток / лунку.
      Примечание: вычитание фона требуется для подложки Бламу.
      1. Не добавляйте клетки или миРНК в "пустые" скважины (рисунок 3). Вместо этого добавьте 80 мкл DMEM + 10% FCS этих скважин, установленных в трех экземплярах.
    3. Инкубируют в течение 24 ч при 37 ° С + 5% CO 2.

3. Изменение СМИ (ДЕНЬ 5)

  1. Через 24 часа, удалите носитель с помощью многоканального адаптера, присоединенную к источнику вакуума или вручную с помощью многоканальной пипетки, и заменить 100 мкл свежей prewarmред DMEM + 10% FCS.
  2. Инкубируют в течение еще ​​48 ч при 37 ° С ± 5% CO 2.
  3. На данный момент, проверить жизнеспособность клеток визуально с использованием стандартного светового микроскопа. Если обратный трансфекция была успешной, значительная гибель клеток будет наблюдаться в лунках, содержащих Plk1 миРНК по сравнению с OTP миРНК.

4. Количественное Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 штамма с использованием КПЦР (ДЕНЬ 7)

  1. После 7 дней роста в ACCM-2 при 37 ° С в 5% СО 2, 2,5% O 2 (1,3), центрифугировать 10 мл C. burnetii pBlaM-CBU0077 культуры при 15000 х г в течение 15 мин при комнатной температуре.
  2. Повторное приостановить бактериальных гранул в 10 мл подогретого DMEM + 10% FCS. Готовят в соотношении 1:10 и 1: 100 разведени культуры (образца) с использованием дН 2 O.
  3. Настройте компоненты, необходимые для кПЦР.
    Примечание: извлечение гДНК может быть выполнена заранее и хранить при температуре от -20 ° C UNTтребуется ил.
    1. Подготовка стандартов:
      1. Экстракт GDNA из Coxiella burnetii RSA439 NMII штамма дикого типа , выращенных в ACCM-2 при 37 ° С в 5% CO 2, 2,5% O 2 в течение 7 дней с использованием набора для экстракции GDNA, в соответствии с инструкциями изготовителя.
      2. Измеряют концентрацию GDNA (г / мкл) с использованием NanoDrop (или эквивалент) при поглощении 260 нм.
      3. Подсчитайте количество геномных копий на мкл с использованием следующей формулы ниже, и преобразование в несколько геномов / мл.
        Уравнение
      4. Регулировка количества геномов / мл до 10 9 / мл (в конечном объеме 100 мкл) в новой пробирке с использованием дН 2 O. Это может быть кипятили в течение 10 мин и хранили при -20 ° С до тех пор, пока требуется.
      5. В день инфицирования, генерировать 10-кратных серийных разведений 10 8 геномов / мл до 10 5 геномов / мл из 10 9 геномаs / мл запаса.
        1. Пипетка 10 мкл 10 9 геномов / мл в 90 мкл дН 2 O для создания 10 8 геномы / мл. Vortex перемешать. Пипетка 10 мкл 10 8 геномов / мл в 90 мкл дН 2 O для создания 10 7 геномы / мл. Vortex и повторить до 10 5 геномов / мл.
    2. Настройка реакции КПЦР. Создание мастер-микс для 25 скважин для учета любых ошибок при использовании пипеток. Для каждой лунки, используйте 10 мкл КПЦР Master Mix; 2 мкл смеси праймера ОмПО (4.3.2.2) и 3 мкл дН 2 O.
      Примечание: OmpA представляет собой внешний мембранный белок С. burnetii '39 и блок 82-пар оснований в пределах высококонсервативной области был выбран для применения в качестве зонда , как было описано выше 40.
      1. Настройка каждого стандарта (Dh 2 O, 10 5, 10 6, 10 7, 10 8, 10 9 геномов / мл) и образец (1:10 и разведение 1: 100) в 96-луночный ПЦР отторгнуть пластину (не огибать) в двух экземплярах или трех экземплярах, соответственно. Добавьте 5 мкл образца или стандарта в соответствующие лунки.
      2. Использование дН 2 O, разбавить как OmpA прямого праймера (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') и обратного праймера , OmpA (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') до конечной концентрации 4 мкМ и комбинируются в то же пробирке.
        Примечание: Смесь праймер OmpA можно приготовить заранее и хранить при -20 ° С до тех пор , пока требуется.
      3. Объединить 250 мкл КПЦР Master Mix, 50 мкл смеси ОмПО праймера, 75 мкл дН 2 O и вихревую перемешать. Добавьте 15 мкл этой основной смеси в лунки, содержащие либо стандарты или образцы.
      4. Поместите 8-крышки ПЦР стрип крышки на соответствующие лунки и импульсной центрифуге пробирки для ПЦР, чтобы убедиться, что все собранные в нижней части труб.
      5. Настройте следующую программу на количественной ПЦР маскула: 50 ° С в течение 2 мин, 95 ° С в течение 10 мин, а затем 45 циклов при 95 ° С в течение 1 сек и 60 ° C в течение 20 сек (рис 4а).
    3. Анализ Ct (пороговый цикл) значения из кПЦР:
      1. Передача значения Ct в электронную таблицу с помощью функции экспорта программы.
      2. Создайте диаграмму рассеяния стандартов 10 5 геномов / мл до 10 9 геномов / мл (выраженное в виде значений LOG). Откажитесь от любых явных выбросов среди трех образцов. Генерация логарифмической трендовая и определить уравнение графика.
      3. Подсчитайте общее количество геномов / мл в образце с использованием уравнения генерируемый в 4.3.3.2. Не забудьте учесть первоначального разведения (1:10 и 1: 100) образцов.

5. Инфекция обратного трансфицированных клеток (ДЕНЬ 7)

  1. После расчета суммарных геномы / мл в C. репейникnetii pBlaM-CBU0077 культуры , которые будут использоваться для инфекции, скорректировать ресуспендировали бактериальной культуры , чтобы инфицировать клетки при MOI 300 в конечном объеме 50 мкл / лунку с использованием предварительно нагретые DMEM + 10% FCS.
    Примечание: ожидаемая плотность посеянных клеток HeLa 229 с нормальным временем удвоения после 72 ч составляет 3,136 × 10 4 клеток / лунку. Количество бактерий , необходимых для инфицирования при MOI 300 составляет 9.408 × 10 6 в 50 мкл, что эквивалентно 1,88 × 10 8 бактерий / мл.
    1. Используя значение , вычисленное из КПЦР (геномов / мл) (4.3.3.3), разбавить ресуспендировали бактерий с использованием предварительно нагретого DMEM + 10% FCS , в конечном объеме 2 мл , чтобы инфицировать обратные трансфецированных клеток.
  2. Удалите существующий носитель из заготовки и обратного трансфицированных клеток.
  3. Добавляют 50 мкл разведенных бактерий (1,88 × 10 8 бактерий / мл) в соответствующие лунки. Добавляют 50 мкл DMEM + 10% FCS к обоим заготовкой и Uninfected скважин.
  4. Инкубируют в течение 24 ч при 37 ° С + 5% CO 2.

6. Добавление Бламу субстрата для определения уровня транслокации (ДЕНЬ 8)

  1. Подготовка решения для Бламу субстрата раствором 6х нагрузки.
    Примечание: раствор А, В и С представлены в наборе подложки Бламу (обратитесь к таблице материалов). Раствор B может образовывать осадок при комнатной температуре. Подогрейте этот раствор до 37 ° C перед использованием и осадок должен раствориться.
    1. При использовании набора в первый раз, добавьте 185 мкл ДМСО (поставляется с комплектом подложки Бламу) в высушенном Solution A. Затем сохраните ресуспендировали растворе при -20 ° C.
    2. Приготовьте 0,1 М раствора пробеницида заранее и хранить в аликвоты объемом 1 мл при температуре от -20 ° С до тех пор, пока требуется.
      1. Приготовьте 0,4 М NaOH (1,6 г в 100 мл дН 2 O).
      2. Подготовьте 100 мМ Na фосфатный буфер с рН 8 (1,56 г NaH 2 PO 4 · 2H 2 HPO 4 в 100 мл дН 2 O).
      3. Растворить 1,25 г пробеницида в 22 мл 0,4 М NaOH при интенсивном перемешивании.
      4. Добавить 22 мл 100 мМ Na фосфатный буфер с рН 8 (раствор будет мутнеть) и перемешивают для растворения осадка, который образуется.
      5. Доводят рН до 8 (при необходимости) с помощью 1 М NaOH / HCl.
      6. Перемешать энергично и тепло мягко (<50 ° С) до тех пор, пока раствор не станет в основном ясно.
      7. Фильтр (0,2 мкм размер пор) и аликвоты в объеме 1 мл. Храните аликвоты при -20 ° C.
  2. Для каждой лунки, используйте 0,06 мкл раствора А, 0,54 мкл раствора В, 7,9 мкл раствора C и 1,5 мкл 0,1 М пробеницида. Создание мастер-микс для 30 лунок сначала комбинированием 1,8 мкл раствора А и 16,2 мкл раствора B вместе в пробирке. Хорошо перемешать с помощью вихря. Добавьте 237 мкл раствора С и 45 мкл 0,1 М пробеницида. Vortex объединить все Componenц.
    Примечание: 6х загрузки раствор стабилен в течение до 4 ч (в темноте), но должны быть готовы как можно ближе перед использованием.
  3. Добавьте 10 мкл 6х погрузочной раствора непосредственно во все заготовки и реверс трансфицированных скважин без удаления существующих средств массовой информации.
  4. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 2 ч в темноте.
  5. Для того, чтобы определить уровень транслокации, определения количества флуоресценции с использованием микропланшет-ридера.
    Примечание: Следующая процедура является специфическим для читателя ClarioSTAR микропланшетов. Эквивалентные читатели микропланшетов также могут быть использованы.
    1. Создать новый протокол интенсивности флуоресценции с использованием конечной точки в режиме чтения.
    2. Настройте основные параметры следующим образом:
      1. Выберите 96-луночный микропланшет.
      2. Под оптическими параметрами, выберите 2 multichromatics со следующими пользовательскими настройками: (1) Входной 410-10 нм возбуждение и излучение 520-10 нм. (2) Ввод 410-10 нм возбуждения и эмиссии 450-10 нм. Обеспечить хорошо стьichromatics выбран.
      3. Выберите орбитальную усреднение с диаметром 3 мм.
      4. Под оптикой, выберите нижний оптический элемент.
      5. По скорости и точности, выберите точный. Это соответствует восьми регионов на лунку.
    3. Отрегулируйте расположение пластины, выбрав соответствующие лунки в качестве образцов.
    4. Выберите измерение начало.
    5. Снимите крышку и поместите лоток в ридере. Для того, чтобы избежать достижения максимальных значений флуоресценции, убедитесь, что значение коэффициента усиления регулируется. Для этого выполнить регулировку усиления на одном из зараженных колодцев, которая была обратной, трансфицированных OTP миРНК. Это соответствует самой высокой ожидаемой транслокации.
    6. Выберите измерение начинают измерять все соответствующие лунки с использованием донных флуоресценции при возбуждении 410 нм и эмиссии как 450 нм и 520 нм для синего и зеленого свечения, соответственно.

