Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Tillämpa Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) för att undersöka Effector Trans Effektivitet av Published: July 6, 2016 doi: 10.3791/54210
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, University of Melbourne

Summary

Undersöker samspelet mellan bakteriella patogener och deras värdar är ett viktigt område för biologisk forskning. Här beskriver vi de nödvändiga tekniker för att mäta effektor translokation av Coxiella burnetii under siRNA geners uttryck med hjälp av BLAM substrat.

Abstract

Coxiella burnetii, det orsakande medlet av Q-feber, är en intracellulär patogen som förlitar sig på en typ IV Dot / Icm sekretionssystemet för att etablera en replika nisch. En kohort av effekten translokeras genom detta system i värdcellen för att manipulera värdprocesser och möjliggöra inrättandet av en unik lysosom härrörande vacuole för replikering. Den metod som presenteras här innebär en kombination av två väletablerade metoder: specifik geners uttryck med hjälp av siRNA och mätning av effektor sloka med hjälp av en FRET-baserad substrat som bygger på β-laktamasaktivitet. Tillämpa dessa två metoder, kan vi börja att förstå vilken roll värdfaktorer i bakteriell sekretionssystemet funktion och effektor translokation. I denna studie undersökte vi roll Rab5A och Rab7A, både viktiga regulatorer av den endocytiska handel vägen. Vi visar att tysta uttrycket av antingen protein resulterar i en minskning av effektor translocation effektivitet. Dessa metoder kan lätt modifieras för att undersöka andra intracellulära och extracellulära patogener som också utnyttjar sekretionssystem. På detta sätt kan en global bild av värdfaktorer som är involverade i bakteriell effektor transloka avslöjas.

Introduction

Coxiella burnetii är en unik intracellulär patogen som orsakar zoonotiska mänsklig infektion Q-feber. Denna sjukdom är förknippad med ett brett spektrum av kliniska presentationer som sträcker sig från asymtomatisk serokonversion till livshotande kronisk infektion som ofta manifesteras som endokardit år efter exponering 1. Mänsklig infektion sker främst genom inandning av kontaminerade aerosoler med idisslare huvud reservoar för infektion, i synnerhet mjölkkor, får och getter. Även Coxiella infektion i dessa djur är vanligtvis subklinisk, kan infektionen leda abort och betydande bakteriehalten i förlossningsvätskan och moderkakan kan förorena den lokala miljön en. Ett exempel på den enorma börda sådan förorening kan ha på både folkhälsan och jordbruksindustrin har nyligen observerats i Q-feber utbrott som inträffade i Nederländerna 2. Mellan 2007 och2010, över 4000 mänskliga fall av Q-feber diagnostiserades och detta utbrott var kopplat till betydande förorening av getgårdar 3. Dessutom är Coxiella en potentiell biologiskt vapen, enligt klassificeringen av de amerikanska Centers for Disease Control and Prevention, på grund av miljö stabiliteten hos bakterier och låg smitt dos som krävs för att orsaka allvarlig sjuklighet och dödlighet 4.

Coxiella förekommer i två faser: Fas I organismer, isolerade från naturliga källor, är extremt virulent och fas II organismer är mycket försvagade in vivo. Till exempel, efter flera in vitro-passager av Coxiella burnetii Nine Mile fas I organismer har fas II bakterier produceras som innehåller en irreversibel kromosom deletion resulterar i stympad lipopolysackarid (LPS) 5. Denna stam, C. burnetii NMII är fenotypiskt liknar fas I i vävnadskulturmodeller och ger en säkrare lägel för forskare att studera Coxiella patogenes i laboratorier 5. Under senare år har flera genombrott har snabbt avancerat inom Coxiella genetik. Framför allt utvecklingen av axenisk media (surgjord citrat cystein medel - ACCM-2) har gjort det cellfria tillväxt Coxiella i både flytande och fasta medier 6,7. Detta resulterade i direkta förbättringar av genetiska verktyg för Coxiella inklusive en inducerbar genuttryck systemet, skyttelvektorer och slumpmässiga transposonmutanter system 8-11. Senast har två metoder för riktad gen inaktive också tagits fram, vilket banar väg för att undersöka specifika virulensgen kandidater 12.

Efter internalisering av alveolära makrofager, replikerar Coxiella höga siffror inom en membranbundna fack kallas Coxiella- innehållande vakuolen (CCV). CCV kräver värd endocytiska handel thgrov tidiga och sena endosomer tills den mognar till en lysosom härrörande organell 13. Under hela denna process, CCV förvärvar värdfaktorer som antingen visas övergående eller förbli associerade med vakuolen, inklusive, men inte begränsat till, Rab5, Rab7, CD63 och LAMP-13-15 januari. Replikering av Coxiella inom värdceller är helt beroende av en fullt fungerande Dot / Icm typ IVB sekretionssystemet (T4SS) 8,16,17. Denna sekretionssystemet är en multi-proteinstruktur ancestrally relaterade till konjugering system och sträcker sig över båda bakteriella och vakuolära membran för att leverera bakteriella proteiner, benämnda effektorer, in i värd cytoplasman 18. Den Coxiella T4SS är funktionellt mycket lik den väl karakteriserade typ IVB Dot / Icm Sekretion System of Legionella pneumophila 19,20. Intressant, inte aktivering av T4SS och efterföljande effektor translokation inte ske förrän Coxiella når den sura lysosom-härleddaorganell, ungefär 8 h efter infektion 17,21. Hittills har mer än 130 punkter / Icm effektenheter identifierats 9,17,22-24. Många av dessa effektenheter spelar troligen en viktig roll vid replikering av Coxiella inom värdceller; har dock endast ett fåtal effektorer funktionellt karaktäriseras 25-29.

I denna studie använder vi en fluorescensbaserad sloka analys som förlitar sig på klyvning av CCF2-AM FRET-substrat (i det följande kallat BLAM substrat) via β-laktamasaktivitet inuti värdcellen cytoplasma (Figur 1). Genen av intresse är sammansmält med TEM-1 β-laktamas (BLAM) på en reporterplasmid som ger konstitutiv expression. Den BLAM substrat är sammansatt av två fluoroforer (kumarin och fluorescein) som bildar ett FRET-par. Excitation av kumarinresulterar i FRET av fluorescein och grönt fluorescensemission i frånvaro av effektorn sloka; Men om den BlaM-effektor-fusionsproteinet translokeras in i värd cytoplasman, den erhållna β-laktamasaktivitet spaltar β-laktamringen av BLAM substrat, separering av FRET paret producerar blå fluorescensemission efter excitering. Denna translokation analys har väl beprövade som en metod för att identifiera effektor proteiner från en rad olika intracellulära och extracellulära bakterier, inklusive C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatogen E. coli, Salmonella och Brucella 17,30-35.

För att bestämma betydelsen av specifika värdfaktorer på Coxiella effektor sloka vi använder en väletablerad metod för geners uttryck kallas RNA-interferens, i synnerhet små störande RNA (siRNA). Ursprungligen identifieras i Caenorhabditis elegans, är RNA-interferens en bevarad endogen cellulär process som används för medfödda defeNSE mot virus samt genreglering 36,37. Efter bindning av sekvensspecifik siRNA sker nedbrytning av mRNA genom RISC (RNA-inducerad tysta komplex) som resulterar i specifik geners uttryck eller knockdown 38. I denna studie var siRNA används för att rikta två värdproteiner, Rab5A och Rab7A, som är viktiga regulatorer av den endocytiska vägen. Effekterna av ljuddämpnings Rab5A och Rab7A på effektor translokation fastställdes med hjälp av C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 valdes som det tidigare visat sig vara translokeras av Dot / Icm sekretionssystem av Coxiella 17.

Med hjälp av både siRNA geners uttryck och fluorescensbaserad translokation analysen beskrivs här, börjar vi att etablera en roll för värdfaktorer i translokation av effektor proteiner av Coxiella. Detta tillvägagångssätt kan tillämpas på ett brett spektrum av både intracellulära och extracellulära bakterier som besitter liknande secretion system som ansvarar för translokation av effektorceller proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Obs: Alla förfaranden som omfattar tillväxt eller manipulation av Coxiella burnetii RSA439 NMII bör utföras i en fysisk skyddsnivå 2 Laboratory och inom ett biologiskt säkerhetsskåp i enlighet med lokala riktlinjer. Ett schematiskt diagram av den omvända transfektion och translokation assay arbetsflöde som beskrivs nedan visas i fig 2.

1. Framställning av C. burnetii Culture Att uttrycka CBU0077 Fused till p-laktamas (pBlaM-CBU0077) (DAG 1)

  1. Bered 1x ACCM-2 6:
    1. Kombinera de komponenter som anges i tabell 1. Justera pH till 4,75 med 6 M NaOH och filtrera sterilisera (inte autoklav). ACCM-2 är stabil i ungefär tre veckor lagrade vid 4 ° C.
  2. Generera C. burnetii pBlaM-CBU0077 bestånd.
    1. Infektera HeLa 229-celler med C. burnetii stam som bär pBlaM-CBU0077 och passage till dess stora vacuoles observeras i de flesta celler.
      1. Växa C. burnetii stam som bär pBlaM-CBU0077 i 20 ml ACCM-2 innehållande 3 pg / ml kloramfenikol i en 75 cm 2 vävnadsodlingskolv med ventilerat lock under 7 dagar vid 37 ° C i 5% CO2, 2,5% O2.
      2. Centrifugera C. burnetii pBlaM-CBU0077 kulturen vid 15000 x g under 15 min vid RT.
      3. Återsuspendera pelleten i 20 ml DMEM + 10% fetalt kalvserum (FCS) + 3 pg / ml kloramfenikol (underhållsmedium). Ta ut mediet från en 50% sammanflytande 75 cm 2 kolv med HeLa 229-celler. Lägg resuspenderas C. burnetii till HeLa 229-celler. Inkubera i 2 dagar vid 37 ° C i 5% CO2 för att tillåta infektion av HeLa 229-celler för att etablera.
      4. Split celler i 175 cm2 vävnadsodlingskolv.
        1. Ta bort materialet från 75 cm 2 kolv och tvätta monoskiktet två gånger med 10 ml förvärmda PBS.
        2. Tillsätt 1 ml of 0,05% trypsin-EDTA-lösning och placera celler vid 37 ° C + 5% CO2 under 3 - 5 min för att lösgöra cellerna.
        3. Återsuspendera cellerna i 10 ml underhållsmedium. Tillsätt 2 ml av återsuspenderas celler i en 175 cm 2 kolv innehållande 38 ml underhållsmedium.
        4. Inkubera vid 37 ° C i 5% CO2 under ytterligare 3 - 5 dagar tills 100% konfluens nås och stora vakuoler observeras.
    2. Supernatanten från 175 cm 2 kolv, tillsätt 10 ml dH 2 O för att täcka de infekterade HeLa 229-celler och inkubera under 15 minuter för att lysera infekterade celler.
    3. Kombinera supernatanten och lyserade celler och pellet vid 15000 x g under 15 min vid RT.
    4. Återsuspendera pelleten i 10 ml dH 2 O. Lyse celler ytterligare genom upprepade gånger passerar resuspension genom en 23G nål fäst vid en 10 ml spruta minst 20 gånger. Pellet vid 500 x g under 5 min för att avlägsna cellrester.
      5. <li> Ta bort och pellets supernatanten vid 15.000 x g under 15 minuter vid RT för att samla C. burnetii.
    5. Återsuspendera C. burnetii i DMEM + 10% FCS och kvantifiera antalet bakterier som per 4. Späd till 1 × 10 9 rade genom / ml med användning av DMEM + 10% FCS + 10% dimetylsulfoxid (DMSO), alikvot 50 pl lager i mikrofugrör och förvara vid -80 ° C.
  3. Ympa 10 ml förvärmda ACCM-2 innehållande 3 pg / ml kloramfenikol med 20 pl C. burnetii pBlaM-CBU0077 stam 17 (från lagren alstrade i 1,2 lagrades vid -80 ° C) i en 25 cm 2 vävnadsodlingskolv med ventilerat lock. Växer bakteriekultur under 7 dagar vid 37 ° C i 5% CO2, 2,5% O2.

2. Omvänd transfektion av siRNA och odling av HeLa 229-celler (DAG 4)

  1. När du använder den experimentella siRNA för första gången förberedasiRNA enligt följande:
    1. centrifugera kortfattat frystorkade siRNA för att säkerställa att siRNA pellets samlas på botten av röret.
    2. Åter avbryta pellet siRNA till en slutlig förrådskoncentration av 20 ^ M genom att pipettera den lämpliga volymen av 1x siRNA buffert (tabell 2).
    3. Pipettera lösningen upp och ner 3 - 5 gånger för att blanda och placera på en orbital-blandare under 30 min vid RT, att vända röret varje 5 - 10 min.
    4. centrifugera kort röret för att säkerställa att siRNA uppsamlas vid botten av röret.
    5. Alikvotera siRNA i 50 | il alikvoter i mikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C tills de behövdes.
    6. För att generera 1 iM arbetar koncentration av siRNA, pipett 950 ul 1X siRNA buffert till en 50 pl alikvot lager (20 M) vid behov. OBS: Denna 1 iM arbetskoncentration kan frys tinas flera gånger för upprepade transfektioner.
  2. Placera DMEM + 10% FCS,; 0,05% trypsin-EDTA och PBS i en 37 ° C vattenbad (eller motsvarande) i 30 minuter för att värma före användning.
  3. Framställning av transfektion komponenter:
    Obs: Följande protokoll har optimerats för HeLa 229-celler i en 96-håls mikroplatta med svarta väggar och platt, transparent botten. Optimering av mängden transfektionsreagens, kan koncentrationen av siRNA och såddtäthet av celler vara nödvändiga för olika cellinjer.
    1. För varje brunn, använd 0,1 l transfektionsreagens, 15,9 pl sänkt serummedium (minimalt essentiellt medium som används för transfektioner, se tabell av material) och 4 pl 1 pM siRNA (vilket resulterar i en slutlig siRNA koncentration av 40 nM). Använd separata mikrofugrör för OTP, PLK1, Rab5A och Rab7A. Mät varje analys tillstånd i tre exemplar. Ett exempel på en 96-brunnars platta layout visas i Figur 3.
      Obs: Detta protokoll omfattar användningen av två kontroller: OTP och PLK1. OTP ärbestår av fyra sammanslagna siRNA som har optimerats för att minska off-target effekter och därmed OTP används som en negativ icke-inriktning kontroll. Scrambled siRNA skulle också kunna användas som en negativ kontroll. Förlust av PLK1 uttryck resulterar i omfattande celldöd i ett antal cellinjer genom att inducera pro-apoptotiska reaktionsvägar och därför PLK1 siRNA används som positiv kontroll för transfektion där celldöd korrelerar till transfektionseffektivitet.
      1. För varje experimentell siRNA transfektion, kombinera 0,4 l transfektionsreagens och 63,6 l reducerat serummedium i ett enskilt mikrofugrör. Vortex alla mikrofugrör och tillåta komponenterna att komplexet under 5 min vid RT.
      2. Lägg 16μl av varje experimentell siRNA till motsvarande mikrocentrifugrör innehållande transfektion komplex. Vortexa och inkubera under 20 min vid RT. Obs: Det är viktigt att inte överskrida 30 minuter, eftersom transfektionseffektiviteten minskar.
  4. Under 20 min inklubation (2.3.1.2) tillsätt 20 pl av transfektionsreagens + reducerad serummedium + siRNA blanda i lämpliga brunnar i en steril svart, platt klar botten 96 brunnar.
  5. Så snart som 20 min inkubationsperiod är fullständig, frö HeLa 229-celler vid en densitet av 3,92 x 10 3 celler / brunn.
    1. Harvest HeLa 229-celler från en konfluent eller sub-sammanflytande 75 cm 2 vävnadsodlingskolv i förvärmda DMEM + 10% FCS och återsuspendera cellerna till en slutlig täthet av 4,9 x 10 4 celler / ml enligt standardmetoder. För att säkerställa transfektion effektivitet inte äventyras, förbereda celler under 20 min inkubationstiden (2.3.1.2).
      1. Tvätta monolager av HeLa 229-celler två gånger med 10 ml förvärmd PBS.
      2. Tillsätt 1 ml 0,05% trypsin-EDTA-lösning och plats HeLa 229-celler vid 37 ° C + 5% CO2 under 3-5 min för att lösgöra cellerna.
      3. Samla in celler i 9 ml av pre-warmed DMEM + 10% FCS. Räkna celler med användning av en hemocytometer och förbereda cellerna till en slutlig täthet av 4,9 x 10 4 celler / ml med användning av DMEM + 10% FCS.
    2. Pipettera 80 pl HeLa 229-celler vid täthet av 4,9 x 10 4 celler / ml i varje brunn som innehåller transfektionsreagens + reducerad serummedium + siRNA mix. Detta motsvarar en celldensitet av 3,92 x 10 3 celler / brunn.
      Obs: Bakgrund subtraktion krävs för BLAM substratet.
      1. Lägg inte till celler eller siRNA till "tomma" brunnar (Figur 3). Istället till 80 pl DMEM + 10% FCS till dessa brunnar som i tre exemplar.
    3. Inkubera i 24 h vid 37 ° C + 5% CO2.

3. Ändra Media (dag 5)

  1. Efter 24 timmar, ta bort media som använder en flerkanals adapter ansluten till en vakuumkälla eller manuellt med en flerkanalig pipett, och ersätt med 100 pl färsk Förvärmed DMEM + 10% FCS.
  2. Inkubera under ytterligare 48 h vid 37 ° C + 5% CO2.
  3. Vid denna punkt, kontrollera livskraft celler visuellt med en vanlig ljusmikroskop. Om det omvända transfektion har varit framgångsrik, kommer betydande celldöd observeras i brunnar innehållande PLK1 siRNA jämfört med OTP siRNA.

4. Kvantifiering av Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 Strain med användning qPCR (DAG 7)

  1. Efter 7 dagars tillväxt i ACCM-2 vid 37 ° C i 5% CO2, 2,5% O 2 (1,3), centrifugera 10 ml C. burnetii pBlaM-CBU0077 kulturen vid 15000 x g under 15 min vid RT.
  2. Återsuspendera den bakteriella pelleten i 10 ml av pre-warmed DMEM + 10% FCS. Förbered 1:10 och 1: 100 utspädningar av kulturen (prov) med hjälp av dH 2 O.
  3. Ställ in de komponenter som krävs för qPCR.
    Notera: gDNA Extraktionen kan genomföras i förväg och lagrades vid -20 ° C until krävs.
    1. Beredning av standarder:
      1. Extrahera gDNA från Coxiella burnetii RSA439 NMII vildtypstammen odlades i ACCM-2 vid 37 ° C i 5% CO2, 2,5% O 2 i 7 dagar med användning av en gDNA extraktion kit, enligt tillverkarens instruktioner.
      2. Mäta gDNA koncentration (g / | il) med användning av en Nanodrop (eller motsvarande) vid en absorbans av 260 nm.
      3. Beräkna antalet genomkopior per il med hjälp av följande formel nedan, och konvertera till antalet för ledare för genom / ml.
        Ekvation
      4. Justera antalet för ledare för genom / ml till 10 9 / ml (i en slutlig volym av 100 | j, l) i ett nytt mikrofugrör med användning dH 2 O. Detta kan kokas under 10 minuter och lagrades vid -20 ° C tills de behövdes.
      5. På dagen för infektionen, generera 10-faldiga seriespädningar av 10 8 Genom / ml till 10 5 rade genom / ml från 10 9-genomets / ml förråd.
        1. Pipett 10 ul av 10 9 rade genom / ml i 90 pl dH 2 O för att generera 10 8 Genom / ml. Vortex för att blanda. Pipett 10 ul av 10 8 Genom / ml i 90 pl dH 2 O för att generera 10 7 rade genom / ml. Vortex och upprepa tills 10 5 rade genom / ml.
    2. Inrätta qPCR reaktion. Skapa en huvudblandning för 25 brunnar för att ta hänsyn till eventuella pipetteringsfel. För varje brunn, använd 10 pl qPCR Master Mix; 2 pl ompA primer mix (4.3.2.2) och 3 pl dH 2 O.
      Obs: OmpA är ett yttre membranprotein av C. burnetii '39 och en 82-base-pair avsnitt inom ett mycket konserverad region valdes för användning såsom en sond såsom beskrivits tidigare 40.
      1. Ställa in varje standard (dH 2 O, 10 5, 10 6, 10 7, 10 8, 10 9 rade genom / ml) och prov (1:10 och 1: 100 spädning) i en 96-brunnars PCR riva bort platta (icke-kjolar) i duplikat eller triplikat, respektive. Tillsätt 5 pl prov eller standard i lämpliga brunnar.
      2. Med användning av dH 2 O, späd både ompA framåtriktad primer (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') och ompA omvänd primer (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') till en slutlig koncentration av 4 | iM och kombinera i samma mikrofugrör.
        Obs: ompA tändämnesblandningen kan beredas i förväg och lagras vid -20 ° C tills de behövdes.
      3. Kombinera 250 pl qPCR Master Mix, 50 pl ompA primer mix, 75 pl dH 2 O och skaka för att blanda. Tillsätt 15 pl av denna Master Mix till brunnar innehållande antingen standarder eller prover.
      4. Placera 8-lock PCR band lock på lämpliga brunnar och Pulscentrifugera PCR-rören för att säkerställa att allt samlas i botten av rören.
      5. Ställ in följande program på en kvantitativ PCR-machine: 50 ° C under 2 min, 95 ° C under 10 min, följt av 45 cykler av 95 ° C för en sekund och 60 ° C under 20 sek (Figur 4A).
    3. Analysera Ct (cykel tröskel) värden från qPCR:
      1. Överför Ct-värdena till ett kalkylblad med hjälp av programmets exportfunktionen.
      2. Skapa en spridningsdiagram av standarderna 10 5 genomen / ml genom till 10 9 rade genom / ml (uttryckt som log-värden). Kasta några uppenbara outliers bland de triplikatprover. Generera en logaritmisk trendlinje och bestämma ekvationen för grafen.
      3. Beräkna det totala antalet för ledare för genom / ml i provet genom att använda ekvationen genereras i 4.3.3.2. Glöm inte att ta hänsyn till den initiala utspädning (1:10 och 1: 100) av proverna.

5. Infektion av Reverse Transfekterade celler (DAG 7)

  1. Efter beräkning av de totala rade genom / ml i C. burnetii pBlaM-CBU0077 kultur som skall användas för infektion, justera återsuspenderades bakteriekultur för att infektera celler vid en MOI av 300 i en slutlig volym av 50 | il / brunn med hjälp av förvärmd DMEM + 10% FCS.
    Obs: Den förväntade densiteten av ympade HeLa 229-celler med en normal fördubbling tid efter 72 timmar är 3.136 x 10 4 celler / brunn. Mängden bakterier som krävs för att infektera vid en MOI av 300 är 9,408 x 10 6 i 50 | il, vilket är lika med 1,88 x 10 8 bakterier / ml.
    1. Med hjälp av värdet beräknades från qPCR (rade genom / ml) (4.3.3.3), späd de återsuspenderade bakterier med användning av förvärmda DMEM + 10% FCS i en slutlig volym av 2 ml för att infektera de omvända transfekterade celler.
  2. Ta bort den befintliga media från ämnet och vända transfekterade celler.
  3. Tillsätt 50 pl av den utspädda bakterier (1,88 x 10 8 bakterier / ml) till de lämpliga brunnarna. Tillsätt 50 pl av DMEM + 10% FCS till både tomma och uninfected brunnar.
  4. Inkubera i 24 h vid 37 ° C + 5% CO2.

6. Tillsats av BLAM substrat att bestämma Nivå Trans (DAG 8)

  1. Förbered lösningar för BLAM substrat 6x laddningslösning.
    Obs: Lösning A, B och C är anordnade i BLAM substratsatsen (Se tabell of Materials). Lösning B kan bilda en fällning vid RT. Värm lösningen till 37 ° C före användning och fällningen bör upplösas.
    1. Vid användning av satsen för första gången, tillsätt 185 pl DMSO (medföljer BLAM substratsatsen) till uttorkade lösning A. Därefter lagra resuspenderas lösning A vid -20 ° C.
    2. Förbereda 0,1 M probenicid lösning i förväg och förvara i 1 ml alikvoter vid -20 ° C tills de behövdes.
      1. Förbered 0,4 M NaOH (1,6 g i 100 ml dH 2 O).
      2. Förbereda 100 mM Na-fosfatbuffert pH 8 (1,56 g NaH 2 PO 4 .2H 2 HPO 4 i 100 ml dH 2 O).
      3. Lös upp 1,25 g av probenecid i 22 ml 0,4 M NaOH genom kraftig omrörning.
      4. Lägg 22 ml 100 mM Na-fosfatbuffert pH 8 (lösning blir grumlig) och rör om för att lösa upp fällningen som bildas.
      5. Justera pH till 8 (om nödvändigt) med användning av 1 M NaOH / HCl.
      6. Rör om kraftigt och värm milt (<50 ° C) till dess att lösningen är mestadels klart.
      7. Filter (0,2 um porstorlek) och delprov i 1 ml volymer. Förvara alikvoter vid -20 ° C.
  2. För varje brunn, använd 0,06 l Lösning A, 0,54 pl lösning B, 7,9 l Lösning C och 1,5 pl 0,1 M probenicid. Skapa en Master Mix för de 30 brunnarna genom att först kombinera 1,8 pl av lösning A och 16,2 | il av lösning B tillsammans i ett mikrofugrör. Blanda väl med hjälp av en virvel. Lägg 237 pl av lösning C och 45 | il av 0,1 M probenicid. Vortex att kombinera alla COMPONENts.
    Anmärkning: 6x laddningslösning är stabil i upp till 4 timmar (i mörker) men bör beredas så nära som möjligt före användning.
  3. Tillsätt 10 pl av 6x laddningslösning direkt i alla tomma och omvänt transfekterade brunnar utan att ta bort den befintliga media.
  4. Inkubera plattan vid rumstemperatur under 2 h i mörker.
  5. För att bestämma nivån av translokation, kvantifiera mängden fluorescens med användning av en mikroplattläsare.
    Obs: följande procedur är specifik för ClarioSTAR mikroplattläsare. Motsvarande mikro läsare kan också användas.
    1. Skapa en ny fluorescensintensitet protokollet använder slutpunkt som läsläge.
    2. Justera de grundläggande parametrarna enligt följande:
      1. Väljer 96-brunnars mikroplatta.
      2. Under optiska inställningar, välj 2 multichromatics med följande användardefinierade inställningar: (1) Ingång 410-10 nm excitation och 520 till 10 nm emission. (2) Ingång 410-10 nm excitation och 450 till 10 nm emission. Säkerställa väl Multiplaichromatics väljs.
      3. Välj omloppsmedelvärdes med en diameter av 3 mm.
      4. Under optisk väljer botten optik.
      5. Under hastighet och precision, väljer exakt. Detta motsvarar åtta regioner per brunn.
    3. Justera plattslayouten genom att välja lämpliga brunnar som prover.
    4. Välj Starta mätningen.
    5. Ta av locket och placera magasinet i plattläsaren. För att undvika att nå maximal fluorescensvärden, se förstärkningsvärdet justeras. För att göra detta, utför en förstärkningsjustering på en av de infekterade brunnar som har omvänt transfekterats med OTP siRNA. Detta motsvarar det högsta förväntade translokation.
    6. Välj start mätning för att mäta alla lämpliga brunnarna med botten fluorescens vid en excitation av 410 nm och emission av både 450 nm och 520 nm för blått och grönt fluorescens, respektive.

7. Analys av resultat:

  1. Beräkna förhållandet450 nm till 520 nm (blått till grönt) för alla prover efter blank minskning och uttrycka förhållande till oinfekterade OTP provet.
    Obs: Följande analyssteg tillhandahålls för ett enkelt kalkylprogram.
    1. Använda exportfunktionen på mikroplattläsare, överföra råfluorescensvärdena som erhölls för både 520 nm och 450 nm emissionsvåglängder (6,5) i ett kalkylblad.
    2. Beräkna genomsnittet av de "tomma" avläsningar (media enbart, inga celler) för 520 nm våglängd genom att tillsätta de råa 520 nm fluorescensvärden och dividera med antalet brunnar (3). Upprepa med användning av de tomma 450 nm våglängdsvärden. Dessa värden representerar bakgrundsfluorescensen på grund av den 96-brunnars platta och media.
    3. Subtrahera bakgrundsfluorescens. Använda värdena i 7.1.2 subtrahera medelvärdet av ämnet 520 nm våglängd från alla prov 520 nm fluorescensvärdena. Upprepa för 450 nm våglängdsvärden.
    4. För att erhålla 450: 520 nm förhållande använda tomma korrigerade värden (7.1.3). Dela upp varje prov 450 nm fluorescensvärdet av dess motsvarande 520 nm värde.
    5. Beräkna medelvärdet av de oinfekterade OTP kvotvärdena genom att lägga till 450: 520 nm förhållandevärden (från 7.1.4) och dividera med antalet brunnar (3).
    6. Beräkna förhållandet av proverna i förhållande till oinfekterade OTP genom att dividera 450: 520 nm kvoten beräknas i 7.1.4 med genomsnittet av de oinfekterade OTP förhållandevärde som beräknats i 7.1.5.

8. Tillsats av Nuclei Stain att bestämma mobilnummer efter transloka analys (DAG 8)

  1. Efter kvantifiering av fluorescens, avlägsna media innehållande 6x laddningslösning från alla brunnar med hjälp av antingen en flerkanalsadapter ansluten till en vakuumkälla eller manuellt med en flerkanalig pipett.
  2. Tillsätt 50 pl 4% PFA (paraformaldehyd) lösningi PBS till alla lämpliga brunnar för att fixera celler. Inkubera vid RT i 20 min.
  3. Ta bort 4% PFA PBS-lösning (enligt 8.1) och tvätta cellerna två gånger med 75 pl PBS.
  4. Tillsätt 50 pl av en cellpermeabla nukleär färgning, exempelvis DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol), till varje brunn. Hämta bilder med ett fluorescensmikroskop och kvantifiera antalet kärnor som föreligger i varje brunn efter siRNA behandling med hjälp av lämplig mjukvara för bildanalys, såsom ImageJ 41.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För denna studie, C. burnetii pBlaM-CBU0077 stammen valdes som CBU0077 har tidigare visats vara en translokerad effektor av Coxiella Dot / Icm sekretionssystemet 17. Före infektion, det totala antalet för ledare för genom / ml i sju dag C. burnetii pBlaM-CBU0077 kultur räknades med hjälp av qPCR. Figur 4 visar ett exempel på tröskeln cykeln (Ct) värden förväntas från både standarder och prover efter qPCR. Ct-värdena (representerade grafiskt i Amplification Plot (figur 4B) och numeriskt (figur 4C)) exporterades och analyserades såsom beskrivits i 4.3.3. Baserat på de representativa data som visas, det fanns 2,31 x 10 8 Genom / ml i 10 ml återsuspenderas bakteriekultur (Figur 4D). För att generera en lämplig bakteriell utspädning (1,88 x 10 8 genomen / ml in 2 ml), 1,63 ml av återsuspenderade bakterier tillsattes till 370 | il färskt, förvärmda DMEM + 10% FCS. Celler omvänt transfekterade med siRNA därefter infekterade med C. burnetii pBlaM-CBU0077 vid ett MOI av 300 under 24 h.

Efter inkubation av den omvända transfekterade infekterade celler med BLAM substrat kvantifiering av effektor translokering kan bestämmas med användning av en fluorescensplattläsare. Efter analys som beskrivs i 7, kan alla kvotvärden som har normaliserats till oinfekterade OTP också normaliseras för infekterat OTP. Nivån på effektor translokation efter tysta av värdgener kan delas in i tre utfall efter jämförelse med infekterade OTP kontroll: (1) Ingen förändring; (2) Ökad effektor translokation; (3) Minskad effektor translokation. Efterföljande statistiska analysen, t ex en student t-test, kan användas för att bestämma signifikansen av eventuella observerade skillnaden to infected OTP kontroll. Ett resultat av tysta antingen Rab5A eller Rab7A på effektor translokering från tre oberoende experiment visas i figur 5A. En signifikant minskning av nivån av BLAM-CBU0077 sloka inträffade under tysta av både Rab5A och Rab7A jämfört med OTP-kontroll (p-värde = 0,0088 (Rab5A) och p-värde = 0,0059 (Rab7A), parat, student t-test). Effekterna av siRNA-behandling på cellviabilitet fastställdes också. Efter transloka analysen fixerades celler, färgades med en kärnor fläck och därefter kvantifieras. Såsom visas i figur 5C, även om behandling med antingen Rab5A eller Rab7A resulterar i en minskning av cellviabilitet jämfört med OTP-kontroll (12% och 31%, respektive), är denna minskning inte lika hårda som PLK1 (97%), en gen känd att orsaka celldöd (p-värde = 0,0102 (Rab5A); p-värde = 0,0081 (Rab7A), p-värde <0,0001 (PLK1), parat, Students t-test). Dessa resultat visar hur tysta värd genes använder siRNA kan negativt påverka nivåerna av bakteriell effektor translokation.

Figur 1
Figur 1. Verkningsmekanismen av BLAM substratet under infektion. C. burnetii internaliseras av värdceller och bildar en lysosom härrörande vakuolen kallas Coxiella-innehållande vakuolen. 24 h efter infektion, celler laddade med membranet permeabelt BLAM substrat som besitter två fluoroforer som bildar ett FRET par (A). I frånvaro av β-laktamas dvs ingen translokation av BLAM-CBU0077 effektor, excitation av kumarin vid 410 nm resulterar i FRET till fluorescein, observerade som ett grönt fluorescenssignal (520 nm) (B). i händelse av en funktionell Dot / Icm sekretionssystem, den BLAM-CBU0077 fusionsprotein kommer att translokeras in i värdcellen och kommer cleave den BLAM substrat, via β-laktamasaktivitet, vilket gör att separationen av de två färgämnena och vilket resulterar i FRET störningar och en blå fluorescenssignal (450 nm) efter excitation vid 410 nm (C). Både de gröna och blå fluorescenssignaler kan vara detekteras med hjälp av en fluorescensplattläsare. klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
. Figur 2. Schematisk översikt av Reverse Transfektion och transloka analys Workflow Dag 1: Förbered C. burnetii pBlaM-CBU0077 kultur Dag 4:. Omvänd transfektera med användning av 40 nM siRNA och utsäde HeLa 229-celler vid en slutlig densitet av 3,92 x 10 3 celler / brunn i en 96-brunnsbricka Dag 5:. Change media Dag 7:. kvantifiera det totala rade genom / ml av C. burnetii pBlaM-CBU0077 kultur med hjälp av qPCR och därefter infektera omvänt transfekterade celler med en MOI av 300. Dag 8:. Lägg 6x laddningsfärg, mäta fluorescens och kvantifiera antalet celler Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. 96-brunnar Layout Används för att ställa upp Reverse Transfektion och sådd av HeLa 229-celler. De "tomma" brunnar (visas i rött) innehåller bara media och behöver inte tillsats av antingen siRNA eller HeLa 229-celler. OTP siRNA (visas i ljusblått för oinfekterade brunnar och mörkblå för infekterade brunnar) används som en icke-inriktning kontroll, eftersom det har optimerats för atthar färre off-target effekter. Den rödbrun och gröna brunnar representerar Rab5A och Rab7A siRNA, respektive. PLK1 siRNA (visas i gult) används som ett mått på transfektion effektivitet förlust av PLK1 uttryck kan inducera pro-apoptotiska vägar och omfattande celldöd i en stor majoritet av cellinjer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Representativa qPCR Ct-värden användes för att kvantifiera det totala antalet för ledare för genom / ml i C. burnetii pBlaM-CBU0077 Cykeln betingelser som används vid qPCR att räkna antalet för ledare för genom / ml i Coxiella kulturer Culture. (A). Ct-värdena för båda standarderna och prover visas grafiskt (B) och numeriskt (C)format. (D) Standard Ct värdena genomsnitt, ritade och en logaritmisk trendlinje beräknades. Med användning av ekvationen och genomsnitten för provet Ct-värden det totala antalet för ledare för genom / ml i C. burnetii pBlaM-CBU0077 kultur bestämdes till 2,31 x 10 8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. translokation av Dot / Icm Effector BLAM-CBU0077 under siRNA tysta Rab5A och Rab7A. HeLa 229-celler omvänd transfekterades med siRNA specifik för Rab5A (rödbruna staplar), Rab7A (gröna staplar), OTP (blå staplar) eller PLK1 (gula staplar) och inkuberades under 72 timmar före infektion med C. burnetii pBlaM-CBU0077 stammen vid en MOI av 300 under 24 h. efter tHan tillsats av BLAM substratades fluorescens mättes med användning av en mikroplattläsare (A) Tabellen visar rå fluorescens värden som erhållits från ett enda experiment tillsammans med 450. 520 nm-förhållande i förhållande till oinfekterade OTP kontroll efter subtraktion av blankvärden (media bara, inga celler). Nivån av translokation (B) och cellviabilitet (C) presenteras som den procentuella medelvärde ± standardavvikelse i förhållande till OTP omvända transfekterade infekterade celler från tre oberoende experiment. * P-värde <0,05; ** P-värde <0,01; **** P-värde <0,0001 (parad, Students t-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Komponent Koncentration
citronsyra 13,4 mM
natriumcitrat 16,1 mM
kaliumfosfat 3,67 mM
magnesiumklorid 1 mM
kalciumklorid 0,02 mM
järnsulfat 0,01 mM
natriumklorid 125.4 mM
L-cystein 1,5 mM
neopeptone 0,1 g / L
kasaminosyror 2,5 g / L
metyl-beta-cyklodextrin 1 g / L
RPMI 125 ml / L

Tabell 1. de komponenter som krävs för att göra 1x ACCM-2.

Tabell 2. Volym 1x siRNA Buffer Krävs för Hydrating Frystorkat siRNA till lämplig koncentration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sekretionssystem, och bakterie effektorproteiner dessa transportsystem i cytoplasman i värdceller, är en viktig virulens komponent som många patogena bakterier använder för att etablera en infektion inom unika replikativa nischer. Fokus för många forskargrupper har varit att undersöka samspelet mellan bakterieeffektenheter och värdproteiner och påverkar dessa effektenheter har på värd cellulära vägar. Mycket begränsad forskning, om någon, har undersökt möjligheten för värdproteiner vara nödvändigt för framgångsrik bakterie effektor translokation.

I denna studie har vi använt obligat, intracellulär patogen Coxiella burnetii, det orsakande medlet av zoonotisk Q-feber. Efter inträde i värdceller, den Coxiella innehållande vakuolen trafikerar passivt genom den kanoniska endocytiska vägen till att nå en sur lysosom härrörande vakuolen, där det replikerar till mycket höga tal. Bortsett från att ta Advantage av den normala värdhandel vägen, bygger förmåga Coxiella att etablera en framgångsrik replika nisch också på en funktionell typ IVB sekretionssystemet (T4SS) och efterföljande effektor transloka 8,17. Denna sekretionssystemet är funktionellt analog med den välkaraktäriserade Dot / Icm T4SS av Legionella. Detta träffande demonstreras genom att komplettera specifika punkter / ICM mutanter av Legionella med sina respektive Coxiella gener 19,20. Fastän T4SSs av både Legionella och Coxiella är väsentliga för replikation, är tidpunkten för när dessa system aktiveras helt annorlunda och återspeglar den divergenta naturen hos deras respektive replikativa nischer. Legionella T4SS utlöses omedelbart vid kontakt med värdceller och den snabba translokation av effektorer tillåter bakterierna att undvika standard endosomal-lysosomal väg och i stället skapa en unik ER-derived replika vakuumle 42. I motsats till detta T4SS av Coxiella aktiveras inte förrän cirka 8 h efter infektion, efter att bakterierna når den sura lysosom-härledda vacuole 21.

Med tanke på att Coxiella transit passivt genom den endocytiska vägen och translokasystemet aktiveras inte förrän den når lysosomen, presenterar en unik möjlighet i sig att använda Coxiella som ett verktyg för att studera endocytiska mognad. Kravet på CCV att bli surgöras före effektorer translokeras indikerar att ett antal värdproteiner är viktiga för den translokation av effektorceller proteiner in i värd cytoplasman, i synnerhet, men inte begränsat till, proteiner som är involverade i den endocytiska trafficking vägen. Med hjälp av siRNA i ett visst målinriktat sätt kan vi börja att belysa betydelsen av särskilda värdproteiner på effektor translokation. I denna studie har vi fokuserat på två proteiner som reglerar den eukaryota endocytiska trafficking vägen, och därmed förutsades för att åstadkomma translokation av Coxiella effektorn CBU0077. Rab5A och Rab7A kontroll membranfusion med tidiga och sena endosomer, respektive. Tysta endera av dessa proteiner med användning av siRNA resulterade i en signifikant minskning av transloka effektivitet CBU0077 när jämfört med kontrollen OTP siRNA (figur 5B). De representativa resultat som visas här återspeglar våra tidigare publicerade resultaten 21 och ger ytterligare validering till betydelsen av dessa humana Rab proteiner till Coxiella effektor translokation. Denna teknik har också använts för att karaktärisera effekten av andra värd processer på Coxiella Dot / Icm effektor translokation. Den retromer komplex befanns vara viktigt för intracellulär replikering av Coxiella. Genom att tysta retromer komponenter, med hjälp av siRNA, och sedan genomföra en translokation analys kunde vi visa att retromer krävs för att skapa den miljö som inducerarCoxiella effektor translokation 43.

Även de representativa resultat som visas här är en jämförelse mellan infekterad OTP kontroll och siRNA inriktning Rab5A och Rab7A kan protokollet modifieras enligt experimentella behov. Exempelvis kan nivån av effektor sloka också jämföras med celler transfekterade med kodat siRNA eller icke-transfekterade celler.

Fokus för denna studie var obligat, intracellulär patogen C. burnetii och proteiner involverade i endocytiska trafficking emellertid de metoder som beskrivs inom lätt kan anpassas till andra intracellulära och extracellulära patogener som utnyttjar sekretionssystem för virulens. Faktum är att fluorescensbaserade translokation analys som bygger på β-laktamasaktivitet i värd cytoplasman används här, har redan i stor utsträckning använts för en rad patogener 30-32,35,44. Naturligtvis infektionsförhållandenspecifika cellinjer som används måste anpassas för att återspegla de infektions krav specifika bakterier. Dessutom, en känd endogen effektor smält till p-laktamas är avgörande för framgången med de metoder som beskrivs i. En viktig faktor för ett framgångsrikt genomförande av protokollet förklaras här är effekten att tysta en viss värd mål kan ha på bakteriell inträde och efterföljande replikering. Här är effektor sloka av Coxiella mätt 24 h efter infektion. I detta fall, och för andra intracellulära bakterier, är av avgörande betydelse för organismens förmåga att ta sig in i värdceller. Dessutom kan specifika geners uttryck också påverka bakteriell replikering därför förändra nivån av translokation observeras. Bekräftelse på att siRNA tysta inte påtagligt påverkar bakterie inträde och / eller replikation, och därmed transloka effektivitet skulle kunna uppnås med hjälp av antingen mikroskopi eller numrering av bakterier. translokationdata kan sedan normaliseras för antalet infekterade celler per siRNA behandling. Bakteriell replikation har inte förväxlas de data som presenteras här som Coxiella genomgår liten eller ingen replikering under 24 h inkubationsperiod.

Denna metod kräver en effektiv transfektion av siRNA in i värdceller för att säkerställa tillräcklig ljuddämpning av genen av intresse. Med detta i åtanke, är oerhört viktigt att välja rätt transfektionsreagens. Bortsett från reagens och betingelser som användes i denna studie, som har optimerats för HeLa 229-celler, det finns många andra reagens för att välja mellan. Den knockdown effektivitet med olika transfektionsreagens kan kvantifieras med hjälp av RT-qPCR att säkerställa att både den mest lämpliga reagens väljs och att siRNA valt specifikt inriktad på utskrift av intresse. Även om det inte presenteras i denna studie, har vi tidigare visat att knockdown effektivitet både Rab5A och Rab7A använder RT-qPCR 21. Dessutom kan användningen av antikroppar mot målet av intresse och bekräftelse av western blöt bekräftar också siRNA tysta specifika mål.

Två andra viktiga faktorer att ta del av när du använder siRNA innefatta möjligheten av off-mål effekter och cellviabiliteten av transfekterade celler. Off-mål uppstår när oavsiktliga mål också förstörts. Detta kan leda till fenotypiska förändringar och kan leda till falska positiva. I denna studie utnyttjade vi en pool av fyra siRNA duplex för att tysta en enda värd mål. Om tysta ett särskilt mål orsakar en minskning av transloka effektivitet, validering att detta resultat beror inte på off-mål-effekter kan uppnås genom att separera de fyra siRNA-duplex och upprepning av translokation analysen. Minst två av fyra siRNA duplex bör visa en liknande fenotyp till den ursprungliga siRNA poolen. Med detta resultat kan man vara mycket säker på att den observerade translocation effektiviteten beror inte på off-mål-effekter. Giltigheten av de transloka resultat som också är beroende av cellernas livskraft. Tillämpningen av en kärnor fläck efter translokation analysen möjliggör uppräkning av cellviabilitet efter siRNA tysta. I fallet med PLK1, kan betydande celldöd lätt observeras utan färgning; dock, med användning av epifluorescensmikroskopi en mer exakt representation kan uppnås. Om genom att tysta en viss värd mål betydande celldöd observeras, t ex 50% jämfört med kontrollen, är det osannolikt att en korrekt bild kan utläsas att det är viktigt att den speciella värdprotein till translokation av effektorer. Såsom visas i denna studie, men tysta antingen Rab5A eller Rab7A har en liten inverkan på cellviabilitet (Figur 5C), är denna minskning inte uttalas nog att förneka giltigheten av transloka observerade data. Ett annat övervägande med avseende på cellviabilitet follgrund siRNA ljuddämpning är observationen att signifikant celldöd leder ofta till en ökning i translokationsförhållandet. Detta är träffande demonstreras av transloka redovisade uppgifterna för PLK1 (figur 5A). Cellantalet minskas resulterar i en proportionell ökning av mångfalden av infektion. Detta kommer att öka infektionsfrekvensen och därmed den translokaförhållandet.

Även om det inte presenteras i denna studie, kan visualisering av effektor sloka också ge en gratis kvantitativt resultat. Använda en epifluorescent mikroskop utrustat med en lång passning dikroisk spegel för att separera excitation och emissionsljus kan ge en visuell observation av intracellulär BLAM substrat fluorescens. Ett möjligt alternativ till β-laktamas reportersystem är att utnyttja den adenylat-cyklas reportersystem. Liknande den reportersystem som beskrivs här, är genen av intresse smält till en kalmodulinberoende adenylatcyklas-genen (cyaA Bordetella pertussis. Effektor translokering kan mätas genom kvantifiering av intracellulär, cyklisk AMP (cAMP) med användning av en immunanalys ELISA-kit. Eftersom aktiviteten hos CyaA är helt beroende av värdcell calmodulin, som endast förekommer i värd cytosolen är effektor sloka bekräftas av en ökning av cAMP-nivåer. Även om denna metod har också använts med framgång för att mäta effektor sloka för en mängd olika bakterier 45-47, kvantifiering av intracellulär cAMP förlitar sig på lys av värdceller för att extrahera cAMP, en process som är mer tidskrävande jämfört med den metod som beskrivs inom. Mätning av effektor sloka använda FRET-baserade β-laktamas reportersystem är mer effektivt eftersom BLAM substrat kan tillsättas direkt till cellerna och fluorescens kan mätas inom några timmar. Dessutom kan den här beskrivna metoden lättare anordnad att alstra hög genomströmning resultat, särskilt i en 96-brunnars formenpå.

Många bakteriella patogener beror på proteintranslokation system för att införa effektor proteiner i värdceller som möjliggör modulering av värdcellfunktioner till förmån för patogenen. Typ IV sekretionssystem används av intracellulära bakterier såsom legionella, Coxiella och Brucella och typ III sekretionssystem används av en rad patogener inklusive Chlamydia, fästa och utplåna E. coli och Salmonella. Genom att jämföra effekten av tysta uttryck av specifika värdproteiner på effektor translokation av en rad patogener, kan en förståelse av värd faktorer som är nödvändiga för effektor translokation av vissa typer av sekretionssystem eller specifika för en enskild patogen belysas. Detta ger en unik metod för att studera den invecklade värd-patogen interaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

målkoncentrationen
1 ^ M 5 | iM 10 ^ M 20 pM
utgångs Mol
1 nmol 1 ml 200 ^ 100 ^ 50 ^
2 nmol 2 ml 400 ^ 200 ^ 100 ^
5 nmol 5 ml 1 ml 500 ^ 250 | il
10 nmol 10 ml 2 ml 1 ml 500 ^
20 nmol 20 ml 4 ml 2 ml 1 ml
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Citric acid Sigma C0759 ACCM-2 medium component
Sodium citrate Sigma S4641 ACCM-2 medium component
Potassium phosphate Sigma 60218 ACCM-2 medium component
Magnesium chloride Calbiochem 442611 ACCM-2 medium component
Calcium chloride Sigma C5080 ACCM-2 medium component
Iron sulfate Fisher S93248 ACCM-2 medium component
Sodium chloride Sigma S9625 ACCM-2 medium component
L-cysteine Sigma C6852 ACCM-2 medium component
Bacto-neopeptone BD 211681 ACCM-2 medium component
Casamino acids Fisher BP1424 ACCM-2 medium component
Methyl beta cyclodextrin Sigma C4555 ACCM-2 medium component
RPMI + Glutamax ThermoFisher Scientific 61870-036 ACCM-2 medium component
Chloramphenicol Sigma C0378 For bacterial culture
ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP) Dharmacon D-001810-10-05 Non-targeting control
siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-003290-01-005 Causes cell death; measure of transfection efficiency
siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-004009-00-0005
siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-010388-00-0005
5x siRNA buffer Dharmacon B-002000-UB-100 Use sterile RNase-free water to dilute 5x siRNA buffer to 1x siRNA buffer
DharmaFECT-1 Transfection Reagent Dharmacon T-2001-01 For transfection
Opti-MEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 51985-034 Reduced-serum medium used for transfection
DMEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 10567-014 For cell culture and infection
Heat-inactivated fetal calf serum (FCS) Thermo Scientific SH30071.03 Can use alternate equivalent product
DMSO Sigma D8418 For storage of Coxiella strain
PBS For cell culture
0.05% Trypsin + EDTA ThermoFisher Scientific 25300-054 For cell culture
dH2O For dilution of samples and standards for qPCR
Quick-gDNA Mini Prep ZYMO Research D3007 Can use alternate equivalent product to extract gDNA
SensiFAST SYBR No-ROX Kit Bioline BIO-98020 Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction
LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM Invitrogen K1032 For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)
Sodium hydroxide Merck 106469 Probenicid solution component
Sodium phosphate monobasic Sigma 71505 Probenicid solution component
di-Sodium hydrogen orthophosphate Merck 106586 Probenicid solution component
Probenicid Sigma P8761 Probenicid solution component
DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) ThermoFisher Scientific 62251 Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS. 
4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS Sigma P6148 Fixing solution for HeLa 229 cells
25 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430639 For growth of bacterial strain
96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile Corning 3603
75 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430641 For growth of HeLa 229 cells
175 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 431080 For growth of HeLa 229 cells
Haemocytometer For quantification of HeLa 229 cells
Tear-A-Way 96 Well PCR plates 4titude 4ti-0750/TA For qPCR reaction
8-Lid chain, flat Sarstedt 65.989.002 For qPCR reaction
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Bench top microfuge
Bench top vortex
Orbital mixer
Centrifuge Eppendorf 5810 R For pelleting bacterial culture
Nanodrop For gDNA quantification
Mx3005P QPCR machine Aligent Technologies 401456 For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture
ClarioSTAR microplate reader BMG LabTech For measurement of fluorescence

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Delsing, C. E., Warris, A., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever: still more queries than answers. Adv Exp Med Biol. 719, 133-143 (2011).
  2. Delsing, C. E., Kullberg, B. J., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever in the Netherlands from 2007 to. Neth J Med. 68, 382-387 (2010).
  3. van der Hoek, W., et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Adv Exp Med Biol. 984, 329-364 (2012).
  4. Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. Lancet Infect Dis. 3, 709-721 (2003).
  5. Hoover, T. A., Culp, D. W., Vodkin, M. H., Williams, J. C., Thompson, H. A. Chromosomal DNA deletions explain phenotypic characteristics of two antigenic variants, phase II and RSA 514 (crazy), of the Coxiella burnetii nine mile strain. Infect Immun. 70, 6726-6733 (2002).
  6. Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii are facilitated by an improved axenic growth medium. Appl Environ Microbiol. 77, 3720-3725 (2011).
  7. Omsland, A., et al. Host cell-free growth of the Q fever bacterium Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4430-4434 (2009).
  8. Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. MBio. 2, e00175-e00111 (2011).
  9. Chen, C., et al. Large-scale identification and translocation of type IV secretion substrates by Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 21755-21760 (2010).
  10. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii cryptic plasmid is enriched in genes encoding type IV secretion system substrates. J Bacteriol. 193, 1493-1503 (2011).
  11. Beare, P. A., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. A. Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Front Microbiol. 2, 97 (2011).
  12. Beare, P. A., Larson, C. L., Gilk, S. D., Heinzen, R. A. Two systems for targeted gene deletion in Coxiella burnetii. Appl Environ Microbiol. 78, 4580-4589 (2012).
  13. Howe, D., Shannon, J. G., Winfree, S., Dorward, D. W., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii phase I and II variants replicate with similar kinetics in degradative phagolysosome-like compartments of human macrophages. Infect Immun. 78, 3465-3474 (2010).
  14. Heinzen, R. A., Scidmore, M. A., Rockey, D. D., Hackstadt, T. Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis. Infect Immun. 64, 796-809 (1996).
  15. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cell Microbiol. 9, 891-909 (2007).
  16. Beare, P. A. Genetic manipulation of Coxiella burnetii. Adv Exp Med Biol. 984, 249-271 (2012).
  17. Carey, K. L., Newton, H. J., Luhrmann, A., Roy, C. R. The Coxiella burnetii Dot/Icm system delivers a unique repertoire of type IV effectors into host cells and is required for intracellular replication. PLoS Pathog. 7, e1002056 (2011).
  18. Segal, G., Shuman, H. A. Possible origin of the Legionella pneumophila virulence genes and their relation to Coxiella burnetii. Mol Microbiol. 33, 669-670 (1999).
  19. Zamboni, D. S., McGrath, S., Rabinovitch, M., Roy, C. R. Coxiella burnetii express type IV secretion system proteins that function similarly to components of the Legionella pneumophila Dot/Icm system. Mol Microbiol. 49, 965-976 (2003).
  20. Zusman, T., Yerushalmi, G., Segal, G. Functional similarities between the icm/dot pathogenesis systems of Coxiella'burnetii and Legionella pneumophila. Infect Immun. 71, 3714-3723 (2003).
  21. Newton, H. J., McDonough, J. A., Roy, C. R. Effector Protein Translocation by the Coxiella burnetii Dot/Icm Type IV Secretion System Requires Endocytic Maturation of the Pathogen-Occupied Vacuole. PLoS One. 8, e54566 (2013).
  22. Lifshitz, Z., et al. Computational modeling and experimental validation of the Legionella and Coxiella virulence-related type-IVB secretion signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E707-E715 (2013).
  23. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii ankyrin repeat domain-containing protein family is heterogeneous, with C-terminal truncations that influence Dot/Icm-mediated secretion. J Bacteriol. 191, 4232-4242 (2009).
  24. Weber, M. M., et al. Identification of C. burnetii type IV secretion substrates required for intracellular replication and Coxiella-containing vacuole formation. J Bacteriol. , (2013).
  25. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Luhrmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-678 (2013).
  26. Larson, C. L., Beare, P. A., Howe, D., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii effector protein subverts clathrin-mediated vesicular trafficking for pathogen vacuole biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4770-E4779 (2013).
  27. Luhrmann, A., Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetii type IV effector protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18997-19001 (2010).
  28. Newton, H. J., et al. A screen of Coxiella burnetii mutants reveals important roles for Dot/Icm effectors and host autophagy in vacuole biogenesis. PLoS Pathog. 10, (2014).
  29. Pan, X., Luhrmann, A., Satoh, A., Laskowski-Arce, M. A., Roy, C. R. Ankyrin repeat proteins comprise a diverse family of bacterial type IV effectors. Science. 320, 1651-1654 (2008).
  30. Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
  31. de Felipe, K. S., et al. Legionella eukaryotic-like type IV substrates interfere with organelle trafficking. PLoS Pathog. 4, e1000117 (2008).
  32. de Jong, M. F., Sun, Y. H., den Hartigh, A. B., van Dijl, J. M., Tsolis, R. M. Identification of VceA and VceC, two members of the VjbR regulon that are translocated into macrophages by the Brucella type IV secretion system. Mol Microbiol. 70, 1378-1396 (2008).
  33. Raffatellu, M., et al. Host restriction of Salmonella enterica serotype Typhi is not caused by functional alteration of SipA, SopB, or SopD. Infect Immun. 73, 7817-7826 (2005).
  34. Wood, R. E., Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Dot/Icm Effector Translocation by Legionella longbeachae Creates a Replicative Vacuole Similar to That of Legionella pneumophila despite Translocation of Distinct Effector Repertoires. Infect Immun. 83, 4081-4092 (2015).
  35. Mueller, K. E., Fields, K. A. Application of beta-lactamase reporter fusions as an indicator of effector protein secretion during infections with the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. PLoS One. 10, (2015).
  36. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  37. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  38. Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e252 (2015).
  39. Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS Pathog. 10, e1004013 (2014).
  40. Jaton, K., Peter, O., Raoult, D., Tissot, J. D., Greub, G. Development of a high throughput PCR to detect Coxiella burnetii and its application in a diagnostic laboratory over a 7-year period. New Microbes New Infect. 1, 6-12 (2013).
  41. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  42. Prashar, A., Terebiznik, M. R. Legionella pneumophila: homeward bound away from the phagosome. Curr Opin Microbiol. 23C, 86-93 (2014).
  43. McDonough, J. A., et al. Host Pathways Important for Coxiella burnetii Infection Revealed by Genome-Wide RNA Interference Screening. MBio. 4 (1), e00606-e00612 (2013).
  44. Farfan, M. J., Toro, C. S., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella enterotoxin-2 is a type III effector that participates in Shigella-induced interleukin 8 secretion by epithelial cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 61, 332-339 (2011).
  45. Al-Khodor, S., Price, C. T., Habyarimana, F., Kalia, A., Abu Kwaik, Y. A Dot/Icm-translocated ankyrin protein of Legionella pneumophila is required for intracellular proliferation within human macrophages and protozoa. Mol Microbiol. 70, 908-923 (2008).
  46. Geddes, K., Worley, M., Niemann, G., Heffron, F. Identification of new secreted effectors in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. 73, 6260-6271 (2005).
  47. Sory, M. P., Boland, A., Lambermont, I., Cornelis, G. R. Identification of the YopE and YopH domains required for secretion and internalization into the cytosol of macrophages, using the cyaA gene fusion approach. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 11998-12002 (1995).

Tags

Infektion värdpatogen interaktion bakteriella sekretionssystem β-laktamas slokaanalys BLAM substrat fluorescens mikrobiologi intracellulära bakteriella patogener, Tysta gener siRNA molekylärbiologi
Tillämpa Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) för att undersöka Effector Trans Effektivitet av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Under siRNA Ljuddämpning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Newton, P., Latomanski, E. A.,… More

Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing. J. Vis. Exp. (113), e54210, doi:10.3791/54210 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter