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Neuroscience

ब्रेन माइटोकॉन्ड्रिया के विश्लेषण सीरियल ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग

Published: July 9, 2016 doi: 10.3791/54214
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Virginia Tech Carilion Research Institute, 2Renovo Neural Incorporated

Abstract

मानव मस्तिष्क एक उच्च ऊर्जा खपत अंग है कि मुख्य रूप से एक ईंधन के स्रोत के रूप में ग्लूकोज पर निर्भर करता है। ग्लूकोज ग्लाइकोलाइसिस, सप्ताह में तीन कार्बोक्जिलिक एसिड (टीसीए) चक्र और आक्सीकारक फास्फारिलीकरण (OXPHOS) रास्ते के माध्यम से मस्तिष्क माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा catabolized है adenosine triphosphate (एटीपी) के रूप में सेलुलर ऊर्जा का उत्पादन करने के लिए। mitochondrial एटीपी उत्पादन की हानि mitochondrial रोग, जो प्रमुख तंत्रिका विज्ञान और myopathic लक्षणों के साथ चिकित्सकीय उपस्थित कारण बनता है। Mitochondrial दोष भी neurodevelopmental विकारों (जैसे आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकार) और neurodegenerative विकारों में मौजूद हैं (जैसे पेशीशोषी पार्श्व काठिन्य, अल्जाइमर और पार्किंसंस रोग)। इस प्रकार, वहाँ दोनों स्वस्थ और रोग राज्यों तहत mitochondrial आकृति विज्ञान, संरचना और वितरण के 3 डी विश्लेषण के प्रदर्शन के लिए क्षेत्र में एक वृद्धि की रुचि है। मस्तिष्क mitochondrial आकृति विज्ञान विशेष रूप से अत्यंत विविध है, कुछ माइटोकॉन्ड्रिया के साथ में उनsynaptic क्षेत्र <200 एनएम व्यास, जो पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी का संकल्प सीमा से नीचे है की रेंज में किया जा रहा है। मस्तिष्क में एक mitochondrially-लक्षित हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त काफी confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा organellar का पता लगाने को बढ़ाता है। हालांकि, यह बड़े आकार के माइटोकॉन्ड्रिया की छवियों oversaturating बिना अपेक्षाकृत छोटे आकार के माइटोकॉन्ड्रिया का पता लगाने की संवेदनशीलता पर बाधाओं को दूर नहीं करता। जबकि धारावाहिक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सफलतापूर्वक न्यूरोनल अन्तर्ग्रथन में माइटोकॉन्ड्रिया चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, इस तकनीक बहुत समय लेने वाली है, खासकर जब कई नमूने की तुलना है। सीरियल ब्लॉक चेहरे स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SBFSEM) तकनीक सेक्शनिंग, ऊतक और डाटा अधिग्रहण की इमेजिंग ब्लॉक के एक स्वचालित प्रक्रिया शामिल है। यहाँ, हम कृंतक मस्तिष्क से एक निर्धारित क्षेत्र के SBFSEM प्रदर्शन करने के लिए तेजी से फिर से संगठित और mitochondrial आकृति विज्ञान कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस तकनीकnique भी एक परिभाषित मस्तिष्क क्षेत्र में mitochondrial संख्या, मात्रा, आकार और वितरण पर सटीक जानकारी प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चूंकि प्राप्त छवि संकल्प अधिक है (आम तौर पर 10 एनएम) के तहत किसी भी सकल mitochondrial रूपात्मक दोष भी पता लगाया जा सकता है।

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया गतिशील अंगों जो उनके आकार और सेलुलर संकेतों और जरूरतों के आधार पर स्थान बदलने के लिए, सेल cytoskeleton के साथ तंग बातचीत में हैं, और इस तरह के न्यूरॉन्स 1 में कैल्शियम धाराओं के रूप में सेलुलर घटनाओं की प्रतिक्रिया में। माइटोकॉन्ड्रिया भी अन्य सेलुलर अंगों के साथ जालिका, जो बदले में उनकी गतिशीलता और चयापचय 2 को नियंत्रित करता है जैसे बातचीत। Mitochondrial आकृति विज्ञान यानी विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में विविधता से पता चलता है। organelle के आकार कि चादरें, बोरे और अंडाकार 3 से मिलकर ट्यूबलर से भिन्न होता है। यह दिखाया गया है कि mitochondrial फ्यूजन और विखंडन चक्र प्रोटीन स्थान, आकार, आकृति और माइटोकॉन्ड्रिया 4 के वितरण को नियंत्रित कर सकते। इसके अलावा, mitochondrial आकार में परिवर्तन neurodegeneration, न्यूरोनल प्लास्टिसिटी, मांसपेशियों शोष, कैल्शियम संकेतन, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों पीढ़ी के रूप में अच्छी तरह से उम्र और कोशिका मृत्यु फंसाने था के साथ जुड़े रहे हैंटी सेल विशिष्ट mitochondrial आकृति विज्ञान सामान्य सेलुलर समारोह 5-11 के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है।

माइटोकॉन्ड्रिया का एक प्रमुख bioenergetic समारोह चयापचय प्रतिक्रियाओं कि टीसीए चक्र के माध्यम से पोषक तत्वों की पूरी टूटने (यानी ग्लूकोज, फैटी एसिड या एमिनो एसिड) शामिल है और OXPHOS रास्ते 12 की एक श्रृंखला को क्रियान्वित करने से adenosine triphosphate (एटीपी) उत्पन्न करने के लिए है। मानव मस्तिष्क शरीर के वजन का केवल 2% हालांकि यह खपत ~ कुल ऊर्जा यह एक अत्यंत ऊर्जा अंग 13 की मांग कर रही है उत्पादन का 20% का गठन किया। इसलिए यह आश्चर्य की बात नहीं है कि मानव में mitochondrial रोग मस्तिष्क संबंधी अभिव्यक्तियों 14-17 की एक बड़ी संख्या को जाता है। OXPHOS घटकों में जेनेटिक म्यूटेशन कि mitochondrial विकारों 17,18, जो ~ 1 की व्यापकता के साथ विकारों के नैदानिक ​​विषम समूह रहे हैं करने के लिए ख़राब एटीपी पीढ़ी सुराग: 5,000 व्यक्तियों, और मीटर का सबसे आम कारण से एकबच्चों और वयस्कों में etabolic विकारों। माइटोकॉन्ड्रिया व्युत्पन्न एटीपी के घाटे में इस तरह के मस्तिष्क, हृदय और कंकाल की मांसपेशियों में मुख्य रूप से इन रोगियों 14,17,18 में प्रभावित किया जा रहा के रूप में उच्च ऊर्जा की मांग अंगों के साथ कई अंग प्रणालियों को प्रभावित करता है। हाल के वर्षों में, कई अध्ययनों से दोनों neurodevelopmental और neurodegenerative विकारों 15-17,19,20 में mitochondrial रोग के लिए सबूत प्रदान की है। चूंकि माइटोकॉन्ड्रिया जरूरी है और मस्तिष्क के विकास और समारोह के लिए महत्वपूर्ण हैं, यह प्रोटोकॉल है कि दोनों स्वस्थ और रोगग्रस्त राज्यों तहत मस्तिष्क mitochondrial आकृति विज्ञान, संरचना, आकार, संख्या और वितरण में परिवर्तन का विश्लेषण कर सकते हैं विकसित करने के लिए आवश्यक है। Mitochondrially-लक्षित हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ माउस मॉडल मस्तिष्क 21,22 में mitochondrial आंदोलनों और स्थानीयकरण कल्पना करने के लिए उत्पादन किया गया है। हालांकि इस mitochondrial गतिशीलता और सामान्य वितरण की जांच के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है, वहाँ कुछ कमियां हैं जो समेतई सीमित संकल्प और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की संवेदनशीलता। इन विशेषताओं के लिए यह मुश्किल अपेक्षाकृत छोटे आकार के माइटोकॉन्ड्रिया ट्रैक करने के लिए बनाते हैं। इसी तरह, धारावाहिक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सफलतापूर्वक synaptic माइटोकॉन्ड्रिया 23 देखने के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन इस विधि बहुत समय लगता है। Mitochondrial आकृति विज्ञान अत्यधिक गतिशील के रूप में वे निरंतर विखंडन और संलयन चक्र से गुजरना में जाना जाता है, और सबसे कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया एक अत्यधिक जुड़ा नेटवर्क 24-26 बनाए रखें। न्यूरॉन्स अत्यधिक ध्रुवीकरण कर रहे हैं कई dendrites और बढ़ाया एक्सोन, और माइटोकॉन्ड्रिया कि सेल शरीर में एक जुड़ा जालीदार नेटवर्क के रूप में के साथ कोशिकाओं को अलग करने के लिए के रूप में वे (चित्रा 1) इन neurites के माध्यम से अपना रास्ता बनाने के लिए हो सकता है। यह मस्तिष्क माइटोकॉन्ड्रिया आकार और आकार में अत्यंत विविध बनाता है। उदाहरण के लिए, सीरियल ब्लॉक चेहरे स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग (SBFSEM) तकनीक है, हम पहले से मनाया कि मात्रा या extrasynaptic mitochondr के आकार में अंतरआइए तंत्रिका टर्मिनलों में मौजूद माइटोकॉन्ड्रिया के रूप में ज्यादा के रूप में सोलह 27 गुना हो सकता है।

मात्रा के प्रदर्शन के लिए कई दृष्टिकोण हैं विश्लेषण 28, जो धारावाहिक अनुभाग मंदिर 29, स्वचालित टेप ultramicrotome SEM 30 एकत्रित भी शामिल है, आयन बीम SEM 31, और 32 SBFSEM ध्यान केंद्रित किया। SBFSEM विश्लेषण इस तरह मस्तिष्क का 1 मिमी तक क्षेत्रों में माइटोकॉन्ड्रिया के रूप में रूपात्मक आकृति, आकार, वितरण और अंगों की संख्या पर मात्रात्मक डेटा प्रदान करने के लिए संकल्प किया है कि उस में फायदे हैं। तकनीकी आपरेशन भी कम से कम मांग, कई जैविक प्रयोगशालाओं कि पिछले ईएम अनुभव की कमी की क्षमताओं के भीतर डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण के साथ है। सीरियल अनुभाग की तरह छवियों पैदा करने के लिए वाणिज्यिक उपकरणों के आगमन के ऊतकों की 3 डी Ultrastructural विश्लेषण किया गया है एक नियमित तकनीक है, जो आगे एक तेजी से और repeatable ढंग से 28 में एक निष्पक्ष बड़ा विश्लेषण परमिट 32 में वर्णित किया गया था और इस्तेमाल तंत्रिका जीव विज्ञान के क्षेत्र में, एक विचार 1981 33। कई अध्ययनों में लीटन द्वारा शुरू की तब से न्यूरोनल circuitry 34 के पुनर्निर्माण के विश्लेषण में एक प्रमुख साधन के रूप में इस तकनीक की स्थापना की है पर आधारित है। इसके अलावा, कई छोटे पैमाने पर परियोजनाओं के लिए, यह पुनर्निर्माण विश्लेषण सेलुलर organelles 27,35-39 की पहचान करने के लिए प्रदान करता है। चूंकि, अधिग्रहीत छवियों कम वोल्टेज वापस बिखराव इलेक्ट्रॉनों से निकाली गई है, नए धुंधला प्रोटोकॉल जो विभिन्न ज्ञात भारी धातु धुंधला तकनीक गठबंधन संकल्प 40 बढ़ाने के लिए विकसित किए गए।

इस पत्र में, हम 3 डी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग और तरीकों कि पहले हमें और दूसरों 38,39,41 द्वारा इस्तेमाल किया गया है के आधार पर मस्तिष्क माइटोकॉन्ड्रिया का बड़ा विश्लेषण के उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। ऊतक बाद के प्रसंस्करण के तरीकों का इस्तेमाल किया, जैसा कि पहले Deerinck एट अल द्वारा वर्णित किया गया40।

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Protocol

आचार कथन: पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) वर्जीनिया टेक में से अनुमोदित किया गया है।

सावधानी: चरम सावधानियों जब से निपटने और कई इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया घटकों निपटाने लिया जाना चाहिए। उपयोग करने से पहले, स्थानीय संस्थागत दिशा निर्देशों और स्वास्थ्य और सुरक्षा प्रथाओं स्थापित किया जाना चाहिए और पीछा किया, विशेष रूप से आज़मियम tetroxide, जो अस्थिर और बेहद जहरीला है, uranyl एसीटेट, जो दोनों एक भारी धातु और रेडियोधर्मिता का स्रोत है, और नेतृत्व नाइट्रेट है, जिसके लिए एक भारी धातु जहर। Thiocarbohydrazide (दर्पण), विस्फोटक और ज़हरीली गैसों का उत्पादन करने के लिए अगर गलत तरीके से संभाला विघटित कर सकते हैं। कई संस्थानों एक ईएम कोर सुविधा है जिसमें इन अभिकर्मकों नियमित तौर पर उपयोग किया जाता है और सहायता प्रदान कर सकते हैं होगा।

1. मस्तिष्क के ऊतकों और SBFSEM इमेजिंग की तैयारी

  1. (- 4 महीने पुरानी ~ 2) C57 काला माउस (C57BL / 6J तनाव) 4 का उपयोग कर - 5% isoflura एक युवा anesthetizene संस्थागत दिशा निर्देशों का पालन। मांसपेशियों टोन, स्वैच्छिक आंदोलनों और एक पूंछ चुटकी तरह प्रतिकूल उत्तेजनाओं को प्रतिक्रियाओं की कमी के नुकसान की निगरानी के द्वारा anesthetization की पुष्टि करें।
  2. एक विच्छेदन ट्रे पर माउस पिन और उदर midline के साथ त्वचा पर एक चीरा बनाते हैं। माउस के रिब पिंजरे का पर्दाफाश करने के लिए त्वचा में आगे चीरों बनाओ। डायाफ्राम काटकर अलग कर देना, और ध्यान परिधि के साथ छाती गुहा काटना दिल की धड़कन को बेनकाब करने के लिए, और फिर सही आलिंद पर एक चीरा बनाते हैं।
  3. एक तितली प्रवेशनी का उपयोग करना, बाएं वेंट्रिकल cannulate। , फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) पीएच 7.2 से 20 मिलीलीटर तक exsanguination जिगर के रंग में बदलाव के द्वारा पुष्टि की है - माउस transcardially 10 का उपयोग कर छिड़कना।
    नोट: जिगर के रंग में बदलाव exsanguination की सीमा निर्धारित करने के लिए एक गाइड के रूप में प्रयोग किया जाता है। कि लाल भूरे रंग से रंग में परिवर्तन के जिगर गुलाबी पीला पुष्टि करें।
  4. 2% glutar के 20 मिलीलीटर - माउस transcardially 10 का उपयोग कर छिड़कनाएल्डिहाइड और 4% paraformaldehyde 0.10 एम cacodylate बफर (7.2 पीएच) में बनाया है, भीतर से तेजी से मस्तिष्क के ऊतकों को ठीक करने के लिए। फिक्सेशन पूंछ stiffening देख द्वारा नजर रखी है।
    नोट: 80 मिलीलीटर पानी में सोडियम cacodylate की 2.14 ग्राम भंग करके 0.10 एम cacodylate बफर (7.2 पीएच) तैयार करें, पीएच को समायोजित, और पानी के साथ 100 मिलीलीटर मात्रा बनाने के लिए हाइड्रोक्लोरिक एसिड जोड़ें।
  5. छिड़काव के बाद, माउस सिर काटना 4 ओ सी पर 48 घंटे के लिए 0.10 एम सोडियम cacodylate बफर (पीएच 7.2) युक्त 2% glutaraldehyde और 4% paraformaldehyde में मस्तिष्क, नियतन के द्वारा पीछा काटना
  6. 48 घंटे के बाद 400 माइक्रोन राज्याभिषेक एक vibratome का उपयोग कर वर्गों बनाने के लिए और फिर ध्यान से (उदाहरण के लिए, हिप्पोकैम्पस) मस्तिष्क में ब्याज के क्षेत्र काटना विच्छेदन माइक्रोस्कोप 42 के अधीन। ध्यान से ऊतक ट्रिम और उन्मुखीकरण के संरक्षण के लिए एक तस्वीर ले लो।
    नोट: SBFSEM में ऊतक धुंधला की पोस्ट प्रसंस्करण विधियों में भारी धातु धुंधला तरीकों की एक किस्म को जोड़ती हैआदेश संकल्प में सुधार करने और विधि Deerinck एट अल 40 से पहले से विकसित पर आधारित हैं।
  7. glutaraldehyde तय ऊतकों 3 बार, 5 मिनट के 0.1 एम cacodylate बफर (पीएच 7.2) में प्रत्येक धो लें।
  8. 0.1 एम सोडियम cacodylate बफर (पीएच 7.2) में tannic एसिड भंग द्वारा 0.1% tannic एसिड समाधान तैयार है। भंवर जब तक भंग और 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर, यदि आवश्यक है।
  9. आरटी पर 60 मिनट - पोस्टफिक्स cacodylate साथ ऊतकों 30 के लिए 1 मिलीलीटर अभिकर्मक में incubating द्वारा 0.1% tannic एसिड बफर।
    नोट: ऊष्मायन समय ऊतक आकार पर निर्भर है, लेकिन 30 मिनट के सबसे ऊतकों के लिए सबसे अच्छा काम करता है।
  10. ऊतकों 3 बार, 5 मिनट cacodylate बफर में प्रत्येक (7.2 पीएच) धो लें।
  11. 0.3 ग्राम पोटेशियम ferrocyanide और आसुत एच 2 ओ 10 मिलीलीटर (DH 2 हे) में 0.86 ग्राम सोडियम cacodylate भंग। बर्फ पर पोटेशियम ferrocyanide समाधान रखें। बस उपयोग करने से पहले, (Oso 4) 4% आज़मियम tetroxide के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  12. 2% ओएस के साथ ऊतकों दाग90 मिनट के लिए mium-ferrocyanide समाधान, बर्फ पर। DH 2 ओ में 3 बार, 5 मिनट प्रत्येक धोने
  13. 10 मिलीलीटर DH 2 ओ में 0.1 ग्राम दर्पण भंग द्वारा 1% thiocarbohydrazide (दर्पण) समाधान तैयार हर 10 मिनट घूमता जब तक पूरी तरह से भंग कर 60 डिग्री सेल्सियस पर भंग। सुरक्षा सावधानियों का पालन दर्पण से निपटने जबकि, विशेष रूप से बाहर सुखाने के लिए उच्च तापमान, या समाधान की इजाजत देने के लिए हीटिंग धातुओं के उपयोग से बचने के लिए ध्यान रखना।
  14. आरटी पर 20 मिनट के लिए हौसले से तैयार 1% दर्पण के साथ नमूने समझो। DH 2 ओ में 3 बार, 5 मिनट प्रत्येक धोने
  15. DH 2 हे के साथ 2% से 4% पतला Oso 4, 1 घंटे के लिए incubating द्वारा 2% जलीय आज़मियम tetroxide साथ दाग ऊतकों। ऊतकों 3 बार, 5 मिनट प्रत्येक DH 2 ओ से धोएं
  16. 4 डिग्री सेल्सियस पर DH 2 हे में नमूने हे / एन 1% uranyl एसीटेट में सेते हैं।
  17. वाल्टन के नेतृत्व aspartate समाधान (के रूप में Deerinck एट अल 40 द्वारा वर्णित) तैयार करें।
    1. 250 मिलीलीटर DH 2 हे में 0.998 जी एल Aspartate भंगऔर फिर एक dropwise फैशन में 10 एन पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड (KOH) जोड़ने जब तक पीएच 5.5 तक पहुँचता है। पीएच समायोजन के बाद, 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के लिए एसिड शेयर और गर्मी aspartic 10 मिलीलीटर में नेतृत्व नाइट्रेट की 0.066 ग्राम जोड़ें।
  18. DH 2 हे में ऊतकों कुल्ला और एक 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में 30 मिनट के लिए वाल्टन के नेतृत्व aspartate दाग के साथ सेते हैं। DH 2 ओ में 3 बार, 5 मिनट प्रत्येक धोने
  19. 5 मिनट प्रत्येक के लिए 20%, 50%, 75%, 85% और 95% इथेनॉल के ठंडा समाधान का उपयोग शराब की एक श्रृंखला के माध्यम से वर्गीकृत नमूने निर्जलीकरण, 100% इथेनॉल के बाद 3 बार, 10 मिनट प्रत्येक।
    नोट: हौसले बोतल खोली से 100% इथेनॉल का प्रयोग करें, खोला इथेनॉल हवा से पानी अवशोषित के रूप में और विफल करने के लिए embedding के कारण। अब incubations बड़ा ऊतकों के नमूनों के साथ आवश्यक हो जाएगा।
  20. धो नमूने 2 बार, 15 मिनट प्रोपलीन आक्साइड में प्रत्येक।
  21. प्लास्टिक एम्बेडिंग 25 मिलीलीटर राल, 10.5 मिलीलीटर DDSA का उपयोग कर राल (succinic एनहाइड्राइड dodecenyl), 15.5 मिलीलीटर एनएमए (nadic मिथाइल एनहाइड्राइड) और 1 मिलीलीटर बनाओDMP-30 (2,4,6-Tris dimethylaminomethyl फिनोल)। झटकों से राल मिश्रण। स्पिन और राल बुलबुले संकल्प जब तक खड़े करने की अनुमति देते हैं।
    नोट: यह मानक मध्यम कठोरता नुस्खा है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) प्लास्टिक राल के अन्य प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन के रूप में नहीं सभी रेजिन SBFSEM के लिए काम अग्रिम में एक गैर-जरूरी नियंत्रण नमूने के साथ परीक्षण किया जाना चाहिए।
  22. एक 50 में ऊतकों हे / एन सेते हैं: embedding राल और प्रोपलीन आक्साइड के 50 मिश्रण, एक शीशी है कि शुरू में 2 घंटे के बाद तो नवोदित छाया हुआ है, इसलिए है कि प्रोपलीन आक्साइड के बारे में 8 की अवधि में उड में - 10 घंटा।
  23. 2 घंटे के लिए स्वच्छ शीशियों में 100% ताजा एम्बेडिंग राल के लिए ऊतकों स्थानांतरण।
  24. ताजा एम्बेडिंग राल में एम्बेड नमूने, फ्लैट नए नए साँचे में कागज लेबल मुद्रित, और 48 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में उन्हें इलाज से युक्त। लगभग 1 घंटे के बाद, फिर से ऊतक नियुक्ति और संरेखण की जाँच करें, और यदि आवश्यक समायोजित करें।
  25. हित के क्षेत्र के लिए नमूने ट्रिम और gellin का उपयोग कर एक एल्यूमीनियम पिन पर माउंटजी cyanoacrylate superglue या एक प्रवाहकीय epoxy राल, तो कोलाइडयन चांदी के साथ कोट ब्लॉक के किनारों के आसपास पेस्ट एल्यूमीनियम पिन करने के लिए एक प्रवाहकीय पथ प्रदान करने के लिए।
  26. एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप एक में चैम्बर ultramicrotome मंच और कम केवी backscattered इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर से लैस 32 सिस्टम का उपयोग कर के ऊतकों के नमूनों की जांच करना।
    नोट: स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) का उपयोग करने में instrument- और साइट-प्रशिक्षण प्राप्त करें और एक अधिकृत उपयोगकर्ता बन जाते हैं। वैकल्पिक रूप से, छोटी परियोजनाओं के लिए एक शोधकर्ता या कोर सुविधा के सहयोग से संभव हो सकता है। के रूप में एसईएम उत्पन्न एक्स रे विकिरण प्रशिक्षण की भी आवश्यकता हो सकती है।
  27. की छवि के लिए नमूने, निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें: 2.25 केवी, 5 - 10 एनएम / पिक्सेल संकल्प, 80 के बीच क्षेत्र के आकार के साथ - एक्स में 250 माइक्रोन, वाई (अन्य क्षेत्र संभव आकार), और 50 का टुकड़ा मोटाई - 100 एनएम, 20 घंटा समय अवधि - एक 16 में 600 स्लाइस - 250 के कुल के साथ।
    नोट: सेटिंग्स अलग माइक्रोस्कोप के बीच में काफी भिन्नता है, भारतीयोंvidual नमूने, और वांछित संकल्प। ये सेटिंग्स छवियों है कि कई नमूनों के लिए आसानी से व्याख्या कर रहे हैं उत्पादन करना चाहिए।

2. इमेजिंग डेटासेट का विश्लेषण

नोट: छवि जम्मू / फिजी सॉफ्टवेयर डाटासेट का विश्लेषण किया जाता है और TrakEM2 प्लगइन पर निर्भर करता है। Preprocessing कदम सॉफ्टवेयर की एक किस्म का उपयोग किया जा सकता है, और व्यापक या अनुभव के स्तर के आधार पर नाबालिग हो सकता है और ढेर प्राप्त की। खुला स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग मुख्य परिवर्तनों (1.50b देखें ImageJ, फिजी डाउनलोड Oct, 1, 2015) यहाँ वर्णित हैं।

  1. सॉफ्टवेयर में खोलने और मेनू आइटम का चयन छवि → प्रकार → 8 बिट द्वारा मूल मालिकाना 16-बिट छवियों से 8 बिट झगड़ा प्रारूप करने के लिए छवियों कन्वर्ट।
    1. अगर इस कदम के दौरान स्वत: इसके विपरीत / चमक रूपांतरण छवियों के लिए आदर्श नहीं है, 16-बिट छवियों को फिर से खोलने, और प्रेस छवि को समायोजित → → चमक / विपरीत। एक सीमा है कि सभी छवियों के लिए काम करता है का चयन करें, और प्रेस को लागू करें। तो सी प्रदर्शनonversion। नोट: कुछ एसईएम पर, इस कदम माइक्रोस्कोप निर्माता सॉफ्टवेयर की आवश्यकता हो सकती है।
    2. यदि आवश्यक हो तो स्लाइस के बीच अस्वीकार्य छवि आंदोलन के कारण (जैसे। कारण चार्ज करने के बहाव), रजिस्टर / छवि के ढेर (मेनू आइटम प्लगइन्स → पंजीकरण → रैखिक StackAlignmentWithSIFT) संरेखित। सबसे पंजीकरण सॉफ्टवेयर में, "कठोर शरीर" "अनुवाद केवल" मोड बजाय के लिए निर्धारित किया है।
      नोट: कई दृष्टिकोण और सॉफ्टवेयर का काम हो सकता है: कई अनुप्रयोगों के लिए झारना पंजीकरण प्लग में काम करता है और वहाँ एक आभासी ढेर संस्करण है।
      1. यदि आवश्यक हो, कैनवास आकार पंजीकरण करने से पहले (छवि → → CanvasSize समायोजित) या ब्याज की एक क्षेत्र (फसल → छवि) के लिए इसे कम बढ़ाना है।
        नोट: कुछ बहाव या splaying हो सकता है, और अन्य plugins या सॉफ्टवेयर की कोशिश कर बेहतर परिणाम का उत्पादन कर सकता है। मैनुअल विकल्प (जैसे। ImageJ / फिजी, प्लगइन्स → पंजीकरण → ManualLandmarkSelection) भी उपलब्ध हैं।
    3. अगर Desirएड, छोटे, अधिक प्रबंधनीय आकार के पैमाने पर छवियों (जैसे। 25%) ImageJ (छवि → स्केल) का उपयोग कर।
  2. सॉफ्टवेयर, फ़ाइल का चयन करें → आयात → छवि अनुक्रम शुरू करने और उसके बाद झगड़ा फ़ाइलों का चयन करें।
  3. फ़ाइल → नई → TrakEM2 (रिक्त) का चयन करके प्लगइन लॉन्च। दो खिड़कियां खुल जाएगा; एक परियोजना और area_lists प्रबंधन और अन्य ट्रेसिंग का प्रबंधन करता है, और 'कैनवास' के रूप में जाना जाता है।
  4. कैनवास आयात पर एक सही क्लिक बनाकर प्लगइन में छवि ढेर लोड। आयात का चयन करें और आयात ढेर पर क्लिक करें। पॉप-अप विकल्प में, आभासी ढेर के लिए बॉक्स की जाँच करें।
    नोट: छवि के ढेर पहले से ही सॉफ्टवेयर में खोला जाता है, वे भी प्लगइन में खोला जाना चाहिए। कंप्यूटर और अधिक सुचारू रूप से यदि आभासी ढेर बॉक्स की जाँच की है चला सकते हैं।
  5. बाद मिपमैप बनाई गई हैं और ढेर भरी हुई है, सही प्लगइन खिड़की के नीचे परियोजना के नाम के लिए क्लिक करें। सही टेम्पलेट कर्नल में 'नए प्रोजेक्ट' पर क्लिक करेंUMN, और चुनें कि परियोजना के लिए 'नए बच्चे को जोड़ें'। अधिकार 'area_list' का चयन करने के लिए फिर से क्लिक करें।
  6. कैनवास पर राइट क्लिक करके मूल इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ सेटिंग्स के साथ सहमत करने के लिए इस परियोजना की जेड अक्ष पैमाने पर सेट है, तो प्रदर्शन क्लिक करें और अंशांकन चयन करें। इसके अलावा, प्लगइन विंडो में सभी परतों का चयन करके जेड पैमाने पर सेट है, ठीक पैमाने जेड और मोटाई का चयन करने के लिए क्लिक करें।
  7. क्लिक करें और 'प्रोजेक्ट' और सभी 'बच्चों' में परियोजना कैनवास विंडो में 'जेड' अंतरिक्ष टैब के तहत 'क्षेत्र सूचियों' बनाने के लिए खंड वस्तुओं खींचें।
  8. 'क्षेत्र' की सूची का चयन करें और सही चयन करें और एक रंग सेट करने के लिए क्लिक करें। अब, इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ छवियों में, इस तरह के माइटोकॉन्ड्रिया के रूप में वस्तुओं का पता लगाने के लिए पेंट ब्रश उपकरण का उपयोग करें। प्रयोग करें 'Shift + क्लिक करें' एक संलग्न सर्कल में भरने के लिए, 'Ctrl + स्क्रॉल' में और बाहर ज़ूम करने के लिए, और एक रबड़ में पेंट ब्रश कर्सर बारी करने के लिए 'Alt +' पर क्लिक करें।
  9. 15 माइक्रोन - की ~ 10 दो क्षेत्रों का चयन करें10 - 15 माइक्रोन ऊपरी बाएँ कोने और छवि के नीचे दायें कोने में है और इन क्षेत्रों के भीतर सभी माइटोकॉन्ड्रिया की पहचान प्रत्येक डाटासेट में माइटोकॉन्ड्रिया की निष्पक्ष नमूने की अनुमति है।
  10. 'कैनवास' पर, पालन और वर्गों में माइटोकॉन्ड्रिया का पता लगा। नोट: माइटोकॉन्ड्रिया काफी अंधेरा / घने प्रदर्शित होने के अंगों व्यास में और शिथिल बेलनाकार समान आकार के हैं। अद्वितीय भीतरी झिल्ली द्वारा गठित cristae इस organelle के अंदर आसानी से अलग पहचाना जाता है।
  11. जब ट्रेसिंग के साथ समाप्त हो, ठीक है, Z अंतरिक्ष टैब के अंतर्गत area_list पर क्लिक करें '3 डी में शो'। यह पता लगाया छवि का एक 3 डी पुनर्निर्माण देखने के लिए 3D व्यूअर प्लगइन का शुभारंभ करेंगे।
    1. mitochondrial मात्रा माप, 3D व्यूअर में चुनिंदा वस्तु को करने के लिए 'संपादन' टैब पर क्लिक करें और 'वस्तु गुण'। mitochondrial मात्रा का अनुमान कई अन्य मापन के साथ साथ सूचीबद्ध है।

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Representative Results

हम जानते हैं कि मस्तिष्क mitochondrial आकृति विज्ञान और आकार अलग न्यूरोनल उप डिब्बों में विषम है प्रदर्शित करता है। कम घनत्व न्यूरोनल lentivirus mitochondrially-लक्षित हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त के साथ ट्रांसड्यूस संस्कृतियों पर Confocal माइक्रोस्कोपी से पता चला कि न्यूरोनल सोमा में रहने वाले माइटोकॉन्ड्रिया एक जालीदार नेटवर्क के रूप में, बाहर का neurites में रहने वाले उन लोगों की है, जबकि एक असतत लम्बी आकृति विज्ञान (चित्रा 1 एबी) दिखा रहे हैं। SBFSEM तकनीक का उपयोग करना, mitochondrial आकृति विज्ञान, आकार, मात्रा और वितरण माउस मस्तिष्क में विश्लेषण किया गया। तीन आयामी (3 डी) माइटोकॉन्ड्रिया की छवियों दोनों neurites और माउस मस्तिष्क हिप्पोकैम्पस में synapses से खंगाला गया। प्रेस्य्नाप्तिक माइटोकॉन्ड्रिया की पहचान की गई है और निवासी माइटोकॉन्ड्रिया को शरण देने presynaptic BOUTONS की संख्या मात्रा। माइटोकॉन्ड्रिया के आकार में विविधता फाई axonal डिब्बों बनाम वृक्ष के समान में मनाया गया (आंकड़ा 1 सीडी)। इसके अलावा, माउस मस्तिष्क हिप्पोकैम्पस में कई छोटे presynaptic डिब्बों (चित्रा 2 एसी) माइटोकॉन्ड्रिया से रहित थे। दोनों presynaptic और extrasynaptic माइटोकॉन्ड्रिया का बड़ा माप से पता चला है कि मात्रा या न्यूरोनल presynapses के भीतर रहने वाले माइटोकॉन्ड्रिया के आकार extrasynaptic क्षेत्र (चित्रा 2 डीएफ) में रहने वाले उन लोगों की तुलना में काफी छोटा था। दिलचस्प है, दो आयामी (2 डी) आकार 200 गैर-दैहिक माइटोकॉन्ड्रिया की एक निष्पक्ष नमूने में से मापा जाता माइटोकॉन्ड्रिया के वितरण से पता चला है कि ~ mitochondrial अंश के 11% प्रकाश माइक्रोस्कोपी का संकल्प सीमा (चित्रा 2 जी) के नीचे स्थित है। इसके अलावा, SBFSEM विश्लेषण द्वारा अधिग्रहीत 2 डी छवियों व्यक्ति माइटोकांड्रिया (चित्रा 3 एबी) के Ultrastructural विशेषताओं कल्पना करने के लिए संकल्प में वृद्धि हुई है प्रदान करते हैं। ऊतक के स्पष्ट रूप से दिखाई स्थलाकृति के कारण, यह सेलुलर कंप्यूटर अनुप्रयोग वर्गीकृत करने के लिए आगे संभव हैअपनी निकटता के निर्धारण से माइटोकॉन्ड्रिया की artment के लिए आसानी से नाभिक (दैहिक) की तरह पहचाने जाने संरचनाओं और synaptic पुटिकाओं (प्रेस्य्नाप्तिक) (चित्रा 3 एबी)। आदेश में neuronal प्रक्रियाओं में मौजूद माइटोकॉन्ड्रिया की पहचान करने के लिए, उपस्थिति या presynaptic BOUTONS क्रमश: 42 की अनुपस्थिति के आधार पर अक्षतंतु या डेन्ड्राइट के रूप में अलग-अलग प्रक्रिया को फिर से संगठित। इन परिणामों के आधार पर, हम प्रस्ताव है कि SBFSEM मस्तिष्क के ऊतकों में और है कि mitochondrial संरचना और वितरण में किसी भी सकल दोष भी इस पद्धति का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता mitochondrial आकृति, आकार, संख्या और वितरण की पहचान करने के लिए एक बहुत ही मूल्यवान विश्लेषणात्मक तकनीक है। मस्तिष्क में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के Ultrastructural विशेषताओं के बाद से अलग है, उदाहरण के लिए कर रहे हैं। astrocytes में ग्लाइकोजन कणिकाओं की उपस्थिति, यह भी मस्तिष्क माइटोकॉन्ड्रिया में सेल प्रकार विशिष्ट अंतर का विश्लेषण करने के लिए संभव है।

आकृति 1 चित्रा 1:। Neuronal Mitochondrial आकृति विज्ञान और वितरण में विविधता Cortical संस्कृतियों प्रसव के बाद दिन 1 माउस पिल्ले से lentivirus mitochondrially-लक्षित हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (Mito-GFP) व्यक्त के साथ transduced थे। (ए) न्यूरोनल सोमा व्यक्त Mito-GFP शो, mitochondrial आकृति विज्ञान की जालीदार नेटवर्क ध्यान दें; परमाणु नाभिक =; स्केल बार = 5 माइक्रोन। (बी) के बाहर का neurites में लम्बी mitochondrial आकृति विज्ञान दिखाता है; स्केल बार = 5 माइक्रोन। (सी) माउस मस्तिष्क के ऊतकों से उत्पन्न SBFSEM डाटासेट से प्रतिनिधि 2 डी छवि, माइटोकॉन्ड्रिया हरे रंग में दाग रहे हैं, डेन्ड्राइट नीले और axonal varicosities में दाग रहे हैं भूरे रंग में दाग रहे हैं; स्केल बार = 1 माइक्रोन। (डी) माउस मस्तिष्क के ऊतकों की neurites में माइटोकॉन्ड्रिया के 3D पुनर्निर्माण, वृक्ष के समान और axonal माइटोकॉन्ड्रिया indicat के बीच आकार में अंतर ध्यान देंबड़े और छोटे नोक क्रमशः द्वारा एड; स्केल बार = 1 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: सीरियल ब्लॉक चेहरे स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SBFSEM) विश्लेषण presynaptic टर्मिनलों में माइटोकॉन्ड्रिया के कम बहुतायत से पता चला (ए) SBFSEM डाटासेट P15 प्रकार के जंगली चूहों के hippocampi से प्राप्त विश्लेषण से प्रतिनिधि 2 डी ultramicrograph;। स्केल बार = 1 माइक्रोन। (बी) 10 प्रीसानेप्टिक तंत्रिका टर्मिनलों के 3D पुनर्निर्माण प्रदर्शित करता है। ध्यान दें कि केवल 10 में से 4 presynaptic टर्मिनलों नमूदार माइटोकॉन्ड्रिया से पता चला है; स्केल बार = 1 माइक्रोन। (सी) बार 173 के quantitation दिखा ग्राफ एसबी से प्रीसानेप्टिक तंत्रिका टर्मिनलों खंगालाFSEM डाटासेट विश्लेषण। (डी) हरे रंग में नीले और प्रेस्य्नाप्तिक माइटोकॉन्ड्रिया में extrasynaptic माइटोकॉन्ड्रिया दिखा SBFSEM डाटासेट से प्रतिनिधि 2 डी छवि; स्केल बार = 1 माइक्रोन। (ई) सॉफ्टवेयर का उपयोग कर SBFSEM डाटासेट से presynaptic और extrasynaptic माइटोकॉन्ड्रिया के 3D पुनर्निर्माण; स्केल बार = 1 माइक्रोन। (एफ) बार ग्राफ extrasynaptic और presynaptic माइटोकॉन्ड्रिया की मात्रा दिखा। डेटा ± SEM के मतलब के रूप में प्लॉट किए जाते हैं; एन = 3 अलग डेटासेट (62 प्रेस्य्नाप्तिक माइटोकॉन्ड्रिया और कुल में 80 extrasynaptic माइटोकॉन्ड्रिया भी शामिल है); * पी मूल्य दर्शाया गया है = 0.0405। (G) छवियों के सभी चार कोनों में एक माइक्रोन 15 से 15 क्षेत्र चिह्नित किए गए थे और सभी गैर-दैहिक माइटोकॉन्ड्रिया यादृच्छिक नमूना अनुमति देने के लिए पहचान की गई। ~ 200 माइटोकॉन्ड्रिया के कम से कम आयाम मापा गया था। पाई ग्राफ से पता चलता है कि ~ गैर-दैहिक माइटोकॉन्ड्रिया के 11% आयाम में <200 एनएम जो प्रकाश माइक्रोस्कोपी का संकल्प सीमा से नीचे है थे। यह आंकड़ा ख हैeen चव्हाण एट अल 27 से अनुकूलित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: माउस मस्तिष्क के पार्श्व Geniculate नाभिक से 2 डी SBFSEM छवियाँ (ए) के दो पार्श्व जानुवत नाभिक (8/8 माइक्रोन) से आयामी प्रतिनिधि SBFSEM छवि क्षेत्र का एक विस्तृत स्थलाकृति का प्रदर्शन है।। सोमा और नाभिक संकेत कर रहे हैं; स्केल बार = 2 माइक्रोन। (बी) के क्षेत्र में पैनल ए नोट रेड स्क्वायर कि माइटोकॉन्ड्रिया के बाहरी और भीतरी झिल्ली के रूप में अच्छी तरह से cristae गठन के लिए स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं ने संकेत की एक बढ़ाई। स्थलाकृति और अन्य अंगों और सेलुलर संरचना के संबंधों में भी मनाया जाता है। पुनश्च प्रेस्य्नाप्तिक माइटोकॉन्ड्रिया के उदाहरण को इंगित करता हैऔर एन एस गैर synaptic (एन एस) दैहिक माइटोकॉन्ड्रिया के उदाहरण इंगित करता है; स्केल बार = 1 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

तंत्रिका तंत्र की जटिलता ऐसे पर्याप्त संकल्प के साथ माइटोकॉन्ड्रिया के रूप में बड़े ऊतक संस्करणों के पुनर्निर्माण और आकृति विज्ञान और अंगों के वितरण का विश्लेषण करने में एक महत्वपूर्ण चुनौती बन गया है। न्यूरॉन्स, oligodendrocytes और तीन आयामों में बढ़ाया कई प्रक्रियाओं के साथ astrocytes सहित कई कोशिकाओं मस्तिष्क के ऊतकों 43 के भीतर बातचीत। चूंकि माइटोकॉन्ड्रिया दोनों कोशिकाओं और दूर प्रक्रियाओं की सोमा में रहता है, mitochondrial आकृति विज्ञान तंत्रिका तंत्र (चित्रा 1) में अत्यंत pleomorphic है। पर्याप्त संकल्प के साथ पर्याप्त 3 डी संरचनात्मक जानकारी इसलिए इस तरह के confocal या दो photon माइक्रोस्कोपी 44,45 के रूप में पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीक से हासिल नहीं किया जा सकता है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी केवल वर्तमान में उपलब्ध तकनीक है कि पर्याप्त उच्च संकल्प के साथ तंत्रिका ऊतक की बड़ी मात्रा के पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देता है। परंपरागत रूप से, तंत्रिका ऊतक के 3D पुनर्निर्माण को प्राप्त किया गया हैultrathin वर्गों 29 के धारावाहिक अनुभाग संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SSTEM) द्वारा घ। हालांकि, हाल ही में तकनीकी प्रगति मात्रा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डाटा अधिग्रहण और स्वचालन की गुणवत्ता में सुधार हुआ है।

SBFSEM एक स्वचालित ब्लॉक चेहरा इमेजिंग तकनीक है जो, एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के कक्ष के अंदर सीरियल सेक्शनिंग जोड़ती आदेश माइक्रोमीटर के सैकड़ों से अधिक 3 डी ऊतक संरचना के पुनर्निर्माण के लिए, एक संकल्प है कि सबसे पतला सेलुलर प्रक्रियाओं का पालन करें और छोटे अंगों की पहचान करने के लिए पर्याप्त है के साथ है । इस तकनीक को नियमित रूप से दोनों अकशेरुकी और कशेरुकी तंत्रिका प्रणाली के पुनर्निर्माण की संभावना खोल दिया है। यह नमूना तैयार करने, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप आपरेशन, डाटा अधिग्रहण, छवि पोस्ट प्रसंस्करण, और छवि विश्लेषण सहित कई कदम शामिल है। इन प्रक्रियाओं विशेष हाथ पर स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप ऑपरेशन के लिए प्रशिक्षण और प्रमाणन की आवश्यकता होती है। तीन कारकों आलोचक हैंअल अर्थात्। सही मस्तिष्क संरचनात्मक क्षेत्र विदारक, उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने, और उचित छवि विश्लेषण प्रदर्शन। तय मस्तिष्क के ऊतकों की vibratome टुकड़ा से ब्याज की संरचनात्मक क्षेत्र विदारक के बाद, यह उचित उन्मुखीकरण के संरक्षण के लिए तस्वीर लेने के लिए महत्वपूर्ण है। यह अन्यथा इमेजिंग के लिए सही साइट का पता लगाने के लिए मुश्किल हो सकता है। उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त निर्धारण और उचित पोस्ट फिक्सिंग धुंधला प्रक्रियाओं पर निर्भर करता है। मस्तिष्क मृत्यु के बाद अपनी फैटी में तेजी से गिरावट से गुजरना करने के लिए जाता है। इसलिए, यह एक glutaraldehyde समाधान उचित transcardial छिड़काव विधि का प्रयोग करने में मस्तिष्क ठीक करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह कम से कम 24 घंटे के लिए glutaraldehyde समाधान में मस्तिष्क के आगे के निर्धारण द्वारा पालन किया जाना चाहिए। चूंकि छवि संकल्प भारी धातु धुंधला तरीकों की एक किस्म के संयोजन पर पूरी तरह से निर्भर है, यह पद फिक्सिंग विधि का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि quantifiabl प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल में विस्तृत जानकारी दीई छवियों। समाधान के तरीकों के रूप में वर्णित किया जाना चाहिए। अंत में, सटीक छवि विश्लेषण के लिए organelle / एस विश्लेषण किया जा स्पष्ट ट्रेसिंग से पहले (ultrastructural विशेषताओं visualizing द्वारा उदा।), पहचान की जानी चाहिए और सॉफ्टवेयर के दिशा-निर्देशों का कड़ाई से पालन किया जाना चाहिए। अधिग्रहीत छवियों का संकल्प बड़ा माप के लिए नैनोमीटर पिक्सल से रूपांतरण के लिए ज्ञात किया जाना चाहिए।

छवि विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित सॉफ्टवेयर के अलावा, अन्य उपलब्ध सॉफ्टवेयर के फिर से संगठित और Knossos की तरह भी इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि वर्णित प्रोटोकॉल का जोर तंत्रिका तंत्र में माइटोकॉन्ड्रिया को देखने पर है, यह ऊतकों की एक किस्म में विभिन्न अन्य subcellular संरचनाओं पर उच्च संकल्प 3 डी जानकारी (जैसे। जालिका, लाइसोसोम आदि।) उत्पन्न करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।

जबकि स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप ओ के लिए एक विस्तृत समस्या निवारण गाइडperation इस लेख (साधन उपयोगकर्ता के मैनुअल और प्रशिक्षण के बारे में जानकारी देखें) के दायरे से बाहर है, कुछ समस्याओं को नियमित इमेजिंग प्रयोगों और उन्हें नए उपयोगकर्ताओं या सहयोग / वाणिज्यिक स्रोतों के माध्यम से छवियों को प्राप्त करने में मदद मिल सकती है उन समस्याओं का निवारण कैसे को समझने के दौरान होते हैं। एक आम समस्या नमूना जो राल क्षेत्रों है कि कम या कोई दाग सामग्री हो में मुख्य रूप से होता है की चार्ज है। में एक "सकारात्मक" छवि (यानी। Cytosol सफेद दिखाई देता है), नाभिक, रक्त वाहिकाओं, और खाली राल विस्तार प्रकट हो सकता है "काला"। इसके अलावा, चार्ज भी स्पष्ट छवि warping में जिसके परिणामस्वरूप स्थानीय किरण बहाव को बढ़ावा देता है। संभव समाधान के साधन और नमूनों के बीच बदलती हैं। केवी सेटिंग्स को कम करना "काला" विरूपण साक्ष्य को कम कर देता है, लेकिन अधिक किरण बहाव को बढ़ावा देने सकता है। एक कम वैक्यूम मोड का उपयोग करना, और नाइट्रोजन (एन 2) गैस, जल वाष्प, आदि शामिल है। चैम्बर में भी चार्ज कम कर देता है, लेकिन संकल्प और Signa की एक पर्याप्त कीमत परएल के लिए शोर अनुपात। एक दूसरा आम समस्या चाकू लंघन है। धीमी स्कैनिंग ब्लॉक सतह है, जो असमान या नहीं / पर सभी कटौती कुछ इमेजिंग के लिए चक्र को काटने के लिए बीम प्रेरित नुकसान का कारण बन सकता है (यानी। लगातार छवियों को एक ही प्रतीत होता है)। कई समाधान कम जेड संकल्प के साथ काटने गहराई / टुकड़ा मोटाई में वृद्धि, स्कैन गति बढ़ रही है और तदनुसार noisier छवियों को स्वीकार करने, पिक्सेल आकार को कम करने और कम एक्स / y संकल्प स्वीकार है, और अधिक तीव्र धुंधला के साथ नमूने या क्षेत्रों को चुनने (के रूप में खराब सहित मौजूद -stained क्षेत्रों में अधिक आसानी से और अधिक, क्षति चार्ज है, और स्वीकार्य के साथ छवियों को प्राप्त करने के लिए अनुपातों शोर संकेत से अब किरण जोखिम की आवश्यकता होती है)। ब्लॉक चेहरे पर मलबा पुनर्निक्षेपण छवियों में विरूपण साक्ष्य के एक सामयिक स्रोत है, और अगर यह अक्सर होता है कि यह अधिग्रहण रोक सकता है की आवश्यकता होती है, और ध्यान से चाकू (उड़ाने हवा) की सफाई, या एक छोटे आकार के नमूना retrimming। ब्लॉक चेहरे चार्ज भी पुनर्निक्षेपण को बढ़ावा देता है, और मई उपरोक्त कदममदद। ध्यान और stigmation का सुधार भी रूप में माइक्रोस्कोप छवियों नमूने लगातार कई घंटे के लिए सप्ताह के लिए, आवश्यक हो सकता है जो समय के चैम्बर में वैक्यूम गहराई बढ़ जाती है, stigmation सुधार की आवश्यकता के दौरान। प्रत्येक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप उम्र और विशेषताओं के अनुसार अलग है, और अनुभव सबसे अच्छा मार्गदर्शक है। stigmation या ध्यान में अचानक नाटकीय परिवर्तन हो सकता है जब sectioned सामग्री माइक्रोस्कोप इमेजिंग घटकों का पालन करता है। कक्ष खोला जाना चाहिए और सामग्री को ध्यान से वैक्यूम या संकुचित नाइट्रोजन के माध्यम से उखाड़ फेंकना है। यह बिल्कुल विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता है।

वहाँ मस्तिष्क माइटोकॉन्ड्रिया का विश्लेषण करने में इसकी उपयोगिता के संबंध के साथ SBFSEM प्रौद्योगिकी के कुछ नुकसान कर रहे हैं। एक बड़ा नुकसान है, तय ऊतकों के सभी माइक्रोस्कोपी के लिए आम है, कि यह एक अत्यंत गतिशील organelle के स्थिर छवियों को प्रदान करता है। माइटोकॉन्ड्रिया, सतत विखंडन और संलयन चक्र 26 से गुजरना मोबाइल और एन साथ तस्करी कर रहे हैंeurite 21 प्रक्रियाओं। Mitochondrial तस्करी में दोष और गतिशीलता जो विशुद्ध रूप से संख्यात्मक या संरचनात्मक आसानी से इस दृष्टिकोण से याद किया जा सकता है नहीं कर रहे हैं, हालांकि, इस तरह के presynapse एक व्याख्या कर सकते हैं के रूप में एक संरचनात्मक रूप में परिभाषित अंतरिक्ष में माइटोकॉन्ड्रिया की संख्या को देखकर माइटोकॉन्ड्रिया के परिवहन बदल दिया 39 जा सकता है अगर । एक दूसरा नुकसान यह है कि यह केवल मस्तिष्क के एक छोटे से हिस्से में किया जाता है इसलिए विशिष्ट दोष mitochondrial वितरण में याद किया जा सकता circuitry है। Correlative दृष्टिकोण 28,46 SBFSEM प्रौद्योगिकी के साथ confocal और multiphoton इमेजिंग गठबंधन करने के लिए दोनों आणविक और ultrastructural डेटा उत्पन्न करने के लिए अवसर दे। mitochondrial विश्लेषण के लिए, इसलिए, यह उपयोगी मस्तिष्क वर्गों के दोनों mitochondrial प्रतिजन विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके या एक transgene जो mitochondrially-लक्षित व्यक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करके प्रकाश सूक्ष्म जांच के बाद SBFSEM प्रदर्शन करने के लिए हो सकता है। इस combinatioएनएएल रणनीति तंत्रिका विज्ञान और mitochondrial विकारों के माउस मॉडल में mitochondrial दोष की पहचान करने के लिए एक मजबूत कार्यप्रणाली प्रदान कर सकता है।

वहाँ भी तकनीकी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के कई रूपों के लिए आम सीमाओं कठोर fixatives, भारी धातु धुंधला और रसायनों के असमान प्रवेश के उपयोग के कारण कर रहे हैं। अन्य सीमाओं के ऊतकों के नमूनों की प्लास्टिक एम्बेडिंग से स्टेम सकता है। राल और कम से सना हुआ संरचनाओं के खाली क्षेत्रों इमेजिंग के दौरान इलेक्ट्रॉनों को बनाए रखने, जिससे बीम नीचे को झुकाव और बहाव (warping छवि) के साथ-साथ artifactual चार्ज संकेतों (जैसे। अंधेरे नाभिक और रक्त वाहिका लुमेन) है, जो दोनों के प्रस्ताव पर टकराना। राल के लिए बीम नुकसान भी असमान काटने को बढ़ावा देता है, और इस कारण से, इमेजिंग आमतौर पर 50 के स्लाइस की आवश्यकता है - 100 एनएम ब्लॉक चेहरे से कटौती करने के लिए, डेटासेट में गैर isotrophic voxels का निर्माण किया। कुछ अनुप्रयोगों के लिए अन्य सीमाओं, शामिल है कि वर्गों नष्ट कर रहे हैं और बाद में reexamined नहीं किया जा सकताजो उन क्षेत्रों है कि उपयोगी डेटा को शामिल नहीं हो सकता है के उच्च संकल्प छवियों को इकट्ठा करने के लिए मजबूर कर सकते हैं।

SBFSEM का एक प्रमुख लाभ यह है कि यह सेक्शनिंग और इमेजिंग ऊतक के ब्लॉक एक कम निर्वात चैम्बर SEM 32,33 में एक कस्टम microtome शामिल द्वारा की प्रक्रिया को स्वचालित है। चूंकि छवियों ब्लॉक चेहरे प्रत्येक में कटौती करने के लिए पहले से सीधे प्राप्त कर रहे हैं, खंड wrinkling, संपीड़न और हैंडलिंग के दौरान नुकसान की समस्याओं का काफी हद तक बचा जा रहे हैं, हालांकि मलबे बयान और वजह से ब्लॉक चेहरे चार्ज warping कुछ छवि हानि और विरूपण करने के लिए योगदान करते हैं । इसके अलावा, कच्चे डेटासेट में प्राप्त छवियों को पहले से ही गठबंधन और आदेश में सबसे अधिक विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी होने के लिए बीम बहाव को समायोजित करने के लिए केवल माइक्रोमीटर पैमाने पर पंजीकरण की आवश्यकता होती है। स्वचालित सेक्शनिंग प्रक्रिया की वजह से, एक बार सिस्टम वैक्यूम स्थिर हो गया है, ऊतक की बड़ी मात्रा महत्वपूर्ण ऑपरेटर भागीदारी के बिना imaged किया जा सकता है। वहाँ इस का उपयोग करने के कई फायदे हैंअंगों और intracellular संरचनाओं पर रूपात्मक और मात्रात्मक अध्ययन के प्रदर्शन में प्रौद्योगिकी। एक लाभ यह माइटोकॉन्ड्रिया के 3 डी संरचना के बारे में जानकारी समय की उचित राशि के भीतर हो रही है। फिर से संगठित 47, 48 और TrakEM Knossos 49-51 की तरह खुला स्रोत सॉफ्टवेयर संकुल पुनर्निर्माण की उपलब्धता के लिए इस तकनीक का एक शक्तिशाली विश्लेषणात्मक उपकरण है जहाँ प्रयोगात्मक पशु मॉडल से neuronal नेटवर्क की विस्तृत 3 डी फैटी सीधे तुलना की जा सकती बना दिया है। Semiautomated और पूरी तरह से स्वचालित छवि विश्लेषण दृष्टिकोण 52 जानवरों जहां mitochondrial आकृति विज्ञान, समारोह और / या जीवजनन प्रभावित होने की उम्मीद कर रहे हैं में अत्यधिक यंत्रवत डेटा का उत्पादन होने की संभावना है। कि एक भी synaptic वी इससे पहले SBFSEM विश्लेषण बहुत कम संकल्प के कारण रुकावट था, लेकिन नए नमूना तैयार बढ़ाया धुंधला तरीकों 40 से जुड़े तकनीक में काफी हद तक सुधार हुआ है संकल्पesicle आसानी से हल किया जा सकता है। इस संकल्प पर इस तरह के vacuolation, झिल्ली विघटन, और cristae की हानि के रूप में माइटोकॉन्ड्रिया में ultrastructural दोषों को आसानी से देखा जा सकता है, और कोशिकाओं के भीतर दोषपूर्ण माइटोकॉन्ड्रिया के वितरण 38,39 निर्धारित किया जा सकता है। इस तकनीक के उच्च संकल्प प्रकाश माइक्रोस्कोपी पर एक बड़ा लाभ यह है जहां संकल्प जेड अक्ष में XY अक्ष में ~ 200 एनएम और ~ 500 एनएम तक सीमित है प्रदान करता है। माइटोकॉन्ड्रिया सिर्फ प्रकाश माइक्रोस्कोपी 53 का संकल्प सीमा पर इसलिए कर रहे हैं। हालांकि संकल्प सीमा से नीचे आयामों वाले माइटोकॉन्ड्रिया अभी भी प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे जा सकते हैं, उनके आयामों मज़बूती से नहीं मापा जा सकता। महत्वपूर्ण बात है, माइटोकॉन्ड्रिया कि एक दूरी एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का संकल्प सीमा से कम से अलग हो रहे प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा हल नहीं किया जा सकता है। एक और लाभ यह है कि mitochondrial संरचनात्मक विश्लेषण organelle के अलगाव के बिना, ऊतक के संदर्भ में किया जा सकता है। यह कर सकते हैं अलऊतक के भीतर उचित तुलना mitochondrial स्थानीयकरण के आधार पर कम, जैसे axonal बनाम दैहिक और / या वृक्ष के समान माइटोकॉन्ड्रिया के लिए। एक अतिरिक्त लाभ यह है कि यह आम तौर पर निर्धारित किया जाए माइटोकॉन्ड्रिया न्यूरोनल या इस तरह के glial तंतु और astrocytes या oligodendrocytes के लिए माइलिन के लिए ग्लाइकोजन के रूप में एक निर्णायक organelle, करने के लिए प्रक्रियाओं का पालन करते हुए स्थानीयकरण में neuroglial हैं संभव है। न्यूरॉन्स और neuroglial कोशिकाओं की प्रक्रिया करीब निकटता में अक्सर होते हैं, और 2 डी मंदिर के रूप में इस तरह के दृष्टिकोण के साथ यह विश्वास जो प्रक्रियाओं न्यूरोनल हैं और जो neuroglial रहे हैं के साथ आवंटित करने के लिए मुश्किल हो सकता है।

, Imaged किया जा मापा और खंगाला 10 एनएम या अधिक है, जो इस तरह के माइटोकॉन्ड्रिया के रूप में पूरे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की कोशिकाओं और अंगों की अनुमति देता है - के 5 ultrastructural संकल्प के साथ आकार में 1,000 माइक्रोन - अंत में, SBFSEM प्रौद्योगिकी सीरियल को कवर ऊतक क्षेत्रों 20 छवियों के ढेर प्रदान करता है । इस पत्र में, हम समर्थकइस तकनीक का इस्तेमाल कर रही है करने के लिए कुछ व्यावहारिक दृष्टिकोण मिली। भविष्य अनुप्रयोगों mitochondrial संरचना और ऐसे neurodevelopmental और neurodegenerative रोग मॉडल के रूप में मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के पशु मॉडल की विविधता में वितरण का विश्लेषण करने के साथ ही इस तरह के जालिका, नाभिक और / या स्वस्थ तहत पूरे कोशिकाओं या ऊतकों में लाइसोसोम और के रूप में विभिन्न subcellular ultrastructures का विश्लेषण शामिल रोग राज्यों।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson laboratory  664
Isoflurane VETone, tradename Fluriso 501017
Dissection tray Fisher scientific  S65105 
Dissection scissors Ted Pella Inc. 1316
Butterfly canula Exel International 26704
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Filter (0.45 micron) EMD Millipore NC0813356
Dissection microscope Olympus SZ61
Vibratome sectioning system Ted Pella Inc. Vibratome 3000
Sodium Cacodylate EMS 12300
Tannic Acid EMS 21700
Potassium Ferrocyanide J.T. Baker 14459-95-1
Osmium Tetroxide 4% Solution EMS 19150
Thiocarbohydrazide EMS 21900
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A93100
Potassium Hydroxide Acros Organics 43731000
Lead Nitrate EMS 17900
EMbed-812 EMBEDDING KIT EMS 14120 Contains Embed 812  resin, DDSA, NMA, and DMP-30.
Glutaraldehyde 25% EM Grade Polysciences Inc. 1909
Paraformaldehyde EMS 19202
Uranyl Acetate EMS 22400
Ethanol EMS 15055
Propylene Oxide EMS 20400
Embedding Mold EMS 70907
Aluminum specimen pin EMS 70446
Colloidal Silver Liquid EMS 12630
Razor EMS 72000
Super Glue (Loctite Gel Control) Loctite 234790 Hardware/craft stores carry this item
Conductive epoxy Ted Pella Inc. 16043
Scanning electron microscope Zeiss Sigma VP
In chamber ultramicrotome for SEM Gatan Inc. 3View2 Can be designed for other SEMs
Trimming microscope for pin preparation Gatan Inc. supplied as part of 3View system
Low kV backscattered electron detector Gatan Inc. 3V-BSED
ImageJ/ Fiji processing package  ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
http://rsb.info.nih.gov/ij/
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf
http://fiji.sc/TrakEM2

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References

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Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, … More

Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, V., Benson, E. K., Kidd, G. J., Srivastava, S. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (113), e54214, doi:10.3791/54214 (2016).

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