7. Анализ результатов:

  1. Рассчитать отношение450 нм до 520 нм (синий на зеленый) для всех образцов следующие сокращения пустой и выразить по отношению к неинфицированным образца OTP.
    Примечание: следующие шаги анализа предназначены для простой программы электронных таблиц.
    1. Используя функцию экспорта на планшет - ридере, передавать необработанные значения флуоресценции , полученные как для 520 нм и 450 нм длиной волны излучения (6.5) в электронную таблицу.
    2. Вычислить среднее значение "пустой" чтений (СМИ только, без клеток) для 520 нм, добавляя сырые 520 нм значения флуоресценции и деления на количество скважин (3). Повторите, используя пустые 450 нм значения. Эти значения представляют фоновой флуоресценции из-за 96-луночного планшета и средств массовой информации.
    3. Вычтите фоновой флуоресценции. Используя значения , полученные в 7.1.2 вычесть среднее заготовки 520 нм от всех значений нм флуоресценции образца 520. Повторите эти действия для значений 450 нм.
    4. Чтобы получить 450: соотношение 520 нм использовать пустые скорректированных значений (7.1.3). Разделите каждый образец 450 нм значение флуоресценции его соответствующим 520 нм значение.
    5. Вычислить среднее значение неинфицированных значений отношения КАП путем добавления 450: значения соотношения нм 520 (от 7.1.4) и деления на количество скважин (3).
    6. Рассчитывают соотношение количества образцов по отношению к неинфицированным OTP путем деления 450: 520 нм соотношение , рассчитанное в 7.1.4 в среднем неинфицированных значения отношения ОТП вычисленной в 7.1.5.

8. Добавление ядер Stain, чтобы определить после сотового телефона транслокации анализа (ДЕНЬ 8)

  1. После количественного определения флуоресценции, удалите носители, содержащие 6х решение загрузки из всех скважин с использованием либо адаптера многоканального подключенного к источнику вакуума или вручную с помощью многоканальной пипетки.
  2. Добавляют 50 мкл 4% раствора PFA (параформальдегид)в PBS, чтобы все соответствующие лунки для фиксации клеток. Инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин.
  3. Удалить 4% раствора PFA PBS (согласно 8.1) и мыть клетки дважды с 75 мкл PBS.
  4. Добавляют 50 мкл клеточной проницаемой, окрашивающий ядра, например, DAPI (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол), в каждую лунку. Получение изображений с помощью флуоресцентного микроскопа и количественного определения количества ядер , присутствующих в каждую лунку после лечения миРНК с использованием соответствующего программного обеспечения для анализа изображений, таких как ImageJ 41.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для этого исследования, C. burnetii pBlaM-CBU0077 штамм был выбран в качестве CBU0077 было ранее показано, что транслокация эффектор системы 17 секреции Coxiella Дот / ICM. До инфекции, общее количество геномов / мл в семидневный C. burnetii pBlaM-CBU0077 культуры был причислен использованием КПЦР. Рисунок 4 демонстрирует пример порогового цикла (Ct) значения ожидаются от обоих стандартов и образцов следующих кПЦР. Значения Ct (представлены графически в Amplification Plot (рис 4В) и численно (рис 4C)) были экспортированы и анализировали , как описано в 4.3.3. На основе репрезентативных данных , показанных, были 2,31 × 10 8 геномов / мл в 10 мл ресуспендировали бактериальной культуры (рис 4D). Для создания соответствующего бактериального разбавления (1,88 × 10 8 геномов / мл яN 2 мл), 1,63 мл ресуспендировали бактерий добавляют к 370 мкл свежей, подогретого DMEM + 10% FCS. Клетки обратной трансфицированные миРНК впоследствии были инфицированы C. burnetii pBlaM-CBU0077 при MOI 300 в течение 24 часов.

После инкубации обратной трансфицированные инфицированных клеток с Бламу субстратной квантификации эффекторной транслокации может быть определена с помощью флуоресцентном счетчике пластины. После анализа , как описано в 7, все значения отношения , которые были нормированы к неинфицированных OTP также могут быть нормализованы к зараженному OTP. Уровень эффекторной транслокации после глушителей генов-хозяев могут быть сгруппированы в три исхода после того, как по сравнению с зараженным контролем OTP: (1) Без изменений; (2) Увеличение эффекторной транслокацию; (3) Снижение эффекторной транслокации. Последующий статистический анализ, например, Т - критерий Стьюдента, может быть использован , чтобы определить значимость любого наблюдаемого разности Тто зараженных контроль OTP. В результате глушителей либо Rab5A или Rab7A на эффекторной транслокации из трех независимых экспериментов показано на рисунке 5А. Значительное снижение уровня Бламу-CBU0077 транслокации произошло во время глушителей обоих Rab5A и Rab7A по сравнению с контролем OTP (значение р = 0,0088 (Rab5A) и р = 0,0059 значение (Rab7A), парного, критерий Стьюдента). Было также установлено, влияние лечения миРНК на жизнеспособность клеток. После анализа транслокации, клетки фиксировали, окрашивали красителем ядер и впоследствии количественно. Как показано на рисунке 5С, хотя лечение с помощью либо Rab5A или Rab7A приводит к снижению жизнеспособности клеток по сравнению с контрольными OTP (12% и 31%, соответственно), это снижение не столь сильным , как PLK1 (97%), ген известного вызывает гибель клеток (величина р = 0,0102 (Rab5A); значение р = 0,0081 (Rab7A); значение р <0,0001 (PLK1), парные, Стьюдента-тест). Эти результаты показывают, как заставить замолчать хозяина GEуказанные в другом месте с помощью миРНК может отрицательно изменить уровни бактериальной транслокации эффектора.

Рисунок 1
Рисунок 1. Механизм действий Бламу субстрата во время инфекции. C. burnetii усвоена клетками - хозяевами и образует лизосом полученный вакуоль называется катио- вакуоль Coxiella. 24 ч после заражения, клетки загружаются с мембраной проницаемой Бламу субстрат , который обладает двумя флуорофоров , образующие FRET пары (А). При отсутствии β-лактамазы т.е. не транслокации эффектора Бламу-CBU0077, возбуждение кумарина в 410 нм приводит к FRET флуоресцеина, наблюдаемые в качестве зеленого флуоресцентного сигнала (520 нм) (В). В случае функциональной системы секреции Дот / ICM, слитый белок Бламу-CBU0077 будет транслокации в клетку - хозяина и клсвеса субстрат Бламу, с помощью β-лактамазы активности, в результате чего разделение двух красителей и приводит к нарушению FRET и сигнал синего флуоресценции (450 нм) после возбуждения при 410 нм (C). Оба зеленого и синего сигнала флуоресценции может быть детектируют с использованием флюоресцентный пластины. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
. Рисунок 2. Схема Обзор обратного Трансфекция и транслокации пробирной Workflow День 1: Подготовьте C. burnetii pBlaM-CBU0077 культуры 4 -й день:. Обратный использованием трансфекции 40 нМ миРНК и семян HeLa 229 клеток в конечной плотности 3,92 × 10 3 клеток / лунку в лоток 96-луночного 5 -й день: Ch.Анж СМИ 7 -й день:. Количественно суммарные геномов / мл C. burnetii pBlaM-CBU0077 культуры с использованием КПЦР и впоследствии заражает обратной трансфекции клеток с MOI 300. 8 -й день:. Добавить краситель 6х загрузки, измерения флуоресценции и количественного определения количества клеток Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. 96-луночного планшета Макет используется для настройки реверса Трансфекция и обсеменения HeLa 229 клеток. "Белые" скважины (показаны красным цветом) содержат только средства массовой информации и не нуждаются в добавление либо миРНК или HeLa 229 клеток. OTP миРНК (показано на светло-голубой для неинфицированных колодцев и темно-синего цвета для зараженных скважин) используется в качестве ненацеливании контроля, так как она была оптимизирована дляимеют меньше от ворот эффектов. Темно-бордовый и зеленые скважины представляют собой Rab5A и Rab7A миРНК, соответственно. PLK1 миРНК (показаны желтым цветом) используется в качестве меры эффективности трансфекции , как потеря экспрессии PLK1 может вызвать проапоптотического пути и обширную гибель клеток в подавляющем большинстве клеточных линий. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Представитель КПЦР Ct значения , используемые для количественной оценки общего числа геномов / мл в C. burnetii pBlaM-CBU0077 Культура. (A) Условия цикла , используемые в кПЦР перечислить количество геномов / мл в Coxiella культур. Значения Ct для обоих стандартов и образцов представлены в графическом (B) и числовой (C)форматов. (D) Стандартные значения Ct были усреднены, рентгенографического и логарифмическая линия тренда была рассчитана. Используя уравнение и средние значения выборки Ct значения общее количество геномов / мл в C. burnetii pBlaM-CBU0077 культура была определена как 2,31 × 10 8. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Транслокация дот / Icm Эффектор Бламу-CBU0077 во миРНК глушителей Rab5A и Rab7A. HeLa 229 клеток обратной трансфицировали siРНК , специфичную Rab5A (бордовые бар), Rab7A (зеленые столбики), OTP (синие полосы) или PLK1 (желтые столбцы) и инкубировали в течение 72 ч перед инфицированием с C. штамм burnetii pBlaM-CBU0077 при MOI 300 в течение 24 ч. После того, как тон добавление субстрата Бламу флуоресценцию измеряли с использованием микропланшет - ридера (А) В таблице показано , необработанные значения флуоресценции , полученные из одного эксперимента наряду с 450:. 520 нм коэффициент по отношению к неинфицированным управления ОТР после вычитания пустых значений (медиа только нет клеток). Уровень транслокации (B) и жизнеспособность клеток (С) представлены в виде процентного среднее значение ± стандартное отклонение по сравнению с ОТР реверсивных трансфицированных клеток , инфицированных из трех независимых экспериментов. * Значение р <0,05; ** Р-значение <0,01; **** Р-значение <0,0001 (парный, Стьюдента -test). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Компонент концентрация
лимонная кислота 13,4 мМ
цитрат натрия 16.1 мМ
фосфат калия 3,67 мМ
хлорид магния 1 мМ
хлорид кальция 0,02 мМ
сульфата железа 0,01 мм
хлористый натрий 125,4 мМ
L-цистеина 1,5 мМ
neopeptone 0,1 г / л
казаминокислот 2,5 г / л
метил бета-циклодекстрин 1 г / л
RPMI 125 мл / л

Таблица 1. Компоненты , необходимые для создания 1x ACCM-2.

Таблица 2. Объем буфера миРНК 1x Требуется для Hydrating лиофилизированных миРНК до соответствующей концентрации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Секреция систем, а также бактериальные эффекторные белки эти транспортные системы в цитоплазму клеток-хозяев, являются важным компонентом вирулентности, что многие патогенные бактерии используют для установления инфекции в уникальных репликативному ниш. В центре внимания многих исследовательских групп было исследовать взаимодействие между бактериальными эффекторов и белков хозяина и влияние эти эффекторы оказывают на хост-клеточных путей. Очень ограниченные исследования, если таковые имеются, изучило потенциал для белков хозяина, необходимы для успешной бактериальной транслокации эффектора.

В данном исследовании мы использовали облигатными внутриклеточными патогена Coxiella burnetii, возбудитель зоонозных лихорадки Ку. После вступления в клетки - хозяева, то -содержащие вакуоль Coxiella пассивно не сбывает через каноническое эндоцитотического пути до достижения кислотного лизосом происхождения вакуоль, где он тиражирует очень большое число. Помимо принятия ADVANTAGE нормального пути торговли хозяина, способность Coxiella создать успешный репликативной нишу также опирается на систему функционального типа секреции IVB (T4SS) и последующего эффектора транслокации 8,17. Эта система секреции функционально аналогичны хорошо охарактеризованного Dot / Icm T4SS легионелл. Об этом наглядно продемонстрировал, дополняя конкретные дот / ИВМ мутанты Legionella с соответствующими генами Coxiella 19,20. Хотя T4SSs обоих Legionella и Coxiella имеют важное значение для репликации, сроки , когда эти системы активируются довольно сильно отличается и отражает расходящийся характер их соответствующих репликативному ниш. Legionella T4SS запускается сразу же после контакта с клетками - хозяевами и быстрой транслокации эффекторов позволяет бактерии , чтобы избежать эндосом-лизосом путь по умолчанию , и вместо того, чтобы создать уникальный ЭР-производных репликативной в вакуумеле 42. В противоположность этому , T4SS из Coxiella не активирован до приблизительно 8 ч после инфицирования, после того, как бактерии достигают кислой лизосомы полученный вакуоль 21.

Учитывая , что Coxiella пассивно проходит через эндоцитотического пути и системы транслокации не активируется до тех пор , пока не достигнет лизосому, уникальная возможность представляет себя использовать Coxiella в качестве инструмента для изучения эндоцитических созреванию. Требование ССГ, чтобы стать подкисляют до того эффекторы транслоцируются указывает на то, что ряд принимающих белков имеют важное значение для транслокации эффекторных белков в цитоплазме хозяина, в частности, но не ограничиваясь ими, белки, участвующие в пути эндоцитоза торговли. Использование миРНК в определенном целенаправленным образом мы можем приступить к выяснению роли отдельных белков принимающих на эффекторной транслокации. В этом исследовании мы сосредоточились на двух белков, которые регулируют эукариотической эндоцитических traffickiнг пути, и , следовательно , были предсказаны для осуществления транслокацию Coxiella эффекторной CBU0077. Rab5A и контроль Rab7A слияние мембран с ранних и поздних эндосом, соответственно. Silencing либо из этих белков с помощью киРНК приводит к значительному снижению эффективности транслокации CBU0077 по сравнению с контролем ОТР миРНК (Фиг.5В). Представительные результаты , представленные здесь , отражают наши предыдущие выводы , опубликованные 21 и обеспечить дальнейшее подтверждение важности этих человеческих Rab белков к Coxiella эффекторной транслокации. Этот метод также был использован для характеристики влияния других процессов узла на Coxiella Dot / Icm эффекторной транслокации. Ретромер комплекс оказался важным для внутриклеточной репликации Coxiella. По глушителей ретромер компонентов, с помощью миРНК, а затем проведение анализа транслокации мы могли бы показать, что ретромер требуется создать среду, индуцирующийCoxiella эффектор транслокация 43.

Хотя представительные результаты, показанные здесь сравнение между зараженным управлением OTP и миРНК ориентации Rab5A и Rab7A, протокол может быть изменен в соответствии с экспериментальными потребностями. Например, уровень эффекторной транслокации также может быть по сравнению с клетками, трансфицированных зашифрованным миРНК или не-трансфицированных клеток.

В центре внимания данного конкретного исследования был облигатным, внутриклеточный патоген C. burnetii и белки , участвующие в эндоцитотическом оборота, однако, способы , описанные в пределах могут быть легко адаптированы к другим внутриклеточным и внеклеточным патогенных микроорганизмов , которые используют системы секреции для вирулентности. Действительно, анализ на основе флуоресцентной транслокация , которая опирается на β-лактамазы активности в цитоплазме хозяина , используемой здесь, уже широко используется в целом ряде патогенных микроорганизмов 30-32,35,44. Естественно, что условия инфекцияспецифические клеточные линии, используемые должны быть адаптированы с учетом требований заражения специфических бактерий. Кроме того, известный эндогенный эффектор, слитый с бета-лактамазу, имеет первостепенное значение для успеха методов, описанных в. Одним из важных моментов для успешного осуществления протокола объясняется здесь является влияние глушителей определенную цель хозяина может оказать на бактериальной записи и последующей репликации. Здесь эффектор транслокации по Coxiella измеряется 24 ч после инфицирования. В этом случае, а также для других внутриклеточных бактерий, способность организма, чтобы получить вход в клетки-хозяева имеет жизненно важное значение. Кроме того, специфический ген глушителей может также влиять на бактериальную репликацию поэтому изменение уровня транслокации наблюдается. Подтверждение того, что миРНК глушителей не оказывает существенного влияние на бактериальную запись и / или репликации, а следовательно, эффективность транслокации, может быть достигнуто с использованием либо микроскопии или подсчитывать их бактерий. транслокацииданные могут быть стандартизированы по количеству зараженных клеток на лечение миРНК. Бактериальный репликации не приводил в замешательство данные , представленные здесь , как Coxiella проходит практически без репликации в течение инкубационного периода 24 ч.

Этот метод требует эффективной трансфекции миРНК в клетки-хозяева, чтобы обеспечить достаточную сайленсинг представляющего интерес гена. С учетом этого, выбор правильного реагента для трансфекции является чрезвычайно важным. Помимо реагента и условий, используемых в данном исследовании, которая оптимизирована для HeLa 229 клеток, существует множество других реагентов для выбора. Нокдаун эффективность использования различных реагентов трансфекции может быть определена количественно с использованием RT-КПЦР чтобы гарантировать, что выбран как наиболее подходящим реагентом и что миРНК выбран избирательно действующий на расшифровку интерес. Хотя это и не представлены в данном исследовании, ранее мы показали нокдаун эффективность как Rab5A и Rab7A с помощью RT-qPCR 21. Кроме того, использование антител против целевого интереса и подтверждения Вестерн-блот может также подтвердить миРНК глушителей конкретных целей.

Два других важных соображений, чтобы принять во внимание при использовании миРНК включают возможность вне целевых эффектов и жизнеспособность клеток трансфицированных клеток. Off-мишени эффекты возникают, когда непредусмотренные цели будут также уничтожены. Это может привести к фенотипическим изменениям и может привести к ложным срабатываниям. В этом исследовании мы использовали пул четырех миРНК дуплексы, чтобы заставить замолчать одну цель хозяина. Если глушителей определенную цель приводит к снижению эффективности транслокации, проверки, что этот результат не из-за пределами целевых эффектов может быть достигнуто путем разделения четырех миРНК дуплексы и повторение анализа транслокации. По крайней мере два из четырех миРНК дуплексы должны продемонстрировать подобный фенотип к исходному миРНК пула. С помощью этого результата, можно быть уверенным, что в высшей степени наблюдаемый трЭффективность anslocation не из-за пределами целевых эффектов. Достоверность результатов, полученных транслокации также зависит от жизнеспособности клеток. Применение ядер пятен после анализа транслокации позволяет перечисление жизнеспособности клеток после миРНК глушителей. В случае PLK1, значительная гибель клеток можно легко наблюдать без окрашивания; Тем не менее, с помощью эпифлуоресцентной микроскопии более точное представление может быть достигнуто. Если с помощью глушителей конкретной целевой принимающей смерть значительная клеток наблюдается, например, на 50% по сравнению с контролем, то маловероятно, что точную картину можно сделать вывод относительно важности этого конкретного белка-хозяина к транслокации эффекторов. Как показано в данном исследовании, хотя глушителей либо Rab5A или Rab7A имеет незначительное влияние на жизнеспособность клеток (рисунок 5C), это сокращение не выражен достаточно , чтобы свести на нет достоверности данных транслокация наблюдаемых. Еще одно соображение в отношении жизнеспособности клеток Фоллявследствие миРНК глушителей является наблюдение, что значительная гибель клеток часто приводит к увеличению коэффициента транслокации. Это точно демонстрируется данными транслокации для зарегистрированных PLK1 (рис 5А). Сокращение числа клеток приводит к пропорциональному увеличению множественности инфекции. Это позволит увеличить скорость инфекции и, следовательно, соотношение транслокации.

Хотя это и не представлены в данном исследовании, визуализация эффекторной транслокации также может дать бесплатный количественный результат. Использование эпифлуоресцентной микроскопа с установленной длинной частот дихроичным зеркалом отдельного возбуждения и испускания света может обеспечить визуальное наблюдение внутриклеточной флуоресценции Бламу субстрата. Возможной альтернативой репортерной системы β-лактамазы является использование репортерной системы аденилатциклазы-циклазным. Подобно репортерной системы , описанной здесь, представляющий интерес ген слит с геном аденилатциклазы в кальмодулинзависимой (CyaA Bordetella коклюша. Эффектор транслокация может быть измерена с помощью количественной оценки внутриклеточного циклического АМФ (цАМФ) с помощью иммунологического анализа ELISA набор. Так как активность CyaA полностью зависит от клетки-хозяина кальмодулин, который присутствует только в принимающей цитозоле, эффектор транслокация подтверждается увеличением уровней цАМФ. Хотя этот метод также был использован успешно для измерения эффекторной транслокацию для различных бактерий 45-47, определение количества внутриклеточного цАМФ опирается на лизис клеток - хозяев для извлечения цАМФ, процесс , который является более timeconsuming по сравнению с методом , описанным в. Измерение эффекторной транслокации с использованием лада на основе системы β-лактамазы-репортер является более эффективным, так как подложка Бламу могут быть добавлены непосредственно к клеткам и флуоресценции может быть измерена в течение нескольких часов. Кроме того, способ, описанный здесь, может быть более легко адаптировать для получения результатов с высокой пропускной способностью, особенно в форме 96-луночногов.

Многие бактериальные патогены зависят от систем белков транслокации вводить эффекторные белки в клетках-хозяевах, позволяющие модуляции функций клетки-хозяина, чтобы принести пользу патогена. Системы типа секреции IV используются внутриклеточными бактериями , такими как Legionella, Coxiella и бруцеллеза и типа III системы секреции используются целым рядом патогенных микроорганизмов , включая хламидии, установка и стирая E. палочка и сальмонелла. Сравнивая влияние глушителей экспрессии специфических белков хозяина на эффекторной транслокации целым рядом патогенов, понимание факторов хозяина, необходимых для эффекторной транслокации конкретными типами систем секреции или по конкретному патогена могут быть выяснены. Это обеспечивает уникальный подход к изучению тонкостей хозяин-патоген взаимодействий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

концентрация Целевая
1 мкм 5 мкМ 10 мкМ 20мкм
Запуск Родинки
1 нмоль 1 мл 200 мкл 100 мкл 50 мкл
2 нмоль 2 мл 400 мкл 200 мкл 100 мкл
5 нмоль 5 мл 1 мл 500 мкл 250 мкл
10 нмоль 10 мл 2 мл 1 мл 500 мкл
20 нмоль 20 мл 4 мл 2 мл 1 мл
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Citric acid Sigma C0759 ACCM-2 medium component
Sodium citrate Sigma S4641 ACCM-2 medium component
Potassium phosphate Sigma 60218 ACCM-2 medium component
Magnesium chloride Calbiochem 442611 ACCM-2 medium component
Calcium chloride Sigma C5080 ACCM-2 medium component
Iron sulfate Fisher S93248 ACCM-2 medium component
Sodium chloride Sigma S9625 ACCM-2 medium component
L-cysteine Sigma C6852 ACCM-2 medium component
Bacto-neopeptone BD 211681 ACCM-2 medium component
Casamino acids Fisher BP1424 ACCM-2 medium component
Methyl beta cyclodextrin Sigma C4555 ACCM-2 medium component
RPMI + Glutamax ThermoFisher Scientific 61870-036 ACCM-2 medium component
Chloramphenicol Sigma C0378 For bacterial culture
ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP) Dharmacon D-001810-10-05 Non-targeting control
siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-003290-01-005 Causes cell death; measure of transfection efficiency
siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-004009-00-0005
siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-010388-00-0005
5x siRNA buffer Dharmacon B-002000-UB-100 Use sterile RNase-free water to dilute 5x siRNA buffer to 1x siRNA buffer
DharmaFECT-1 Transfection Reagent Dharmacon T-2001-01 For transfection
Opti-MEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 51985-034 Reduced-serum medium used for transfection
DMEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 10567-014 For cell culture and infection
Heat-inactivated fetal calf serum (FCS) Thermo Scientific SH30071.03 Can use alternate equivalent product
DMSO Sigma D8418 For storage of Coxiella strain
PBS For cell culture
0.05% Trypsin + EDTA ThermoFisher Scientific 25300-054 For cell culture
dH2O For dilution of samples and standards for qPCR
Quick-gDNA Mini Prep ZYMO Research D3007 Can use alternate equivalent product to extract gDNA
SensiFAST SYBR No-ROX Kit Bioline BIO-98020 Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction
LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM Invitrogen K1032 For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)
Sodium hydroxide Merck 106469 Probenicid solution component
Sodium phosphate monobasic Sigma 71505 Probenicid solution component
di-Sodium hydrogen orthophosphate Merck 106586 Probenicid solution component
Probenicid Sigma P8761 Probenicid solution component
DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) ThermoFisher Scientific 62251 Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS. 
4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS Sigma P6148 Fixing solution for HeLa 229 cells
25 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430639 For growth of bacterial strain
96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile Corning 3603
75 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430641 For growth of HeLa 229 cells
175 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 431080 For growth of HeLa 229 cells
Haemocytometer For quantification of HeLa 229 cells
Tear-A-Way 96 Well PCR plates 4titude 4ti-0750/TA For qPCR reaction
8-Lid chain, flat Sarstedt 65.989.002 For qPCR reaction
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Bench top microfuge
Bench top vortex
Orbital mixer
Centrifuge Eppendorf 5810 R For pelleting bacterial culture
Nanodrop For gDNA quantification
Mx3005P QPCR machine Aligent Technologies 401456 For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture
ClarioSTAR microplate reader BMG LabTech For measurement of fluorescence

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Delsing, C. E., Warris, A., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever: still more queries than answers. Adv Exp Med Biol. 719, 133-143 (2011).
  2. Delsing, C. E., Kullberg, B. J., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever in the Netherlands from 2007 to. Neth J Med. 68, 382-387 (2010).
  3. van der Hoek, W., et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Adv Exp Med Biol. 984, 329-364 (2012).
  4. Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. Lancet Infect Dis. 3, 709-721 (2003).
  5. Hoover, T. A., Culp, D. W., Vodkin, M. H., Williams, J. C., Thompson, H. A. Chromosomal DNA deletions explain phenotypic characteristics of two antigenic variants, phase II and RSA 514 (crazy), of the Coxiella burnetii nine mile strain. Infect Immun. 70, 6726-6733 (2002).
  6. Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii are facilitated by an improved axenic growth medium. Appl Environ Microbiol. 77, 3720-3725 (2011).
  7. Omsland, A., et al. Host cell-free growth of the Q fever bacterium Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4430-4434 (2009).
  8. Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. MBio. 2, e00175-e00111 (2011).
  9. Chen, C., et al. Large-scale identification and translocation of type IV secretion substrates by Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 21755-21760 (2010).
  10. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii cryptic plasmid is enriched in genes encoding type IV secretion system substrates. J Bacteriol. 193, 1493-1503 (2011).
  11. Beare, P. A., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. A. Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Front Microbiol. 2, 97 (2011).
  12. Beare, P. A., Larson, C. L., Gilk, S. D., Heinzen, R. A. Two systems for targeted gene deletion in Coxiella burnetii. Appl Environ Microbiol. 78, 4580-4589 (2012).
  13. Howe, D., Shannon, J. G., Winfree, S., Dorward, D. W., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii phase I and II variants replicate with similar kinetics in degradative phagolysosome-like compartments of human macrophages. Infect Immun. 78, 3465-3474 (2010).
  14. Heinzen, R. A., Scidmore, M. A., Rockey, D. D., Hackstadt, T. Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis. Infect Immun. 64, 796-809 (1996).
  15. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cell Microbiol. 9, 891-909 (2007).
  16. Beare, P. A. Genetic manipulation of Coxiella burnetii. Adv Exp Med Biol. 984, 249-271 (2012).
  17. Carey, K. L., Newton, H. J., Luhrmann, A., Roy, C. R. The Coxiella burnetii Dot/Icm system delivers a unique repertoire of type IV effectors into host cells and is required for intracellular replication. PLoS Pathog. 7, e1002056 (2011).
  18. Segal, G., Shuman, H. A. Possible origin of the Legionella pneumophila virulence genes and their relation to Coxiella burnetii. Mol Microbiol. 33, 669-670 (1999).
  19. Zamboni, D. S., McGrath, S., Rabinovitch, M., Roy, C. R. Coxiella burnetii express type IV secretion system proteins that function similarly to components of the Legionella pneumophila Dot/Icm system. Mol Microbiol. 49, 965-976 (2003).
  20. Zusman, T., Yerushalmi, G., Segal, G. Functional similarities between the icm/dot pathogenesis systems of Coxiella'burnetii and Legionella pneumophila. Infect Immun. 71, 3714-3723 (2003).
  21. Newton, H. J., McDonough, J. A., Roy, C. R. Effector Protein Translocation by the Coxiella burnetii Dot/Icm Type IV Secretion System Requires Endocytic Maturation of the Pathogen-Occupied Vacuole. PLoS One. 8, e54566 (2013).
  22. Lifshitz, Z., et al. Computational modeling and experimental validation of the Legionella and Coxiella virulence-related type-IVB secretion signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E707-E715 (2013).
  23. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii ankyrin repeat domain-containing protein family is heterogeneous, with C-terminal truncations that influence Dot/Icm-mediated secretion. J Bacteriol. 191, 4232-4242 (2009).
  24. Weber, M. M., et al. Identification of C. burnetii type IV secretion substrates required for intracellular replication and Coxiella-containing vacuole formation. J Bacteriol. , (2013).
  25. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Luhrmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-678 (2013).
  26. Larson, C. L., Beare, P. A., Howe, D., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii effector protein subverts clathrin-mediated vesicular trafficking for pathogen vacuole biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4770-E4779 (2013).
  27. Luhrmann, A., Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetii type IV effector protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18997-19001 (2010).
  28. Newton, H. J., et al. A screen of Coxiella burnetii mutants reveals important roles for Dot/Icm effectors and host autophagy in vacuole biogenesis. PLoS Pathog. 10, (2014).
  29. Pan, X., Luhrmann, A., Satoh, A., Laskowski-Arce, M. A., Roy, C. R. Ankyrin repeat proteins comprise a diverse family of bacterial type IV effectors. Science. 320, 1651-1654 (2008).
  30. Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
  31. de Felipe, K. S., et al. Legionella eukaryotic-like type IV substrates interfere with organelle trafficking. PLoS Pathog. 4, e1000117 (2008).
  32. de Jong, M. F., Sun, Y. H., den Hartigh, A. B., van Dijl, J. M., Tsolis, R. M. Identification of VceA and VceC, two members of the VjbR regulon that are translocated into macrophages by the Brucella type IV secretion system. Mol Microbiol. 70, 1378-1396 (2008).
  33. Raffatellu, M., et al. Host restriction of Salmonella enterica serotype Typhi is not caused by functional alteration of SipA, SopB, or SopD. Infect Immun. 73, 7817-7826 (2005).
  34. Wood, R. E., Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Dot/Icm Effector Translocation by Legionella longbeachae Creates a Replicative Vacuole Similar to That of Legionella pneumophila despite Translocation of Distinct Effector Repertoires. Infect Immun. 83, 4081-4092 (2015).
  35. Mueller, K. E., Fields, K. A. Application of beta-lactamase reporter fusions as an indicator of effector protein secretion during infections with the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. PLoS One. 10, (2015).
  36. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  37. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  38. Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e252 (2015).
  39. Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS Pathog. 10, e1004013 (2014).
  40. Jaton, K., Peter, O., Raoult, D., Tissot, J. D., Greub, G. Development of a high throughput PCR to detect Coxiella burnetii and its application in a diagnostic laboratory over a 7-year period. New Microbes New Infect. 1, 6-12 (2013).
  41. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  42. Prashar, A., Terebiznik, M. R. Legionella pneumophila: homeward bound away from the phagosome. Curr Opin Microbiol. 23C, 86-93 (2014).
  43. McDonough, J. A., et al. Host Pathways Important for Coxiella burnetii Infection Revealed by Genome-Wide RNA Interference Screening. MBio. 4 (1), e00606-e00612 (2013).
  44. Farfan, M. J., Toro, C. S., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella enterotoxin-2 is a type III effector that participates in Shigella-induced interleukin 8 secretion by epithelial cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 61, 332-339 (2011).
  45. Al-Khodor, S., Price, C. T., Habyarimana, F., Kalia, A., Abu Kwaik, Y. A Dot/Icm-translocated ankyrin protein of Legionella pneumophila is required for intracellular proliferation within human macrophages and protozoa. Mol Microbiol. 70, 908-923 (2008).
  46. Geddes, K., Worley, M., Niemann, G., Heffron, F. Identification of new secreted effectors in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. 73, 6260-6271 (2005).
  47. Sory, M. P., Boland, A., Lambermont, I., Cornelis, G. R. Identification of the YopE and YopH domains required for secretion and internalization into the cytosol of macrophages, using the cyaA gene fusion approach. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 11998-12002 (1995).

Tags

Инфекция выпуск 113 хозяин-патоген взаимодействия бактериальные системы секреции β-лактамазы транслокации анализа Бламу субстрат флуоресценция микробиология внутриклеточные бактериальные патогены, Ген глушителей миРНК молекулярная биология
Применение флуоресцентного резонанса переноса энергии (FRET) для изучения Эффектор транслокации эффективности путем<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Во время миРНК Глушащий
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Newton, P., Latomanski, E. A.,… More

Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing. J. Vis. Exp. (113), e54210, doi:10.3791/54210 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter