Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Anvendelse fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) til at undersøge Effector translokationseffektivitet af Published: July 6, 2016 doi: 10.3791/54210
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, University of Melbourne

Summary

Undersøge samspillet mellem bakterielle patogener og deres værter er et vigtigt område for biologisk forskning. Her beskriver vi de nødvendige teknikker til at måle effektor translokation af Coxiella burnetii under siRNA gendæmpning hjælp BlaM substrat.

Abstract

Coxiella burnetii, det agens af Q-feber, er et intracellulært patogen, der bygger på en type IV Dot / Icm Sekretion System at etablere et replikativt niche. En kohorte af effektorer translokeres via dette system i værtscellen til at manipulere vært processer og tillade etableringen af ​​et unikt lysosom-afledt vacuole for replikation. Fremgangsmåden præsenteres her involverer kombinationen af ​​to veletablerede teknikker: specifik gendæmpning hjælp siRNA og måling af effektor translokation anvendelse af en FRET-baseret substrat, der er afhængig af β-lactamase-aktivitet. Anvendelsen af ​​disse to tilgange, kan vi begynde at forstå betydningen af ​​værten faktorer i bakteriel sekretion-system funktion og effektor translokation. I dette studie undersøgte vi rollen som Rab5A og Rab7A, som begge er vigtige regulatorer af endocytiske trafficking pathway. Vi viser, at silencing ekspressionen af ​​enten protein resulterer i en formindskelse af effektor translocation effektivitet. Disse fremgangsmåder kan let modificeres til at undersøge andre intracellulære og ekstracellulære patogener, der også udnytter sekretionssystemer. På denne måde kan et samlet billede af værten faktorer involveret i bakteriel effektor translokation blive afsløret.

Introduction

Coxiella burnetii er en unik intracellulært patogen, som forårsager den zoonotiske infektioner hos mennesker Q-feber. Denne sygdom er forbundet med et bredt spektrum af kliniske præsentationer strækker sig fra asymptomatisk serokonversion til livstruende kronisk infektion, som ofte manifesterer sig som endocarditis år efter eksponering 1. Menneskelig infektion forekommer primært gennem indånding af forurenede aerosoler med drøvtyggere den største reservoir for infektion, især malkekøer, får og geder. Selv Coxiella infektion i disse dyr er typisk subklinisk, kan infektionen udløse abort og den betydelige bakterielle belastning i fødende væske og placenta kan forurene det lokale miljø en. Et eksempel på den enorme byrde sådan kontaminering kan have på både folkesundheden og landbrugsindustrien blev for nylig observeret i Q-feber udbrud, der fandt sted i Holland 2. Mellem 2007 og2010 blev over 4.000 humane tilfælde af Q-feber diagnosticeret og dette udbrud var forbundet med betydelig forurening af ged gårde 3. Derudover Coxiella er en potentiel biologisk våben, som klassificeret af det amerikanske Centers for Disease Control og Forebyggelse, på grund af den miljømæssige stabilitet bakterier og lav infektiøs dosis nødvendig for at forårsage alvorlig sygelighed og dødelighed 4.

Coxiella eksisterer i to faser: Fase I organismer, isoleret fra naturlige kilder, er yderst virulent og fase II organismer er stærkt svækket in vivo. For eksempel, efter flere in vitro passager af Coxiella burnetii Nine Mile Fase I organismer, blev fase II bakterier produceres der indeholder en irreversibel kromosomal deletion resulterer i afkortede lipopolysaccharid (LPS) 5. Denne stamme, C. burnetii NMII, er fænotypisk svarer til fase I i vævskultur modeller og giver en mere sikker tilstandl for forskerne at studere Coxiella patogenese i laboratorier 5. I de senere år har flere gennembrud hurtigt avancerede inden for Coxiella genetik. Mest bemærkelsesværdigt, udvikling af axenisk medier (syrnet citrat cystein medium - ACCM-2) har tilladt celle-fri vækst i Coxiella i både flydende og faste medier 6,7. Dette resulterede i direkte forbedringer af genetiske værktøjer til rådighed for Coxiella herunder et inducerbart genekspression systemet, shuttle vektorer og tilfældige transposon systemer 8-11. Senest har to metoder til målrettet gen inaktivering også blevet udviklet, hvilket banede vejen for behandlingen specifikke virulens gen kandidater 12.

Efter internalisering af alveolære makrofager, Coxiella replikerer til høje numre i en membranbundet rum betegnet Coxiella- indeholdende vacuolen (CCV). Den CCV kræver vært endocytiske handel thru tidlige og sene endosomer indtil det modnes til en lysosomer-afledt organel 13. I hele denne proces, CCV erhverver værten faktorer, enten vises forbigående eller forblive forbundet med vakuolet, herunder, men ikke begrænset til, Rab5, Rab7, CD63 og LAMP-1 13-15. Replikation af Coxiella inden værtsceller er helt afhængig af en fuldt funktionel Dot / Icm Type IVB Sekretion System (T4SS) 8,16,17. Denne sekretion system er en multi-proteinstruktur ancestrally relateret konjugering systemer og strækker sig over begge bakterielle og vakuolære membraner til at levere bakterielle proteiner, betegnet effektorer, i værtens cytoplasma 18. Coxiella T4SS er funktionelt meget lig den velkarakteriserede Type IVB Dot / Icm Sekretion System af Legionella pneumophila 19,20. Interessant nok aktivering af T4SS og efterfølgende effektor translokation ikke før Coxiella når den sure lysosomet-afledteorganel, ca. 8 timer efter infektion 17,21. Til dato har over 130 Dot / .icm effektorer blevet identificeret 9,17,22-24. Mange af disse effektorer sandsynligvis spiller en vigtig rolle under replikation af Coxiella inden værtsceller; har dog kun få effektorer blevet funktionelt karakteriseret 25-29.

I denne undersøgelse anvender vi en fluorescens baseret translokation assay, der bygger på spaltning af CCF2-AM FRET substrat (i det følgende benævnt BlaM substrat) via β-lactamase-aktivitet i værtscellen cytoplasma (figur 1). Genet af interesse er fusioneret til TEM-1 β-lactamase (BlaM) på et reporterplasmid, der tilvejebringer konstitutiv ekspression. Den BlaM Bundlaget består af to fluorophorer (coumarin og fluorescein), som danner et FRET-par. Excitation af coumarin resultater i FRET af fluorescein og grøn fluorescensemission i fraværet af effektor translokation; Men hvis BlaM-effektor-fusionsproteinet translokeres i værtens cytoplasma, den resulterende β-lactamase-aktivitet spalter β-lactamringen af ​​BlaM substratet, adskillelse af FRET-par producerer blå fluorescensemission efter excitation. Denne translokation assay er blevet godt bevist som en tilgang til at identificere effektor proteiner fra en række forskellige intracellulære og ekstracellulære bakterier, herunder C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatogene E. coli, salmonella og Brucella 17,30-35.

For at fastlægge den rolle, specifikke vært faktorer på Coxiella effektor translokation vi udnytte en veletableret metode til gendæmpning kaldet RNA-interferens, især små interfererende RNA (siRNA). Oprindeligt identificeret i Caenorhabditis elegans, RNA-interferens er et bevaret endogen cellulær proces, der anvendes til medfødte FORSVARSPOLITIKNSE mod virus samt genregulering 36,37. Efter binding af sekvens-specifikke siRNA, nedbrydning af mRNA forekommer gennem RISC (RNA-induceret silencing kompleks) resulterer i specifikt gen-nedregulering eller knockdown 38. I denne undersøgelse blev siRNA anvendes til at målrette to værtsproteiner, Rab5A og Rab7A, som er vigtige regulatorer af endocytiske proces. Virkningen af lyddæmpning Rab5A og Rab7A på effektor translokation blev konstateret ved hjælp af C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 blev valgt som det var tidligere vist at være omplantes af Dot / Icm sekretion system Coxiella 17.

Ved hjælp både siRNA gendæmpning og fluorescencebased translokation assay beskrives her, er vi begyndt at etablere en rolle for værten faktorer i translokationen af effektor proteiner ved Coxiella. Denne fremgangsmåde kan anvendes til en bred vifte af både intracellulære og ekstracellulære bakterier, der besidder lignende secretion-systemer, der er ansvarlige for translokation af effektor proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Alle procedurer, der omfatter vækst eller manipulation af Coxiella burnetii RSA439 NMII bør udføres i en fysisk indeslutning niveau 2 Laboratorium og inden for en biologisk sikkerhedsskab i overensstemmelse med lokale retningslinjer. Et skematisk diagram af den omvendte transfektion og translokation assay arbejdsgang er beskrevet nedenfor, er vist i figur 2.

1. Fremstilling af C. burnetii Culture Udtrykke CBU0077 fusioneret til p-lactamase (pBlaM-CBU0077) (dag 1)

  1. Forbered 1X ACCM-2 6:
    1. Kombiner de komponenter, der er anført i tabel 1. Juster pH til 4,75 med 6 M NaOH og filter sterilisere (må ikke autoklaveres). ACCM-2 er stabil i ca. tre uger opbevaret ved 4 ° C.
  2. Generer C. burnetii pBlaM-CBU0077 bestande.
    1. Infect HeLa 229-celler med C. burnetii stamme, der bærer pBlaM-CBU0077 og passage indtil store vacuoles observeres i de fleste celler.
      1. Grow C. burnetii stamme, der bærer pBlaM-CBU0077 i 20 ml ACCM-2 indeholdende 3 ug / ml chloramphenicol i et 75 cm2 vævskulturkolbe med ventileret hætte i 7 dage ved 37 ° C i 5% CO2, 2,5% O2.
      2. Centrifugeres C. burnetii pBlaM-CBU0077 kultur ved 15.000 x g i 15 minutter ved stuetemperatur.
      3. Resuspender pellet i 20 ml DMEM + 10% føtalt kalveserum (FCS) + 3 ug / ml chloramphenicol (opretholdelsesmedium). Fjern medier fra et 50% sammenflydende 75 cm 2 kolbe af HeLa 229 celler. Tilføj resuspenderede C. burnetii til HeLa 229-celler. Inkuber i 2 dage ved 37 ° C i 5% CO2 for at tillade infektion af HeLa 229-celler for at etablere.
      4. Split celler i 175 cm2 vævskultur kolbe.
        1. Fjern medier fra 75 cm2 kolbe og vaskes monolaget to gange med 10 ml forvarmet PBS.
        2. Tilsæt 1 ml of 0,05% trypsin-EDTA-opløsning og placere celler ved 37 ° C + 5% CO2 i 3 - 5 min at løsne cellerne.
        3. Resuspender celler i 10 ml opretholdelsesmedium. Tilsættes 2 ml resuspenderede celler i en 175 cm2 kolbe, der indeholdt 38 ml opretholdelsesmedium.
        4. Der inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2 i yderligere 3 - 5 dage indtil 100% sammenflydning er nået, og der observeres store vakuoler.
    2. Saml supernatant fra 175 cm2 kolbe, der tilsættes 10 ml dH 2 O til at dække de inficerede HeLa 229 celler og inkuberes i 15 min for at lysere inficerede celler.
    3. Kombiner supernatanten og lyserede celler og pellet ved 15.000 x g i 15 minutter ved stuetemperatur.
    4. Re-suspendere pellet i 10 ml dH 2 O. Lyserer celler yderligere ved gentagne gange at passere resuspension gennem en 23G nål fastgjort til en 10 ml sprøjte mindst 20 gange. Pellet ved 500 x g i 5 minutter for at fjerne cellerester.
      5. <li> Fjern og pellet supernatant ved 15.000 x g i 15 minutter ved stuetemperatur til at indsamle C. burnetii.
    5. Re-suspendere C. burnetii i DMEM + 10% FCS og kvantificere antallet af bakterier, som pr 4. Fortynd til 1 × 10 9 genomer / ml med DMEM + 10% FCS + 10% dimethylsulfoxid (DMSO), alikvot 50 pi lagre i mikrocentrifugerør og opbevares ved -80 ° C.
  3. Inokulere 10 ml foropvarmet ACCM-2 indeholdende 3 ug / ml chloramphenicol med 20 pi C. burnetii pBlaM-CBU0077 stamme 17 (fra lagre genereret i 1,2 opbevaret ved -80 ° C) i en 25 cm 2 vævskultur kolbe med ventileret hætte. Grow bakteriekultur i 7 dage ved 37 ° C i 5% CO2, 2,5% O2.

2. Reverse Transfektion af siRNA og udsåning af HeLa 229-celler (DAY 4)

  1. Ved anvendelse af eksperimentelle siRNA for første gang forberedesiRNA som følger:
    1. Kort fortalt centrifugeres det lyofiliserede siRNA at sikre, at siRNA pelleten opsamles ved bunden af ​​røret.
    2. Resuspender pelleteret siRNA til en endelig koncentration af stamopløsning på 20 uM ved pipettering det passende volumen af 1x siRNA buffer (tabel 2).
    3. Pipetteres opløsningen op og ned 3 - 5 gange for at blande og sted på en orbital-blander i 30 minutter ved stuetemperatur, vende røret hver 5 - 10 min.
    4. Kort fortalt centrifugeres røret for at sikre, at siRNA opsamles ved bunden af ​​røret.
    5. Alikvot siRNA i 50 pi alikvoter i mikrofugerør og opbevares ved -20 ° C indtil brug.
    6. For at generere 1 uM arbejder koncentration af siRNA, pipette 950 pi 1X siRNA buffer i en 50 pi alikvot stamopløsning (20 uM), når det er nødvendigt. Bemærk: Denne 1 pM arbejder koncentration kan fryse-optøet flere gange for gentagne transfektioner.
  2. Placer DMEM + 10% FCS,0,05% trypsin-EDTA og PBS i et 37 ° C vandbad (eller tilsvarende) i 30 minutter til at varme før anvendelse.
  3. Fremstilling af transfektions- komponenter:
    Bemærk: Den følgende protokol er optimeret til HeLa 229-celler i en 96-brønds mikroplade med sorte vægge og flad, transparent bund. Optimering af mængden af ​​transfektionsreagens, kan koncentrationen af ​​siRNA og podningstæthed af celler være nødvendig for forskellige cellelinier.
    1. For hver brønd, bruge 0,1 pi transfektionsreagens, 15,9 pi nedsat serum medium (minimale væsentlige medier bruges til transfektioner Se Tabel of Materials) og 4 pi af en uM siRNA (hvilket resulterer i en endelig siRNA koncentration på 40 nM). Brug separate mikrocentrifugerør til OTP, PLK1, Rab5A og Rab7A. Mål hvert assay betingelse i tredobbeltbestemmelse. Et eksempel på en 96-brønds plade layout er vist i figur 3.
      Bemærk: Denne protokol indarbejder brugen af ​​to kontroller: OTP og PLK1. OTP ersammensat af fire poolet siRNA, der er optimeret for at reducere ikke-tilsigtede virkninger og således OTP anvendes som negative, ikke-targeting kontrol. Scrambled siRNA kunne også anvendes som en negativ kontrol. Tab af PLK1 ekspression resulterer i omfattende celledød i en række cellelinier ved at inducere pro-apoptotiske veje, og derfor PLK1 siRNA anvendes som positiv kontrol til transfektion hvor celledød korrelerer til transfektionseffektivitet.
      1. For hver forsøgsgruppe siRNA transfektion, kombinere 0,4 pi transfektionsreagens og 63,6 pi reduceret serum medium i en individuel mikrofugerør. Vortex alle mikrocentrifugerør og tillade komponenter til komplekse i 5 minutter ved stuetemperatur.
      2. Tilføj 16μl af hver eksperimentel siRNA til de tilsvarende mikrocentrifugerør indeholdende transfektion kompleks. Vortexes og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur. Bemærk: Det er vigtigt ikke at overskride 30 min, som transfektionseffektiviteten vil falde.
  4. Under 20 min incubation (2.3.1.2) tilsættes 20 ul af transfektion reagens + reduceret serum medium + siRNA mix i de relevante brønde af en steril sort, flad klar bund 96 brønde bakke.
  5. Så snart 20 min inkubationsperiode er fuldstændig, frø HeLa 229-celler med en densitet på 3,92 x 10 3 celler / brønd.
    1. Harvest HeLa 229-celler fra et sammenflydende eller sub-sammenflydende 75 cm 2 vævs- dyrkningskolbe i forvarmet DMEM + 10% FCS og resuspender celler til en endelig densitet på 4,9 x 10 4 celler / ml pr standard metoder. For at sikre transfektionseffektiviteten ikke kompromitteres, forberede celler under 20 min inkubationstiden (2.3.1.2).
      1. Vask monolaget af HeLa 229-celler to gange med 10 ml forvarmet PBS.
      2. Der tilsættes 1 ml 0,05% trypsin-EDTA-opløsning og sted HeLa 229-celler ved 37 ° C + 5% CO2 i 3 - 5 minutter for at frigøre celler.
      3. Indsamle celler i 9 ml forvarmet DMEM + 10% FCS. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer og forberede celler til en endelig densitet på 4,9 x 10 4 celler / ml ved anvendelse af DMEM + 10% FCS.
    2. Pipette 80 pi HeLa 229-celler ved densitet på 4,9 x 10 4 celler / ml i hver brønd, der indeholder den transfektionsreagens + reduceret serummedium + siRNA mix. Dette svarer til en celledensitet på 3,92 x 10 3 celler / brønd.
      Bemærk: Baggrund subtraktion er nødvendig for BlaM substratet.
      1. Tilføj ikke celler eller siRNA til "tomme" brønde (figur 3). I stedet tilsættes 80 pi DMEM + 10% FCS til disse brønde, der er i tre eksemplarer.
    3. Inkuber i 24 timer ved 37 ° C + 5% CO2.

3. Skift Media (Dag 5)

  1. Efter 24 timer, fjerne medier ved hjælp af en multikanal-adapter er knyttet til et vakuum kilde eller manuelt med en multi-kanal pipette, og erstatte med 100 ul frisk Forvarmed DMEM + 10% FCS.
  2. Inkuber i yderligere 48 timer ved 37 ° C + 5% CO2.
  3. På dette tidspunkt, kontrollere levedygtigheden af ​​celler visuelt under anvendelse af et standard lysmikroskop. Hvis den omvendte transfektion har været en succes, vil en betydelig celledød observeres i brøndene indeholder PLK1 siRNA forhold til OTP siRNA.

4. Kvantificering af Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 Strain hjælp qPCR (Dag 7)

  1. Efter 7 dages vækst i ACCM-2 ved 37 ° C i 5% CO2, 2,5% O2 (1,3) centrifugeres 10 ml C. burnetii pBlaM-CBU0077 kultur ved 15.000 x g i 15 minutter ved stuetemperatur.
  2. Re-suspendere den bakterielle pellet i 10 ml forvarmet DMEM + 10% FCS. Forbered 1:10 og 1: 100 fortyndinger af kulturen (prøve) ved anvendelse dH 2 O.
  3. Opsætning af komponenter, der kræves for qPCR.
    Bemærk: gDNA ekstraktion kan udføres i forvejen og opbevares ved -20 ° C UNTil påkrævet.
    1. Fremstilling af standarder:
      1. Uddrag gDNA fra Coxiella burnetii RSA439 NMII stamme vildtype dyrket i ACCM-2 ved 37 ° C i 5% CO2, 2,5% O2 i 7 dage under anvendelse af et gDNA ekstraktionskit, i henhold til producentens anvisninger.
      2. Mål gDNA fusion (g / pl) under anvendelse af en NanoDrop (eller tilsvarende) ved en absorbans på 260 nm.
      3. Beregn antal genom kopier pr pi hjælp af følgende formel nedenfor, og konvertere til antallet af genomer / ml.
        ligning
      4. Justere antallet af genomer / ml til 10 9 / ml (i et endeligt volumen på 100 pi) i en ny mikrocentrifugerør ved anvendelse dH 2 O. Dette kan koges i 10 minutter og opbevaret ved -20 ° C indtil brug.
      5. På dagen for infektionen, generere 10-gange serielle fortyndinger af 10 8 genomer / ml til 10 5 genomer / ml fra 10 9 genomets / ml stamopløsning.
        1. Afpipetteres 10 pi 10 9 genomer / ml i 90 pi dH2O at generere 10 8 genomer / ml. Vortex at blande. Afpipetteres 10 pi 10 8 genomer / ml i 90 pi dH2O at generere 10 7 genomer / ml. Vortex og gentag indtil 10 5 genomer / ml.
    2. Opsæt qPCR reaktion. Opret en master mix for 25 brønde til at redegøre for eventuelle pipetteringsfejl. For hver brønd, bruge 10 pi qPCR Master Mix; 2 pi ompA primer mix (4.3.2.2) og 3 pi dH 2 O.
      Bemærk: OmpA er en ydre-membranprotein af C. burnetii '39 og en 82-basepar sektion af en stærkt bevaret region blev udvalgt til anvendelse som en probe som tidligere 40 beskrevet.
      1. Oprette hver standard (dH 2 O, 10 5, 10 6, 10 7, 10 8, 10 9 genomer / ml) og prøve (1:10 og 1: 100 fortynding) i en 96-brønds PCR rivbart plade (ikke-skørt) to eller tre gange, henholdsvis. Tilsæt 5 pi prøve eller standard i de relevante brønde.
      2. Brug af dH2O, fortyndes både ompA fremadrettede primer (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') og OmpA revers primer (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') til en slutkoncentration på 4 uM og kombinere i den samme mikrofugerør.
        Bemærk: ompA primerblanding kan fremstilles i forvejen og opbevares ved -20 ° C indtil brug.
      3. Kombiner 250 pi qPCR Master Mix, 50 pi ompA primer mix, 75 pi dH 2 O og vortex at blande. Der tilsættes 15 ul af denne master mix til brønde, der indeholder enten standarder eller prøver.
      4. Placer 8-låg PCR bånd hætter på de relevante brønde og puls centrifuge PCR-rør for at sikre alt er indsamlet i bunden af ​​rørene.
      5. Opsæt følgende program på en kvantitativ PCR machine: 50 ° C i 2 min, 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 45 cykler af 95 ° C i 1 sek og 60 ° C i 20 sekunder (figur 4A).
    3. Analyser Ct (tærskel cyklus) værdier fra qPCR:
      1. Overfør Ct-værdier til et regneark ved hjælp af programmet eksport funktion.
      2. Opret en scatterplot af standarderne 10 5 genomer / ml igennem til 10 9 genomer / ml (udtrykt som logaritmiske værdier). Kassér åbenlyse outliers blandt de tredobbelte prøver. Generere en logaritmisk tendenslinje og bestemme ligningen for grafen.
      3. Beregn det samlede antal genomer / ml i prøven ved anvendelse af ligningen genereres i 4.3.3.2. Glem ikke at tage højde for den indledende fortynding (1:10 og 1: 100) af prøverne.

5. Infektion af Reverse transfekterede celler (Dag 7)

  1. Efter beregningen af de samlede genomer / ml i C. burnetii pBlaM-CBU0077 kultur skal anvendes til infektion, justere resuspenderede bakteriekultur til at inficere celler ved en MOI på 300 i et endeligt volumen på 50 gl / brønd ved anvendelse forvarmet DMEM + 10% FCS.
    Bemærk: Den forventede tæthed seedede HeLa 229 celler med en normal fordoblingstid efter 72 timer er 3.136 × 10 4 celler / brønd. Mængden af bakterier, der kræves til at inficere ved en MOI på 300 er 9,408 × 10 6 i 50 pi, hvilket svarer til 1,88 × 10 8 bakterier / ml.
    1. Fra værdien beregnet ud fra qPCR (genomer / ml) (4.3.3.3), fortynde resuspenderede bakterier under anvendelse forvarmet DMEM + 10% FCS i et slutvolumen på 2 ml, inficere de tilbagegående transficerede celler.
  2. Fjern den eksisterende medier fra den tomme og omvendt transfekterede celler.
  3. Tilsæt 50 pi af de fortyndede bakterier (1,88 × 10 8 bakterier / ml) til de relevante brønde. Der tilsættes 50 pi DMEM + 10% FCS til både den tomme og uninfected brønde.
  4. Inkuber i 24 timer ved 37 ° C + 5% CO2.

6. Tilsætning af BlaM Substrat til Bestem niveau af translokation (DAG 8)

  1. Forbered løsninger til BlaM substrat 6x lastning løsning.
    Bemærk: Opløsning A, B og C er forudsat i BlaM substrat kit (Se tabel of Materials). Opløsning B kan danne et bundfald ved stuetemperatur. Varm denne opløsning til 37 ° C før brug, og bundfaldet bør opløses.
    1. Når anvendelse af kittet for første gang, tilsættes 185 pi DMSO (følger med BlaM substratkit) til den udtørrede Solution A. Efterfølgende opbevares resuspenderede opløsning A ved -20 ° C.
    2. Forbered 0,1 M Probenicid opløsning i forvejen og opbevares i 1 ml prøver ved -20 ° C indtil brug.
      1. Forbered 0,4 M NaOH (1,6 g i 100 ml dH2O).
      2. Forbered 100 mM Na-phosphat-buffer pH 8 (1,56 g NaH 2 PO4 .2H 2 HPO 4 i 100 ml dH 2 O).
      3. Opløs 1,25 g Probenicid i 22 ml 0,4 M NaOH ved kraftig omrøring.
      4. Tilsættes 22 ml 100 mM Na-phosphat-buffer pH 8 (opløsning vil blive uklar) og omrør for at opløse præcipitatet, der dannes.
      5. Justere pH til 8 (om nødvendigt) under anvendelse af 1 M NaOH / HCI.
      6. Rør kraftigt og varme mildt (<50 ° C), indtil opløsningen er for det meste klar.
      7. Filter (0,2 um porestørrelse) og alikvot i 1 ml volumener. Opbevar portioner ved -20 ° C.
  2. For hver brønd, bruge 0,06 pi Opløsning A, 0,54 pi opløsning B, 7,9 pi opløsning C og 1,5 pi 0,1 M Probenicid. Skabe en master mix for de 30 brønde ved først at kombinere 1,8 pi af opløsning A og 16,2 pi opløsning B sammen i et mikrofugerør. Bland godt ved anvendelse af en vortex. Tilføj 237 pi opløsning C og 45 pi 0,1 M Probenicid. Vortex at kombinere alle components.
    Bemærk: 6x loading opløsning er stabil i op til 4 timer (i mørke), men bør være forberedt så tæt som muligt før brug.
  3. Tilsæt 10 ul af 6x lastning løsning direkte ind i alle tomme og omvendt transfekterede brønde uden at fjerne eksisterende medier.
  4. Inkubér pladen ved stuetemperatur i 2 timer i mørke.
  5. At bestemme niveauet af translokation, kvantificere mængden af ​​fluorescens under anvendelse af en mikropladelæser.
    Bemærk: Den følgende procedure er specifik for ClarioSTAR mikropladelæser. Ækvivalente mikropladelæsere kan også anvendes.
    1. Opret en ny fluorescensintensitet protokol hjælp endepunkt som læsning mode.
    2. Juster de grundlæggende parametre som følger:
      1. Vælg 96-brønds mikroplade.
      2. Under optiske indstillinger, skal du vælge 2 multichromatics med følgende brugerdefinerede indstillinger: (1) Indgang 410-10 nm excitation og 520-10 nm emission. (2) Indtast 410-10 nm excitation og 450-10 nm emission. Sikre godt multichromatics er valgt.
      3. Vælg orbital gennemsnit med en diameter på 3 mm.
      4. Under optisk Vælg bund optik.
      5. Under hastighed og præcision, skal du vælge præcis. Det svarer til otte regioner per brønd.
    3. Juster pladen layout ved at vælge de relevante brønde som prøver.
    4. Vælg starte måling.
    5. Fjern låget, og læg bakken ind i pladen læseren. For at undgå at nå maksimale fluorescens værdier, sikre gevinsten værdien justeres. For at gøre dette, skal du udføre en justering gevinst på en af ​​de inficerede brønde, der er blevet omvendt transficeret med OTP siRNA. Det svarer til den højeste forventede translokation.
    6. Vælg starte måling for at måle alle relevante brønde med bund fluorescens ved en excitation af 410 nm og emission af både 450 nm og 520 nm for blå og grøn fluorescens, hhv.

7. Analyse af resultater:

  1. Beregne forholdetpå 450 nm til 520 nm (blå til grøn) for alle prøver efter blank reduktion og udtrykker i forhold til den ikke-inficerede OTP prøven.
    Bemærk: de følgende trin analyse er fastsat et simpelt regneark.
    1. Brug af eksport funktion på mikropladelæser, overføre de rå fluorescens opnået for både 520 nm og 450 nm emissionsbølgelængder (6.5) i et regneark.
    2. Beregn gennemsnittet af "blank" aflæsninger (medier kun, ingen celler) til 520 nm bølgelængde ved at tilføje de rå 520 nm fluorescensværdier og dividere med antallet af brønde (3). Gentag dette med datoer 450 nm bølgelængde værdier. Disse værdier repræsenterer baggrunden fluorescens som følge af den 96-brønds plade og medier.
    3. Fratræk baggrundsfluorescens. Ved hjælp af værdierne opnået i 7.1.2 trække gennemsnittet af råemnet 520 nm bølgelængde fra alle prøve 520 nm fluorescensværdier. Gentag for de 450 nm bølgelængde værdier.
    4. For at opnå den 450: 520 nm-forholdet bruge de tomme korrigerede værdier (7.1.3). Opdel hver prøve 450 nm fluorescens værdi ved dens tilsvarende 520 nm værdi.
    5. Beregn gennemsnittet af de uinficerede OTP forholdsværdier ved at tilføje 450: 520 nm forholdstallene (fra 7.1.4) og dividere med antallet af brønde (3).
    6. Beregne forholdet af prøverne i forhold til ikke-inficerede OTP ved at dividere 450: 520 nm forhold beregnet i 7.1.4 med gennemsnittet af den ikke-inficerede OTP forholdsværdi beregnet i 7.1.5.

8. Tilsætning af Nuclei Stain konstateres celle nummer efter translokation Assay (DAG 8)

  1. Efter kvantificering af fluorescens, fjerne medier, der indeholder 6x lastning løsning fra alle brønde ved hjælp af enten en multi-kanal adapter er knyttet til et vakuum kilde eller manuelt med en multi-kanal pipette.
  2. Der tilsættes 50 pi 4% PFA (paraformaldehyd) opløsningi PBS til alle relevante brønde at reparere celler. Inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter.
  3. Fjern 4% PFA PBS-opløsning (som pr 8.1) og vaskes cellerne to gange med 75 pi PBS.
  4. Der tilsættes 50 ul af en celle permeabel nuklear farvning, f.eks DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol), til hver brønd. Anskaf billeder med et fluorescerende mikroskop og kvantificere antallet af kerner til stede i hver brønd efter siRNA behandling ved hjælp af passende billedanalyse software, såsom ImageJ 41.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Til denne undersøgelse C. burnetii pBlaM-CBU0077 stamme blev valgt som CBU0077 tidligere er blevet vist at være en omplantes effektor af Coxiella Dot / Icm sekretionssystem 17. Før infektion, det samlede antal genomer / ml i syv dages C. burnetii pBlaM-CBU0077 kulturen blev optalt under anvendelse af qPCR. Figur 4 viser et eksempel på tærsklen cyklus (Ct) værdier forventes fra begge standarder og prøver følgende qPCR. De Ct-værdier (repræsenteret grafisk i Amplification Plot (figur 4B) og numerisk (figur 4C)) blev eksporteret og analyseret som beskrevet i 4.3.3. Baseret på de repræsentative data vist, var 2.31 ​​x 10 8 genomer / ml i 10 ml resuspenderet bakteriekultur (figur 4D). For at generere den passende bakteriel fortynding (1,88 × 10 8 genomer / ml in 2 ml), 1,63 ml resuspenderet bakterier blev tilsat til 370 pi frisk, foropvarmet DMEM + 10% FCS. Celler revers transficeret med siRNA blev efterfølgende inficeret med C. burnetii pBlaM-CBU0077 ved en MOI på 300 i 24 timer.

Efter inkubering af den omvendte kan bestemmes transficerede inficerede celler med BlaM substrat kvantificering af effektor translokation ved anvendelse af en fluorescenspladelæser. Efter analyse som beskrevet i 7, kan alle forholdet værdier, der er blevet normaliseret til ikke-inficerede OTP også normaliseret til inficeret OTP. Niveauet af effektor translokation efter tavshed af værten gener kan inddeles i tre udfald efter sammenligning for inficeret OTP kontrol: (1) Ingen ændringer; (2) Øget effektor translokation; (3) Nedsat effektor translokation. Efterfølgende statistiske analyse, for eksempel en Student t-test, kan anvendes til at bestemme betydningen af en eventuel observerede forskel to inficeret OTP kontrol. Resultatet af silencing enten Rab5A eller Rab7A på effektor translokation fra tre uafhængige forsøg er vist i figur 5A. Et signifikant fald i niveauet af BlaM-CBU0077 translokation forekommet under silencing af både Rab5A og Rab7A sammenlignet med OTP kontrol (p-værdi = 0,0088 (Rab5A) og p-værdi = 0,0059 (Rab7A), parret, Student t-test). Virkningen af ​​siRNA behandling på cellelevedygtighed blev også etableret. Efter translokation assayet blev cellerne fikseret, farvet med et kerner pletten og efterfølgende kvantificeres. Som vist i figur 5C, selvom behandling med enten Rab5A eller Rab7A resulterer i en reduktion i cellelevedygtighed sammenlignet med OTP kontrol (12% og 31%, henholdsvis), denne reduktion er ikke så alvorligt som PLK1 (97%), et gen kendt at forårsage celledød (p-værdi = 0,0102 (Rab5A); p-værdi = 0,0081 (Rab7A); p-værdi <0,0001 (PLK1), parret, Student t-test). Disse resultater viser, hvordan silencing af værten geian bruger siRNA kan have en negativ ændre niveauet af bakteriel effektor translokation.

figur 1
Figur 1. Virkningsmekanisme af BlaM Substrat Under infektion. C. burnetii er internaliseret af værtsceller og danner en lysosomer-afledt vacuole betegnes Coxiella holdige vacuole. 24 timer efter infektion blev celler fyldt med membranen permeabel BlaM substrat, der har to fluorophorer danner et FRET-par (A). I fravær af β-lactamase dvs. ingen translokation af BlaM-CBU0077 effektor, excitation af cumarin på 410 nm resulterer i FRET til fluorescein, observeret som en grøn fluorescens signal (520 nm) (B). i tilfælde af en funktionel Dot / Icm sekretion system, BlaM-CBU0077 fusionsproteinet vil blive translokeret i værtscellen og vil cleave den BlaM substratet via β-lactamase-aktivitet, forårsager adskillelse af de to farvestoffer og resulterer i FRET forstyrrelser og en blå fluorescens signal (450 nm) efter excitation ved 410 nm (C). Både de grønne og blå fluorescenssignaler kan være detekteres ved hjælp af en fluorescens-pladeaflæser. klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
. Figur 2. Skematisk Oversigt over Reverse Transfektion og translokation Assay Workflow Dag 1: Forbered C. burnetii pBlaM-CBU0077 kultur Dag 4:. Reverse transficere anvendelse af 40 nM siRNA og frø HeLa 229-celler ved en endelig densitet på 3,92 x 10 3 celler / brønd i en 96-brønds bakke Dag 5:. Change medier Dag 7:. bestemme den samlede genomer / ml af C. burnetii pBlaM-CBU0077 kultur ved hjælp qPCR og efterfølgende inficere omvendt transfekterede celler med en MOI på 300. Dag 8:. Tilføj 6x lastning farvestof, måle fluorescens og kvantificere celle nummer Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Den 96-brønds plade Layout Bruges til at Opsæt Reverse Transfektion og Seeding af HeLa 229 Celler. De "tomme" brønde (vist med rødt) indeholder kun medier og behøver ikke tilsætning af enten siRNA eller HeLa 229 celler. OTP siRNA (vist i lyseblå til ikke-inficerede brønde og mørkeblå for smittede brønde) anvendes som en ikke-målrettet kontrol, da det er blevet optimeret til athar færre ikke-tilsigtede virkninger. Den rødbrune og grønne brønde repræsenterer Rab5A og Rab7A siRNA hhv. PLK1 siRNA (vist med gult) anvendes som et mål for transfektionseffektiviteten som tab af PLK1 udtryk kan fremkalde pro-apoptotiske veje og omfattende celledød i langt de fleste cellelinjer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Repræsentant qPCR Ct værdier Bruges til at kvantificere det samlede antal genomer / ml i C. burnetii pBlaM-CBU0077 kultur. (A) Cyklus anvendte i qPCR at optælle antallet af genomer / ml i Coxiella kulturer. Ct-værdier for begge standarder og prøver vist grafisk (B) og numerisk (C)formater. (D) Standard Ct-værdier blev midlet, tegnede og en logaritmisk tendenslinje blev beregnet. Anvendelse af ligningen og gennemsnittene af prøven Ct-værdier det samlede antal genomer / ml i C. burnetii pBlaM-CBU0077 kultur blev bestemt til at være 2,31 × 10 8. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Translokation af Dot / Icm Effector BlaM-CBU0077 under siRNA Silencing af Rab5A og Rab7A. HeLa 229 celler blev omvendt transficeret med siRNA specifik for Rab5A (rødbrun søjler), Rab7A (grønne søjler), OTP (blå søjler) eller PLK1 (gule søjler) og inkuberet i 72 timer før infektion med C. burnetii pBlaM-CBU0077 stamme ved en MOI på 300 i 24 timer. efter than tilsætning af BlaM substrat, blev fluorescens målt under anvendelse af en mikropladelæser (A) Tabellen viser de rå fluorescensværdier opnået fra et enkelt forsøg ved siden af 450:. 520 nm forhold i forhold til ikke-inficerede OTP kontrol efter fratrækning af blindprøver (medier kun, ingen celler). Niveauet af translokation (B) og cellelevedygtighed (C) er vist som den procentdel middelværdi ± standardafvigelse i forhold til OTP reverse transficerede inficerede celler fra tre uafhængige forsøg. * P-værdi <0,05; ** P-værdi <0,01; **** P-værdi <0,0001 (parret, Student t-test). Klik her for at se en større version af dette tal.

Komponent Koncentration
Citronsyre 13.4 mM
natriumcitrat 16.1 mM
kaliumphosphat 3,67 mM
magnesiumchlorid 1 mM
calciumchlorid 0,02 mM
jernsulfat 0,01 mM
natriumchlorid 125,4 mM
L-cystein 1,5 mM
neopeptone 0,1 g / l
casaminosyrer 2,5 g / l
methyl beta cyclodextrin 1 g / l
RPMI 125 ml / L

Tabel 1. Komponenter forpligtet til at foretage 1x ACCM-2.

Tabel 2. Volumen af 1x siRNA Buffer Kræves til Hydrating Frysetørret siRNA til den passende koncentration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sekretionssystemer og de bakterielle effektor proteiner disse transportsystemer ind i cytoplasmaet af værtsceller, er en vigtig virulens komponent, mange patogene bakterier anvender til at etablere en infektion i unikke replikative nicher. Fokus for mange forskergrupper har været at undersøge samspillet mellem bakterielle effektorer og værtsproteiner og den indflydelse, disse effektorer har på værten cellulære veje. Meget begrænset forskning, om nogen, har undersøgt potentialet for værtsproteiner at være nødvendig for en vellykket bakteriel effektor translokation.

I denne undersøgelse anvendte vi obligat, intracellulær patogen Coxiella burnetii, det agens af zoonotisk Q-feber. Efter indtræden i værtsceller, den Coxiella holdige vacuolen passivt trafikker gennem den kanoniske endocytiske proces indtil den når en sur lysosomer-afledt vacuole, hvor det kopierer til meget høje tal. Bortset fra at tage Advantage af den normale vært handel vej, evne Coxiella til at etablere en vellykket replikation niche afhænger også på en funktionel form IVB sekretion systemet (T4SS) og efterfølgende effektor translokation 8,17. Denne sekretion system er funktionelt analog med den velkarakteriserede Dot / Icm T4SS af Legionella. Dette blev rammende demonstreret ved at supplere specifikke prik / ICM mutanter af Legionella med deres respektive Coxiella gener 19,20. Selvom T4SSs af både Legionella og Coxiella er afgørende for replikation, timingen af, når disse systemer aktiveres er helt anderledes og afspejler den divergerende karakter af deres respektive replikative nicher. Den Legionella T4SS udløses straks ved kontakt med værtsceller og hurtig translokation af effektorer tillader bakterierne at undgå standard endosomale-lysosomal pathway og i stedet skabe en unik ER-afledt replikative vakuumle 42. I modsætning hertil er den T4SS af Coxiella ikke aktiveret indtil ca. 8 timer efter infektion efter bakterierne nå den sure lysosomet-afledte vacuole 21.

I betragtning af at Coxiella passivt transitter gennem endocytiske proces og translokationen systemet ikke er aktiveret, indtil den når lysosomet, en unik mulighed byder sig for at bruge Coxiella som et redskab til at studere endocytisk modning. Kravet om CCV at blive syrnet før effektorer omplantes indikerer, at en række værtsproteiner er vigtige for translokationen af ​​effektorceller proteiner i værten cytoplasmaet, især, men ikke begrænset til, proteiner involveret i endocytiske trafficking pathway. Ved hjælp siRNA i et specifikt målrettet kan vi begynde at belyse den rolle, som bestemte værtsproteiner på effektor translokation. I denne undersøgelse fokuserede vi på to proteiner, der regulerer eukaryote endocytiske trafficking pathway, og derfor blev forudsagt at bevirke translokation af Coxiella effektor CBU0077. Rab5A og Rab7A kontrol membran fusion med tidlige og sene endosomer hhv. Silencing en af disse proteiner under anvendelse af siRNA resulterede i et signifikant fald i translokation effektivitet CBU0077 når sammenlignet med kontrollen OTP siRNA (figur 5B). De repræsentative resultater er vist her afspejler vores tidligere offentliggjorte resultater 21 og give yderligere validering på betydningen af disse menneskelige Rab proteiner til Coxiella effektor translokation. Denne teknik er også blevet anvendt til at karakterisere virkningen af andre værts processer på Coxiella Dot / Icm effektor translokation. Den retromer kompleks blev fundet at være vigtige for intracellulær replikation af Coxiella. Ved at tavshed retromer komponenter, ved hjælp af siRNA, og derefter gennemføre en translokation assay vi kunne vise, at retromer er nødvendig for at skabe det miljø, der inducererCoxiella effektor translokation 43.

Selvom de repræsentative resultater vist her er en sammenligning mellem inficeret OTP kontrol og siRNA målrettet Rab5A og Rab7A, kan protokollen ændres i henhold til eksperimentelle behov. For eksempel kan niveauet af effektor translokation også sammenlignes med celler transficeret med scrambled siRNA eller ikke-transficerede celler.

Fokus i denne særlige undersøgelse var den obligate, intracellulære patogen C. burnetii og proteiner involveret i endocytiske handel imidlertid fremgangsmåderne beskrevet i let kan tilpasses til andre intracellulære og ekstracellulære patogener, der udnytter sekretionssignaler systemer til virulens. Faktisk fluorescerende-baserede translokation assay, der bygger på β-lactamase-aktivitet inden værten cytoplasma bruges her, er allerede blevet flittigt brugt på en række patogener 30-32,35,44. Naturally infektionen betingelser ispecifikke cellelinier anvendes, skal være tilpasset for at afspejle infektion krav specifikke bakterier. Derudover en kendt endogene effektor fusioneret til p-lactamase er altafgørende for succesen af ​​de metoder, der er beskrevet i. En vigtig overvejelse for en vellykket gennemførelse af protokollen forklaret her er virkningen silencing en bestemt vært mål kunne have på bakteriel indrejse og efterfølgende replikation. Her bliver effektor translokation af Coxiella målt 24 timer efter infektion. I dette tilfælde og for andre intracellulære bakterier, evnen af ​​organismen at få adgang til værtsceller er afgørende. Derudover kunne specifikt gen silencing også påvirke bakteriel replikation derfor ændre niveauet af translokation observeret. Bekræftelse af, at siRNA silencing ikke væsentligt påvirke bakteriel indtastning og / eller replikation, og følgelig translokation effektivitet, kunne opnås ved anvendelse af enten mikroskopi eller tælling af bakterier. translokationdata kan derefter normaliseres til antallet af inficerede celler pr siRNA behandling. Bakteriel replikering har ikke forvirret data præsenteret her som Coxiella gennemgår lidt at ingen replikation under 24 timers inkubationstid.

Denne metode kræver effektiv transfektion af siRNA i værtsceller for at sikre tilstrækkelig lyddæmpning af genet af interesse. Med dette i tankerne, at vælge den rigtige transfektion reagens er ekstremt vigtigt. Bortset fra reagenset og betingelser, der anvendes i denne særlige undersøgelse, som er optimeret til HeLa 229-celler, er der talrige andre reagenser at vælge fra. Knockdown effektivitet under anvendelse af forskellige transfektionsreagenser kan kvantificeres ved anvendelse af RT-qPCR at sikre, at både den mest hensigtsmæssige reagens er valgt, og at siRNA valgt specifikt mål referatet af interesse. Selvom det ikke er præsenteret i denne undersøgelse, har vi tidligere vist, knockdown effektivitet både Rab5A og Rab7A anvendelse af RT-qPCR 21. Derudover kan brugen af ​​antistoffer mod målet af interesse og bekræftelse af Western blot bekræfter også siRNA lyddæmpning af specifikke mål.

To andre vigtige overvejelser at tage til efterretning, når du bruger siRNA omfatte muligheden for off-target effekter og cellen levedygtighed transfekterede celler. Off-target forekomme virkninger, når utilsigtede mål også ødelagt. Dette kan føre til fænotypiske forandringer og kan resultere i falske positive. I denne undersøgelse anvendte vi en pulje af fire siRNA-duplexer at lukke munden på en enkelt vært mål. Hvis silencing et bestemt mål forårsager en reduktion i translokation effektivitet, validering at dette resultat ikke skyldes off-target effekter kan opnås ved at adskille de fire siRNA-duplexer og gentage translokation assay. Mindst to ud af fire siRNA-duplexer bør udvise en lignende fænotype til den oprindelige siRNA pool. Med dette resultat kan man være meget sikker på, at den observerede translocation effektivitet skyldes ikke off-target effekter. Gyldigheden af ​​translokation resultater, er også afhængig af cellernes levedygtighed. Anvendelsen af ​​et kerner plet efter translokationen assay muliggør tælling af cellelevedygtighed efter siRNA lyddæmpning. I tilfælde af PLK1, kan betydelig celledød let observeret uden farvning; dog under anvendelse af epifluorescens-mikroskopi en mere præcis gengivelse kan opnås. Hvis det ved silencing en bestemt vært target betydelig celledød observeres, fx 50% sammenlignet med kontrollen, er det usandsynligt, at et nøjagtigt billede kan udledes, at betydningen af ​​denne bestemte vært protein til translokationen af ​​effektorer. Som det fremgår af denne undersøgelse, selv om tavshed enten Rab5A eller Rab7A har en lille indflydelse på cellernes levedygtighed (figur 5C), er denne reduktion ikke udtalt nok til at ophæve gyldigheden af translokation data observeret. En anden overvejelse med hensyn til cellernes levedygtighed follgrund siRNA silencing er den observation at signifikant celledød ofte fører til en stigning i translokation ratio. Dette er rammende fremgår af de translokation indberettet for PLK1 (figur 5A). Det reducerede celleantal i en proportional stigning i infektionsmultiplicitet. Dette vil øge infektion og dermed den translokationen ratio.

Selvom det ikke er præsenteret i denne undersøgelse, kan visualisering af effektor translokation også give gratis kvantitativt resultat. Under anvendelse af et epifluorescensmikroskop udstyret med en lang-pass dikroisk spejl til særskilt excitation og emission lys kan tilvejebringe en visuel observation af intracellulær BlaM substrat fluorescens. Et muligt alternativ til β-lactamase reporter system er at udnytte adenylat-cyclase reporter system. Svarende til reportersystem beskrevet her, er genet af interesse fusioneret til en calmodulin-afhængig adenylatcyklase genet (CyaA Bordetella pertussis. Effektor translokation kan måles ved kvantificering af intracellulært cyklisk AMP (cAMP) ved anvendelse af et immunoassay ELISA-kit. Da aktiviteten af ​​CyaA er helt afhængig af værtscelle calmodulin, som kun er til stede i værten cytosolen, er effektor translokation bekræftes af en stigning i cAMP-niveauer. Selv om der er brugt denne metode med succes til at måle effektor translokation for en række bakterier 45-47, kvantificering af intracellulært cAMP afhængig af lysis af værtsceller til at udtrække cAMP, en proces, der er mere tidskrævende end fremgangsmåden beskrevet i metode. Måling af effektor translokation ved hjælp af FRET-baserede β-lactamase reporter system er mere effektiv, da den BlaM substrat kan tilsættes direkte til cellerne, og fluorescens kan måles inden for timer. Derudover kan den her beskrevne fremgangsmåde lettere indrettet til at generere high-throughput resultater, især i en 96-brønds formularpå.

Mange bakterielle patogener afhænger protein translokation og indføre effektor proteiner i værtsceller muliggør modulation af værtens cellefunktioner til gavn patogenet. Type IV sekretionssystemer anvendes af intracellulære bakterier, såsom Legionella, Coxiella og Brucella og III sekretionssystemer udnyttes af en række patogener, herunder Chlamydia, fastgørelse og effacing E. coli og Salmonella. Ved at sammenligne effekten af ​​lyddæmpende ekspression af specifikke værtsproteiner på effektor translokation af en række patogener, kunne en forståelse af vært faktorer, der er nødvendige for effektor translokation af bestemte typer af sekretion systemer eller specifik til en individuel patogen blive belyst. Dette giver en unik tilgang til at studere snørklede af vært-patogen interaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

målkoncentration
1 uM 5 uM 10 pM 20 uM
Starter Muldvarpe
1 nmol 1 ml 200 pi 100 pi 50 pi
2 nmol 2 ml 400 pi 200 pi 100 pi
5 nmol 5 ml 1 ml 500 pi 250 pi
10 nmol 10 ml 2 ml 1 ml 500 pi
20 nmol 20 ml 4 ml 2 ml 1 ml
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Citric acid Sigma C0759 ACCM-2 medium component
Sodium citrate Sigma S4641 ACCM-2 medium component
Potassium phosphate Sigma 60218 ACCM-2 medium component
Magnesium chloride Calbiochem 442611 ACCM-2 medium component
Calcium chloride Sigma C5080 ACCM-2 medium component
Iron sulfate Fisher S93248 ACCM-2 medium component
Sodium chloride Sigma S9625 ACCM-2 medium component
L-cysteine Sigma C6852 ACCM-2 medium component
Bacto-neopeptone BD 211681 ACCM-2 medium component
Casamino acids Fisher BP1424 ACCM-2 medium component
Methyl beta cyclodextrin Sigma C4555 ACCM-2 medium component
RPMI + Glutamax ThermoFisher Scientific 61870-036 ACCM-2 medium component
Chloramphenicol Sigma C0378 For bacterial culture
ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP) Dharmacon D-001810-10-05 Non-targeting control
siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-003290-01-005 Causes cell death; measure of transfection efficiency
siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-004009-00-0005
siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-010388-00-0005
5x siRNA buffer Dharmacon B-002000-UB-100 Use sterile RNase-free water to dilute 5x siRNA buffer to 1x siRNA buffer
DharmaFECT-1 Transfection Reagent Dharmacon T-2001-01 For transfection
Opti-MEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 51985-034 Reduced-serum medium used for transfection
DMEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 10567-014 For cell culture and infection
Heat-inactivated fetal calf serum (FCS) Thermo Scientific SH30071.03 Can use alternate equivalent product
DMSO Sigma D8418 For storage of Coxiella strain
PBS For cell culture
0.05% Trypsin + EDTA ThermoFisher Scientific 25300-054 For cell culture
dH2O For dilution of samples and standards for qPCR
Quick-gDNA Mini Prep ZYMO Research D3007 Can use alternate equivalent product to extract gDNA
SensiFAST SYBR No-ROX Kit Bioline BIO-98020 Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction
LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM Invitrogen K1032 For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)
Sodium hydroxide Merck 106469 Probenicid solution component
Sodium phosphate monobasic Sigma 71505 Probenicid solution component
di-Sodium hydrogen orthophosphate Merck 106586 Probenicid solution component
Probenicid Sigma P8761 Probenicid solution component
DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) ThermoFisher Scientific 62251 Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS. 
4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS Sigma P6148 Fixing solution for HeLa 229 cells
25 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430639 For growth of bacterial strain
96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile Corning 3603
75 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430641 For growth of HeLa 229 cells
175 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 431080 For growth of HeLa 229 cells
Haemocytometer For quantification of HeLa 229 cells
Tear-A-Way 96 Well PCR plates 4titude 4ti-0750/TA For qPCR reaction
8-Lid chain, flat Sarstedt 65.989.002 For qPCR reaction
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Bench top microfuge
Bench top vortex
Orbital mixer
Centrifuge Eppendorf 5810 R For pelleting bacterial culture
Nanodrop For gDNA quantification
Mx3005P QPCR machine Aligent Technologies 401456 For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture
ClarioSTAR microplate reader BMG LabTech For measurement of fluorescence

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Delsing, C. E., Warris, A., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever: still more queries than answers. Adv Exp Med Biol. 719, 133-143 (2011).
  2. Delsing, C. E., Kullberg, B. J., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever in the Netherlands from 2007 to. Neth J Med. 68, 382-387 (2010).
  3. van der Hoek, W., et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Adv Exp Med Biol. 984, 329-364 (2012).
  4. Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. Lancet Infect Dis. 3, 709-721 (2003).
  5. Hoover, T. A., Culp, D. W., Vodkin, M. H., Williams, J. C., Thompson, H. A. Chromosomal DNA deletions explain phenotypic characteristics of two antigenic variants, phase II and RSA 514 (crazy), of the Coxiella burnetii nine mile strain. Infect Immun. 70, 6726-6733 (2002).
  6. Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii are facilitated by an improved axenic growth medium. Appl Environ Microbiol. 77, 3720-3725 (2011).
  7. Omsland, A., et al. Host cell-free growth of the Q fever bacterium Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4430-4434 (2009).
  8. Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. MBio. 2, e00175-e00111 (2011).
  9. Chen, C., et al. Large-scale identification and translocation of type IV secretion substrates by Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 21755-21760 (2010).
  10. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii cryptic plasmid is enriched in genes encoding type IV secretion system substrates. J Bacteriol. 193, 1493-1503 (2011).
  11. Beare, P. A., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. A. Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Front Microbiol. 2, 97 (2011).
  12. Beare, P. A., Larson, C. L., Gilk, S. D., Heinzen, R. A. Two systems for targeted gene deletion in Coxiella burnetii. Appl Environ Microbiol. 78, 4580-4589 (2012).
  13. Howe, D., Shannon, J. G., Winfree, S., Dorward, D. W., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii phase I and II variants replicate with similar kinetics in degradative phagolysosome-like compartments of human macrophages. Infect Immun. 78, 3465-3474 (2010).
  14. Heinzen, R. A., Scidmore, M. A., Rockey, D. D., Hackstadt, T. Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis. Infect Immun. 64, 796-809 (1996).
  15. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cell Microbiol. 9, 891-909 (2007).
  16. Beare, P. A. Genetic manipulation of Coxiella burnetii. Adv Exp Med Biol. 984, 249-271 (2012).
  17. Carey, K. L., Newton, H. J., Luhrmann, A., Roy, C. R. The Coxiella burnetii Dot/Icm system delivers a unique repertoire of type IV effectors into host cells and is required for intracellular replication. PLoS Pathog. 7, e1002056 (2011).
  18. Segal, G., Shuman, H. A. Possible origin of the Legionella pneumophila virulence genes and their relation to Coxiella burnetii. Mol Microbiol. 33, 669-670 (1999).
  19. Zamboni, D. S., McGrath, S., Rabinovitch, M., Roy, C. R. Coxiella burnetii express type IV secretion system proteins that function similarly to components of the Legionella pneumophila Dot/Icm system. Mol Microbiol. 49, 965-976 (2003).
  20. Zusman, T., Yerushalmi, G., Segal, G. Functional similarities between the icm/dot pathogenesis systems of Coxiella'burnetii and Legionella pneumophila. Infect Immun. 71, 3714-3723 (2003).
  21. Newton, H. J., McDonough, J. A., Roy, C. R. Effector Protein Translocation by the Coxiella burnetii Dot/Icm Type IV Secretion System Requires Endocytic Maturation of the Pathogen-Occupied Vacuole. PLoS One. 8, e54566 (2013).
  22. Lifshitz, Z., et al. Computational modeling and experimental validation of the Legionella and Coxiella virulence-related type-IVB secretion signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E707-E715 (2013).
  23. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii ankyrin repeat domain-containing protein family is heterogeneous, with C-terminal truncations that influence Dot/Icm-mediated secretion. J Bacteriol. 191, 4232-4242 (2009).
  24. Weber, M. M., et al. Identification of C. burnetii type IV secretion substrates required for intracellular replication and Coxiella-containing vacuole formation. J Bacteriol. , (2013).
  25. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Luhrmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-678 (2013).
  26. Larson, C. L., Beare, P. A., Howe, D., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii effector protein subverts clathrin-mediated vesicular trafficking for pathogen vacuole biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4770-E4779 (2013).
  27. Luhrmann, A., Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetii type IV effector protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18997-19001 (2010).
  28. Newton, H. J., et al. A screen of Coxiella burnetii mutants reveals important roles for Dot/Icm effectors and host autophagy in vacuole biogenesis. PLoS Pathog. 10, (2014).
  29. Pan, X., Luhrmann, A., Satoh, A., Laskowski-Arce, M. A., Roy, C. R. Ankyrin repeat proteins comprise a diverse family of bacterial type IV effectors. Science. 320, 1651-1654 (2008).
  30. Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
  31. de Felipe, K. S., et al. Legionella eukaryotic-like type IV substrates interfere with organelle trafficking. PLoS Pathog. 4, e1000117 (2008).
  32. de Jong, M. F., Sun, Y. H., den Hartigh, A. B., van Dijl, J. M., Tsolis, R. M. Identification of VceA and VceC, two members of the VjbR regulon that are translocated into macrophages by the Brucella type IV secretion system. Mol Microbiol. 70, 1378-1396 (2008).
  33. Raffatellu, M., et al. Host restriction of Salmonella enterica serotype Typhi is not caused by functional alteration of SipA, SopB, or SopD. Infect Immun. 73, 7817-7826 (2005).
  34. Wood, R. E., Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Dot/Icm Effector Translocation by Legionella longbeachae Creates a Replicative Vacuole Similar to That of Legionella pneumophila despite Translocation of Distinct Effector Repertoires. Infect Immun. 83, 4081-4092 (2015).
  35. Mueller, K. E., Fields, K. A. Application of beta-lactamase reporter fusions as an indicator of effector protein secretion during infections with the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. PLoS One. 10, (2015).
  36. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  37. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  38. Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e252 (2015).
  39. Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS Pathog. 10, e1004013 (2014).
  40. Jaton, K., Peter, O., Raoult, D., Tissot, J. D., Greub, G. Development of a high throughput PCR to detect Coxiella burnetii and its application in a diagnostic laboratory over a 7-year period. New Microbes New Infect. 1, 6-12 (2013).
  41. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  42. Prashar, A., Terebiznik, M. R. Legionella pneumophila: homeward bound away from the phagosome. Curr Opin Microbiol. 23C, 86-93 (2014).
  43. McDonough, J. A., et al. Host Pathways Important for Coxiella burnetii Infection Revealed by Genome-Wide RNA Interference Screening. MBio. 4 (1), e00606-e00612 (2013).
  44. Farfan, M. J., Toro, C. S., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella enterotoxin-2 is a type III effector that participates in Shigella-induced interleukin 8 secretion by epithelial cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 61, 332-339 (2011).
  45. Al-Khodor, S., Price, C. T., Habyarimana, F., Kalia, A., Abu Kwaik, Y. A Dot/Icm-translocated ankyrin protein of Legionella pneumophila is required for intracellular proliferation within human macrophages and protozoa. Mol Microbiol. 70, 908-923 (2008).
  46. Geddes, K., Worley, M., Niemann, G., Heffron, F. Identification of new secreted effectors in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. 73, 6260-6271 (2005).
  47. Sory, M. P., Boland, A., Lambermont, I., Cornelis, G. R. Identification of the YopE and YopH domains required for secretion and internalization into the cytosol of macrophages, using the cyaA gene fusion approach. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 11998-12002 (1995).

Tags

Infektion Host-patogen interaktioner bakterielle sekretion systemer β-lactamase translokation assay BlaM substrat fluorescens mikrobiologi intracellulære bakterielle patogener, Gene silencing siRNA molekylærbiologi
Anvendelse fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) til at undersøge Effector translokationseffektivitet af<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Under siRNA Silencing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Newton, P., Latomanski, E. A.,… More

Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing. J. Vis. Exp. (113), e54210, doi:10.3791/54210 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter