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Neuroscience

Analyse de Brain mitochondries utilisant Serial Bloc-Face microscopie électronique à balayage

Published: July 9, 2016 doi: 10.3791/54214
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Virginia Tech Carilion Research Institute, 2Renovo Neural Incorporated

Abstract

Le cerveau humain est un organe de consommation d'énergie élevée qui repose principalement sur le glucose comme source de carburant. Le glucose est catabolisme par les mitochondries du cerveau via la glycolyse, l' acide tri-carboxylique (TCA) et le cycle de la phosphorylation oxydative (OXPHOS) voies pour produire l' énergie cellulaire sous la forme d'adénosine triphosphate (ATP). Dépréciation de la production d'ATP mitochondrial provoque des troubles mitochondriaux, qui présentent cliniquement avec des symptômes neurologiques et myopathes importants. Défauts mitochondriaux sont également présents dans les troubles neurodéveloppementaux (par exemple l' autisme des troubles du spectre) et des troubles neurodégénératifs (par exemple , la sclérose latérale amyotrophique, la maladie d' Alzheimer et la maladie de Parkinson). Ainsi, il y a un intérêt croissant dans le domaine pour effectuer une analyse 3D de la morphologie mitochondriale, la structure et la distribution dans les deux états sains et les maladies. La morphologie du cerveau mitochondrial est extrêmement diversifié, avec quelques mitochondries en particulier ceuxla région synaptique étant dans la gamme de <200 nm de diamètre, ce qui est en dessous de la limite de résolution de la microscopie optique traditionnelle. Exprimant une protéine mitochondriale ciblée fluorescente verte (GFP) dans le cerveau améliore considérablement la détection des organites par microscopie confocale. Toutefois, il ne résout pas les contraintes pesant sur la sensibilité de détection de relativement petites dimensions, sans mitochondries sursaturer les images de grandes dimensions mitochondries. Alors que la microscopie de série électronique à transmission a été utilisée avec succès pour caractériser les mitochondries dans les synapses des neurones, cette technique est extrêmement chronophage en particulier lorsque l'on compare les échantillons multiples. La technique de la microscopie électronique à balayage d'îlot série (SBFSEM) implique un processus automatisé de sectionner, blocs d'imagerie d'acquisition des tissus et des données. Ici, nous fournissons un protocole pour effectuer SBFSEM d'une région définie du cerveau de rongeur pour reconstruire rapidement et de visualiser la morphologie mitochondriale. Cette technologienique peut également être utilisé pour fournir des informations précises sur le nombre mitochondriale, le volume, la taille et la distribution dans une région du cerveau définie. Depuis la résolution de l'image obtenue est élevée (typiquement de moins de 10 nm) des défauts morphologiques mitochondriales bruts peuvent également être détectées.

Introduction

Les mitochondries sont des organelles dynamiques qui changent leur forme et leur emplacement en fonction des besoins et des signaux cellulaires, en interaction étroite avec le cytosquelette cellulaire, et en réponse à des événements cellulaires tels que les courants de calcium dans les neurones 1. Les mitochondries interagissent également avec d' autres organites cellulaires , par exemple réticulum endoplasmique, qui à son tour régule leur dynamique et leur métabolisme 2. Morphologie mitochondriale montre une hétérogénéité dans différents types de cellules ie. la forme de l'organite varie d' un tube à celui constitué par des feuilles, des sacs et des ovales 3. Il a été montré que les protéines du cycle de fusion et de fission mitochondriale peuvent réguler l'emplacement, la taille, la forme et la distribution des mitochondries 4. De plus, les changements dans la forme mitochondriale sont associés à la neurodégénérescence, la plasticité neuronale, une atrophie musculaire, la signalisation du calcium, de l'oxygène production d'espèces réactives ainsi que la durée de vie et la mort cellulaire impliquant thala morphologie des mitochondries des cellules T spécifiques est essentielle pour le maintien de la fonction cellulaire normale 11/05.

Une fonction majeure bioénergétique des mitochondries est de générer de l' adénosine triphosphate (ATP) en exécutant une série de réactions métaboliques qui impliquent ventilation complète des nutriments (c. -à- glucose, acides gras ou acides aminés) par l' intermédiaire du cycle de TCA et OXPHOS voies 12. Le cerveau humain ne représente que 2% du poids du corps mais il consomme environ 20% de l' énergie totale produite qui en fait une énergie extrêmement exigeante organe 13. Il est donc pas surprenant que le dysfonctionnement mitochondrial chez l' homme conduit à un grand nombre de manifestations neurologiques 14-17. Les mutations génétiques dans les composants OXPHOS qui nuisent conduit ATP génération à des troubles mitochondriaux 17,18, qui sont un groupe hétérogène de troubles cliniquement avec une prévalence de 1 ~: 5.000 personnes, et l' une des causes les plus communes de mtroubles etabolic chez les enfants et les adultes. Déficit de l' ATP des mitochondries dérivées affecte plusieurs organes et systèmes d'organes exigeants de haute énergie tels que le cerveau, le cœur et les muscles squelettiques étant principalement affectés chez ces patients 14,17,18. Au cours des dernières années, plusieurs études ont fourni des preuves pour le dysfonctionnement mitochondrial dans les deux troubles neurodéveloppementaux et neurodégénératives 15-17,19,20. Comme les mitochondries sont essentielles et critiques pour le développement et le fonctionnement du cerveau, il est impératif d'élaborer des protocoles qui peuvent analyser les changements dans le cerveau mitochondrial la morphologie, la structure, la taille, le nombre et la distribution au titre des deux états sains et malades. Des modèles de souris avec mitochondrie ciblée protéine fluorescente verte (GFP) ont été produits pour visualiser les mouvements mitochondriales et la localisation dans le cerveau 21,22. Bien que ce soit un outil extrêmement utile pour examiner la motilité mitochondrial et la distribution générale, il y a quelques inconvénients qui INCLUDe résolution limitée et la sensibilité de la microscopie par fluorescence. Ces attributs font qu'il est difficile de suivre les relativement petites mitochondries de taille. De même, la microscopie de série électronique à transmission a été utilisé avec succès pour afficher les mitochondries synaptique 23, mais cette méthode est très coûteuse en temps. Morphologie mitochondriale est connue pour être hautement dynamique car ils sont soumis à des cycles de fission et de fusion en continu, et dans la plupart des cellules mitochondries maintenir un réseau fortement connecté 24-26. Les neurones sont des cellules fortement avec plusieurs dendrites et des axones étendus et les mitochondries qui forment un réseau réticulaire connecté dans le corps de la cellule polarisée peut avoir à séparer car elles se frayer un chemin à travers ces neurites (figure 1). Cela rend les mitochondries cérébrales extrêmement variées en taille et en forme. Par exemple, en utilisant la microscopie électronique à balayage d'îlot série (SBFSEM) technique, nous l'avons déjà fait remarquer que la différence dans le volume ou la taille de mitochondr extrasynaptiqueia aux mitochondries présentes dans les terminaisons nerveuses peut être jusqu'à seize replient 27.

Il existe plusieurs approches pour réaliser le volume des analyses 28, qui comprend de série section TEM 29, bande automatisé collecte ultramicrotome SEM 30, faisceaux d' ions focalisés SEM 31, et SBFSEM 32. L'analyse de SBFSEM présente des avantages en ce qu 'il a une résolution pour fournir des données quantitatives sur la forme morphologique, la taille, la distribution et le nombre d'organites tels que les mitochondries dans des zones allant jusqu'à 1 mm du cerveau. Le fonctionnement technique est aussi le moins exigeant, avec l'acquisition de données et d'analyse au sein des capacités de nombreux laboratoires biologiques qui manquent d'expérience EM précédente. L'avènement des instruments du commerce pour générer des images de section en forme de série a fait une analyse des tissus microscopie électronique 3D une technique de routine, ce qui permet en outre une analyse volumétrique non biaisé de façon rapide et reproductible 28 32, basé sur une idée introduite par Leighton en 1981 33. De nombreuses études depuis ont mis en place cette technique comme un outil majeur dans l' analyse de la reconstruction des circuits neuronaux 34. En outre, pour de nombreux projets à plus petite échelle, il fournit une analyse de la reconstruction pour identifier les organites cellulaires 27,35-39. Depuis, les images acquises sont dérivées de basse tension des électrons de rétrodiffusion, de nouveaux protocoles de coloration qui combinent différentes techniques connues de coloration des métaux lourds ont été développés pour augmenter la résolution 40.

Dans cet article, nous fournissons un protocole pour l' utilisation de la 3D imagerie par microscopie électronique et analyse volumétrique des mitochondries cérébrales basée sur les méthodes qui ont déjà été utilisées par nous et d' autres 38,39,41. Les méthodes de tissus post-traitement ont été utilisées comme décrit précédemment par Deerinck et al40.

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Protocol

Déclaration d'éthique: Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) à Virginia Tech.

Attention: les précautions extrêmes doivent être prises lors de la manipulation et de l'élimination de plusieurs composants utilisés dans ce protocole. Avant utilisation, la section locale des directives institutionnelles et pratiques de santé et de sécurité doivent être établies et suivies, en particulier pour le tétroxyde d'osmium, qui est volatile et extrêmement toxique, l'acétate d'uranyle, qui est à la fois un métal lourd et source de radioactivité, et le nitrate de plomb, ce qui est un poison de métal lourd. Thiocarbohydrazide (TCH) peut se décomposer pour produire des gaz explosifs et toxiques, si mal géré. De nombreux établissements seront dotés d'une installation de base EM dans lequel ces réactifs sont couramment utilisés et peuvent fournir de l'aide.

1. Préparation du tissu cérébral et SBFSEM Imaging

  1. Anesthetize un jeune (~ 2 - 4 mois) C57 souris noire (C57BL / 6J de souche) en utilisant le 4 - 5% isoflurane suivant les directives institutionnelles. Confirmer anesthetization en surveillant la perte de tonus musculaire, le manque de mouvements volontaires et les réponses aux stimuli aversifs comme un pincement de la queue.
  2. Pin de la souris sur un plateau de dissection et faire une incision sur la peau sur la ligne médiane ventrale. Faire d'autres incisions dans la peau pour exposer la cage thoracique de la souris. Inciser le diaphragme, et soigneusement disséquer la cavité thoracique le long de la périphérie pour exposer le cœur battant, puis faire une incision sur l'oreillette droite.
  3. En utilisant une canule de papillon, cathétériser le ventricule gauche. Perfuser la souris à l'aide transcardiaque 10 - 20 ml de solution saline de tampon phosphate (PBS), pH 7,2, jusqu'à ce que l'exsanguination est confirmé par une modification de la couleur du foie.
    Remarque: Une modification de la couleur du foie est utilisé comme un guide pour déterminer l'étendue de l'exsanguination. Assurez-vous que la couleur du foie passe de brun rougeâtre à rose pâle.
  4. Perfuser la souris à l'aide transcardiaque 10 - 20 ml de 2% glutaraldéhyde et 4% de paraformaldehyde faite 0,10 M de tampon cacodylate (pH 7,2), pour fixer le tissu cérébral rapidement à partir de l'intérieur. La fixation est contrôlée en observant la queue de raidissement.
    Note: Préparer le tampon cacodylate 0,10 M (pH 7,2) en dissolvant 2,14 g de cacodylate de sodium dans 80 ml d'eau, ajouter de l'acide chlorhydrique pour ajuster le pH, et de porter le volume à 100 ml avec de l'eau.
  5. À la suite de la perfusion, décapitent la souris, disséquer le cerveau, suivie par la fixation dans 0,10 M de tampon cacodylate de sodium (pH 7,2) contenant 2% de glutaraldéhyde et de 4% de paraformaldehyde pendant 48 h à 4 ° C
  6. Après 48 h faire 400 um coupes coronales en utilisant un vibratome puis disséquer soigneusement la région d'intérêt dans le cerveau (par exemple, l'hippocampe) sous le microscope de dissection 42. couper délicatement le tissu et prendre une photo pour préserver l'orientation.
    Remarque: Déposer les méthodes de coloration des tissus dans SBFSEM de traitement combine une variété de méthodes de coloration de métaux lourds dansafin d'améliorer la résolution et sont basées sur la méthode développée précédemment par Deerinck et al 40.
  7. Laver les tissus fixées au glutaraldéhyde 3 fois, 5 minutes à chaque fois dans 0,1 M de tampon cacodylate (pH 7,2).
  8. Préparer une solution d'acide tannique à 0,1% par dissolution de l'acide tannique dans 0,1 M tampon cacodylate de sodium (pH 7,2). Agiter jusqu'à dissolution et filtrer à travers 0,45 um filtre, si nécessaire.
  9. Postfix les tissus avec cacodylate tamponnée 0,1% d'acide tannique par incubation dans 1 ml de réactif pour 30 - 60 min à température ambiante.
    Remarque: Le temps d'incubation dépend de la taille des tissus, mais 30 min qui fonctionne le mieux pour la plupart des tissus.
  10. Laver les tissus 3 fois, 5 minutes à chaque fois dans un tampon de cacodylate (pH 7,2).
  11. Dissoudre 0,3 g de ferrocyanure de potassium et 0,86 g de cacodylate de sodium dans 10 ml d'eau distillée H 2 O (dh 2 O). Conserver la solution de ferrocyanure de potassium sur la glace. Juste avant utilisation, ajouter 10 ml de 4% de tétroxyde d' osmium (OSO 4).
  12. Colorer les tissus avec 2% ossolution mium-ferrocyanure pendant 90 min, sur la glace. Laver 3 fois, 5 min chacune dans dH 2 O.
  13. Préparer 1% thiocarbohydrazide (TCH) solution en dissolvant 0,1 g TCH dans 10 ml dH 2 O. Dissoudre à 60 ° C, en agitant toutes les 10 minutes jusqu'à dissolution complète. Respecter les consignes de sécurité lors de la manipulation TCH, en particulier prendre soin d'éviter l'utilisation de métaux, chauffage à haute température, ou de permettre à une solution à sécher.
  14. Traiter les échantillons fraîchement préparés avec 1% TCH pendant 20 min à température ambiante. Laver 3 fois, 5 min chacune dans dH 2 O.
  15. Diluer 4% OsO 4 à 2% avec dH2Û, les tissus de teinture aqueux à 2% avec du tétroxyde d' osmium en incubant pendant 1 h. Laver les tissus 3 fois, 5 min chacun avec dH 2 O.
  16. Incuber les échantillons O / N à 1% d' acétate d'uranyle dans dH 2 O à 4 ° C.
  17. Préparer la solution de aspartate avance de Walton (comme décrit par Deerinck et al 40).
    1. Dissoudre 0,998 g L-aspartate dans dH 2 O de 250puis ajouter 10 l'hydroxyde de potassium (KOH) d'une manière goutte à goutte jusqu'à ce que le pH atteigne 5,5. Après ajustement du pH, ajouter 0,066 g de nitrate de plomb dans 10 ml aspartique stocks d'acide et de la chaleur à 60 ° C pendant 30 min.
  18. Rincer les tissus dans dH2Û et laisser incuber avec du plomb tache aspartate Walton pendant 30 min dans un four à 60 °. Laver 3 fois, 5 min chacune dans dH 2 O.
  19. Déshydrater les échantillons à travers une série graduée de l'alcool en utilisant des solutions congelées de 20%, 50%, 75%, 85% et 95% d'éthanol pendant 5 minutes à chaque fois, suivi de 100% d'éthanol, 3 fois 10 minutes à chaque fois.
    Remarque: Utilisez éthanol à 100% de la bouteille fraîchement ouvert, que l'éthanol ouvert absorbe l'eau de l'air et provoquer l'intégration à l'échec. incubations plus longues seront nécessaires avec des échantillons de tissus plus grands.
  20. échantillons Laver 2 fois, 15 min chacun dans de l'oxyde de propylène.
  21. Faire résine plastique d'enrobage en utilisant 25 ml de résine, 10,5 ml DDSA (anhydride dodécénylsuccinique), 15,5 ml NMA (Anhydride méthyl nadique) et 1 mlDMP-30 (2,4,6-Tris diméthylaminométhyl phénol). Mélanger la résine par agitation. Spin et laisser la résine reposer jusqu'à ce que des bulles détermination.
    Note: Ceci est la recette de dureté moyenne standard. D'autres types de microscopie (EM) en résine plastique d'électrons peuvent être utilisés, mais ils doivent être testés avec un échantillon témoin non essentiel à l'avance pas toutes les résines de travail pour SBFSEM.
  22. Incuber les tissus O / N dans un 50 50 mélange de résine et de propylène oxyde d'enrobage, dans un flacon qui est coiffé d'abord, puis, après 2 h non écrêtée de sorte que l'oxyde de propylène évapore pendant la période d'environ 8 à 10 heures.
  23. Transférer les tissus à 100% de résine d'enrobage frais dans des flacons propres pendant 2 heures.
  24. échantillons Intégrer en résine d'enrobage frais, dans des moules plats contenant imprimées des étiquettes en papier, et soignez-les dans un four à 60 ° C pendant 48 heures. Après environ 1 heure, vérifier le placement des tissus et de l'alignement à nouveau, et ajuster si nécessaire.
  25. Couper des échantillons vers la zone d'intérêt et de montage sur une broche d'aluminium en utilisant Gelling cyanoacrylate de colle ou d'une résine époxy conductrice, ensuite une couche d'argent colloïdal coller sur les côtés du bloc pour fournir un chemin conducteur à la broche d'aluminium.
  26. Examiner les échantillons de tissus en utilisant un système de microscope électronique à balayage équipé d'un étage dans la chambre basse et ultramicrotome kV détecteur d'électrons rétrodiffusés 32.
    Note: Obtenir instrument- et le site de formation en microscopie électronique à balayage (MEB) utiliser et devenir un utilisateur autorisé. Alternativement, la collaboration avec un centre de chercheur ou de base pour les petits projets peut être possible. la formation de rayonnement peut également être nécessaire que MEB génèrent des radiographies.
  27. Pour l'image des échantillons, utilisez les paramètres suivants: 2,25 kV, de 5 - 10 nm / pixels de résolution, avec des tailles de champ entre 80-250 um en x, y (autre domaine tailles possible), et l'épaisseur de tranche de 50 - 100 nm, avec un total de 250 - 600 tranches dans un 16 - période de 20 h.
    Remarque: Les paramètres varient considérablement entre les différents microscopes, indiéchantillons individuels, et de la résolution souhaitée. Ces paramètres doivent produire des images qui sont facilement interprétables pour de nombreux échantillons.

2. Analyse de l'Dataset Imaging

Note: Le J / Fiji logiciel Image est utilisé pour analyser l'ensemble de données et repose sur le plugin TrakEM2. étapes de prétraitement peuvent être effectuées en utilisant une variété de logiciels, et peuvent être étendus ou mineur selon le niveau d'expérience et les piles obtenues. Les principales transformations en utilisant le logiciel open-source (ImageJ ver 1.50b, FIDJI télécharger 1 octobre 2015) sont décrites ici.

  1. Convertir des images au format TIFF 8 bits à partir des propriétaires images originales 16 bits en ouvrant dans le logiciel et la sélection des éléments de menu image → Type → 8 bits.
    1. Si la conversion automatique de contraste / luminosité lors de cette étape est idéal pour les images, rouvrir les images 16 bits, et appuyez sur l'image → Régler → Luminosité / Contraste. Sélectionnez une plage qui fonctionne pour toutes les images, et appuyez sur Appliquer. Puis effectuer cCONVERSION. Remarque: Sur certains MEB, cette étape peut nécessiter un logiciel de fabricant de microscope.
    2. Si nécessaire, en raison du mouvement d'image inacceptable entre les tranches (par ex. La dérive due à la charge), enregistrer / aligner les piles d'images (éléments de menu Plugins → Enregistrement → StackAlignmentWithSIFT linéaire). Dans la plupart des logiciels d'enregistrement, défini pour le mode "traduction uniquement" plutôt que "corps rigide".
      Remarque: De nombreuses approches et logiciels peuvent travailler: les inscriptions EIPD plug-in fonctionne pour de nombreuses applications et il y a une version virtuelle de la pile.
      1. Si nécessaire, agrandir la taille de la toile avant l'enregistrement (image → Régler → taillecanevas) ou la réduire à une zone d'intérêt (image → Rogner).
        Remarque: Certaines dérive ou évasement peuvent se produire, et d'essayer d'autres plugins ou logiciel peut produire de meilleurs résultats. Options manuelles sont également disponibles (par ex. ImageJ / FIDJI, Plugins → Enregistrement → ManualLandmarkSelection).
    3. Si desired, images à l'échelle de taille plus petite, plus facile à gérer (par exemple. 25%) en utilisant ImageJ (image → Scale).
  2. Lancez le logiciel, sélectionnez Fichier → Importer → séquence d'images, puis sélectionnez les fichiers TIFF.
  3. Lancez le plugin en sélectionnant Fichier → Nouveau → TrakEM2 (Blank). Deux fenêtres seront ouvertes; on gère le projet et area_lists et l'autre gère le traçage, et est appelée la «toile».
  4. Charger la pile d'images dans le plug-in en faisant un clic droit sur l'importation de la toile. Sélectionnez l'importation et cliquez sur la pile d'importation. Dans les options de pop-up, cochez la case pour les piles virtuelles.
    Note: Bien que les piles d'images sont déjà ouvertes dans le logiciel, ils doivent également être ouverts dans le plug-in. L'ordinateur peut fonctionner plus en douceur si la boîte de piles virtuelles est cochée.
  5. Après les mipmaps sont créés et la pile est chargée, cliquez droit de nommer le projet sous la fenêtre du plugin. Clic droit sur «nouveau projet» dans le col de modèlelonne, et sélectionnez «Ajouter nouvel enfant» pour ce projet. Faites un clic droit à nouveau pour sélectionner 'area_list'.
  6. Réglez l'échelle de l'axe Z du projet d'accord avec les paramètres d'un microscope électronique d'origine par un clic droit sur la toile, puis cliquez sur Affichage et sélectionnez l'étalonnage. Aussi, réglez le Z-échelle en sélectionnant toutes les couches dans la fenêtre du plug-in, cliquez à droite pour sélectionner l'échelle Z et de l'épaisseur.
  7. Cliquez et faites glisser le «projet» et tous les «enfants» dans le projet Objets section pour créer les «listes de la zone» sous l'onglet 'Z de l'espace »dans la fenêtre de toile.
  8. Sélectionnez la «liste de la zone» et cliquez à droite pour sélectionner et définir une couleur. Maintenant, utilisez l'outil pinceau pour tracer des objets tels que les mitochondries, dans les images d'un microscope électronique. Utilisez 'Maj + clic »pour remplir un cercle fermé,' Ctrl + défilement 'pour zoomer et dézoomer, et« Alt + clic pour faire tourner pinceau curseur dans une gomme à effacer.
  9. Sélectionnez deux zones de ~ 10 à 15 umpar 10-15 um dans le coin gauche en haut et en bas à droite de l'image et d'identifier toutes les mitochondries dans ces domaines pour permettre un échantillonnage biaisé des mitochondries dans chaque jeu de données.
  10. Sur la 'toile', observer et suivre les mitochondries dans les sections. Remarque: Les mitochondries sont des organites assez sombres / denses apparaissant, de taille similaire de diamètre et vaguement cylindriques. Le cristae unique, formé par la membrane interne sont faciles à distinguer à l'intérieur de cet organite.
  11. Lorsque vous avez terminé avec le traçage, cliquez droit sur le area_list sous l'onglet de l'espace Z, sélectionnez «Afficher en 3D». Cela permet de lancer le visualiseur plug-in 3D pour afficher une reconstruction 3D de l'image tracée.
    1. Pour effectuer des mesures de volume mitochondriales, sélectionnez l'objet dans la visionneuse 3D, cliquez sur l'onglet «Modifier» et sélectionnez «Propriétés de l'objet». L'estimation du volume mitochondrial est répertorié avec plusieurs autres mesures.

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Representative Results

Nous démontrons que la morphologie du cerveau et la taille mitochondrial est hétérogène dans les différents sous-compartiments neuronaux. La microscopie confocale sur des cultures de neurones de faible densité transduction avec des lentivirus exprimant la protéine fluorescente verte mitochondrial ciblée a montré que les mitochondries résidant dans le soma des neurones forment un réseau réticulaire, alors que ceux qui résident dans distaux de neurites présentent une morphologie allongée discrète (Figure 1 AB). En utilisant la technique SBFSEM, la morphologie des mitochondries, la taille, le volume et la distribution ont été analysés dans le cerveau de la souris. Trois dimensions (3D) des images de mitochondries ont été reconstruites à partir des deux neurites et des synapses dans l'hippocampe du cerveau de la souris. Les mitochondries présynaptiques ont été identifiées et le nombre de boutons présynaptiques hébergeant les mitochondries résidents quantifiées. L' hétérogénéité de la taille des mitochondries a été observée dans les compartiments dendritique par rapport axonales (Figurer 1 CD). En outre, un grand nombre de petits compartiments synaptiques dans l'hippocampe du cerveau de la souris étaient dépourvues de mitochondries (figure 2 ca). Les mesures volumétriques des deux mitochondries présynaptiques et extrasynaptiques ont révélé que le volume ou la taille des mitochondries résidant dans les presynapses neuronales était significativement plus faible que ceux qui résident dans la région extrasynaptique (Figure 2 DF). Fait intéressant, les dimensions (2D) , la distribution des mitochondries , mesurée à partir d' un échantillonnage non biaisé de 200 mitochondries non somatiques a révélé que deux taille d' environ 11% de la fraction mitochondriale est inférieure à la limite de résolution de la microscopie optique (figure 2G). En outre, les images acquises par analyse 2D SBFSEM apportent une plus grande résolution pour visualiser les caractéristiques ultrastructurales des mitochondries individuels (Figure 3 AB). En raison de la topographie clairement visible du tissu, il est en outre possible de classer l'échantillon cellulaireartment des mitochondries en déterminant sa proximité facilement identifiables comme des structures noyau (somatique) et des vésicules synaptiques (présynaptique) (Figure 3 AB). Afin d'identifier les mitochondries présentes dans les processus neuronaux, reconstruire le processus individuel comme axone ou de dendrites sur la base de la présence ou de l' absence de boutons présynaptiques respectivement 42. Sur la base de ces résultats, nous proposons que SBFSEM est une technique d'analyse extrêmement précieux pour identifier la forme mitochondriale, la taille, le nombre et la distribution dans les tissus du cerveau et que tous les défauts grossiers dans la structure et la distribution mitochondriale peuvent également être déterminées en utilisant cette méthode. Etant donné que les caractéristiques ultrastructurales des différents types de cellules dans le cerveau sont distincts, par exemple. présence de granules de glycogène dans les astrocytes, il est également possible d'analyser les différences type de cellule spécifique dans les mitochondries du cerveau.

Figure 1 Figure 1:. Hétérogénéité dans Neuronal mitochondrial Morphologie et distribution cultures corticales de jour 1 chiots postnatales de souris ont été transduites avec lentivirus exprimant la protéine fluorescente verte mitochondries ciblée (mito-GFP). (A) Affiche soma neuronale exprimant mito-GFP, notez le réseau réticulaire de la morphologie mitochondriale; Nu = noyau; barre d'échelle = 5 um. (B) montre la morphologie mitochondriale allongée dans neurites distale; barre d'échelle = 5 um. (C) d'image représentant 2D du jeu de données SBFSEM généré à partir du tissu du cerveau de la souris, les mitochondries sont colorées en vert, les dendrites sont colorées en bleu et varicosités axonales sont colorées en brun; barre d'échelle = 1 um. (D) des reconstructions 3D des mitochondries dans les neurites de tissu cérébral de souris, notez la différence de taille entre dendritique et axonale mitochondries indicated par petits et grands arrowhead respectivement; barre d' échelle = 1 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Serial Scanning Bloc-face Electron Microscopy (SBFSEM) L' analyse a révélé une faible abondance de mitochondries dans les terminaux présynaptiques (A) représentant 2D ultramicrograph de l'analyse de données SBFSEM obtenu à partir du hippocampes de souris de type sauvage P15;. barre d'échelle = 1 um. (B) Affiche la reconstruction 3D de 10 terminaisons nerveuses présynaptiques. Notez que les terminaux présynaptiques seulement 4 sur 10 ont montré des mitochondries discernable; barre d'échelle = 1 um. (C) Bar graphique montrant la quantification de 173 reconstruit les terminaisons nerveuses présynaptiques du SBFSEM analyse des données. (D) d'image représentant 2D de SBFSEM ensemble de données montrant les mitochondries extrasynaptique dans les mitochondries bleu et présynaptiques en vert; barre d'échelle = 1 um. (E) reconstructions 3D des mitochondries présynaptique et extrasynaptique du jeu de données SBFSEM en utilisant le logiciel; barre d'échelle = 1 um. (F) Bar graphique montrant le volume des mitochondries extrasynaptiques et présynaptiques. Les données sont tracées en tant que moyenne ± SEM; n = 3 ensembles de données différents (y compris les 62 mitochondries présynaptiques et 80 mitochondries extrasynaptiques au total); * Dépeint valeur p = 0,0405. (G) Une zone 15 de 15 um dans les quatre coins d'images ont été marquées et toutes les mitochondries non-somatiques ont été identifiés pour permettre un échantillonnage aléatoire. La dimension minimale de ~ 200 mitochondries a été mesurée. graphique circulaire montre que ~ 11% des mitochondries non-somatiques étaient <200 nm dans la dimension qui est inférieure à la limite de résolution de la microscopie optique. Ce chiffre a been adapté de Chavan et al 27. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: 2D SBFSEM Images du latéral géniculé Noyaux de cerveau de souris (A) Deux d'image SBFSEM représentant dimensions à partir des noyaux géniculés latéraux (8/8 de um) démontrant une topographie détaillée de la région.. Soma et le noyau sont indiqués; barre d'échelle = 2 pm. (B) Un grossissement de la zone indiquée par le carré rouge dans le panneau A. Notez que les membranes externes et internes des mitochondries ainsi que cristae formation sont clairement visibles. La topographie et des relations avec d'autres organites et la structure cellulaire est également observée. PS indique par exemple des mitochondries présynaptiqueet NS indique par exemple de non-synaptique (NS) mitochondries somatique; barre d' échelle = 1 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

La complexité du système nerveux représente un défi important dans la reconstruction de grands volumes de tissus et l'analyse de la morphologie et la distribution des organites tels que les mitochondries, avec une résolution suffisante. Plusieurs cellules , y compris les neurones, les oligodendrocytes et les astrocytes avec de nombreux processus étendus en trois dimensions interagissent dans le tissu cérébral 43. Depuis mitochondries réside à la fois dans le soma des cellules et des processus distants, la morphologie mitochondriale est extrêmement pléomorphes dans le système nerveux (Figure 1). Information structurale 3D adéquate avec une résolution suffisante ne peut donc pas être acquis par des techniques de microscopie de lumière classiques tels que confocale ou microscopie à deux photons 44,45. La microscopie électronique est la seule technique actuellement disponible qui permet la reconstruction de grands volumes de tissu neural avec une résolution suffisamment élevée. Traditionnellement, la reconstruction 3D du tissu neural a été atteindred par microscopie série section d'émission d'électrons (sstem) des sections ultraminces 29. Cependant, les récentes avancées technologiques ont amélioré la qualité de l'acquisition de données de microscopie électronique de volume et de l'automatisation.

SBFSEM est une technique d'imagerie îlot automatisé qui combine tronçonnage série à l'intérieur de la chambre d'un microscope électronique à balayage, afin de reconstruire la structure des tissus 3D sur des centaines de micromètres, avec une résolution suffisante pour suivre les processus cellulaires les plus minces et d'identifier les petits organites . Cette technique a ouvert la perspective de reconstruire systématiquement les deux systèmes d'invertébrés et de vertébrés nerveux. Il implique plusieurs étapes, y compris la préparation des échantillons, le fonctionnement du microscope électronique à balayage, l'acquisition de données, l'image post-traitement et l'analyse d'image. Ces procédures exigent une formation pratique et de certification pour le fonctionnement du microscope électronique à balayage spécialisés. Trois facteurs sont critiquec. -à- al. disséquant le bon cerveau région anatomique, l'obtention d'images à haute résolution, et en effectuant une analyse d'image correcte. Après dissection de la région anatomique d'intérêt de la tranche de vibratome du tissu cérébral fixe, il est crucial de prendre la photo pour la préservation de la bonne orientation. Il peut par ailleurs être difficile de déterminer le site approprié pour l'imagerie. L'obtention d'images à haute résolution dépend de la fixation adéquate et des procédures de coloration post-fixation appropriés. Le cerveau a tendance à subir une détérioration rapide de son ultrastructure après la mort. Par conséquent, il est essentiel de fixer le cerveau dans une solution de glutaraldéhyde à l'aide de la méthode de perfusion transcardial appropriée. Ceci doit être suivi par une fixation supplémentaire du cerveau dans une solution de glutaraldéhyde pendant au moins 24 heures. Depuis la résolution de l'image est complètement dépendante de la combinaison d'une variété de méthodes de coloration des métaux lourds, il est essentiel de suivre la méthode post-fixation comme indiqué dans le protocole d'acquérir quantifiable images. Les solutions doivent être faites comme décrit dans les méthodes. Enfin, pour l' analyse d'image précise l'organite / s à analyser doit être identifié sans équivoque (par ex. Par la visualisation des caractéristiques ultrastructurales) avant le traçage, et les lignes directrices du logiciel doit être strictement respectée. La résolution des images acquises devrait être connu pour la conversion de pixels à nanomètres pour des mesures volumétriques.

Outre le logiciel décrit dans le protocole pour effectuer une analyse d'image, peut également être utilisé de d'autres logiciels disponibles comme Reconstruire et Knossos. Bien que l'accent du protocole décrit est à la visualisation des mitochondries dans le système nerveux, il peut être modifié pour générer des informations 3D à haute résolution sur diverses autres structures sous - cellulaires (par ex. Du réticulum endoplasmique, les lysosomes etc.) Dans une variété de tissus.

Alors qu'un guide détaillé de dépannage pour microscope électronique à balayage opération est au-delà de la portée de cet article (voir les manuels d'utilisation de l'instrument et de l'information de formation), quelques problèmes se produisent régulièrement au cours d'expériences et de comprendre comment résoudre les peuvent aider les nouveaux utilisateurs ou ceux obtenir des images grâce à la collaboration / sources commerciales imagerie. Un problème commun est en charge de l'échantillon qui se produit principalement dans les régions de résine qui contiennent peu ou pas de matériel souillé. Dans une «positive» l' image (ie. Cytosol apparaît en blanc), les noyaux, les vaisseaux sanguins, et vides étendues de résine peuvent apparaître "noircie". En outre, la charge favorise également la dérive du faisceau local résultant en image apparente gauchissement. Les solutions possibles varient entre les instruments et les échantillons. Réduire les paramètres kV réduit le "noircissement" artefact mais peut favoriser plus la dérive du faisceau. En utilisant un mode à vide inférieur, et comprenant de l' azote (N2) gazeux, de la vapeur d'eau, etc. dans la chambre réduit également la charge, mais à un coût substantiel de la résolution et de Signarapport l-bruit. Un deuxième problème commun est un couteau à sauter. Balayage plus lent peut causer des dommages induits par faisceau à la surface du bloc, qui coupe de manière inégale ou pas du tout pour une imagerie / cycles de coupe (ie. Des images successives apparaît le même). Plusieurs solutions existent notamment en augmentant la profondeur de coupe / épaisseur de coupe avec réduite z résolution, en augmentant la vitesse de balayage et d'accepter par voie de conséquence les images les plus bruyants, réduisant la taille de pixel et d'accepter inférieure x / y-résolution, et en choisissant des échantillons ou des zones avec une coloration plus intense (aussi mal zones -stained payer plus, des dommages plus facilement, et nécessitent une exposition plus longue du faisceau pour obtenir des images avec acceptable signal -Noise ratios). Debris redéposition sur le bloc-face est une source occasionnelle d'artefact en images, et si cela se produit souvent, il peut exiger une pause de l'acquisition, et un nettoyage soigneux du (soufflage d'air) couteau ou retrimming l'échantillon à une taille plus petite. Bloc-face de charge favorise également redéposition, et les étapes ci-dessus peuventAidez-moi. Correction de la mise au point et stigmation peut également être nécessaire que les échantillons d'images de microscope en continu pendant plusieurs heures à quelques semaines, au cours de laquelle le vide profondeur augmente dans la chambre, ce qui nécessite stigmation corrections. Chaque microscope électronique à balayage diffère selon l'âge et les caractéristiques, et l'expérience est le meilleur guide. des changements dramatiques soudains de stigmation ou mise au point peut se produire lorsque la matière sectionnée adhère aux composants d'imagerie de microscope. La chambre doit être ouverte et matériel soigneusement délogé par le vide ou l'azote comprimé. Cela nécessite absolument une formation spécialisée.

Il y a quelques inconvénients de la technologie SBFSEM en ce qui concerne son utilité dans l'analyse des mitochondries du cerveau. Un inconvénient majeur, commun à tous microscopique des tissus fixés, est qu'il fournit des images statiques d'un organite extrêmement dynamique. Les mitochondries subissent fission et de fusion des cycles continus 26, sont mobiles et traite le long de la neurite traite 21. Des défauts dans le trafic mitochondrial et la dynamique qui ne sont pas purement numérique ou structurel peut être facilement oubliée par cette approche, bien que, en regardant le nombre de mitochondries dans un espace anatomiquement défini tels que presynapse on peut interpréter si le transport des mitochondries peut être modifiée 39 . Un deuxième inconvénient est qu'il est effectué uniquement dans une petite partie du cerveau, donc circuiterie défauts spécifiques dans la distribution mitochondriale peut être manquée. Corrélative approches 28,46 se permettre la possibilité de combiner l'imagerie confocale et multiphotonique avec la technologie SBFSEM pour générer à la fois les données moléculaires et ultrastructurales. Pour l'analyse mitochondriale, par conséquent, il peut être utile d'effectuer la SBFSEM après examen au microscope optique de coupes de cerveau en utilisant soit l'anticorps spécifique de l'antigène mitochondrial ou à l'aide d'un transgène qui exprime la protéine fluorescente mitochondrial ciblée. Cette combinatiostratégie finale peut fournir une méthodologie robuste pour identifier les défauts mitochondriaux dans les modèles de souris de troubles neurologiques et mitochondriales.

Il y a aussi des limitations techniques communes à de nombreuses formes de microscopie électronique en raison de l'utilisation de fixateurs dures, coloration des métaux lourds et la pénétration inégale des produits chimiques. D'autres limitations peuvent provenir de l'enrobage en plastique d'échantillons de tissus. Régions vides de résine et de structures faiblement colorés conservent des électrons lors de l' imagerie, ce qui provoque la déviation du faisceau et de la dérive ( l' image gauchissement) ainsi que des signaux de charge artefactuels (ex. Les noyaux sombres et lumière de vaisseau sanguin), qui à la fois empiéter sur la résolution. dommages Beam pour la résine favorise également la coupe inégale, et pour cette raison, l'imagerie nécessite généralement des tranches de 50 - 100 nm à découper à partir du bloc-face, produisant voxels non-isotrophic dans les ensembles de données. D'autres limitations pour certaines applications comprennent que les sections sont détruites et ne peuvent pas être réexaminées par la suite,qui peut forcer les utilisateurs à recueillir des images haute résolution de zones qui pourraient ne pas contenir des données utiles.

Un avantage majeur de SBFSEM est qu'il automatise le processus de sectionnement et l' imagerie des blocs de tissu en incorporant un microtome personnalisé dans un faible vide de la chambre SEM 32,33. Étant donné que les images sont obtenues directement à partir du bloc-face avant chaque coupe, les problèmes de l'article plissement, la compression et la perte lors de la manipulation sont sensiblement évités, bien que le dépôt de débris et la déformation due à bloquer face charge ne contribuent à une certaine perte et la distorsion d'image . En outre, les images obtenues dans des ensembles de données brutes sont déjà alignés et ne nécessitent que l'enregistrement micromètre échelle pour accueillir la dérive du faisceau afin de se prêter à la plupart des analyses. En raison du processus de découpe automatique, une fois que le vide du système est stabilisé, de grands volumes de tissu peuvent être imagées sans intervention de l'opérateur significatif. Il y a plusieurs avantages de l'utilisation de cettela technologie dans la réalisation d'études morphologiques et quantitatives sur les organelles et les structures intracellulaires. Un avantage est d'obtenir l'information sur la structure 3D des mitochondries dans un laps de temps raisonnable. La disponibilité des logiciels de reconstruction open source comme Reconstruire 47, TrakEM 48 et Knossos 49-51 ont fait de cette technologie un puissant outil d' analyse où détaillée ultrastructure 3D du réseau neuronal à partir de modèles animaux expérimentaux peuvent être directement comparés. L'analyse d'image semi - automatique et entièrement automatisé des approches 52 sont susceptibles de produire des données très mécanistes chez les animaux où la morphologie mitochondriale, la fonction et / ou la biogenèse sont censés être touchés. Plus tôt l' analyse SBFSEM a été fortement entravée en raison de faible résolution, les techniques de préparation des échantillons cependant plus récents impliquant l' amélioration des méthodes de coloration 40 ont considérablement amélioré la résolution à un point que même un seul v synaptiqueesicle peut être facilement résolu. Cette résolution des défauts de ultrastructurales des mitochondries tels que vacuolisation, la rupture de la membrane, et la perte de crêtes peuvent être facilement observés, ainsi que la distribution des mitochondries défectueuses dans les cellules peut être déterminé 38,39. La haute résolution de cette technique offre un avantage majeur sur la microscopie optique où la résolution est limitée à ~ 200 nm dans l'axe XY et ~ 500 nm dans l'axe Z. Les mitochondries sont donc juste à la limite de résolution de la microscopie optique 53. Bien que les mitochondries ayant des dimensions inférieures à la limite de résolution peut encore être visualisées par microscopie optique, leurs dimensions ne peuvent pas être mesurés de manière fiable. Fait important, les mitochondries qui sont séparées par une distance inférieure à la limite de résolution d'un microscope optique ne peuvent pas être résolus par microscopie optique. Un autre avantage est que l'analyse de la structure mitochondriale peut être réalisée dans le contexte du tissu, sans isolement de l'organite. Ceci peut alfaible pour les comparaisons appropriées dans le tissu en fonction de la localisation mitochondriale, par exemple axonale vs somatique et / ou les mitochondries dendritiques. Un avantage supplémentaire est qu'il est généralement possible de déterminer si les mitochondries sont neuronal ou neurogliale dans la localisation en suivant les processus à un organite définissant, tels que les filaments gliales et glycogène pour les astrocytes ou la myéline pour oligodendrocytes. Les processus de neurones et les cellules gliales sont souvent à proximité, et 2D approches telles que TEM, il peut être difficile d'attribuer avec confiance que les processus sont neuronal et qui sont neurogliale.

En conclusion, la technique de SBFSEM fournit des empilements d'images en série couvrant les zones de tissu 20 - 1000 um avec une résolution ultrastructurale 5 - 10 nm ou supérieure, ce qui permet à l'ensemble des cellules du système nerveux central et des organites tels que les mitochondries à imager, mesurés et reconstruits . Dans cet article, nous avons proprévu des approches pratiques pour l'utilisation de cette technologie. Les applications futures comprennent l'analyse de la structure mitochondriale et la distribution dans une variété de modèles animaux de maladies neurologiques telles que des modèles de maladies neuro-développementaux et neurodégénératives, ainsi que l'analyse des différents ultrastructures subcellulaires tels que le réticulum endoplasmique, le noyau et / ou lysosomes dans les cellules ou tissus entiers sous saine et états pathologiques.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson laboratory  664
Isoflurane VETone, tradename Fluriso 501017
Dissection tray Fisher scientific  S65105 
Dissection scissors Ted Pella Inc. 1316
Butterfly canula Exel International 26704
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Filter (0.45 micron) EMD Millipore NC0813356
Dissection microscope Olympus SZ61
Vibratome sectioning system Ted Pella Inc. Vibratome 3000
Sodium Cacodylate EMS 12300
Tannic Acid EMS 21700
Potassium Ferrocyanide J.T. Baker 14459-95-1
Osmium Tetroxide 4% Solution EMS 19150
Thiocarbohydrazide EMS 21900
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A93100
Potassium Hydroxide Acros Organics 43731000
Lead Nitrate EMS 17900
EMbed-812 EMBEDDING KIT EMS 14120 Contains Embed 812  resin, DDSA, NMA, and DMP-30.
Glutaraldehyde 25% EM Grade Polysciences Inc. 1909
Paraformaldehyde EMS 19202
Uranyl Acetate EMS 22400
Ethanol EMS 15055
Propylene Oxide EMS 20400
Embedding Mold EMS 70907
Aluminum specimen pin EMS 70446
Colloidal Silver Liquid EMS 12630
Razor EMS 72000
Super Glue (Loctite Gel Control) Loctite 234790 Hardware/craft stores carry this item
Conductive epoxy Ted Pella Inc. 16043
Scanning electron microscope Zeiss Sigma VP
In chamber ultramicrotome for SEM Gatan Inc. 3View2 Can be designed for other SEMs
Trimming microscope for pin preparation Gatan Inc. supplied as part of 3View system
Low kV backscattered electron detector Gatan Inc. 3V-BSED
ImageJ/ Fiji processing package  ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
http://rsb.info.nih.gov/ij/
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf
http://fiji.sc/TrakEM2

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Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, … More

Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, V., Benson, E. K., Kidd, G. J., Srivastava, S. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (113), e54214, doi:10.3791/54214 (2016).

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