Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Анализ мозга Митохондрии Использование последовательного Block-Face сканирующая электронная микроскопия

Published: July 9, 2016 doi: 10.3791/54214

Abstract

Человеческий мозг является высокое потребление энергии орган, который в основном опирается на глюкозу в качестве источника топлива. Глюкоза катаболизируется митохондрий мозга с помощью гликолиза, пути три-карбоновой кислоты (ТСА) цикл и окислительного фосфорилирования (OXPHOS) для получения клеточной энергии в виде аденозинтрифосфата (АТФ). Нарушение митохондриальной АТФ вызывает митохондриальных нарушений, которые представляют клинически с видными неврологическими и миопатии симптомов. Митохондриальные дефекты также присутствуют в неврологическими расстройствами (например , расстройства спектра аутизма) и нейродегенеративных расстройств (например , боковой амиотрофический склероз, болезнь Альцгеймера и болезни Паркинсона). Таким образом, существует повышенный интерес к области для проведения 3D анализа митохондриальной морфологии, структуры и распределения в рамках обоих здоровых и болезненных состояний. Мозг митохондриальная морфологии чрезвычайно разнообразны, с некоторыми митохондрии особенно всинаптической области находится в диапазоне от <диаметром 200 нм, что ниже предела разрешения традиционной световой микроскопии. Выражая митохондрии нацеленную зеленый флуоресцентный белок (GFP) в головном мозге значительно повышает органоидного обнаружение с помощью конфокальной микроскопии. Тем не менее, оно не устраняет ограничения на чувствительность обнаружения относительно небольших размеров митохондрий без oversaturating образы больших размеров митохондрий. В то время как последовательная передача электронной микроскопии была успешно использована для описания митохондрии на нейронном синапсе, этот метод очень много времени, особенно при сравнении нескольких образцов. Метод последовательного блок-лицо сканирующей электронной микроскопии (SBFSEM) включает в себя автоматизированный процесс секционирования, блоки формирования изображения ткани и сбора данных. Здесь мы приводим протокол для выполнения SBFSEM из определенной области от мозга грызуна быстро реконструировать и визуализировать митохондриальной морфологии. Эта технологияNique также может быть использован для обеспечения точной информации о митохондриальной номер, объем, размер и распределение в определенной области мозга. Так как полученное разрешение изображения высокое (как правило, до 10 нм), также могут быть обнаружены какие-либо грубые митохондриальные морфологические дефекты.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Митохондрии являются динамическими органеллы , которые изменяют свою форму и расположение в зависимости от сотовой связи киев и потребностей, в тесном взаимодействии с цитоскелета клетки, и в ответ на клеточных событий , таких как токи кальция в нейронах 1. Митохондрии также взаимодействовать с другими клеточные органеллы , например , эндоплазматический ретикулум, что , в свою очередь , регулирует их динамику и метаболизм 2. Митохондриальная морфология показывает гетерогенность в различных типах клеток т.е.. форма органеллы изменяется от трубчатой ​​до , что состоящие из листов, мешков и овалы 3. Было показано , что митохондриальные синтеза и деления белков цикл может регулировать местоположение, размер, форма и распределение митохондрий 4. Более того, изменения в митохондриальной формы связаны с нейродегенерации, нейрональной пластичности, мышечной атрофии, кальциевой сигнализации, генерации активных форм кислорода, а также продолжительность жизни и гибели клеток вовлекая тхаТ - клеток специфических митохондриальная морфологии имеет решающее значение для поддержания нормальной клеточной функции 5-11.

Одна из основных биоэнергетической функция митохондрий является создание аденозинтрифосфата (АТФ), выполнив ряд метаболических реакций , которые включают полный распад питательных веществ (т.е. глюкоза, жирные кислоты или амино-кислоты) через ЦТК и OXPHOS путей 12. Человеческий мозг составляет лишь 2% от массы тела , однако он потребляет ~ 20% от общего объема произведенной энергии делает его чрезвычайно энергию с требованием органа 13. Поэтому не удивительно , что митохондриальной дисфункцией у человека приводит к большому числу неврологических проявлений 14-17 лет. Генетические мутации в компонентах OXPHOS , которые ослабляют приводит АТФ поколения к митохондриальных нарушений 17,18, которые клинически гетерогенную группу расстройств с преобладанием ~ 1: 5000 человек, и одна из наиболее распространенных причин мetabolic расстройства у детей и взрослых. Дефицит митохондрии происхождения АТФ влияет на несколько органов и систем с требовательными органов высоких энергий , таких как мозг, сердце и скелетных мышц будучи преимущественно затронуты в этих больных 14,17,18. В последние годы, несколько исследований были получены данные для митохондриальной дисфункции у обоих неврологическими и нейродегенеративные расстройства 15-17,19,20. Поскольку митохондрии являются существенными и решающее значение для развития и функционирования мозга, что необходимо разработать протоколы, которые могут анализировать изменения мозга митохондриальной морфологии, структуры, размера, количества и распределения по обоим здоровых и больных состояний. Мышиные модели с митохондриях-целевой зеленого флуоресцентного белка (GFP) были произведены для визуализации митохондриальные движения и локализации в головном мозге 21,22. Хотя это является чрезвычайно полезным инструментом для изучения митохондриальной моторику и общее распределение, есть некоторые недостатки, которые входите ограниченное разрешение и чувствительность флуоресцентной микроскопии. Эти свойства делают его трудно отследить относительно небольшие митохондрии размера. Аналогичным образом , последовательная передача электронной микроскопии была успешно использована для просмотра синаптическую митохондрии 23, но этот метод очень много времени. Митохондриальная морфология , как известно, весьма динамично , как они проходят непрерывные деления и термоядерных циклов, и в большинстве клеток митохондрии поддерживать высокосвязных сети 24-26. Нейроны высоко поляризованные клетки с множественными дендритов и аксонов, протяженных и митохондрий , которые образуют соединение с сетью сетчатую в теле клетки , возможно , придется разделить , как они делают свой ​​путь через эти невриты (рис 1). Это делает митохондрии мозга весьма разнообразные по форме и размеру. Например, с помощью последовательного блок-слойного сканирующей электронной микроскопии (SBFSEM) метод, ранее мы наблюдали, что разница в объеме или размер внесинаптического mitochondrIA в митохондриях , присутствующих в нервных окончаниях , может быть столько , сколько шестнадцать сгиб 27.

Есть несколько подходов к проведению анализа объема 28, который включает в себя последовательный раздел TEM 29, автоматизированная лента сбора ультрамикротоме SEM 30, сфокусированный пучок ионов SEM 31 и SBFSEM 32. Анализ SBFSEM имеет преимущества в том, что она имеет разрешение предоставлять количественные данные о морфологической формы, размера, распределения и числа органелл, таких как митохондрии в районах до 1 мм мозга. Техническая операция также наименее требовательным, с сбора и анализа данных в рамках возможностей многих биологических лабораторий, которые испытывают недостаток предыдущего опыта EM. Появление коммерческих инструментов для создания последовательных секций подобные изображения сделал 3D ультраструктурную анализ тканей рутинной техникой, которая дополнительно позволяет непредвзятый анализ объемный в быстрой и повторяемым способом 28 32, основанный на идее , введенной Лейтона в 1981 году 33. Несколько исследований с тех пор установили эту технику в качестве основного инструмента при анализе реконструкции нейронной цепи 34. Кроме того, для многих небольших масштабных проектов, обеспечивает анализ реконструкции для выявления клеточных органелл 27,35-39. Так, приобретенные изображения являются производными от низкого напряжения обратного рассеяния электронов, были разработаны новые протоколы окрашивания , которые сочетают в себе различные известные методы окраски тяжелых металлов , чтобы увеличить разрешение 40.

В этой статье мы приводим протокол для использования 3D электронной микроскопии и обработки изображений объемный анализ митохондрий мозга , основанный на методах, которые ранее были использованы нами и другими 38,39,41. Методы ткани после обработки , используемые были , как описано ранее Deerinck и др40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Этика Заявление: Процедуры с участием субъектов животных были одобрены Animal Care и использование комитета Institutional (IACUC) в Вирджинии с.

Внимание: Экстремальные меры предосторожности следует соблюдать осторожность при обращении и утилизации нескольких компонентов, используемых в данном протоколе. Перед использованием местных институциональных руководящих принципов и практики охраны здоровья и безопасности должны быть установлены и с последующим, в частности, для осмия, который является летучим и чрезвычайно ядовиты, уранилацетате, который является одновременно тяжелый металл и источник радиоактивности, а также нитрат свинца, который является тяжелый металл яд. Тиокарбогидразида (TCH) может разлагаться производить взрывчатые и ядовитые газы, если неправильно обрабатывается. Многие учреждения будут иметь базовый центр EM, в котором эти реагенты обычно используются и могут оказать помощь.

1. Подготовка ткани головного мозга и SBFSEM визуализации

  1. Обезболить молодой (~ 2 - 4 месяца) C57 черная мышь (C57BL / 6J штамма), используя 4 - 5% isofluraпе следуя институциональных руководящих принципов. Подтвердите обезболивание путем контроля потери мышечного тонуса, отсутствие произвольных движений и ответов на неприятные стимулы, как хвост крайнем случае.
  2. Pin мыши на рассечение лотка и сделать надрез на коже вдоль вентральной срединной линии. Сделайте дополнительные надрезы в коже, чтобы подвергать грудной клетки мыши. Надрезать диафрагму, и осторожно рассекают из грудной полости по периферии, чтобы выставить бьющееся сердце, а затем сделать надрез на правое предсердие.
  3. Использование бабочки канюлю, вводить иглу в левый желудочек. Заливать мышь транскардиальную, используя 10 - 20 мл фосфатно-солевого буфера (PBS), рН 7,2, до тех пор, пока обескровливание подтверждается изменением цвета печени.
    Примечание: Изменение цвета печени используется в качестве ориентира для определения степени обескровливания. Убедитесь, что цвет печени изменяется от красновато-коричневого до бледно-розового цвета.
  4. Заливать мышь транскардиальную, используя 10 - 20 мл 2% глутаровыхальдегид и 4% параформальдегида сделано в 0,10 М какодилатный буфер (рН 7,2), чтобы зафиксировать ткань мозга быстро изнутри. Фиксирование контролируется путем наблюдения за хвост жесткости.
    Примечание: Приготовьте 0,10 М какодилатный буфер (рН 7,2) при растворении 2,14 г какодилате натрия в 80 мл воды, добавляют соляную кислоту, чтобы довести рН, и сделать объем до 100 мл водой.
  5. После перфузию, обезглавить мышь, рассекать мозг, с последующим закреплением в 0,10 М какодилатном натрия буфера (рН 7,2) , содержащего 2% глутаральдегида и 4% параформальдегида в течение 48 ч при 4 о С.
  6. Через 48 ч , до 400 мкм Коронарные срезы , используя vibratome , а затем осторожно рассекают интересующую область в мозге (например, гиппокамп) под микроскопом рассечение 42. Аккуратно обрежьте ткань и сделайте снимок для сохранения ориентации.
    Примечание: Post методы обработки окрашивания тканей в SBFSEM сочетает в себе различные методы окрашивания тяжелых металлов вдля того , чтобы повысить разрешение и основаны на методике , разработанной ранее Deerinck соавт 40.
  7. Промыть глутаральдегида фиксированных тканей 3 раза, 5 мин каждая в 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,2).
  8. Готовят 0,1% раствор дубильной кислоты путем растворения дубильные кислоты в 0,1 М буфере какодилатном натрия (рН 7,2). Вихревой до растворения и фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм, если это необходимо.
  9. Postfix ткани с какодилате буферном 0,1% дубильной кислоты путем инкубации в 1 мл реагента в течение 30 - 60 мин при комнатной температуре.
    Примечание: Время инкубации зависит от размера ткани, но 30 мин лучше всего работает для большинства тканей.
  10. Вымойте тканей 3 раза, 5 мин каждый в какодилатном буфере (рН 7,2).
  11. Растворить 0,3 г ферроцианида калия и 0,86 г какодилат натри в 10 мл дистиллированной H 2 O (дН 2 O). Хранить раствор кровяной соли на льду. Непосредственно перед использованием добавляют 10 мл 4% -ного осмия (OSO 4).
  12. Пятно ткани с 2% зеваMium-ферроцианида раствор в течение 90 мин, на льду. Промыть 3 раза, 5 мин каждый в дН 2 O.
  13. Готовят 1% раствор тиокарбогидразида (TCH) путем растворения 0,1 г TCH в 10 мл дН 2 O. Растворение при температуре 60 ° С с помощью закрученного каждые 10 мин до полного растворения. Соблюдать правила техники безопасности при обращении с ТКП, в частности, заботиться, чтобы избежать использования металлов, нагрев до высокой температуры, или позволяя раствору высохнуть.
  14. Treat образцы со свежеприготовленным 1% КН в течение 20 мин при комнатной температуре. Промыть 3 раза, 5 мин каждый в дН 2 O.
  15. Развести 4% OsO 4 до 2% с дН 2 O, ткани окрашиваются 2% -ным водным раствором осмия инкубацией в течение 1 ч. Вымойте тканей 3 раза, 5 мин каждый с дН 2 O.
  16. Инкубируйте образцы O / N в 1% ацетата уранила в дН 2 O при 4 ° С.
  17. Готовят раствор свинца аспартат Уолтона (как описано Deerinck соавт 40).
    1. Растворите 0,998 г L-аспартата в 250 мл дН 2 Oа затем добавляют 10 N гидроксида калия (КОН) по каплям моды до тех пор, пока рН не достигнет 5,5. После регулировки рН, добавляют 0,066 г нитрата свинца в 10 мл аспарагиновой кислоты запаса и нагревают до 60 ° С в течение 30 мин.
  18. Полоскание ткани в дН 2 O и инкубировать со свинцом аспартат пятно Уолтона в течение 30 мин в 60 ° C духовке. Промыть 3 раза, 5 мин каждый в дН 2 O.
  19. Высушить пробы через градуированных серии спирта с использованием охлажденных растворов на 20%, 50%, 75%, 85% и 95% этанолом в течение 5 мин каждый, а затем 100% -ным этанолом 3 раза, в течение 10 мин каждый.
    Примечание: Используйте 100% этанола из только что открытой бутылки, как прочитанного этанол поглощает воду из воздуха и вызывать встраивание потерпеть неудачу. Более длинные инкубирование необходимо будет с более крупными образцами тканей.
  20. Вымойте образцы 2 раза, 15 мин каждый раз в окись пропилена.
  21. Сделать пластическую вложение смолы с использованием 25 мл смолы, 10,5 мл DDSA (додеценил янтарного ангидрида), 15,5 мл NMA (надиковый метил ангидрид) и 1 млДМП-30 (2,4,6-трис диметиламинометил фенол). Смешайте смолу путем встряхивания. Спин и позволяют смолу стоять, пока пузырьки решимости.
    Примечание: Это стандартный рецепт среда твердости. Могут быть использованы другие типы электронной микроскопии (ЭМ) пластиковые смолы, но должна быть проверена с неосновной контрольного образца заранее, так как не все смолы работать на SBFSEM.
  22. Инкубируйте ткани O / N в 50: 50 смеси заливочных смол и окисью пропилена, в пузырек, который ограничен на начальном этапе, а затем без колпачков после 2 часов таким образом, чтобы окись пропилена испарится в течение периода приблизительно 8 - 10 часов.
  23. Передача ткани до 100% свежего вложению смолы в чистых флаконах в течение 2 часов.
  24. Код для вставки образцов в свежем вложении смолы, в плоских формах, содержащими печатные бумажные этикетки, и вылечить их в печи при температуре 60 ° С в течение 48 часов. Примерно через 1 час, проверьте размещение ткани и выравнивание снова, и при необходимости отрегулировать.
  25. Обрежьте образцы в интересующей области и смонтировать на алюминиевом штифтом с использованием gellinг цианакриловый суперклей или проводящую эпоксидную смолу, а затем слой с коллоидным серебром паста вокруг сторон блока для обеспечения токопроводящей дорожки к алюминиевым штифтом.
  26. Изучение образцов тканей с помощью микроскопа систему сканирующего электронного оснащенного стадии ультрамикротомом в-камере и низкой кВ детектора 32 обратного рассеяния электронов.
    Примечание: Получить приборостроении и сайт-обучение в сканирующей электронной микроскопии (SEM) использование и стать авторизованным пользователем. С другой стороны, сотрудничество с исследователем или основного объекта для небольших проектов может оказаться невозможным. Лучевая обучение также может потребоваться в качестве SEMs генерировать рентгеновские лучи.
  27. Для изображения образцов, используйте следующие настройки: 2,25 кВ, при 5 - 10 нм / разрешение пиксела, с размерами поля от 80 - 250 мкм в х, у (другое поле размеров возможно), и ломтик толщиной 50 - 100 нм, в общей сложности 250 - 600 ломтиков в 16 - период времени 20 ч.
    Примечание: Настройки существенно различаются между различными микроскопами, Индидуальные образцы и требуемое разрешение. Эти параметры должны создавать изображения, которые легко интерпретируемых для многих образцов.

2. Анализ формирования изображения Dataset

Примечание: Программное обеспечение Image J / Фиджи используется для анализа набора данных и опирается на плагин TrakEM2. Препроцессирование этапы могут быть выполнены с использованием различных программных средств, и может быть обширным или незначительным в зависимости от уровня опыта и полученные штабели. Основные преобразования с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом (ImageJ 1.50b вер, ФИДЖИ скачать 1 октября 2015) описаны здесь.

  1. Преобразование изображения в 8 битный формат TIFF с оригинальных фирменных 16-битных изображений, открыв в программном обеспечении и выборе элементов меню Image → Type → 8 бит.
    1. Если автоматическое преобразование контрастности / яркости во время этого шага не является идеальным для изображений, вновь открыть 16-битные изображения и нажмите Изображение → Настройка → Яркость / Контраст. Выберите диапазон, который работает для всех изображений, и нажмите кнопку Применить. Затем выполните грКонверсию. Примечание: На некоторых SEMs, этот шаг может потребоваться программное обеспечение микроскопа производителя.
    2. В случае необходимости, из - за недопустимого перемещения изображения между дольками (например. Дрейф из - за зарядки), зарегистрировать / выравнивания изображения стеки (пункты меню Плагины → Регистрация → Линейная StackAlignmentWithSIFT). В большинстве регистрации программного обеспечения, установленного для "перевод-только" режим, а не "твердого тела".
      Примечание: Многие подходы и программное обеспечение может работать: регистрация SIFT плагин работает для многих приложений и есть виртуальная версия стека.
      1. При необходимости увеличить размер холста до регистрации (Изображение → Настройка → CanvasSize) или уменьшить его в область интереса (Image → Crop).
        Примечание: Некоторые дрейфа или splaying может произойти, и попытки других плагинов или программного обеспечения может привести к лучшим результатам. Руководство опции также доступны (например. ImageJ / ФИДЖИ, Плагины → Регистрация → ManualLandmarkSelection).
    3. Если Desirе изд, масштаб изображения на меньшие, более приемлемого размера (например , 25%.) с использованием ImageJ (Изображение → Scale).
  2. Запустите программу, выберите Файл → Импорт → последовательность изображений, а затем выберите файлы TIFF.
  3. Запустите плагин, выбрав Файл → Создать → TrakEM2 (Blank). Два окна открываются; один управляет проектом и area_lists, а другой управляет трассировку, и упоминается как «холст».
  4. Загрузите стопку изображения в плагин, сделав щелчок правой кнопкой мыши на импорт холст. Выберите импорт и нажмите на стек импорта. В всплывающих опций, установите флажок для виртуальных стеков.
    Примечание: Хотя изображения стеки уже открыты в программном обеспечении, они также должны быть открыты в плагине. Компьютер может работать более плавно, если окно виртуального стека проверяется.
  5. После того, как мипмапов создаются и стек загружается, щелкните правой кнопкой мыши, чтобы назвать проект под окна плагина. Щелкните правой кнопкой мыши на "новый проект" в шаблоне седловинеитп, и выберите "добавить новый дочерний 'для этого проекта. Щелкните правой кнопкой мыши еще раз, чтобы выбрать 'area_list'.
  6. Установите Z-оси масштаб проекта, чтобы согласовать с исходными параметрами электронно-микроскопический снимок правой кнопкой мыши на холсте, а затем нажмите дисплей и выберите калибровку. Кроме того, установите Z-шкалу, выбрав все слои в окне плагина, щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать масштаб Z и толщины.
  7. Нажмите и перетащите "проект" и всех "детей" в раздел, чтобы создать 'списки области' на вкладке 'Z' пространства в окне холст проект объектов.
  8. Выберите 'списка областей' и щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать и установить цвет. Теперь, используйте инструмент кисть, чтобы проследить объекты, такие как митохондрии, в электронной микрофотографии изображений. Используйте 'Shift + нажмите кнопку ", чтобы заполнить в замкнутом круге," Ctrl + прокрутка', чтобы увеличивать и уменьшать масштаб, и "Alt + клик", чтобы включить малярная кисть курсор в резинкой.
  9. Выберите две области ~ 10 - 15 мкмна 10 - 15 мкм, в верхнем левом углу и нижнем правом углу изображения и идентифицировать все митохондрии в этих районах, чтобы обеспечить беспристрастный отбор проб митохондрий в каждом наборе данных.
  10. На «холст», наблюдать и проследить митохондрии на протяжении секций. Примечание: Митохондрии довольно темные / плотные появляются органеллы, подобного размера в диаметре и свободно цилиндрические. Уникальный крист, образованный внутренней мембраны легко различимы внутри этой органеллы.
  11. Закончив трассировку, щелкните правой кнопкой мыши на area_list на вкладке Z пространства, выберите "Показать в 3D". Это запустит плагин просмотра 3D для просмотра 3D-реконструкция трассируемого изображения.
    1. Для проведения измерений митохондриальные тома, выберите объект в 3D-просмотра, нажмите на вкладку "Edit" и выберите "Свойства объекта". Оценка митохондриальный объем указана вместе с несколькими другими измерениями.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Показано, что мозг митохондриальная морфологии и размера неоднородна в различных нейрональных подразделам отсеков. Конфокальной микроскопии на низкой плотности нейрональных культур трансдуцированных с лентивирусов выражения митохондрии нацеленную зеленый флуоресцентный белок показал , что митохондрии , проживающих в нейронную сомы образуют сеть ретикулярной, а тех , кто проживает в дистальных невриты обладают дискретной удлиненную морфологию (рис 1 AB). С помощью метода SBFSEM, митохондриальная морфология, размер, объем и распределение были проанализированы в головном мозге мышей. Трехмерные (3D) изображения митохондрий были реконструированы с обеих невриты и синапсов в гиппокампе мозга мыши. В пресинаптические Митохондрии были идентифицированы, и количество пресинаптических бутонов укрывательство митохондрии резидентные количественно. Неоднородность в размерах митохондрий наблюдалось в дендритные против аксонов отсеков (Fi1 цифра CD). К тому же , многие небольшие пресинаптические отсеков , расположенных в гиппокампе головного мозга мыши были лишены митохондрий (рис 2 переменного тока). Объемные измерения обоих пресинаптических и внесинаптических митохондрий показал , что объем или размер митохондрий , проживающих в пределах нейрональных presynapses был значительно меньше , чем тех , кто проживает в регионе внесинаптического (Рисунок 2 DF). Интересно отметить , что двухмерная (2D) распределение размеров митохондрий , измеренных от несмещенной выборки 200 не-соматическими митохондриях показали , что ~ 11% митохондриальной фракции лежит ниже предела разрешения световой микроскопии (рис 2G). Кроме того, 2D изображения , полученные с помощью анализа SBFSEM обеспечивают повышенное разрешение для визуализации ультраструктурным характеристик отдельных митохондрий (рис 3 AB). В связи с четко видимой топографии ткани, то далее можно классифицировать клеточный компartment митохондрий путем определения его близости к легко идентифицируемые структуры , как ядра (соматической) и синаптические везикулы (пресинаптических) (Рисунок 3) AB. Для того чтобы идентифицировать митохондрии , присутствующие в нейрональных процессов, реконструировать индивидуальный процесс как аксона или дендрита на основе наличия или отсутствия пресинаптических бутонов соответственно 42. На основании этих результатов, мы полагаем, что SBFSEM является чрезвычайно ценным аналитическим методом для выявления митохондриальной форму, размер, количество и распределение в тканях головного мозга и что любые грубые дефекты в митохондриальной структуры и распределения также может быть определено с помощью этого метода. Поскольку ультраструктурных характеристик различных типов клеток в головном мозге различны, например , для. наличие гликогена гранул в астроциты, также можно проанализировать различия клеточного типа специфичные в митохондриях головного мозга.

Рисунок 1 Рисунок 1:. Неоднородность в нейрональных митохондриальной морфологии и распространении кортикальные культуры от послеродовых 1 -й день мышат мыши были трансдуцированных с лентивирусов выражения митохондрии нацеленную зеленый флуоресцентный белок (мито-GFP). (A) показывает нейронную сому , выражающую Mito-GFP, отмечают сетчатой ​​сеть митохондриальной морфологии; Nu = ядро; Шкала бар = 5 мкм. (Б) показывает удлиненное митохондриальной морфологии в дистальных невритов; Шкала бар = 5 мкм. (C) представитель 2D - изображение из SBFSEM набора данных генерируется из ткани мозга мыши, митохондрии окрашены в зеленый цвет, дендриты окрашены в синий и аксонов варикоз окрашиваются в коричневый цвет; Шкала бар = 1 мкм. (D) 3D реконструкции митохондрий в невриты ткани мозга мыши, обратите внимание на разницу в размерах между дендритов и аксонов митохондрии indicatред больших и малых соответственно наконечник стрелы; Шкала бар = 1 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Последовательный блок-лицо сканирующей электронной микроскопии (SBFSEM) анализ показал низкой численности Митохондрии на пресинаптических окончаний (A) Представитель 2D ultramicrograph из анализа набора данных SBFSEM , полученного из гиппокампа мышей дикого типа Р15;. Шкала бар = 1 мкм. (B) Отображение 3D - реконструкция 10 пресинаптических нервных окончаний. Обратите внимание, что только 4 из 10 пресинаптические терминалы показали ощутимое митохондрии; Шкала бар = 1 мкм. (C) Бар график , показывающий количественное 173 реконструированы пресинаптические нервные окончания от SBМКСЭ анализ набора данных. (D) Представитель 2D - изображение из SBFSEM набора данных , показывающий внесинаптических митохондрии в синих и пресинаптических митохондриях в зеленый; Шкала бар = 1 мкм. (E) 3D реконструкции пресинаптической и внесинаптического митохондрий из SBFSEM набора данных с помощью программного обеспечения; Шкала бар = 1 мкм. (F) Бар график , показывающий объем внесинаптических и пресинаптических митохондриях. Данные представлены как среднее ± SEM; п = 3 различных наборов данных (включает в себя 62 пресинаптические митохондрии и 80 внесинаптических митохондрии в целом); * Изображает значение р = 0,0405. (G) Зона 15 от 15 мкм во всех четырех углах изображений были отмечены и все не соматические митохондрии были идентифицированы , чтобы позволить случайной выборки. Измеряли Наименьшая размерность ~ 200 митохондрий. Круговая диаграмма показывает, что ~ 11% не-соматическими митохондрий были <200 нм в измерении, которое находится ниже предела разрешения световой микроскопии. Эта цифра имеет бееп адаптировано из Chavan 27 и др. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: 2D SBFSEM Изображения от боковых коленчатых ядрах мозга мыши (A) Двумерный представитель SBFSEM изображение от боковых ядер коленчатых (8/8 мкм) , демонстрирующих подробную топографию региона.. Сома и ядра обозначены; Шкала бар = 2 мкм. (Б) увеличение площади , указанной красной площади в панели A. Обратите внимание , что внешние и внутренние мембраны митохондрий, а также Кристы образование отчетливо видны. Топография и отношение к другим органелл и клеточной структуры также наблюдается. PS показывает пример пресинаптической митохондрийи NS показывает пример не-синаптической (NS) соматической митохондрий; Шкала бар = 1 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Сложность нервной системы представляет собой значительную проблему в реконструкции больших объемов тканей и анализа морфологии и распределения органелл, таких как митохондрии с достаточным разрешением. Несколько клеток включая нейроны, олигодендроциты и астроциты с многочисленными процессами протяженных в трех измерениях взаимодействуют в ткани головного мозга 43. Поскольку митохондрии проживает как в сомы клеток и удаленных процессов, митохондриальная морфологии чрезвычайно плеоморфная в нервной системе (рисунок 1). Адекватное 3D структурная информация с достаточным разрешением , следовательно , не могут быть получены обычными методами световой микроскопии , таких как конфокальной или двухфотонного микроскопии 44,45. Электронная микроскопия является единственным доступным в настоящее время метод, который позволяет реконструкцию больших объемов нервной ткани с достаточно высоким разрешением. Традиционно, 3D реконструкция нервной ткани было достичьd путем последовательной передачи раздела электронной микроскопии (SSTEM) из ультратонких срезов 29. Тем не менее, последние технологические достижения улучшили качество сбора данных объем электронной микроскопии и автоматизации.

SBFSEM представляет собой автоматизированный блок-лицо метод визуализации, который сочетает в себе последовательный секционирования внутри камеры сканирующего электронного микроскопа, чтобы реконструировать структуру ткани 3D на сотни микрометров, с разрешением, которое является достаточным, чтобы следовать тончайшие клеточные процессы и выявить небольшие органеллы , Этот метод открывает перспективу регулярной реконструкции и позвоночных и беспозвоночных нервной системы. Она включает в себя несколько этапов, включая подготовку образца, операции с помощью сканирующего электронного микроскопа, сбор данных, изображений после обработки и анализа изображений. Эти процедуры требуют специализированные практические занятия и сертификации для работы сканирующего электронного микроскопа. Три фактора являются критикааль то есть. рассекает анатомической области мозга правильно, получение изображений с высоким разрешением, а также выполнение надлежащего анализа изображения. После рассечения анатомическую область интереса от vibratome среза фиксированной ткани мозга, чрезвычайно важно, чтобы сделать снимок для сохранения правильной ориентации. Это может в противном случае быть трудно определить правильное место для работы с изображениями. Получение изображений с высоким разрешением зависит от адекватной фиксации и надлежащих процедур окрашивания после фиксации. Мозг имеет тенденцию подвергаться быстрому ухудшению в его ультраструктуры после смерти. Поэтому крайне важно, чтобы зафиксировать мозг в глютаральдегидном растворе с использованием надлежащего transcardial метод перфузии. Это должно сопровождаться дальнейшей фиксации мозга в глютаральдегидном растворе в течение по крайней мере 24 часов. Так как разрешение изображения полностью зависит от комбинации различных методов окрашивания тяжелых металлов, очень важно следовать методу после фиксации, как описано в протоколе о приобретении quantifiablе изображения. Решения должны быть сделаны, как описано в методах. И, наконец, для точного анализа изображений органеллы / s для анализа должны быть определены однозначно (например, визуализируя ультраструктурным характеристик) до трассировки, а также руководящих принципов программного обеспечения должны строго соблюдаться. Разрешение получаемых изображений должны быть известны для преобразования пикселей в нанометрах для объемных измерений.

Помимо программного обеспечения, описанного в протоколе для проведения анализа изображений, можно также использовать другие доступные программному обеспечению, как реконструируют и Кноссе. Хотя акцент описанного протокола находится на просмотре митохондрии в нервной системе, он может быть изменен для создания высокого разрешения 3D информации о различных других субклеточных структур (например. Эндоплазматического ретикулума, лизосом и др.) В различных тканях.

Хотя подробное руководство по устранению неполадок для сканирования электронного микроскопа Operation выходит за рамки данной статьи (см руководства пользователя инструмент и учебной информации), несколько проблем обычно возникают во время экспериментов визуализации и понимания того, как их устранения может помочь новым пользователям и тем, получение изображений с помощью совместной работы / коммерческих источников. Общей проблемой зарядки образца, которое происходит главным образом в тех регионах, смолы, которые содержат мало или вообще не окрашенного материала. В "положительное" изображение (т.е.. Цитозоль отображается белым цветом), может появиться ядра, кровеносные сосуды, и пустые пространства смолы "почернела". Кроме того, зарядка также способствует локальный дрейф луча, что приводит к видимой деформации изображения. Возможные решения варьируются от инструментов и образцов. Снижение параметров кВ уменьшает "почернения" артефакт, но может способствовать более дрейфа пучка. С использованием более низкого вакуума режим, и в том числе азот (N 2) газ, водяной пар и т.д.. в камере также уменьшает зарядку, но при существенных затратах разрешения и Signaл-шум. Второй распространенной проблемой является нож пропуск. Более медленное сканирование может привести к наведенного повреждения поверхности блока, который разрезает неравномерно или вовсе не какое - то визуализации / циклы резания (то есть. Последовательные изображения появляется то же самое). Некоторые решения существуют в том числе увеличение глубины резания / толщина среза с уменьшенной г-разрешением, увеличивая скорость сканирования и последовательно принимать шумные изображения, уменьшая размер пикселя и принимать более низкую х / у-разрешение, и выбор образцов или участков с более интенсивным окрашиванием (как плохо -stained зоны зарядки больше, повреждение более легко, и требуют более длительного воздействия луча для получения изображений с приемлемым отношением сигнал к -noise отношения). Обломки переотложение на блок-лицо является случайным источником артефактов в изображениях, и если это происходит часто он может потребовать приостановки приобретения и тщательно очистки ножа (вдувания воздуха), или retrimming образца до меньшего размера. Блок-зарядка лица также способствует повторному осаждению, и шаги выше, могутПомогите. Коррекция фокусировки и стигмация также может потребоваться в качестве образцов микроскопа изображения непрерывно в течение многих часов до нескольких недель, в течение которых вакуумные глубина увеличивается в камере, требующих стигмация корректировки. Каждый растровый электронный микроскоп отличается в зависимости от возраста и характеристик, а также опыт является наилучшим руководством. Внезапные резкие изменения в стигмация или фокус может произойти, когда разрезали материал прилипает к компонентам визуализации микроскопа. Камера должна быть открыта и материал тщательно выбиты через вакуум или сжатым азотом. Это абсолютно требует специальной подготовки.

Есть несколько недостатков технологии SBFSEM относительно ее полезности в анализе митохондрии мозга. Основным недостатком, общим для всех микроскопии фиксированных тканей, является то, что она обеспечивает статические изображения чрезвычайно динамической органеллы. Митохондрии проходят непрерывные деления и термоядерных циклов 26, являются мобильными и торговли по пeurite процессов 21. Дефекты в митохондриальной оборота и динамики , которые не являются чисто числовые или структурные можно легко пропустить при таком подходе, хотя, глядя на количество митохондрий в анатомически определенном пространстве , таких как presynapse можно интерпретировать , если перенос митохондрий может быть изменен 39 , Вторым недостатком является то, что оно выполняется только в небольшой части головного мозга, поэтому схемами специфические дефекты, в митохондриальной распределения могут быть упущены. Коррелятивное подходы 28,46 себе возможность сочетать конфокальной и многофотонной изображений с SBFSEM технологии для создания как молекулярных и ультраструктурных данных. Для анализа митохондриальной, следовательно, может быть полезным для выполнения SBFSEM после того, как световой микроскопией срезов головного мозга, либо с помощью митохондриального антиген-специфичных антител или с помощью трансгена, выражающее митохондрии целенаправленную флуоресцентный белок. Это combinatioNAL стратегия может обеспечить надежную методологию для выявления митохондриальных дефектов в мышиных моделях неврологических и митохондриальных нарушений.

Существуют также технические ограничения, общие для многих форм электронной микроскопии в связи с использованием жестких фиксаторов, металлической окраски тяжелый и неравномерному проникновению химических веществ. Другие ограничения могут вытекать из пластмассового вложения образцов ткани. Пустые участки смолы и слабо окрашенных структур сохраняют электронов во время формирования изображения, в результате чего отклонения луча и дрейфа (изображение коробление), а также артефактом зарядки сигналов (например. Темные ядра и кровеносных сосудов просвет), которые оба падают на разрешение. повреждение луча к смоле также способствует неравномерное резку, и по этой причине, как правило, требует формирования изображения ломтиков 50 - 100 нм, чтобы быть вырезаны из блок-лица, производя, не isotrophic вокселей в наборах данных. Другие ограничения для некоторых приложений включают в себя, что секции разрушаются и не может быть пересмотрено в дальнейшем,которые могут заставить пользователей собирать изображения с высоким разрешением областей, которые могут не содержать полезные данные.

Основным преимуществом является то , что SBFSEM она позволяет автоматизировать процесс секционирования и визуализации блоков ткани путем включения пользовательского микротом в низком вакууме СЭМ камеры 32,33. Поскольку изображения получены непосредственно из блок-лица перед каждым разрезом, проблемы раздела складок, сжатия и потери во время обработки, по существу избежать, хотя отложения мусора и коробления из-за блокирования-лицевой зарядки действительно способствуют некоторые потери изображения и искажения , Кроме того, изображения, полученные в сырых массивов данных уже выровнены и требуют только регистрации микронных для размещения дрейфа потока для того, чтобы поддаваться наиболее анализа. Из-за автоматизированного процесса секционирования, как только вакуумная система стабилизировалась, большие объемы ткани могут быть отображены без существенного участия оператора. Есть несколько преимуществ использования этоготехнологии при проведении морфологических и количественных исследований по органелл и внутриклеточных структур. Одним из преимуществ является получение информации о 3D структуры митохондрий в течение разумного периода времени. Доступность с открытым исходным кодом программных пакетов реконструкции , как реконструируют 47, TrakEM 48 и Кносский 49-51 сделали эту технологию мощный аналитический инструмент , где подробный 3D ультраструктура нейронной сети из экспериментальных животных моделей можно непосредственно сравнивать. Полуавтоматический и полностью автоматизированный анализ изображений приближается к 52, скорее всего, производят весьма механистические данные у животных , где митохондриальная морфологии, функции и / или биогенеза , как ожидается, будут затронуты. Ранее анализ SBFSEM было сильно затруднено из - за более низкого разрешения, однако новые методы подготовки образца , включающие усовершенствованные методы окрашивания 40 значительно улучшили разрешение до такой степени , что даже один синаптической vesicle может быть легко решена. В этой резолюции ультраструктурные дефекты в митохондриях , такие как вакуолизация, разрушение мембраны и потере крист можно легко наблюдать, и распределение дефектных митохондрий в клетках может быть определена 38,39. Высокая разрешающая способность этого метода обеспечивает значительное преимущество по сравнению с световой микроскопии, где разрешение ограничено до ~ 200 нм оси XY и ~ 500 нм в Z-оси. Поэтому Митохондрии только на пределе разрешения световой микроскопии 53. Хотя митохондрии, имеющие размеры ниже предела разрешения по-прежнему могут быть визуализированы с помощью световой микроскопии, их размеры не могут быть надежно измерена. Важно отметить, что митохондрии, которые разделены расстоянием ниже предела разрешения светового микроскопа не может быть решена с помощью световой микроскопии. Еще одно преимущество состоит в том, что митохондриальная структурный анализ может быть проведен в контексте ткани, без выделения органелл. Это может альнизкой для соответствующих сравнений в пределах ткани на основе митохондриальной локализации, например , для аксонов против соматического и / или дендритных митохондрий. Дополнительным преимуществом является то, что она, как правило, можно определить, является ли митохондрии нейронов или нейроглии в локализации, следуя процессы в определяющей органеллы, такие как глиальных филаментов и гликоген для астроцитов или миелина для олигодендроцитов. Процессы нейронов и нейроглии клетки часто находятся в непосредственной близости, а также с 2D подходов, таких как ТЭМ может быть трудно назначить с уверенностью, какие процессы нейрональной и которые являются нейроглии.

В заключение отметим, что технология SBFSEM обеспечивает стопок последовательных изображений, охватывающих областей ткани 20 - 1000 мкм размером с ультраструктурным разрешением 5 - 10 нм и выше, что позволяет всей центральной клетки нервной системы и органеллы, такие как митохондрии, которые будут отображены, измерены и реконструированы , В этой статье мы пронекоторые практические которое прилагается подходы к использования этой технологии. Будущие приложения включают в себя анализ митохондриальной структуры и распределения в различных животных моделях неврологических заболеваний, таких как развитие нервной системы и нейродегенеративных моделей заболеваний, а также для анализа различных субклеточных ультраструктуры, такие как эндоплазматический ретикулум, ядро ​​и / или лизосом в целых клетках или тканях под здоровым и болезненные состояния.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson laboratory  664
Isoflurane VETone, tradename Fluriso 501017
Dissection tray Fisher scientific  S65105 
Dissection scissors Ted Pella Inc. 1316
Butterfly canula Exel International 26704
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Filter (0.45 micron) EMD Millipore NC0813356
Dissection microscope Olympus SZ61
Vibratome sectioning system Ted Pella Inc. Vibratome 3000
Sodium Cacodylate EMS 12300
Tannic Acid EMS 21700
Potassium Ferrocyanide J.T. Baker 14459-95-1
Osmium Tetroxide 4% Solution EMS 19150
Thiocarbohydrazide EMS 21900
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A93100
Potassium Hydroxide Acros Organics 43731000
Lead Nitrate EMS 17900
EMbed-812 EMBEDDING KIT EMS 14120 Contains Embed 812  resin, DDSA, NMA, and DMP-30.
Glutaraldehyde 25% EM Grade Polysciences Inc. 1909
Paraformaldehyde EMS 19202
Uranyl Acetate EMS 22400
Ethanol EMS 15055
Propylene Oxide EMS 20400
Embedding Mold EMS 70907
Aluminum specimen pin EMS 70446
Colloidal Silver Liquid EMS 12630
Razor EMS 72000
Super Glue (Loctite Gel Control) Loctite 234790 Hardware/craft stores carry this item
Conductive epoxy Ted Pella Inc. 16043
Scanning electron microscope Zeiss Sigma VP
In chamber ultramicrotome for SEM Gatan Inc. 3View2 Can be designed for other SEMs
Trimming microscope for pin preparation Gatan Inc. supplied as part of 3View system
Low kV backscattered electron detector Gatan Inc. 3V-BSED
ImageJ/ Fiji processing package  ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
http://rsb.info.nih.gov/ij/
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf
http://fiji.sc/TrakEM2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kasahara, A., Scorrano, L. Mitochondria: from cell death executioners to regulators of cell differentiation. Trends Cell Biol. 24, 761-770 (2014).
  2. Friedman, J. R., et al. ER tubules mark sites of mitochondrial division. Science. 334, 358-362 (2011).
  3. Bereiter-Hahn, J., Voth, M., Mai, S., Jendrach, M. Structural implications of mitochondrial dynamics. Biotechnol J. 3, 765-780 (2008).
  4. Campello, S., Scorrano, L. Mitochondrial shape changes: orchestrating cell pathophysiology. EMBO Rep. 11, 678-684 (2010).
  5. Trimmer, P. A., et al. Abnormal mitochondrial morphology in sporadic Parkinson's and Alzheimer's disease cybrid cell lines. Exp Neurol. 162, 37-50 (2000).
  6. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Hum Mol Genet. 18, 169-176 (2009).
  7. Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y., Sheng, M. The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses. Cell. 119, 873-887 (2004).
  8. Romanello, V., et al. Mitochondrial fission and remodelling contributes to muscle atrophy. EMBO J. 29, 1774-1785 (2010).
  9. Szabadkai, G., et al. Drp-1-dependent division of the mitochondrial network blocks intraorganellar Ca2+ waves and protects against Ca2+-mediated apoptosis. Mol Cell. 16, 59-68 (2004).
  10. Yu, T., Robotham, J. L., Yoon, Y. Increased production of reactive oxygen species in hyperglycemic conditions requires dynamic change of mitochondrial morphology. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 2653-2658 (2006).
  11. Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat Cell Biol. 9, 99-105 (2007).
  12. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., 3rd,, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25, 158-170 (2015).
  13. Macke, J. H., et al. Contour-propagation algorithms for semi-automated reconstruction of neural processes. J Neurosci Methods. 167, 349-357 (2008).
  14. Parikh, S. The neurologic manifestations of mitochondrial disease. Dev Disabil Res Rev. 16, 120-128 (2010).
  15. Frye, R. E., Rossignol, D. A. Mitochondrial dysfunction can connect the diverse medical symptoms associated with autism spectrum disorders. Pediatr Res. 69, 41-47 (2011).
  16. Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1366, 211-223 (1998).
  17. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial disorders in the nervous system. Annu Rev Neurosci. 31, 91-123 (2008).
  18. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial respiratory-chain diseases. N Engl J Med. 348, 2656-2668 (2003).
  19. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Hum Mol Genet. 20, 4515-4529 (2011).
  20. Anitha, A., et al. Downregulation of the expression of mitochondrial electron transport complex genes in autism brains. Brain Pathol. 23, 294-302 (2013).
  21. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Methods. 4, 559-561 (2007).
  22. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 10515-10520 (2015).
  23. Shepherd, G. M., Harris, K. M. Three-dimensional structure and composition of CA3→CA1 axons in rat hippocampal slices: implications for presynaptic connectivity and compartmentalization. J Neurosci. 18, 8300-8310 (1998).
  24. Wang, C., et al. Dynamic tubulation of mitochondria drives mitochondrial network formation. Cell Res. 25, (10), 1108-1120 (2015).
  25. Glancy, B., et al. Mitochondrial reticulum for cellular energy distribution in muscle. Nature. 523, 617-620 (2015).
  26. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics in mammals. Curr Top Dev Biol. 59, 119-144 (2004).
  27. Chavan, V., et al. Central presynaptic terminals are enriched in ATP but the majority lack mitochondria. PLoS One. 10, e0125185 (2015).
  28. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  29. Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26, 12101-12103 (2006).
  30. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
  31. Bushby, A. J., et al. Imaging three-dimensional tissue architectures by focused ion beam scanning electron microscopy. Nat Protoc. 6, 845-858 (2011).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
  33. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scan Electron Microsc. 73-76 (1981).
  34. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  35. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. J Microsc. 259, 155-164 (2015).
  36. Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J Mol Cell Cardiol. 76, 1-11 (2014).
  37. Miyazaki, N., Esaki, M., Ogura, T., Murata, K. Serial block-face scanning electron microscopy for three-dimensional analysis of morphological changes in mitochondria regulated by Cdc48p/p97 ATPase. J Struct Biol. 187, 187-193 (2014).
  38. Traka, M., et al. WDR81 is necessary for purkinje and photoreceptor cell survival. J Neurosci. 33, 6834-6844 (2013).
  39. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9953-9958 (2014).
  40. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. University of California San Diego. San Diego, CA. Available at http://ncmir.ucsd.edu/sbfsem-protocol.pdf (2010).
  41. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of Ranvier. J Neurosci. 31, 7249-7258 (2011).
  42. Hammer, S., Monavarfeshani, A., Lemon, T., Su, J., Fox, M. A. Multiple Retinal Axons Converge onto Relay Cells in the Adult Mouse Thalamus. Cell Rep. 12, 1575-1583 (2015).
  43. Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162, 648-661 (2015).
  44. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, 920-931 (2005).
  45. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  46. Bohorquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J Vis Exp. e52918 (2015).
  47. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. J Microsc. 218, 52-61 (2005).
  48. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7, e38011 (2012).
  49. Helmstaedter, M., Mitra, P. P. Computational methods and challenges for large-scale circuit mapping. Curr Opin Neurobiol. 22, 162-169 (2012).
  50. Helmstaedter, M., Briggman, K. L., Denk, W. High-accuracy neurite reconstruction for high-throughput neuroanatomy. Nat Neurosci. 14, 1081-1088 (2011).
  51. Saalfeld, S., Cardona, A., Hartenstein, V., Tomancak, P. CATMAID: collaborative annotation toolkit for massive amounts of image data. Bioinformatics. 25, 1984-1986 (2009).
  52. Giuly, R. J., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Method: automatic segmentation of mitochondria utilizing patch classification, contour pair classification, and automatically seeded level sets. BMC Bioinformatics. 13, 29 (2012).
  53. Jakobs, S., Wurm, C. A. Super-resolution microscopy of mitochondria. Curr Opin Chem Biol. 20, 9-15 (2014).
Анализ мозга Митохондрии Использование последовательного Block-Face сканирующая электронная микроскопия
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, V., Benson, E. K., Kidd, G. J., Srivastava, S. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (113), e54214, doi:10.3791/54214 (2016).More

Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, V., Benson, E. K., Kidd, G. J., Srivastava, S. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (113), e54214, doi:10.3791/54214 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter