Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.
Hjernen er et kraftkrevende organ som i hovedsak baserer seg på glukose som en brennstoffkilde. Glukose blir katabolisert av hjerne mitokondriene via glykolyse, tri-karboksyl-syre (TCA) syklus og oksidativ fosforylering (OXPHOS) veier å produsere energi i cellene i form av adenosintrifosfat (ATP). Nedskrivning av mitokondriell ATP produksjon fører mitokondrie lidelser, som presenterer klinisk med fremtredende nevrologiske og myopatiske symptomer. Mitokondrie defekter er også til stede i nevrologiske lidelser (f.eks autisme spektrum lidelse) og nevrodegenerative lidelser (f.eks amyotrofisk lateral sklerose, Alzheimers og Parkinsons sykdom). Dermed er det en økt interesse for feltet for å utføre 3D analyser av mitokondriell morfologi, struktur og distribusjon under begge friske og sykdomstilstander. Hjernen mitokondrielle morfologi er meget mangfoldig, med noen mitokondrier særlig de iden synaptiske region er i området på <200 nm diameter, som er under oppløsningsgrensen av tradisjonell lysmikroskopi. Uttrykker en mitochondrially målrettet grønt fluorescerende protein (GFP) i hjernen øker betydelig organellar påvisning av konfokal mikroskopi. Men det betyr ikke overvinne begrensninger på sensitiviteten for påvisning av relativt liten størrelse mitokondrier uten oversaturating bilder av store store mitokondriene. Mens seriell transmisjonselektronmikroskopi har blitt brukt for å karakter mitokondriene ved synapsen Denne teknikk er svært tidkrevende, spesielt når man sammenligner flere prøver. Serie blokk-ansikt scanning elektronmikroskopi (SBFSEM) teknikken innebærer en automatisert prosess med seksjonering, bildeblokker vev og datainnsamling. Her gir vi en protokoll for å utføre SBFSEM av et definert område fra gnager hjernen til raskt rekonstruere og visualisere mitokondrie morfologi. dette technique kan også brukes til å gi nøyaktig informasjon om mitokondrie antall, volum, størrelse og fordeling i et definert område hjerne. Siden den oppnådde oppløsning er høy (vanligvis under 10 nm) eventuelle grove mitokondrielle morfologiske defekter kan også bli detektert.
Mitokondriene er dynamiske organeller som endrer sin form og plassering, avhengig av cellulære signaler og behov, i tett interaksjon med celle cytoskjelett, og i respons til cellulære hendelser, for eksempel kalsiumstrømmer i nerveceller 1. Mitokondrier også samhandle med andre cellulære organeller f.eks endoplasmatiske retikulum, som igjen regulerer deres dynamikk og metabolisme 2. Mitokondrie morfologi viser heterogenitet i ulike celletyper ie. formen på organeller varierer fra røret til den består av plater, sekker og ovaler 3. Det har vist seg at mitokondrielle fusjons og fisjonssyklusproteiner kan regulere plassering, størrelse, form og fordeling av mitokondrier 4. Videre er endringene i form mitokondrienes assosiert med neurodegenerering, neuronal plastisitet, muskelatrofi, kalsiumsignalisering, reaktive oksygenarter generasjon, så vel som levetiden og celledød impliserer thaT-celle-spesifikke mitokondrielle morfologi er kritisk for å opprettholde normal cellefunksjon 5-11.
En stor bioenergetisk funksjon av mitokondriene er å generere adenosin trifosfat (ATP) ved å utføre en serie av metabolske reaksjoner som involverer fullstendig sammenbrudd av næringsstoffer (for eksempel glukose, fettsyrer eller aminosyrer) via TCA syklus og OXPHOS Pathways 12. Den menneskelige hjerne utgjør bare 2% av kroppsvekten, men den forbruker ~ 20% av den totale energi som produseres slik at det er en svært energikrevende organ 13. Det er derfor ikke overraskende at mitokondriell dysfunksjon hos mennesker fører til et stort antall av nevrologiske manifestasjoner 14-17. Genetiske mutasjoner i OXPHOS komponenter som svekker ATP generasjon fører til mitokondrie lidelser 17,18, som er klinisk heterogen gruppe lidelser med en forekomst på ~ 1: 5000 individer, og en av de vanligste årsaken til metabolic lidelser hos barn og voksne. Underskudd av mitokondrier-avledet ATP påvirker flere organsystemer med høy energikrevende organer som hjerne, hjerte og skjelettmuskulatur blir hovedsakelig påvirket hos disse pasientene 14,17,18. I de senere årene har flere studier gitt bevis for mitokondriell dysfunksjon i både nevrologiske og nevrodegenerative lidelser 15-17,19,20. Siden mitokondrier er viktig og avgjørende for hjernens utvikling og funksjon, er det viktig å utvikle protokoller som kan analysere endringer i hjernens mitokondrie morfologi, struktur, størrelse, antall og fordeling i henhold til både friske og syke tilstander. Musemodeller med mitochondrially målrettet grønt fluorescerende protein (GFP) har blitt produsert for å visualisere mitokondrielle bevegelser og lokalisering i hjernen 21,22. Selv om dette er et svært nyttig verktøy for å undersøke mitokondriebevegelighet og generell distribusjon, er det noen ulemper som inkluderer treninge begrenset oppløsning og følsomhet av fluorescens mikroskopi. Disse egenskapene gjør det vanskelig å spore de forholdsvis små størrelser mitokondriene. På samme måte har seriell transmisjonselektronmikroskopi blitt brukt til å vise synaptic mitokondriene 23, men denne fremgangsmåte er meget tidkrevende. Mitokondriell morfologi er kjent for å være svært dynamisk som de gjennomgår kontinuerlige fisjon og fusjon sykluser, og i de fleste cellene mitokondriene opprettholde et høyt tilkoblede nettverket 24-26. Nerveceller er sterkt polarisert celler med flere dendritter og utvidede axoner, og mitokondrier som danner en tilkoblet retikulære nettverk i cellen kroppen kan ha å skille som de gjør sin vei gjennom disse neurites (figur 1). Dette gjør hjerne mitokondrier ekstremt variert i størrelse og form. For eksempel, ved hjelp av serie blokk-ansikt scanning elektronmikroskopi (SBFSEM) teknikk, har vi tidligere observert at forskjellen i volumet eller størrelsen av extrasynaptic mitochondria til mitokondriene er tilstede i nerveterminaler kan være så mye som seksten fold 27.
Det finnes flere tilnærminger for å utføre volum analyser 28, som omfatter serie delen TEM 29, automatisert tape samle ultramicrotome SEM 30, fokusert ion stråle SEM 31, og SBFSEM 32. Den SBFSEM Analysen har fordeler ved at den har den oppløsning til å gi kvantitative data om den morfologiske form, størrelse, fordeling og antall av organeller som mitokondrier i områder inntil 1 mm av hjernen. Den teknisk drift er også den minst krevende, med datainnsamling og analyse innenfor mulighetene mange biologiske laboratorier som mangler forrige EM opplevelse. Ankomsten av kommersielle instrumenter for generering av serieseksjons-lignende bilder har gjort 3D ultrastructural analyse av vev en rutine teknikk, som ytterligere muliggjør en objektiv volumetrisk analyse i en hurtig og repeterbar måte 28 </sup>. Den SBFSEM ble først beskrevet og brukt innen nevrobiologi i 2004 32, basert på en idé introdusert av Leighton i 1981 33. Flere studier siden da har etablert denne teknikken som et viktig verktøy i rekonstruksjon analyse av nevronale kretser 34. Videre, for mange mindre prosjekter, gir det ombygging analyse for å identifisere cellulære organeller 27,35-39. Siden er de oppkjøpte bildene stammer fra lav spenning tilbake scatter elektroner ble nye flekker protokoller som kombinerer forskjellige kjente heavy metal fargeteknikker utviklet for å øke oppløsningen 40.
I denne artikkelen gir vi en protokoll for å utnytte 3D elektronmikroskopi bildebehandling og volumetrisk analyse av hjerne mitokondrier basert på metoder som tidligere har blitt brukt av oss og andre 38,39,41. De vev etterbehandlingsfremgangsmåter som ble brukt var som beskrevet tidligere av Deerinck m.fl.40.
Kompleksiteten av nervesystemet utgjør en betydelig utfordring i å rekonstruere store volumer vev og analysering av morfologien og fordelingen av organeller som mitokondrier med tilstrekkelig oppløsning. Flere celler, inkludert neuroner, oligodendrocytter og astrocytter med mange prosesser forlenget i tre dimensjoner samhandle innenfor hjernevevet 43. Siden mitokondriene ligger både i soma av celler og fjerne prosesser, er mitokondrie morfologi svært pleomorphic i nervesystemet (figur 1).</strong…
The authors have nothing to disclose.
We thank Sidney Walker for providing technical help. This work was supported in part by a grant from the National Institute of Health (1R01EY024712-01A1).
C57BL/6J mice | Jackson laboratory | 664 | |
Isoflurane | VETone, tradename Fluriso | 501017 | |
Dissection tray | Fisher scientific | S65105 | |
Dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
Butterfly canula | Exel International | 26704 | |
Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
Filter (0.45 micron) | EMD Millipore | NC0813356 | |
Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
Vibratome sectioning system | Ted Pella Inc. | Vibratome 3000 | |
Sodium Cacodylate | EMS | 12300 | |
Tannic Acid | EMS | 21700 | |
Potassium Ferrocyanide | J.T. Baker | 14459-95-1 | |
Osmium Tetroxide 4% Solution | EMS | 19150 | |
Thiocarbohydrazide | EMS | 21900 | |
L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A93100 | |
Potassium Hydroxide | Acros Organics | 43731000 | |
Lead Nitrate | EMS | 17900 | |
EMbed-812 EMBEDDING KIT | EMS | 14120 | Contains Embed 812 resin, DDSA, NMA, and DMP-30. |
Glutaraldehyde 25% EM Grade | Polysciences Inc. | 1909 | |
Paraformaldehyde | EMS | 19202 | |
Uranyl Acetate | EMS | 22400 | |
Ethanol | EMS | 15055 | |
Propylene Oxide | EMS | 20400 | |
Embedding Mold | EMS | 70907 | |
Aluminum specimen pin | EMS | 70446 | |
Colloidal Silver Liquid | EMS | 12630 | |
Razor | EMS | 72000 | |
Super Glue (Loctite Gel Control) | Loctite | 234790 | Hardware/craft stores carry this item |
Conductive epoxy | Ted Pella Inc. | 16043 | |
Scanning electron microscope | Zeiss | Sigma VP | |
In chamber ultramicrotome for SEM | Gatan Inc. | 3View2 | Can be designed for other SEMs |
Trimming microscope for pin preparation | Gatan Inc. | supplied as part of 3View system | |
Low kV backscattered electron detector | Gatan Inc. | 3V-BSED | |
ImageJ/ Fiji processing package | ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 | http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf | |
http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |||
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf | |||
http://fiji.sc/TrakEM2 |