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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Anwenden von Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) zu untersuchen Effektor Translokation Effizienz durch Published: July 6, 2016 doi: 10.3791/54210
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, University of Melbourne

Summary

Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Erregern und ihren Wirten ist ein wichtiger Bereich der biologischen Forschung. Hier beschreiben wir die notwendigen Techniken Effektor - Translokation durch Coxiella burnetii während siRNA Gen - Silencing mit BlaM Substrat zu messen.

Abstract

Coxiella burnetii, der Erreger des Q - Fiebers, ist ein intrazelluläres Pathogen , das IV Dot / Icm Sekretionssystem auf einer Art setzt eine replikative Nische zu etablieren. Eine Kohorte von Effektoren werden durch dieses System in die Wirtszelle Host-Prozesse transloziert und ermöglichen die Schaffung eines einzigartigen Lysosom abgeleiteten Vakuole für die Replikation zu manipulieren. Die hier vorgestellte Methode beinhaltet die Kombination von zwei gut etablierte Techniken: spezifische Silencing Gen siRNA und Messung der Effektor-Translokation mit einem FRET-basierten Substrat verwenden, die auf β-Lactamase-Aktivität beruht. Die Anwendung dieser beiden Ansätze können wir damit beginnen, die Rolle von Wirtsfaktoren in bakteriellen Sekretionssystem Funktion und Effektor-Translokation zu verstehen. In dieser Studie untersuchten wir die Rolle der RAB5A und Rab7A, die beide wichtige Regulatoren des endocytic Handel Weg. Wir zeigen, dass eine Abnahme der Effektor translocatio die Expression von Protein Ergebnisse Silencingn Effizienz. Diese Verfahren können leicht modifiziert werden, um andere intra- und extrazellulären Krankheitserregern zu untersuchen, die auch die Sekretion Systeme nutzen. Auf diese Weise kann aufgedeckt werden ein globales Bild Faktoren Wirt in bakteriellen Effektor-Translokation beteiligt.

Introduction

Coxiella burnetii ist ein einzigartiges intrazelluläre Erreger der zoonotischen Infektionen beim Menschen Q - Fieber verursacht. Diese Krankheit wird mit einem breiten Spektrum von klinischen Präsentationen im Zusammenhang von asymptomatischen Serokonversion zu lebensbedrohlichen chronischen Infektion erstreckt , die als Endokarditis Jahre nach der Exposition 1 oft manifestiert. Die Infektion des Menschen erfolgt in erster Linie durch das Einatmen von kontaminierten Aerosolen mit Wiederkäuern der großen Reservoir für Infektionen, insbesondere Milchkühe, Schafe und Ziegen. Obwohl Coxiella Infektion bei diesen Tieren der Regel subklinischen ist, kann die Infektion Abtreibung auslösen und die erhebliche bakterielle Belastung innerhalb der Entbindungs ​​Flüssigkeit und Plazenta kann die lokale Umgebung 1 verunreinigen. Ein Beispiel für die enorme Belastung eine solche Kontamination kann sowohl auf die öffentliche Gesundheit haben und die Agrarindustrie vor kurzem in der Q - Fieber - Ausbruch beobachtet wurde , die in den Niederlanden 2 aufgetreten ist . Zwischen 2007 und2010 mehr als 4.000 menschliche Fälle von Q - Fieber diagnostiziert wurden und dieser Ausbruch zu erheblichen Kontamination von Ziegenbetriebe 3 wurde verknüpft. Darüber hinaus ist Coxiella eine potenzielle biologische Waffe, wie für Disease Control von den US Centers klassifiziert und Prävention, durch die Umweltstabilität der Bakterien und geringe Infektionsdosis erforderlich schwere Morbidität und Mortalität 4 zu verursachen.

Coxiella existiert in zwei Phasen: Phase I Organismen, isoliert aus natürlichen Quellen, sind extrem virulent und Phase - II - Organismen in vivo stark gedämpft. Beispielsweise nach mehreren in vitro Passagen Coxiella burnetii Nine Mile Phase I Organismen, Phase II Bakterien produziert wurden , die eine irreversible chromosomale Deletion in abgeschnittene Lipopolysaccharid (LPS) enthalten 5. Dieser Stamm, C. burnetii NMII ist phänotypisch ähnlich ich in Gewebekulturmodellen zu Phase und bietet einen sichereren Modusl für Forscher Coxiella Pathogenese in Laboratorien zu untersuchen 5. In den letzten Jahren haben mehrere Durchbrüche auf dem Gebiet der Genetik Coxiella rasch vorangetrieben . Vor allem die Entwicklung von axenic Medien (Citrat Cystein Medium angesäuert - ACCM-2) hat die zellfreie Wachstum von Coxiella sowohl in flüssiger und auf festen Medien 6,7 erlaubt. Dies führte zu direkten Verbesserungen der genetischen Werkzeuge zur Verfügung , für Coxiella einschließlich eines induzierbaren Genexpressionssystem, Shuttle - Vektoren und zufällige Transposon - Systeme 11.08. In jüngster Zeit werden zwei Verfahren zur gezielten Geninaktivierung sind ebenfalls entwickelt worden, die den Weg für 12 spezifische Virulenzgen Kandidaten untersucht.

Folgende Internalisierung durch Alveolarmakrophagen, repliziert Coxiella zu hohen Zahlen innerhalb eines membrangebundenen Kompartiment bezeichnet die Coxiella- enthält Vakuole (CCV). Der CCV erfordert Host endocytic Handel thrau frühen und späten Endosomen , bis es reift in ein Lysosom abgeleiteten Organell 13. Im Laufe dieses Prozesses erwirbt der CCV Wirtsfaktoren , die entweder vorübergehend erscheinen oder bleiben mit der Vakuole verbunden sind , einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Rab5, Rab7, CD63 und LAMP-1 . 13-15 Die Replikation von Coxiella innerhalb von Wirtszellen ist völlig abhängig von einem voll funktionsfähigen Dot / Icm Typ IVB - Sekretionssystem (T4SS) 8,16,17. Dieses Sekretionssystem ist ein Multi-Proteinstruktur ancestrally Konjugation Systemen und erstreckt sich über sowohl bakterielle als auch vacuolar Membranen bakterielle Proteine ​​zu liefern, bezeichnet als Effektoren in das Wirts Zytoplasma 18. Die Coxiella T4SS funktionell sehr ähnlich dem gut charakterisierten Typ IVB Dot / Icm Sekretionssystem von Legionellen pneumophila 19,20. Interessanterweise Aktivierung des T4SS und nachfolgende Translokation Effektor nicht auftritt , bis die saure Coxiella Lysosom-derived erreichtOrganell, etwa 8 Stunden nach der Infektion 17,21. Bis heute sind über 130 Dot / Icm Effektoren wurden 9,17,22-24 identifiziert. Viele dieser Effektoren spielen wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Replikation von Coxiella in Wirtszellen; jedoch nur wenige Effektoren wurden funktionell 25-29 charakterisiert.

In dieser Studie nutzen wir eine fluoreszenzbasierten Translokation Assay, der auf der Spaltung des (bezeichnet im Folgenden als BlaM Substrat) CCF2-AM FRET Substrat stützt über β-Lactamase - Aktivität in der Wirtszelle Zytoplasma (Abbildung 1). Das Gen von Interesse fusioniert an TEM-1-β-Lactamase (BlaM) auf einem Reporterplasmid, das eine konstitutive Expression sorgt. Das BlaM Substrat besteht aus zwei Fluorophore (Cumarin und Fluorescein), die ein FRET-Paar bilden. Anregung der Cumarin Ergebnisse in FRET des Fluorescein und grüne Fluoreszenzemission in Abwesenheit von Effektorzellen Translokation; Wenn jedoch die BlaM-Effektor-Fusionsprotein wird in das Wirts Zytoplasma transloziert, die sich ergebende β-Lactamase-Aktivität spaltet die β-Lactam-Ring des BlaM Substrat, wobei das FRET-Paar produzieren blaue Fluoreszenzemission nach Anregung zu trennen. Diese Translokation Assay wurde als ein Ansatz zur Identifizierung Effektor - Proteine ​​aus einer Reihe von verschiedenen intra- und extrazellulären Bakterien gut bewährt, einschließlich C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, darmpathogene E. coli, Salmonella und Brucella 17,30-35.

Um die Rolle der spezifischen Wirtsfaktoren auf Coxiella Effektor Translokation bestimmen verwenden wir ein gut etabliertes Verfahren zur Gen - Silencing als RNA - Interferenz bekannt, insbesondere small interfering RNA (siRNA). Ursprünglich in Caenorhabditis elegans identifiziert, ist die RNA - Interferenz ein konserviertes endogenen zellulären Prozess für angeborene defe verwendetnse gegen Viren sowie der Genregulation 36,37. Von sequenzspezifischen siRNA, Abbau von mRNA erfolgt durch RISC (RNA-induced silencing complex) , was zu spezifischen Gen - Silencing oder Zuschlags 38 nach der Bindung. In dieser Studie wurde siRNA zwei Wirtsproteine ​​zu zielen, RAB5A und Rab7A, die wichtige Regulatoren des endocytischen sind. Die Auswirkungen der RAB5A und Rab7A auf Effektor - Translokation zum Schweigen zu bringen wurde mit C ermittelt burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 ausgewählt wurde , wie es zuvor durch die Dot / Icm Sekretionssystem von Coxiella 17 transloziert werden , wurde gezeigt.

Unter Verwendung sowohl siRNA Gen - Silencing und die fluorescencebased Translokation Assay hier beschrieben, beginnen wir eine Rolle für die Wirtsfaktoren bei der Translokation von Effektor - Proteine ​​, die durch Coxiella zu etablieren. Dieser Ansatz kann auf eine breite Palette von sowohl intra- und extrazellulären Bakterien angewendet werden, die ähnliche secretio besitzenn-Systeme, die für die Translokation von Effektor-Proteine.

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Protocol

Hinweis: Alle Verfahren , das Wachstum oder die Manipulation von Coxiella burnetii RSA439 NMII Beteiligung sollte in einem physikalischen Sicherheitsstufe 2 Labor und in einem biologischen Sicherheitsschrank unter Beachtung der örtlichen Richtlinien durchgeführt werden. Ein schematisches Diagramm der reversen Transfektion und Translokation Assay Workflow unten beschrieben ist in Abbildung 2 dargestellt.

1. Herstellung von C. burnetii Kultur Ausdruck CBU0077 Fused zu ß-Lactamase (pBlaM-CBU0077) (Tag 1)

  1. Bereiten 1X ACCM-2 6:
    1. Kombinieren Sie die aufgeführten Komponenten in Tabelle 1 aufgeführt . Der pH - Wert auf 4,75 mit 6 M NaOH und Filter zu sterilisieren (Sterilisieren nicht). ACCM-2 ist für ca. drei Wochen gelagert bei 4 ° C stabil.
  2. Generieren C. burnetii pBlaM-CBU0077 Aktien.
    1. Infect HeLa 229 - Zellen mit dem C. burnetii Stamm trägt pBlaM-CBU0077 und Passage bis große vacuoles werden in der Mehrzahl der Zellen beobachtet.
      1. Wachsen die C. burnetii Stamm trägt pBlaM-CBU0077 in 20 ml ACCM-2 , enthaltend 3 & mgr; g / ml Chloramphenicol in einem 75 cm 2 Gewebekulturflasche mit belüftete Kappe für 7 Tage bei 37 ° C in 5% CO 2, 2,5% O 2.
      2. Zentrifugieren Sie die C. burnetii pBlaM-CBU0077 Kultur bei 15.000 × g für 15 min bei RT.
      3. Resuspendieren des Pellets in 20 ml DMEM + 10% fötales Kälberserum (FCS) + 3 & mgr; g / ml Chloramphenicol (Erhaltungsmedium). Entfernen Sie das Medium aus einer 50% konfluenten 75 cm 2 Kolben von HeLa - 229 - Zellen. In resuspendierten C. burnetii zu HeLa - 229 - Zellen. Inkubieren für 2 Tage bei 37 ° C in 5% CO 2 Infektion von HeLa - 229 - Zellen zu ermöglichen , zu schaffen.
      4. Split - Zellen in 175 cm 2 Gewebekulturflasche.
        1. Entfernen Sie das Medium aus dem 75 cm 2 Kolben und waschen Sie die Monoschicht zweimal mit 10 ml vorgewärmtes PBS.
        2. 1 ml of 0,05% Trypsin-EDTA - Lösung und Ortszellen bei 37 ° C + 5% CO 2 3 - 5 min Zellen zu lösen.
        3. Re-suspendieren Zellen in 10 ml Erhaltungsmedium. 2 ml resuspendierten Zellen in einen 175 cm 2 -Kolben 38 ml Erhaltungsmedium enthält.
        4. Bei 37 ° C inkubieren in 5% CO 2 für weitere 3 bis 5 Tage bis zu 100% Konfluenz erreicht ist , und große Vakuolen beobachtet.
    2. Sammeln Überstand aus dem 175 cm 2 Kolben, 10 ml dH 2 O , um die infizierten HeLa - 229 - Zellen zu bedecken und für 15 min Inkubation auf infizierte Zellen lysieren.
    3. Kombinieren Überstand und Pellet lysierten Zellen und bei 15.000 × g für 15 min bei RT.
    4. Re-suspendieren Pellet in 10 ml dH 2 O. Lysieren Zellen weiter, indem wiederholt die Resuspension durch eine 23G Nadel vorbei an einer 10 ml-Spritze mindestens 20 Mal. Pellet bei 500 × g für 5 min um Zelltrümmer zu entfernen.
      5. <li> 15 min bei RT mit 15.000 × g entfernen und Pelletüberstand C. sammeln burnetii.
    5. Re-suspendieren C. burnetii in DMEM + 10% FCS und die Anzahl der Bakterien pro 4 quantifizieren. Die Lösung wird bis 1 × 10 9 Genome / ml mit DMEM + 10% FCS + 10% Dimethylsulfoxid (DMSO), aliquote 50 ul Bestände in Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C.
  3. Beimpfen von 10 ml vorgewärmtes ACCM-2 , enthaltend 3 & mgr; g / ml Chloramphenicol mit 20 & mgr; l C. burnetii pBlaM-CBU0077 Stamm 17 (von Aktien generiert in 1,2 bei -80 ° C gelagert) in einem 25 cm 2 Gewebekulturflasche mit Filtrierkappe. Wachsen Bakterienkultur für 7 Tage bei 37 ° C in 5% CO 2, 2,5% O 2.

2. Reverse - Transfektion von siRNA und Seeding von HeLa - 229 - Zellen (Tag 4)

  1. Wenn die experimentelle siRNA zum ersten Mal unter Verwendung vorbereitendie siRNA, wie folgt:
    1. Zentrifuge kurz die lyophilisierte siRNA, um sicherzustellen, daß das siRNA Pellet am Boden des Röhrchens gesammelt wird.
    2. Re-suspend die pelle siRNA zu einer endgültigen Lager - Konzentration von 20 & mgr; M durch Pipettieren das entsprechende Volumen 1x siRNA - Puffer (Tabelle 2).
    3. Pipette, um die Lösung auf und ab 3 bis 5-mal zu mischen und auf einem Orbitalmischer für 30 min bei RT, Umdrehen des Röhrchens alle 5 - 10 min.
    4. Zentrifuge kurz die Röhre die siRNA gesammelt am Ende des Rohres zu gewährleisten.
    5. Aliquot der siRNA in 50 ul-Aliquoten in Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C, bis sie benötigt.
    6. Um 1 uM erzeugen Arbeitskonzentration von siRNA, Pipette 950 ul 1X siRNA-Puffer in ein 50-ul-Aliquot Lager (20 & mgr; M), wenn nötig. Hinweis: Diese 1 uM Arbeitskonzentration mehrfach für die wiederholte Transfektionen gefrieraufgetaut werden kann.
  2. Platzieren DMEM + 10% FCS,vor erwärmen verwenden 0,05% für 30 min in einem 37 ° C Wasserbad (oder ein Äquivalent) Trypsin-EDTA und PBS;.
  3. Herstellung von Transfektionskomponenten:
    Hinweis: Das folgende Protokoll wurde für HeLa-229-Zellen in einer 96-Well-Mikroplatte mit schwarzen Wänden und flachen, transparenten Boden optimiert. Optimierung der Menge des Transfektionsreagenz, die Konzentration der siRNA und Einsaatdichte von Zellen für verschiedene Zelllinien erforderlich.
    1. Für jede Vertiefung wurden 0,1 ul Transfektionsreagenz verwenden, 15,9 ul reduzierten Serum Medium und 4 ul von 1 uM siRNA (was zu einer endgültigen siRNA - Konzentration von 40 nM) (minimal essential Medien für Transfektionen siehe Tabelle der verwendeten Materialien). Verwenden Sie separate Mikrozentrifugenröhrchen für OTP, PLK1, RAB5A und Rab7A. Messen Sie jeden Testbedingungen in dreifacher Ausfertigung. Ein Beispiel einer 96-Well - Platte Layout wird in Abbildung 3 dargestellt.
      Hinweis: Dieses Protokoll umfasst die Verwendung von zwei Steuerungen: OTP und PLK1. OTP istbestehend aus vier gepoolten siRNA, die optimiert wurden, Nebeneffekte zu reduzieren und somit wird OTP als negative, nicht-Targeting-Kontrolle verwendet. Verwürfelten siRNA könnte auch als negative Kontrolle verwendet werden. Verlust von PLK1 Expression zu ausgedehnten Zelltod in einer Reihe von Zelllinien durch pro-apoptotische Wege induzieren und daher PLK1 siRNA als positive Kontrolle für die Transfektionseffizienz verwendet, bei denen Zelltod Transfektionseffizienz korreliert.
      1. Für jede experimentelle siRNA-Transfektion, kombinieren 0,4 ul Transfektionsreagenz und 63,6 ul reduzierten Serum Medium in einem einzelnen Mikrozentrifugenröhrchen. Vortex alle Mikrozentrifugenröhrchen und lassen Komponenten Komplex für 5 min bei RT.
      2. Hinzufügen, 16 ul von jeder experimentellen siRNA in die entsprechenden Mikrozentrifugenröhrchen Transfektionskomplex enthält. Vortexen und 20 min bei RT inkubiert. Hinweis: Es ist wichtig, nicht mehr als 30 min zu überschreiten, da die Transfektionseffizienz verringern.
  4. Während der 20 min incubation (2.3.1.2) 20 ul des Transfektionsreagenz hinzufügen + reduziertem Serum - Medium + siRNA in die Vertiefungen einer sterilen schwarz, flach klarer Boden 96-Well - Fach ein .
  5. Sobald die 20 min Inkubationszeit vollständig, Saatgut HeLa 229 - Zellen bei einer Dichte von 3,92 × 10 3 Zellen / Vertiefung.
    1. Ernte HeLa 229 - Zellen aus einem konfluenten oder subkonfluenten 75 cm 2 Gewebekulturkolben in vorgewärmten DMEM + 10% FCS und resuspendieren Zellen zu einer Enddichte von 4,9 × 10 4 Zellen / ml nach Standardmethoden. Um sicherzustellen , dass die Transfektionseffizienz nicht beeinträchtigt wird, bereiten Zellen während der 20 Minuten Inkubationszeit (2.3.1.2).
      1. Wasche die Monoschicht von HeLa 229-Zellen zweimal mit 10 ml vorgewärmtes PBS.
      2. 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA - Lösung und statt 229 HeLa - Zellen bei 37 ° C + 5% CO 2 für 3 bis 5 min Zellen abzulösen.
      3. Sammeln Zellen in 9 ml vorgewärmtem DMEM + 10% FCS. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und DMEM + 10% FCS unter Verwendung von Zellen auf eine Enddichte von 4,9 × 10 4 Zellen / ml herzustellen.
    2. Pipette 80 ul HeLa 229 - Zellen bei einer Dichte von 4,9 × 10 4 Zellen / ml in jeder Vertiefung, die das Transfektionsreagenz + reduzierte serumhaltigem Medium + siRNA Mischung enthält. Dies entspricht einer Zelldichte von 3,92 × 10 3 Zellen / Vertiefung.
      Hinweis: Hintergrundkorrektur ist für das BlaM Substrat erforderlich.
      1. Fügen Sie keine Zellen oder siRNA zu "leeren" Brunnen (Abbildung 3). Stattdessen fügen 80 ul DMEM + 10% FCS auf diese Vertiefungen in dreifacher Ausfertigung eingerichtet.
    3. Inkubieren für 24 Stunden bei 37 ° C + 5% CO 2.

3. Ändern Medien (TAG 5)

  1. Nach 24 Stunden entfernen Medien einen Mehrkanal-Adapter mit einer Vakuumquelle oder manuell mit einer Mehrkanalpipette angebracht verwendet und ersetzen mit 100 ul frisch vorwärmened DMEM + 10% FCS.
  2. Inkubieren für weitere 48 h bei 37 ° C + 5% CO 2.
  3. An diesem Punkt überprüfen die Lebensfähigkeit der Zellen optisch ein Standard-Lichtmikroskop. Wenn die umgekehrte Transfektion erfolgreich war, signifikante Zelltod wird in den Vertiefungen, enthaltend PLK1 siRNA Vergleich zu OTP siRNA beobachtet werden.

4. Quantifizierung von Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 Stamm mit qPCR (Tag 7)

  1. Nach 7 Tagen Wachstum in ACCM-2 bei 37 ° C in 5% CO 2, 2,5% O 2 (1.3), der Zentrifuge 10 ml C. burnetii pBlaM-CBU0077 Kultur bei 15.000 × g für 15 min bei RT.
  2. Re-suspendieren das Bakterienpellet in 10 ml des vorgewärmten DMEM + 10% FCS. Bereiten 1:10 und 1: 100 Verdünnungen der Kultur (Probe) unter Verwendung von dH 2 O.
  3. Richten Sie die Komponenten für die qPCR erforderlich.
    Hinweis: gDNA Extraktion kann im voraus und bei -20 ° C durchgeführt werden until erforderlich.
    1. Ausarbeitung von Normen:
      1. Auszug gDNA von Coxiella burnetii RSA439 NMII Wildtyp - Stamm gewachsen in ACCM-2 bei 37 ° C in 5% CO 2, 2,5% O 2 für 7 Tage mit einem gDNA - Extraktions - Kits, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      2. Messen der gDNA-Konzentration (g / & mgr; l), um eine Nanodrop (oder Äquivalent) bei einer Absorption von 260 nm verwendet wird.
      3. Berechnung der Anzahl der Genomkopien pro ul der folgenden Formel unter Verwendung von und zu konvertieren Anzahl von Genomen / ml.
        Gleichung
      4. Stellen Sie die Anzahl von Genomen / ml bis 10 9 / ml (in einem Endvolumen von 100 & mgr; l) in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung von dH 2 O. Dies kann für 10 min und bei -20 ° C gekocht werden, bis sie benötigt wurden.
      5. Am Tag der Infektion erzeugen 10fache Reihenverdünnungen von 10 8 Genome / ml bis 10 5 Genomen / ml von der 10 9 Genoms / ml Lager.
        1. Pipette 10 ul 10 9 Genome / ml in 90 ul dH & sub2 ; O 10 8 Genome / ml zu erzeugen. Vortex mischen. Pipette 10 ul 10 8 Genome / ml in 90 ul dH & sub2 ; O 10 7 Genomen / ml zu erzeugen. Vortex und wiederholen , bis 10 5 Genomen / ml.
    2. Richten Sie qPCR Reaktion. Erstellen Sie einen Master-Mix für 25 Brunnen für alle Pipettierfehler zu berücksichtigen. Für jede Vertiefung verwenden 10 ul qPCR Master Mix; 2 ul ompA Zündmittelgemisch (4.3.2.2) und 3 & mgr; l dH 2 O.
      Hinweis: OmpA ist ein Außenmembranprotein von C. burnetii '39 und ein 82-Basenpaar - Abschnitt innerhalb einer hochkonservierten Region wurde zur Verwendung als Sonde ausgewählt , wie zuvor beschrieben 40.
      1. Einrichten jeden Standard (dH 2 O, 10 5, 10 6, 10 7, 10 8, 10 9 Genome / ml) und Probe (1:10 und 1: 100 Verdünnung) in eine 96-well PCR losreißen Platte (nicht umsäumte) doppelt oder dreifach sind. In 5 ul Probe oder Standard in die Vertiefungen.
      2. Verwendung von dH 2 O, verdünnter sowohl die ompA Vorwärtsprimer (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') und ompA - Rückwärtsprimer (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') bis zu einer Endkonzentration von 4 & mgr; M und verbinden sich zu dem gleichen Mikrozentrifugenröhrchen.
        Hinweis: Das ompA Zündmittelmischung kann im Voraus gespeichert und bei -20 ° C hergestellt werden , bis sie benötigt wurden .
      3. Kombinieren Sie 250 ul qPCR Master Mix, 50 ul ompA - Primer - Gemisch, 75 & mgr; l dH 2 O und Wirbel zu mischen. In 15 ul dieses Mastermixes in die Vertiefungen entweder Standards oder Proben enthalten.
      4. Legen Sie 8-Deckel PCR Streifen Kappen auf die entsprechenden Vertiefungen und pulszentrifugieren PCR-Röhrchen alles, um sicherzustellen, ist im Boden der Röhrchen gesammelt.
      5. Stellen Sie das folgende Programm auf einer quantitativen PCR ma upchine: 50 ° C für 2 min, 95 ° C für 10 min, gefolgt von 45 Zyklen von 95 ° C für 1 sec und 60 ° C für 20 sec (4A).
    3. Analysieren Sie den Ct (cycle threshold) Werte aus der qPCR:
      1. Übertragen Sie die Ct-Werte in eine Tabelle mit der Exportfunktion des Programms.
      2. Erstellen Sie ein Streudiagramm der Standards 10 5 Genomen / ml bis zu 10 9 Genome / ml (als Log - Werte ausgedrückt). Entsorgen Sie alle offensichtliche Ausreißer unter den dreifachen Proben. Generieren Sie eine logarithmische Trendlinie und bestimmen die Gleichung des Graphen.
      3. Berechnen der Gesamtzahl der Genome / ml in der Probe durch die Gleichung in 4.3.3.2 erzeugt. Vergessen Sie nicht, für die anfängliche Verdünnung zu berücksichtigen (1:10 und 1: 100) der Proben.

5. Die Infektion von Reverse-transfizierter Zellen (Tag 7)

  1. Nachdem die gesamten Genome / ml in der C Berechnung Klettenetii pBlaM-CBU0077 Kultur zur Infektion verwendet werden, stellen Bakterienkultur resuspendierten Zellen bei einer MOI von 300 in einem Endvolumen von 50 ul zu infizieren / Vertiefung unter Verwendung vorgewärmtem DMEM + 10% FCS.
    Anmerkung: Die erwartete Dichte der beimpften HeLa 229 - Zellen mit einer normalen Verdopplungszeit nach 72 h 3,136 × 10 4 Zellen / Vertiefung. Die Menge an Bakterien bei einem MOI von 300 infiziert erforderlich ist 9,408 × 10 6 in 50 & mgr; l, das auf 1,88 × 10 8 Bakterien / ml entspricht.
    1. Unter Verwendung des Wertes aus den qPCR berechnet (Genome / ml) (4.3.3.3), verdünnen die resuspendierten Bakterien mittels vorgewärmten DMEM + 10% FCS in einem Gesamtvolumen von 2 ml , die Reverse - transfizierten Zellen zu infizieren.
  2. Entfernen Sie den vorhandenen Medien aus dem Rohling und transfizierten Zellen umkehren.
  3. In 50 ul der verdünnten Bakterien (1,88 × 10 8 Bakterien / ml) in die entsprechenden Vertiefungen. Zugabe von 50 & mgr; l DMEM + 10% FCS sowohl mit dem Rohling und uninfected Brunnen.
  4. Inkubieren für 24 Stunden bei 37 ° C + 5% CO 2.

6. Zugabe von BlaM Substrat zu bestimmen Niveau Translokation (TAG 8)

  1. Bereiten Sie die Lösungen für die BlaM Substrat 6x Beladungslösung.
    Hinweis: Lösung A, B und C sind vorgesehen , innerhalb des BlaM Substrat Kit (Siehe Tabelle der Materialien). Lösung B kann einen Niederschlag bei RT bilden. Erwärmen, diese Lösung auf 37 ° C vor der Verwendung und der Niederschlag sollte aufzulösen.
    1. Wenn das Kit zum ersten Mal verwenden, fügen Sie 185 ul DMSO (mit dem BlaM Substrat-Kit mitgeliefert) an die ausgetrockneten Lösung A. Anschließend speichern Sie die resuspendierten Lösung A bei -20 ° C.
    2. Bereiten 0,1 M Probenicid Lösung im Voraus und lagern in 1 ml Aliquots bei -20 ° C, bis sie benötigt.
      1. Bereiten 0,4 M NaOH (1,6 g in 100 ml dH 2 O).
      2. Herstellung von 100 mM Na - Phosphatpuffer pH 8 (1,56 g NaH 2 PO 4 .2H 2 HPO 4 in 100 ml dH 2 O).
      3. Man löst 1,25 g Probenicid in 22 ml von 0,4 M NaOH unter kräftigem Rühren.
      4. In 22 ml 100 mM Na-Phosphat-Puffer pH 8 (Lösung wird trüb) und rühren Sie die sich bildende Niederschlag aufzulösen.
      5. Der pH-Wert 8 (falls erforderlich) unter Verwendung von 1 M NaOH / HCl.
      6. Gut durchrühren und erhitzen mild (<50 ° C), bis die Lösung meist klar.
      7. Filter (0,2 & mgr; m Porengröße) und aliquoten in 1 ml Volumen. Store Aliquots bei -20 ° C.
  2. Für jede Vertiefung verwenden 0,06 ul Lösung A, 0,54 ul Lösung B, 7,9 ul Lösung C und 1,5 ul 0,1 M Probenicid. Erstellen eines Master-Mix für 30 Vertiefungen, indem zuerst 1,8 ul Lösung A und 16,2 ul Lösung B zusammen in einem Mikrozentrifugenröhrchen kombiniert. Gut mischen einen Wirbel verwenden. Hinzufügen 237 ul Lösung C und 45 ul 0,1 M Probenicid. Vortex zu vereinen alle components.
    Hinweis: Die 6x Ladelösung für bis zu 4 Stunden (im Dunkeln) stabil ist, aber sollte so nah wie möglich vor der Anwendung hergestellt werden.
  3. In 10 ul der 6-fachem Beladungslösung direkt in alle leer und Reverse-transfizierten Brunnen, ohne die vorhandene Medien zu entfernen.
  4. Inkubiere die Platte bei RT für 2 h im Dunkeln.
  5. Um das Niveau der Translokation bestimmen, quantifizieren die Menge der Fluoreszenz eines Mikroplattenleser.
    Hinweis: Das folgende Verfahren ist spezifisch für die ClarioSTAR Mikroplatten-Reader. Equivalent Mikrotiterplatten-Leser können ebenfalls verwendet werden.
    1. Erstellen Sie eine neue Fluoreszenzintensität Protokoll Endpunkt als Lesemodus.
    2. Passen Sie die grundlegenden Parameter wie folgt:
      1. Wählen Sie 96-well Mikrotiterplatten.
      2. Unter Optik-Einstellungen wählen Sie 2 multichromatics mit den folgenden benutzerdefinierten Einstellungen: (1) Eingang 410-10 nm Anregung und 520-10 nm-Emission. (2) Eingaben 410-10 nm Anregung und 450-10 nm-Emission. Stellen Sie sicher, gut multichromatics ausgewählt ist.
      3. Wählen orbital Lungs mit einem Durchmesser von 3 mm.
      4. Unter Optik, untere Optik aus.
      5. Unter Geschwindigkeit und Präzision, wählen Sie präzise. Dies entspricht acht Regionen pro Vertiefung.
    3. Stellen Sie den Plattenlayout, indem Sie die entsprechenden Wells als Proben ausgewählt.
    4. Wählen Sie das Startmessung.
    5. Entfernen Sie den Deckel und legen Sie das Fach in den Plattenleser. Um zu vermeiden, maximale Fluoreszenzwerte zu erreichen, stellen Sie sicher der Verstärkungswert eingestellt wird. Dazu führen Sie so eine Verstärkungseinstellung an einem der infizierten Wells, die Reverse-transfiziert mit OTP siRNA wurde. Dies entspricht der höchsten erwarteten Translokation.
    6. Wählen Sie das Start Messung alle geeigneten Vertiefungen mit Boden Fluoreszenz bei einer Anregung von 410 nm und einer Emission von sowohl 450 nm und 520 nm für blaue und grüne Fluoreszenz zu messen sind.

7. Analyse der Ergebnisse:

  1. Berechnen Sie das Verhältnisvon 450 nm bis 520 nm (blau bis grün) für alle Proben nach Leer Reduktion und zur nicht infizierten OTP Probe relativ auszudrücken.
    Hinweis: Die folgenden Analyseschritte sind für ein einfaches Kalkulationsprogramm zur Verfügung gestellt.
    1. Mit der Exportfunktion auf den Mikroplatten - Reader, übertragen Sie die Rohwerte Fluoreszenz sowohl für 520 nm und 450 nm Emissionswellenlängen erhalten (6,5) in eine Tabelle.
    2. Berechnen Sie den Mittelwert der "leeren" Lesungen (Medien nur, keine Zellen) für die 520 nm Wellenlänge durch Zugabe der rohen 520 nm Fluoreszenzwerte und dividiert durch die Anzahl der Vertiefungen (3). Wiederholen Sie die Leer 450 nm Wellenlänge Werten. Diese Werte stellen die Hintergrundfluoreszenz aufgrund der 96-Well-Platte und Medien.
    3. Ziehen Sie die Hintergrundfluoreszenz. Unter Verwendung der erhaltenen Werte in 7.1.2 subtrahieren den Mittelwert des Rohlings 520 nm Wellenlänge , die von allen Proben 520 nm Fluoreszenzwerte. Wiederholen Sie dies für die 450 nm Wellenlänge Werte.
    4. So erhalten die 450: 520 nm Verhältnis der Leer korrigierten Werte verwenden (7.1.3). Teilen Sie jede Probe 450 nm Fluoreszenzwert durch seine 520 nm Wert entspricht.
    5. Berechne den Mittelwert der nicht infizierten OTP Verhältniswerte durch die Zugabe von 450: 520 nm Verhältniswerte (von 7.1.4) und Dividieren durch die Anzahl von Vertiefungen (3).
    6. Berechnen des Verhältnisses der Proben relativ zu uninfizierten OTP durch das Dividieren 450: in 7.1.4 durch den Durchschnitt der nicht infizierten OTP Verhältniswert in 7.1.5 berechneten 520 nm - Verhältnis.

8. Zugabe von Nuclei Stain zu bestimmen Zellzahl nach der Translokation Assay (TAG 8)

  1. Folgende Quantifizierung der Fluoreszenz, entfernen Medien mit 6x Beladungslösung aus allen Vertiefungen unter Verwendung von entweder einem Mehrkanaladapter an eine Vakuumquelle angeschlossen oder von Hand mit einer Mehrkanalpipette.
  2. In 50 ul 4% PFA (Paraformaldehyd) Lösungin PBS zu allen geeigneten Vertiefungen Zellen zu fixieren. 20 min bei RT inkubiert.
  3. Entfernen Sie die 4% PFA PBS - Lösung (gemäß 8.1) und waschen Sie die Zellen zweimal mit 75 ul PBS.
  4. Werden 50 ul einer Zell permeable Kernfärbung, beispielsweise DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol), zu jeder Vertiefung. Erwerb von Bildern mit einem Fluoreszenzmikroskop und zu quantifizieren , die Anzahl der Kerne , die in jeder Vertiefung nach siRNA Behandlung mit geeigneten Bildanalysesoftware, wie ImageJ 41.

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Representative Results

Für diese Studie wurden die C. burnetii pBlaM-CBU0077 Stamm wurde ausgewählt als CBU0077 wurde zuvor ein transloziert Effektor des Coxiella Dot / Icm Sekretionssystem 17 gezeigt ist. Vor der Infektion, die Gesamtzahl der Genome / ml in der 7 Tage C. burnetii pBlaM-CBU0077 Kultur aufgezählt wurde qPCR unter Verwendung dar. 4 zeigt ein Beispiel des Zyklus Schwellenwert (Ct) -Werte von beiden Standards erwartet und Proben nach qPCR. Die Ct - Werte ( der grafischen Darstellung im Amplification Plot (4B) und numerisch (4C)) wurden in 4.3.3 beschrieben exportiert und analysiert. Auf der Grundlage der repräsentativen Daten gezeigt wird , gab es 2,31 × 10 8 Genome / ml in der 10 ml resuspendiert Bakterienkultur (4D). Um die geeignete bakterielle Verdünnung erzeugen (1,88 × 10 8 Genome / ml in 2 ml), 1,63 ml der resuspendierten Bakterien wurden zu 370 & mgr; l frischem, vorgewärmten DMEM + 10% FCS. Zellen mit siRNA transfizierten Reverse wurden anschließend mit C infiziert burnetii pBlaM-CBU0077 bei einer MOI von 300 für 24 Std.

Nach der Inkubation der reversen transfizierten-infizierten Zellen mit BlaM Substrat Quantifizierung von Effektorzellen Translokation kann unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenlesegerät bestimmt werden. Nach der Analyse , wie in 7, alle Verhältniswerte beschrieben, die auf nicht - infizierte OTP normalisiert worden sind , auch auf infizierte OTP normalisiert werden. Die Höhe der Effektor-Translokation nach Genen von Host-Silencing kann in drei Ergebnisse nach Vergleich zu infizierten OTP Steuerung gruppiert werden: (1) Keine Änderung; (2) Effektor Translokation erhöht wird; (3) Verringerte Effektor-Translokation. Die anschließende statistische Analyse, zum Beispiel ein Student t - Test, kann die Bedeutung jeder beobachtete Differenz t zu bestimmen , verwendet werden ,o infiziert OTP Kontrolle. Das Ergebnis entweder RAB5A oder Rab7A auf Effektorzellen Translokation aus drei unabhängigen Experimenten Silencing wird in 5A gezeigt. Eine signifikante Abnahme in der Höhe der BlaM-CBU0077 Translokation aufgetreten beide RAB5A und Rab7A im Vergleich zu OTP Kontrolle während der Silencing (p - Wert = 0,0088 (RAB5A) und p - Wert = 0,0059 (Rab7A), paarig, Student t - Test). Die Auswirkungen der siRNA-Behandlung auf die Lebensfähigkeit der Zellen wurde auch festgestellt. Nach der Translokation Assay wurden die Zellen fixiert, mit Kernen Färbung gefärbt und anschließend quantifiziert. Wie in 5C gezeigt, obwohl die Behandlung mit entweder RAB5A oder Rab7A führt zu einer Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen im Vergleich zu OTP Kontrolle (12% bzw. 31% betrugen), ist diese Verringerung nicht so schwerwiegend wie PLK1 ist (97%), ein Gen , bekannten um zu bewirken Zelltod (p-Wert = 0,0102 (RAB5A); p-Wert = 0,0081 (Rab7A); p-Wert <0,0001 (PLK1), paarig, Student t-Test). Diese Ergebnisse zeigen, wie der Host-Silencing-genes siRNA verwendet, kann sich negativ auf die Ebenen der bakteriellen Effektor-Translokation verändern.

Abbildung 1
Abbildung 1. Der Wirkmechanismus des BlaM Substrat während der Infektion. C. burnetii wird von Wirtszellen aufgenommen und bildet eine Lysosom abgeleitete Vakuole die Coxiella -haltigen Vakuole bezeichnet. 24 Stunden nach der Infektion werden die Zellen mit der Membran permeabel BlaM Substrat geladen , das zwei Fluorophore Bilden eines FRET - Paars (A) besitzt. In der Abwesenheit von β-Lactamase dh keine Translokation des BlaM-CBU0077 Effektor, Anregung des Coumarin an 410 nm Ergebnisse in FRET zu Fluorescein, als grünes Fluoreszenzsignal beobachtet (520 nm) (B). im Falle eines funktionellen Dot / Icm Sekretionssystem, das BlaM-CBU0077 Fusionsprotein wird in die Wirtszelle transloziert und cleave das BlaM Substrat, über β-Lactamase - Aktivität, die Trennung der beiden Farbstoffe verursachen und was zu FRET Unterbrechung und einem blauen Fluoreszenzsignal (450 nm) nach Anregung bei 410 nm (C). Die beiden grünen und blauen Fluoreszenzsignale können sein mit Hilfe eines Fluoreszenzplattenlesegerät erkannt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
. Abbildung 2. Schematische Übersicht über die Reverse - Transfektion und Translokation Assay Workflow - Tag 1: Bereiten Sie die C. burnetii pBlaM-CBU0077 Kultur . 4. Tag: Reverse - transfizierbaren unter Verwendung von 40 nM siRNA und Samen HeLa - 229 - Zellen bei einer Enddichte von 3,92 × 10 3 Zellen / Well in einer 96-Well - Fach Tag 5: Ch .ange Medien . 7. Tag: Quantifizieren die gesamten Genome / ml des C. burnetii pBlaM-CBU0077 Kultur qPCR verwendet und anschließend infizieren Reverse - Zellen , die mit einer MOI von 300 . 8. Tag: In 6x Lade Farbstoff, Fluoreszenz messen und die Zellzahl quantifizieren Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Die 96-Well - Platte - Layout verwendet , um den Reverse - Transfektion und Seeding von HeLa - 229 - Zellen ein. Die "leeren" Brunnen (in rot dargestellt) enthalten Medien nur und brauchen nicht auf die Zugabe von entweder siRNA oder HeLa - 229 - Zellen. Die OTP siRNA (in hellblau für nicht infizierte Brunnen und dunkelblau für infizierte Brunnen gezeigt) ist als nicht-Targeting-Steuerung verwendet, da es optimiert wurdeweniger Nebeneffekte haben. Die kastanienbraun und grün Brunnen stellen die RAB5A und Rab7A siRNA, respectively. PLK1 siRNA (gelb dargestellt) als Maß für die Transfektionseffizienz verwendet wird als Verlust der PLK1 - Expression kann pro-apoptotische Wege induzieren und umfangreiche Zelltod in einer großen Mehrheit der Zelllinien. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Repräsentative qPCR Ct - Werte verwendet , um die Gesamtzahl der Genome / ml in C quantitativ zu bestimmen burnetii pBlaM-CBU0077 Kultur. (A) Die Zyklusbedingungen in der qPCR verwendet , um die Anzahl der Genome / ml in Coxiella Kulturen aufzuzählen. Die Ct - Werte für beide Standards und Proben werden in grafischen (B) und numerische (C) dargestellt wirdFormate. (D) Die Standard - Ct - Werte wurden gemittelt, grafisch dargestellt und eine logarithmische Trendlinie berechnet. Unter Verwendung der Gleichung und die Mittelwerte der Probe Ct schätzt die Gesamtzahl der Genome / ml in der C burnetii pBlaM-CBU0077 Kultur wurde bestimmt 2,31 × 10 8 sein. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Translokation des Dot / Icm Effektor BlaM-CBU0077 während siRNA Silencing von RAB5A und Rab7A. HeLa - 229 - Zellen wurden Reverse - transfiziert mit siRNA spezifisch RAB5A (kastanienbraun Balken), Rab7A (grüne Balken), OTP (blaue Balken) oder PLK1 (gelbe Balken) und 72 Stunden vor der Infektion mit dem C inkubiert burnetii pBlaM-CBU0077 Stamm bei einer MOI von 300 für 24 Stunden. Nach ter Zugabe des BlaM Substrat, Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines Mikrotiterplatten - Lesegerät gemessen (A) Die Tabelle der rohen Fluoreszenzwerte zeigt , aus einem einzigen Experiment erhalten neben dem 450:. 520 nm - Verhältnis in Bezug auf nicht - infizierte OTP Kontrolle nach Abzug der Leerwerte (Medien nur, keine Zellen). Die Höhe der Translokation (B) und die Lebensfähigkeit der Zellen (C) als Prozentsatz Mittelwert ± Standardabweichung , bezogen auf OTP Reverse transfizierten infizierten Zellen aus drei unabhängigen Experimenten dargestellt. * P-Wert <0,05; ** P-Wert <0,01; **** P-Wert <0,0001 (gepaart, Student t -Test). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Komponente Konzentration
Zitronensäure 13,4 mM
Natriumcitrat 16,1 mM
Kaliumphosphat 3,67 mM
Magnesiumchlorid 1 mM
Calciumchlorid 0,02 mM
Eisensulfat 0,01 mM
Kochsalz 125,4 mM
L-Cystein 1,5 mM
Neopepton 0,1 g / L
Casaminosäuren 2,5 g / L
Methyl-beta-Cyclodextrin 1 g / L
RPMI 125 ml / L

Tabelle 1. Die Komponenten erforderlich , um 1x ACCM-2.

Tabelle 2. Volumen von 1x siRNA Buffer Erforderlich für Feuchtigkeitsspend Lyophilized siRNA auf die geeignete Konzentration.

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Discussion

Sekret-Systeme sowie der bakteriellen Effektor-Proteine ​​diese Systeme Transport in das Zytoplasma der Wirtszellen, sind eine wichtige Komponente, die Virulenz viele pathogene Bakterien verwenden, um eine Infektion innerhalb von einzigartigen replikativen Nischen zu etablieren. Im Mittelpunkt vieler Forschungsgruppen wurde das Zusammenspiel zwischen bakteriellen Effektoren und Wirtsproteinen und dem Einfluss diese Effektoren auf Host zellulären Wege haben zu untersuchen. Sehr begrenzte Forschung, wenn überhaupt, hat das Potenzial für Wirtsproteine ​​untersucht, für eine erfolgreiche bakterielle Effektor Translokation erforderlich.

In dieser Studie verwendeten wir die obligate, intrazelluläre Erreger Coxiella burnetii, der Erreger der Zoonose - Q - Fieber. Nach dem Eintritt in die Wirtszellen, die Verkehre Coxiella -haltigen Vakuole passiv durch die kanonische endocytischen Weg bis zur sauren Lysosom-derived Vakuole Erreichen wo sie zu sehr hohen Zahlen repliziert. Neben advanta Einnahmege des normalen Wirtshandel Pathway, die Fähigkeit von Coxiella eine erfolgreiche replikativen Nische zu etablieren stützt sich auch auf eine funktionelle Aktivität IVB Sekretionssystem (T4SS) und anschließender Translokation Effektor 8,17. Dieses Sekret System ist funktionell analog zu dem gut charakterisierten Dot / Icm T4SS von Legionellen. Dies wurde treffend durch die Ergänzung spezifischen Punkt / icm Mutanten von Legionellen mit ihren jeweiligen Coxiella Gene 19,20 demonstriert. Obwohl die T4SSs sowohl Legionellen und Coxiella für die Replikation wesentlich sind, der Zeitpunkt , wenn diese Systeme aktiviert werden , ist ganz anders und spiegelt die divergenten Natur der jeweiligen replikativen Nischen. Die Legionellen T4SS wird ausgelöst , unmittelbar nach dem Kontakt mit Wirtszellen und die schnelle Translokation von Effektoren können die Bakterien , die die Standard - Endosomen-Lysosomen Weg zu vermeiden und stattdessen eine einzigartige ER abgeleitete replikativen Vakuum schaffenle 42. Im Gegensatz dazu ist die saure Lysosom abgeleitete Vakuole 21 die T4SS von Coxiella erst ca. 8 Stunden nach der Infektion, nachdem die Bakterien erreichen aktiviert.

Da Coxiella Transite passiv durch die endocytischen und Translokationssystem wird erst aktiviert , wenn es das Lysosom erreicht, eine einmalige Gelegenheit bietet sich Coxiella als Werkzeug zu benutzen endocytic Reifung zu studieren. Die Anforderung an die CCV angesäuert werden, bevor Effektoren transloziert werden, zeigt, dass eine Reihe von Wirtsproteinen wichtig sind für die Translokation von Effektor-Proteine ​​in den Wirts Zytoplasma, insbesondere, aber nicht beschränkt auf, Proteine ​​im endozytischen Stoffwechselweg beteiligt Handel. Unter Verwendung siRNA in einer bestimmten gezielt können wir beginnen, die Rolle bestimmter Wirtsproteine ​​auf Effektor-Translokation aufzuklären. In dieser Studie konzentrierten wir uns auf zwei Proteine, die die eukaryotische endocytic trafficki regulierenng Weg und daher vorhergesagt wurden Translokation des Coxiella Effektor CBU0077 zu bewirken. RAB5A und Rab7A Kontrolle der Membranfusion mit frühen und späten Endosomen sind. Silencing entweder dieser Proteine ​​siRNA unter Verwendung resultierte in einer signifikanten Abnahme der Translokation Effizienz CBU0077 zur Kontroll OTP siRNA (5B) verglichen. Die repräsentativen hier gezeigten Ergebnisse spiegeln unsere bisherigen veröffentlichten Ergebnisse 21 und eine weitere Bestätigung für die Bedeutung dieser menschlichen Rab - Proteine ​​zu Coxiella Effektor Translokation bereitzustellen. Diese Technik wurde auch eingesetzt worden , um die Auswirkungen der anderen Host - Prozesse auf Coxiella Dot / Icm Effektor - Translokation zu charakterisieren. Der Retromer Komplex wurde gefunden für die intrazelluläre Replikation von Coxiella wichtig zu sein. Durch Retromer Komponenten zum Schweigen zu bringen, mit siRNA, und dann eine Translokation Assay führen wir, dass Retromer erforderlich ist, zeigen könnte, die Umwelt, die induziert zu schaffenCoxiella Effektor - Translokation 43.

Obwohl die repräsentative Ergebnisse hier ist ein Vergleich zwischen infizierten OTP Steuerung gezeigt und siRNA Targeting RAB5A und Rab7A kann das Protokoll nach experimentellen Anforderungen modifiziert werden. Beispielsweise kann auch die Höhe der Effektor-Translokation an Zellen verglichen werden mit verwürfelten siRNA transfizierten oder nicht-transfizierten Zellen.

Der Schwerpunkt dieser speziellen Studie war die obligate, intrazelluläre Erreger C. burnetii und Proteine ​​in endozytischen Handel beteiligt sind jedoch die im beschriebenen Verfahren leicht an andere intra- und extrazellulären Pathogenen angepasst werden kann , die Sekretionssysteme zur Virulenz zu nutzen. Tatsächlich ist die Fluoreszenz-basierten Assays Translokation , die hier auf β-Lactamase - Aktivität in dem Wirt Zytoplasma beruht, verwendet wurde , in einer Reihe von Krankheitserregern 30-32,35,44 bereits extensiv genutzt. Natürlich sind die Infektionsbedingungen derspezifische Zelllinien verwendet werden, müssen die Infektion Anforderungen bestimmter Bakterien zu reflektieren angepasst werden. Zusätzlich verschmolzenen eine bekannte endogene Effektor zu ß-Lactamase auf dem Erfolg der Methoden innerhalb beschrieben höchster Bedeutung ist. Eine wichtige Überlegung für eine erfolgreiche Umsetzung des Protokolls erklärt hier ist der Einfluss eines bestimmten Host verstummen auf bakterielle und die anschließende Replikation haben könnte. Hier Effektor Translokation von Coxiella wird 24 Stunden nach der Infektion gemessen. In diesem Fall und anderen intrazellulären Bakterien, die Fähigkeit des Organismus, den Eintritt in die Wirtszellen zu gewinnen, ist von entscheidender Bedeutung. Zusätzlich könnten spezifische Gen-Silencing daher bakterielle Replikation beeinflussen auch beobachtet, das Niveau der Translokation zu verändern. Bestätigung, dass siRNA silencing nicht wesentlich Bakterieneintrag Schlag- und / oder Replikation und folglich Translokation Effizienz, könnte entweder Mikroskopie oder numeration von Bakterien erreicht. Die TranslokationDaten können dann für die Anzahl der infizierten Zellen pro siRNA Behandlung normalisiert werden. Bakterielle Replikation hat die hier präsentierten Daten nicht verwechselt als Coxiella wenig während der 24 Stunden Inkubationszeit keine Replikation durchläuft.

Dieses Verfahren erfordert eine effiziente Transfektion von siRNA in Wirtszellen eine ausreichende Inaktivierung des Gens von Interesse zu gewährleisten. In diesem Sinne, die Wahl des richtigen Transfektionsreagenz ist extrem wichtig. Neben dem Reagenz Bedingungen in dieser speziellen Studie verwendet, die für HeLa 229-Zellen optimiert worden ist, gibt es zahlreiche andere Reagenzien zur Auswahl. Die Zuschlags Effizienz verschiedene Transfektionsreagenzien verwendet, kann mittels RT-qPCR quantifiziert werden, um sicherzustellen, dass sowohl die am besten geeignete Reagens ausgewählt ist, und dass die siRNA gewählt zielt speziell auf das Transkript von Interesse. Obwohl nicht in dieser Studie präsentierten, haben wir bereits gezeigt, den Zuschlag Effizienz sowohl RAB5A und Rab7A RT mit-qPCR 21. Darüber hinaus kann die Verwendung von Antikörpern gegen das Ziel von Interesse und Bestätigung durch Western-Blot auch siRNA-Silencing bestimmter Ziele bestätigen.

Zwei weitere wichtige Überlegungen zur Kenntnis zu nehmen bei der Verwendung von siRNA beinhalten die Möglichkeit eines Off-Target-Effekte und die Lebensfähigkeit der Zellen transfizierter Zellen. Off-Target-Effekte auftreten, wenn unbeabsichtigte Ziele auch zerstört werden. Dies kann zu phänotypischen Veränderungen führen und in False Positives führen könnte. In dieser Studie verwendeten wir einen Pool von vier siRNA-Duplexe einen einzelnen Host Ziel zum Schweigen zu bringen. Wenn ein bestimmtes Ziel-Silencing bewirkt eine Verringerung der Effizienz der Translokation, Validierung, dass dieses Ergebnis zu Nebeneffekte können aufgrund ist durch die Trennung der vier siRNA-Duplexe und Wiederholen der Translokation Assay erreicht werden. Mindestens zwei von vier siRNA-Duplexe sollte einen ähnlichen Phänotyp zur ursprünglichen siRNA Pool demonstrieren. Mit diesem Ergebnis kann man sehr zuversichtlich sein, dass der beobachtete translocation Effizienz ist zu Off-Target-Effekte zurückzuführen. Die Gültigkeit der Translokation Ergebnissen ist auch abhängig von der Lebensfähigkeit der Zellen. Die Anwendung einer Kerne Flecken nach der Translokation Assay ermöglicht Enumeration der Zellviabilität folgenden siRNA silencing. Im Falle von PLK1 können signifikante Zelltod leicht ohne Anfärbung beobachtet werden; jedoch unter Verwendung von Epifluoreszenzmikroskopie eine genauere Darstellung erreicht werden. Wenn durch einen bestimmten Host Ziel signifikanten Zelltod Silencing beobachtet wird, beispielsweise 50% im Vergleich zur Kontrolle, es unwahrscheinlich ist, dass ein genaues Bild kann als auf die Bedeutung des jeweiligen Wirtsprotein an die Translokation von Effektoren zu entnehmen. Wie in dieser Studie gezeigt, obwohl zum Schweigen zu bringen entweder RAB5A oder Rab7A geringe Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen (5C) hat, wird diese Reduktion nicht genug , um zu negieren die Gültigkeit der Translokation Daten beobachtet ausgeprägt. Eine weitere Überlegung in Bezug auf die Lebensfähigkeit der Zellen FollsiRNA-Silencing aufgrund der Beobachtung, dass signifikante Zelltod zu einer Erhöhung der Translokation Verhältnis führt häufig. Dies wird passend durch die Translokation Daten für PLK1 (5A) berichtet demonstriert. Die Reduzierung der Zellzahl führt zu einer proportionalen Erhöhung der Vielzahl der Infektion. Dies wird die Infektionsrate zu erhöhen und damit die Translokation Verhältnis.

Obwohl nicht in dieser Studie vorgestellt, die Visualisierung der Effektor-Translokation kann auch ein kostenloses quantitatives Ergebnis ergeben. ein Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem Langpass dichroitischen Spiegel zur Trennung von Anregungs- und Emissionslicht kann eine visuelle Beobachtung von intrazellulären BlaM Substrat Fluoreszenz bereitzustellen angebracht werden. Eine mögliche Alternative zur β-Lactamase-Reportersystem ist, die Adenylat-Cyclase-Reportersystem zu verwenden. Ähnlich wie bei dem Reportersystem hier beschrieben, wird das Gen von Interesse zu einer Calmodulin-abhängigen Adenylatcyclase-Gen fusioniert (cyaA Bordetella pertussis abgeleitet. Effektor-Translokation kann durch Quantifizierung der intrazellulären zyklischen AMP (cAMP) unter Verwendung eines Immunoassay ELISA-Kit gemessen werden. Da die Aktivität des CyaA auf Wirtszelle Calmodulin völlig abhängig ist, die nur in dem Host-Cytosol, wird Effektor Translokation durch eine Zunahme der cAMP-Werte bestätigt. Obwohl dieses Verfahren auch 45-47, Quantifizierung von intrazellulärem cAMP für eine Vielzahl von Bakterien erfolgreich Effektor Translokation Messung beruht auf der Lyse der Wirtszellen zu extrahieren cAMP, ein Prozess, der mehr zeitraubend ist im Vergleich zu der in beschriebenen Verfahrens verwendet wurde. Messung der Effektor Translokation des FRET-basierten β-Lactamase-Reportersystem ist effizienter, da die BlaM Substrat direkt zu den Zellen gegeben werden kann, und Fluoreszenz kann innerhalb von Stunden gemessen werden. Zusätzlich kann die Methode, die hier beschrieben werden leicht angepasst Hochdurchsatz-Ergebnisse zu erzeugen, insbesondere in einem 96-Well-Formbeim.

Viele bakterielle Erreger sind abhängig von Protein Translokationssystemen Effektor-Proteine ​​in Wirtszellen einzuführen ermöglicht Modulation von Wirtszellfunktionen des Erregers zu profitieren. Typ IV Sekretion Systeme werden durch intrazelluläre Bakterien wie Legionellen, Coxiella und Brucella und Typ - III - Sekretionssystem Systeme werden durch eine Reihe von Krankheitserregern einschließlich Chlamydien, Befestigung und effacing E. genutzt verwendet coli und Salmonella. Durch einen Vergleich kann die Wirkung der Schalldämpfungs Expression von spezifischen Wirtsproteine ​​auf Effektorzellen Translokation durch eine Reihe von Krankheitserreger, ein Verständnis von Wirtsfaktoren, die für Effektorfunktionen Translokation durch bestimmte Arten von Sekretionssystemen oder spezifisch für einen einzelnen Erreger erläutert. Dies bietet einen einzigartigen Ansatz, die Feinheiten der Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen.

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Materials

Zielkonzentration
1 uM 5 & mgr; M 10 uM 20 uM
Ab Moles
1 nmol 1 ml 200 ul 100 ul 50 ul
2 nmol 2 ml 400 ul 200 ul 100 ul
5 nmol 5 ml 1 ml 500 ul 250 ul
10 nmol 10 ml 2 ml 1 ml 500 ul
20 nmol 20 ml 4 ml 2 ml 1 ml
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Citric acid Sigma C0759 ACCM-2 medium component
Sodium citrate Sigma S4641 ACCM-2 medium component
Potassium phosphate Sigma 60218 ACCM-2 medium component
Magnesium chloride Calbiochem 442611 ACCM-2 medium component
Calcium chloride Sigma C5080 ACCM-2 medium component
Iron sulfate Fisher S93248 ACCM-2 medium component
Sodium chloride Sigma S9625 ACCM-2 medium component
L-cysteine Sigma C6852 ACCM-2 medium component
Bacto-neopeptone BD 211681 ACCM-2 medium component
Casamino acids Fisher BP1424 ACCM-2 medium component
Methyl beta cyclodextrin Sigma C4555 ACCM-2 medium component
RPMI + Glutamax ThermoFisher Scientific 61870-036 ACCM-2 medium component
Chloramphenicol Sigma C0378 For bacterial culture
ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP) Dharmacon D-001810-10-05 Non-targeting control
siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-003290-01-005 Causes cell death; measure of transfection efficiency
siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-004009-00-0005
siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-010388-00-0005
5x siRNA buffer Dharmacon B-002000-UB-100 Use sterile RNase-free water to dilute 5x siRNA buffer to 1x siRNA buffer
DharmaFECT-1 Transfection Reagent Dharmacon T-2001-01 For transfection
Opti-MEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 51985-034 Reduced-serum medium used for transfection
DMEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 10567-014 For cell culture and infection
Heat-inactivated fetal calf serum (FCS) Thermo Scientific SH30071.03 Can use alternate equivalent product
DMSO Sigma D8418 For storage of Coxiella strain
PBS For cell culture
0.05% Trypsin + EDTA ThermoFisher Scientific 25300-054 For cell culture
dH2O For dilution of samples and standards for qPCR
Quick-gDNA Mini Prep ZYMO Research D3007 Can use alternate equivalent product to extract gDNA
SensiFAST SYBR No-ROX Kit Bioline BIO-98020 Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction
LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM Invitrogen K1032 For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)
Sodium hydroxide Merck 106469 Probenicid solution component
Sodium phosphate monobasic Sigma 71505 Probenicid solution component
di-Sodium hydrogen orthophosphate Merck 106586 Probenicid solution component
Probenicid Sigma P8761 Probenicid solution component
DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) ThermoFisher Scientific 62251 Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS. 
4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS Sigma P6148 Fixing solution for HeLa 229 cells
25 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430639 For growth of bacterial strain
96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile Corning 3603
75 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430641 For growth of HeLa 229 cells
175 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 431080 For growth of HeLa 229 cells
Haemocytometer For quantification of HeLa 229 cells
Tear-A-Way 96 Well PCR plates 4titude 4ti-0750/TA For qPCR reaction
8-Lid chain, flat Sarstedt 65.989.002 For qPCR reaction
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Bench top microfuge
Bench top vortex
Orbital mixer
Centrifuge Eppendorf 5810 R For pelleting bacterial culture
Nanodrop For gDNA quantification
Mx3005P QPCR machine Aligent Technologies 401456 For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture
ClarioSTAR microplate reader BMG LabTech For measurement of fluorescence

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References

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Die Infektion Ausgabe 113 Wirt-Pathogen-Interaktionen bakterielle Sekretion Systeme β-Lactamase-Translokation Assay BlaM Substrat Fluoreszenz Mikrobiologie intrazelluläre bakterielle Erreger, Gen-Silencing siRNA Molekularbiologie
Anwenden von Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) zu untersuchen Effektor Translokation Effizienz durch<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Während siRNA Silencing
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Newton, P., Latomanski, E. A.,… More

Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing. J. Vis. Exp. (113), e54210, doi:10.3791/54210 (2016).

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